登革次单位疫苗组成物的制作方法

1.本发明涉及一种次单位疫苗组成物，特别涉及一种含去除c端的非结构 蛋白1(ns1δc或截短ns1δc)予以共轭或连接于非结构蛋白3c(ns3c或截短 ns3c)及/或同源套膜蛋白第三区块(cediii)的至少一多肽的融合蛋白的重组登 革次单位疫苗组成物，其中至少一多肽为非结构蛋白3c(ns3c或截短ns3c) 及/或同源套膜蛋白第三区块(cediii)。


背景技术：

2.登革病毒(dengue virus，denv)是全球公卫最重要的虫媒病毒疾病(who, 2016)。denv经由埃及斑蚊(aedes aegypti)与白线斑蚊(aedes albopictus)传染 人，每年造成估计3.9亿个案例感染，其中有9.6千万案例有明显征状，有50 万案例有登革出血热或登革休克症候群(dengue hemorrhagic fever/dengue shocksyndrome，dhf/dss)(bhatt et al.,2013；diamond and pierson,2015；katzelnicket al.,2017)。至今有超过128个国家已报导有denv的传染，主要影响亚洲及 拉丁美洲的热带及亚热带地区。因此，为了控制登革疾病，开发登革疫苗为当 务之急(wan et al.,2013)。
3.赛诺菲巴斯德在2015年12月推出全球首例登革疫苗(或称 cyd
‑
tdv)；然而，该疫苗对于血清呈阴性的疫苗接种者，其安全性仍有疑虑 (wichmann et al.,2017；normile,2017；sridhar et al.,2018；gubler and halstead, 2019)。另二支登革疫苗，分别是美国国家过敏与传染病研究所(nationalinstitute of allergy and infectious diseases，niaid)研发的tv003/tv005疫苗， 以及武田公司研发的tak
‑
003疫苗，目前仍在进行第三期人体试验中 (kirkpatrick et al.,2015；biswal et al.,2019)。上述三支疫苗都是活性减毒疫苗 (screaton et al.,2015；who,2016)。由于对于目前登革疫苗的接种 计划仍有安全性的疑虑，其他活性减毒候选疫苗的安全性亦仍待审慎评估(normile,2017)。开发denv的改良型疫苗及/或抗病毒疗法仍是全球公卫的重 点。
4.针对开发登革次单位疫苗，先前研究认为，套膜(envelope，e)蛋白是引起 保护型抗体反应的主要抗原。套膜蛋白第三区块(ediii)含有细胞表面受体辨识 区域，被视为是登革次单位疫苗的潜在标的(guzman et al.,2010)。然而，针对 e蛋白的抗体不仅可以中和denv，却也可能通过抗体依赖型增强作用 (antibody
‑
dependent enhancement，ade)而增加denv的感染(guzman et al., 2015)。过去研究曾通过比对四种血清型denv的不同分离株的序列，找出同 源套膜蛋白第三区块(consensus ediii，cediii)作为免疫原。这些研究显示， cediii可引发抗体反应，借此交叉中和四种血清型的denv(leng et al.,2009)。 在非人类的灵长类动物研究中，以cediii与磷酸铝接种猴子，可引起猴子对 第二型登革病毒(denv2)的抗体反应，且反应是明显强烈并持久。同时也引起 特异性的t细胞反应并产生细胞激素，这与抗体反应相关(chen et al.,2013)。
5.ns1蛋白在内质网(endoplasmic reticulum，er)内腔(lumen)经转译后修饰 成二
no：1或4所示序列，ns1δc多肽为如seq id no：2 或5所示的序列，如seq id no：3或6所示序列的ns3c多肽，以及选择性 地含有一或多种药学上可接受的载剂及/或佐剂。
12.在一实施例中，上述融合蛋白的n端至c端的顺序可为cediii多肽及 ns1δc多肽(cediii
‑
ns1ic)。在一具体例中，前述融合蛋白在cediii多肽与 ns1δc多肽之间包含第一连接肽。
13.在一实施例中，上述融合蛋白的n端至c端的顺序可为ns1δc多肽及 cediii多肽(ns1δc
‑
cediii)，并共轭至ns3c多肽。在一具体例中，前述融合 蛋白在ns1δc多肽与ns3c多肽之间包含第二连接肽。
14.在一实施例中，上述融合蛋白的n端至c端的顺序可为ns1δc多肽以及 cediii多肽(ns1δc
‑
cediii)。在一具体例中，前述融合蛋白在cediii多肽与 ns1δc多肽之间可包含第一连接肽。
15.在一实施例中，上述由n端至c端以ns1δc
‑
cediii的顺序的融合蛋白可 共轭至ns3c多肽。在一具体例中，第二连接肽可共轭至cediii多肽与ns1δc 多肽之间。
16.在一实施例中，上述融合蛋白还可选择性地含有佐剂。
17.根据本发明的上述态样，还提出一种登革次单位疫苗组成物，包含一融合 蛋白，其为如seq id no：5所示序列的截短ns1δc多肽以及如seq id no： 6所示序列的截短ns3c多肽，以及选择性地含有一或多种药学上可接受的载 剂及/或佐剂。
18.在一实施例中，上述融合蛋白的n端至c端的顺序为截短ns1δc多肽以 及截短ns3c多肽(截短ns1δc
‑
截短ns3c)。
19.在一实施例中，上述融合蛋白在截短ns1δc多肽与截短ns3c多肽之间 包含第一连接肽。
20.在一实施例中，上述融合蛋白的n端至c端的顺序为截短ns3c多肽以 及截短ns1δc多肽(截短ns3c
‑
截短ns1δc)。
21.在一实施例中，上述融合蛋白在截短ns1δc多肽与截短ns3c多肽之间 包含第一连接肽。
22.在一实施例中，上述组成物还包含如seq id nos：1或4所示序列的 cediii多肽。在此实施例中，前述融合蛋白的截短ns1δc多肽可选择性共轭 至cediii多肽。在一些具体例中，前述融合蛋白的截短ns3c多肽可选择性共 轭至cediii多肽。在其他具体例中，前述cediii多肽可选择性共轭至截短 ns1δc多肽与截短ns3c多肽之间。
23.应用本发明登革次单位疫苗组成物，其包含cediii
‑
ns1δc的融合蛋白以 及ns3c多肽，或者截短ns1δc多肽与ns3c多肽的融合蛋白，借此加强对登 革病毒攻击的保护并减缓相关病理反应。
附图说明
24.为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附 图式的详细说明如下：
25.图1a至图8b为绘示根据本发明数个实施例的登革次单位疫苗组成物的 各种次单位。
26.图9a至图9c为绘示利用cediii
‑
ns1δc、cediii加上dj ns1以及dj ns1 重组蛋白
免疫诱导的抗体反应的结果。(图9a)此图式显示cediii、ns1δc、 dj ns1以及线性融合的cediii
‑
ns1δc重组蛋白。(图9b)每只小鼠给予25μgcediii
‑
ns1δc、5μg cediii加上( )20μg dj ns1、或25μg dj ns1蛋白并混 合铝盐作为佐剂，皮下免疫小鼠三次。(图9c)在第二次免疫及第三次免疫后三 天，收集小鼠血清并测定抗体力价(n＝3)。
27.图10a至图10d为绘示以铝盐混合cediii
‑
ns1δc或dj ns1蛋白免疫小 鼠，其血清对抗四种血清型denv的中和抗体力价的结果。将未免疫小鼠的 血清(mock serum)、以铝盐免疫的血清(alum serum)、以cediii
‑
ns1δc混合铝 盐免疫的血清(cediii
‑
ns1δc serum)及以dj ns1混合铝盐免疫的血清(dj ns1 serum)经二倍序列稀释，与50
‑
80pfu的denv1(图10a)、denv2(图10b)、 denv3(图10c)或denv4(图10d)于室温混合1小时后，再接种1
×
105的 bhk
‑
21细胞。利用溶斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test，prnt) 测定抗denv的中和抗体。每组数据以溶斑产生的平均百分比与误差线(sdbar)表示(n＝3)。
28.图11a至图11d为绘示以铝盐混合cediii
‑
ns1δc或dj ns1蛋白免疫小 鼠的血清可对于受四种不同血清型denv感染的细胞引起补体介导的细胞溶 解的结果。以denv1(图11a)、denv2(图11b)、denv3(图11c)或denv4 (图11d)(moi＝20)个别感染hmec
‑
1细胞达48小时。然后，以1：200倍稀 释的未免疫小鼠的血清(mock serum)、以铝盐免疫的血清(alum serum)、以 cediii
‑
ns1δc混合铝盐免疫的血清(cediii
‑
ns1δc serum)或以dj ns1混合铝 盐免疫的血清(dj ns1 serum)，在存在或不存在补体下，与细胞在37℃培养6 小时。收集细胞上清液，分析释放出的乳酸脱氢酶(ldh)。以三重复的培养物 的平均值
±
sd表示。**：p<0.01；***：p<0.001(n＝3)。
29.图12a至图12b为绘示以cediii
‑
ns1δc蛋白免疫小鼠的实验设计及在四 种不同血清型denv感染前的抗体力价。(图12a)以25μg/小鼠的 cediii
‑
ns1δc蛋白混合铝盐，皮下注射(s.c.)免疫小鼠三次。在第二次及第三 次免疫后3天，收集小鼠血清并测定抗体力价。(未免疫组，n＝2；denv免疫 组，n＝3；铝盐免疫组、denv加cediii
‑
ns1δc混合铝盐组，n＝4)。(fig.12b)。 小鼠在第24天经由静脉注射(i.v.)的途径接种1
×
108pfu的denv1、denv2、 denv3及denv4。感染2天后，分析小鼠的出血时间延长，收集血清以测定 病毒力价与可溶性ns1的含量，如图13a至图14d所示。
30.图13a至图13d为绘示以cediii
‑
ns1δc主动免疫可降低denv诱导的 出血时间延长。图12a为显示小鼠免疫模式。小鼠在第24天以1
×
108pfu 的denv1(图13a)、denv2(图13b)、denv3(图13c)、denv4(图13d) 经由静脉注射(i.v.)的途径接种。感染后2天检测小鼠尾部出血时间。*p<0.05， **p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns：无显著差异(not significant)。
31.图14a至图14d为绘示以cediii
‑
ns1δc主动免疫可降低小鼠血清中的病 毒力价。小鼠在第24天以1
×
108pfu的denv1(图14a)、denv2(图14b)、 denv3(图14c)、denv4(图14d)经由静脉注射(i.v.)的途径接种。小鼠在感 染后2天牺牲。收集血清，利用荧光聚焦分析法(fluorescent focus assay，ffa) 检测病毒力价。**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns：无显著差异(notsignificant)。
32.图15a至图15d为绘示以dj ns1及ns3主动免疫程度(％)的结果，其以 dj ns1或ns3抗原于离体刺激后，可诱导cd4

与cd8

t细胞活化。在第0 天，c3h/hen小鼠经皮下免疫不
同剂量的免疫原，即25μg dj ns1加上12.5μgns3/小鼠、25μg dj ns1/小鼠、12.5μg ns3/小鼠、单独铝盐或pbs，并于第 14天补强免疫(boosted)。小鼠在第21天牺牲，收集淋巴结(lymph node，ln) 细胞，并利用5μg/ml dj ns1或ns3蛋白再刺激3天，最后4小时与抗 cd3/cd28抗体培养，然后利用pe
‑
标定的抗cd25抗体、fitc标定的抗cd4 抗体以及pe/cy7标定的抗cd8抗体进行三重染色，以利用流式细胞仪分析cd4

及cd8

t细胞的cd25的表现量。图15a为绘示cd4

t细胞经dj ns1 抗原刺激后，反应出的cd25

百分比。图15b为绘示cd4

t细胞经ns3抗原 刺激后，反应出的cd25

百分比。图15c为绘示cd8

t细胞经dj ns1抗原 刺激后，反应出的cd25

百分比。图15d为绘示cd8

t细胞经ns3抗原刺激 后，反应出的cd25

百分比。dj ns1加上ns3的组别的n＝5，而其他组别 的n＝4。每个组别以平均值
±
sd显示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001， 以上利用单因子变异数分析(one
‑
way anova)及杜凯事后比较法检定(tukeypost hoc test)判定。
33.图16a至图16c为绘示以dj ns1及ns3主动免疫诱导细胞毒杀性t淋 巴细胞反应(cytotoxic t lymphocyte；ctl)对抗表现ns3的l929细胞的结果。 图16a为绘示ctl毒杀分析的实验设计。收集淋巴结细胞并以5μg/ml dj ns1 或ns3蛋白再刺激3天，以作为效应细胞。图16b为将表现ns1的l929细 胞(t)与效应细胞(e)进行共培养，其中e:t比例为20:1。经4小时后，收集目 标细胞(t)，并利用pi染色与流式细胞仪分析细胞死亡。利用西方墨点法分析 ns1表现量。图16c为显示具有s135a的ns2b/3可用于ns3表现的l929 细胞，ns2b3的自降解(self
‑
processing)不存在，则由西方墨点法分析可确认突 变构筑体的蛋白酶活性受损。ns3表现的l929细胞(t)与效应细胞(e)进行共 培养，其中e:t比例为20:1。经4小时后，收集目标细胞(t)，并利用pi染色 与流式细胞仪分析细胞死亡。利用西方墨点法分析ns1表现量。dj ns1加上 ns3的组别的n＝5，而其他组别的n＝4。每个组别以平均值
±
sd显示。*p< 0.05，**p<0.01，以上利用单因子变异数分析(one
‑
way anova)及杜凯事后比 较法检定(tukey post hoc test)判定。
34.图17a至图17b为绘示以dj ns1及ns3免疫的小鼠，经dj ns1(图17a) 或ns3(图17b)的抗原离体刺激后，其cd107a表现量增加的结果，其中 cd107a为毒杀性cd8

t细胞活性的标记。小鼠在第21天牺牲，收集淋巴结 细胞并再利用5μg/ml dj ns1或ns3蛋白刺激3天后，与抗cd3/cd28抗体、 莫能菌素(monensin)及布雷非德菌素a(brefeldin a)培养最后4小时，之后对 cd8

t细胞表现的cd107a进行表面染色，并利用流式细胞仪分析。dj ns1加 上ns3的组别的n＝5，而其他组别的n＝4。每个组别以平均值
±
sd显示。 *p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，以上利用单因子变异数分析(one
‑
wayanova)及杜凯事后比较法检定(tukey post hoc test)判定。
35.图18a至图18c为绘示以dj ns1及ns3主动免疫的结果，以降低被 denv感染的小鼠血清中的病毒力价。图18a为显示进行免疫的小鼠模式的 实验设计(n＝3/group)。在第17天，以1
×
108pfu denv2病毒株454009a经 由静脉注射(i.v.)接种c3h/hen小鼠。图18b为显示以dj ns1及ns3进行主 动免疫，以降低denv引起的出血趋势。在第17天，以1
×
108pfu denv2 病毒株454009a经由静脉注射(i.v.)接种c3h/hen小鼠。在感染后的2天，检 测尾部出血时间。图18c为显示在第19天牺牲的小鼠并收集血清样本，利用 ffa检测病毒力价。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，以上利用单因子变 异数分析(one
‑
way anova)及杜凯事后比较检定法(tukey post hoc test)判定。
36.图19为绘示以dj ns1及ns3主动免疫诱导的免疫反应与保护效力的示 意图。由产生ns3专一性ctl反应、cd107表现量提高、促进ns1专一性t 细胞反应以及抗体力价证实，以dj ns1加上ns3蛋白进行免疫，可以协同诱 导更有效的免疫反应。保护机转包括利用ctls直接毒杀被denv感染的细胞， 以及利用抗ns1抗体中和ns1诱导的致病作用。
37.图20a至图20d为绘示根据本发明数个实施例的截短ns1δc
‑
cediii
‑
截 短ns3c融合蛋白(图20a及图20b，mw＝49kda)以及截短ns1δc
‑
截短ns3c 融合蛋白(图20c及图20d，mw＝35kda)的表现量，其为利用sds
‑
page(图 20a及图20c)及西方墨点法(图20b及图20d)检测。
38.图21a至图21d为绘示实验设计(图21a)及以截短ns1δc
‑
cediii
‑
截短 ns3c(或称为ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf)融合蛋白以及截短ns1δc
‑
截短ns3c(或 称为ns1fδc
‑
ns3cf)融合蛋白主动免疫的结果(图21b至图21d)，上述二种 融合蛋白是由哺乳类动物293f细胞纯化，可以降低被denv感染小鼠的病毒 力价(图21b)、补体依赖型细胞毒杀作用(cdc；图21c)及出血时间(图21d)。
39.图22a至图22d为绘示实验设计(图22a)及以截短ns1δc
‑
cediii
‑
截短 ns3c(或称为ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf)融合蛋白以及截短ns1δc
‑
截短ns3c(或 称为ns1fδc
‑
ns3cf)融合蛋白主动免疫的结果(图22b至图22d)，上述二种融 合蛋白是由果蝇s2细胞纯化，可以降低被denv感染小鼠的病毒力价(图 22b)、补体依赖型细胞毒杀作用(cdc；图22c)及出血时间(图22d)。
40.其中，附图标记：
41.101、103、201、203、205、207、301、303、401、403、501、503：曲线
具体实施方式
42.通过以下详细说明，并参酌所附图式，使本发明的实施例显而易见，其中 相同图号是指相同元件。
43.此处参照引用的所有文献，视同通过引用每篇个别文献或专利申请书特定 且个别并入参考文献。倘若引用文献对一术语的定义或用法，与此处对该术语 的定义不一致或相反，则适用此处对该术语的定义，而不适用该引用文献对该 术语的定义。
44.为了解释说明书，将适用以下定义，在适当的情况中，单数名词也包括复 数，反之亦然。整个详细说明阐述额外的定义。
45.除非上下文不适当，否则此处所述的「一(a/an)」及「该(the/said)」定义为 「一或多」且包括复数型。
46.本发明揭露一种登革次单位疫苗组成物，其包括一融合蛋白，此融合蛋白 为去除c端的非结构蛋白1(ns1δc)多肽予以共轭或连接于至少一多肽，此 至少一多肽为非结构蛋白3c(ns3c)多肽及/或同源套膜蛋白第三区块(cediii) 多肽，借此加强对登革病毒攻击的保护并减缓相关病理反应。其次，本发明揭 露一种登革次单位疫苗组成物，其包含ns3c多肽及一融合蛋白，此融合蛋白 为cediii多肽以及ns1δc多肽(cediii
‑
ns1δc)。另一种方式，本发明揭露一 种登革次单位疫苗组成物，其包括一融合蛋白，此融合蛋白为截短ns1δc多 肽(亦称为ns1fδc)及截短ns3c多肽(亦称为ns3cf)。另一种方式，前述组成 物亦包含转译上述多肽的多个聚核苷酸片段。
47.此处所述的「登革次单位疫苗」包含一融合蛋白，此融合蛋白为去除c 端的非结构蛋白1(ns1δc)多肽予以共轭或连接于至少一多肽，此至少一多 肽为非结构蛋白3c(ns3c)多肽及/或同源套膜蛋白第三区块(cediii)多肽，且可 选择性地含有一或多种药学上可接受的载剂及/或佐剂，借此加强对登革病毒 攻击的保护并减缓相关病理反应。
48.在一些实施例中，此处所述的「融合蛋白」指ns1δc多肽(或截短ns1δc) 予以共轭或连接于至少一多肽，此至少一多肽为ns3c多肽(或截短ns3c)及/ 或cediii多肽，二者可以任何顺序，例如cediii
‑
ns1δc、ns1δc
‑
cediii、ns1δc
‑
ns3c、ns3c
‑
ns1δc、cediii
‑
ns1δc
‑
ns3c、ns1δc
‑
cediii
‑
ns3c、 ns3c
‑
cediii
‑
ns1δc，通过标准的胜肽键(意即无额外的连接肽)直接连接，或 通过至少一额外的连接肽(例如连接肽
‑
1及连接肽
‑
2)予以共轭或连接，如图1a 至图8b所示的融合蛋白的变体。
49.在一些具体例中，「cediii」多肽可例如seq id no：1或4所示序列。 「ns1δc」多肽可例如seq id no：2或5所示的序列。「ns3c」多肽可例如 如seq id no：3或6所示序列。
50.在其他实施例中，融合蛋白的截短ns1δc多肽可例如seq id no：5所 示序列，截短ns3c多肽可例如seq id no：6所示序列。在这些实施例中， 上述组成物可选择性地包含如seq id nos：1或4所示序列的cediii多肽。 在一些实施例中，上述融合蛋白的ns1δc多肽与ns3c多肽之前、之间、之 后可包含cediii多肽，且顺序不拘。
51.在一些实施例中，此处所述的连接肽(linker)，例如连接肽
‑
1或连接肽
‑
2， 可无歧异地理解为一般分子生物学常用的「连接符(linker)」或「间隔区 (spacer)」。连接肽可以是任何习知用于将ns1δc(或截短ns1δc、ns1fδc)予 以共轭或连接于至少一多肽的寡肽或化合物，其中至少一多肽为ns3c多肽(或 截短ns3c、ns3cf)及cediii多肽。在一些具体例中，连接肽可含有至少一氨 基酸、经修饰的氨基酸或非人类氨基酸的元素。前述元素可例如包含以下一或 多者：氨基
‑3‑
氧杂戊酸(amino
‑3‑
oxapentanoic acid)、peg1、peg2、peg4、β 氨基酸、γ氨基酸、氨基己酸(aminohexanoic acid)或氨基3,6
‑
二氧杂辛酸 (amino
‑
3,6
‑
dioxaoctanoic acid)。
52.「登革次单位疫苗」一词可如之前的组成物所述，用来加强对登革病毒攻 击的保护并减缓相关病理反应。
53.「受试对象(subject)」包括人类及非人类动物。非人类动物可包括如哺乳 类及非哺乳类动物的所有的脊椎动物，像是非人类的灵长类动物、羊、狗、牛、 鸡、两栖类动物及爬虫类动物。除非另外说明，否则本文所述的「患者」或「受 试对象」的名词是相互通用的。
54.以下利用数个示范实施例说明本发明的应用，然其并非用以限定本发明， 本发明技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作 各种的更动与润饰。
55.实施例
56.建立实验动物模式
57.品系c3h/hen小鼠是由查尔斯河实验室(charles river breedinglaboratories)公司所取得。小鼠在成功大学医学院实验动物中心，以标准实验 室级饲料及水饲养。取6至8周龄的小鼠或3周龄的子代用于生产抗体及感染 的实验。上述动物实验计划书业经实验动物照护与使用委员会(institutionalanimal care and use committee，iacuc)的审查通过。以下实施例已由成功大 学动物实验伦理委员会通过。
58.制备重组蛋白及血清
59.此实施例为构筑cediii
‑
ns1δc多肽，其为融合ns1δc与cediii的dna 片段的构筑体(由陈信伟博士提供)，以限制酶not i与xho i的位点插入pet21b 质体中。由此所得的重组蛋白c端具有额外连续6个组氨酸标签(hexahistidinetag，his
‑
tag)。为了表现蛋白，上述构筑体系转型至大肠杆菌bl21品系 (escherichia coli bl21 strains)中，以产生表现cediii
‑
ns1δc融合蛋白的大肠杆 菌。所得的转型株菌体培养于卢里亚培养液(luria broth，lb)中，以0.5mm的 异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside，iptg)诱导后，离心沉淀(pelleted) 菌体。之后，利用超音波处理后，溶解菌体。从包涵体回收的cediii
‑
ns1δc 融合蛋白(或称重组蛋白)属于不溶的聚集物，接着在变性(denatured)试剂(尿素 缓冲液，含有8m尿素、500mm nacl、20mm tris
‑
hcl)中予以变性。前述重 组蛋白先利用镍离子管柱(ni
2
column)纯化后，在l
‑
精氨酸、edta、pmsf、 还原型麸胱甘肽及氧化型麸胱甘肽的存在下，缓缓稀释掉变性试剂后，使重组 蛋白再折叠(refolded)。此实施例利用配置ultracel
‑
30滤膜的amicon ultra
‑
30 离心式过滤单元(millipore)浓缩重组蛋白。此外，ns1δc(删除第271
‑
352个氨 基酸残基)与dj ns1(denv ns1第1
‑
270个氨基酸残基与jev ns1第271
‑
352 个氨基酸残基)的cdna选殖(cloned)到带有组氨酸标签(his
‑
tag)的pet28a载 体。cediii质体(由陈信伟博士取得)是由大肠杆菌(e.coli)bl21表现。经纯化 后，利用10％或12％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，sds
‑
page)进行检验。纯化后的 cediii
‑
ns1δc与铝盐(alum)混合后作为佐剂，以由皮下免疫c3h/hen小鼠三 次。分别在第一次免疫后七天、第二次免疫及第三次免疫后三天，收集小鼠血 清并测定抗体力价。牺牲小鼠后，收集小鼠血清并于
–
20℃下储存。
60.dj ns1(denv ns1第1
‑
270个氨基酸残基与jev ns1第271
‑
352个氨基 酸残基融合)的cdna选殖(cloned)到带有组氨酸标签(his
‑
tag)的pet28a载体 (wan et al.,2014)。接着将上述质体导入大肠杆菌(e.coli)bl21，利用异丙基 b
‑
d
‑1‑
硫代半乳糖苷(isopropyl b
‑
d
‑1‑
thiogalactoside，iptg；calbiochem,sandiego,ca)诱导重组蛋白，溶于尿素缓冲液(含有8m尿素、500mm nacl、20 mm tris
‑
hcl)，并利用镍离子
‑
氮基三醋酸(nta)亲和性管柱(ni
2
‑
nta affinitycolumn，ge healthcare life science,uk)纯化。纯化后，利用sds
‑
page检验 上述蛋白，然后利用考马思亮蓝r250(coomassie brilliant blue r250)染色。纯 化后的蛋白于再折叠缓冲液[含有50mm tris
‑
hcl，250mm nacl，1mmedta，250mm l
‑
精氨酸(l
‑
arginine)，10mm gsh(还原型麸胱甘肽)与1mmgssg(氧化型麸胱甘肽)，以及5％甘油]中进行透析，并利用amicon ultra超 滤离心管(centrifugal filters；millipore,billerica,ma)浓缩。
[0061]
denv ns3 cdna选殖到带有his
‑
tag的pet21b载体(由卫生研究院余 佳益博士提供)。上述质体转型至大肠杆菌bl21中。转型细胞于lb培养液[含 有100μg/ml安比西林(ampicillin)]中在37℃进行隔夜培养。隔夜培养物利用 lb培养液[含有100μg/ml安比西林]稀释100倍后，在37℃再培养至600nm 的光密度(optical density，od)值达0.5。接着添加1mm iptg，在30℃诱导6 小时，以表现denv2 ns3。为了分析ns3蛋白的表现量，所有样品在4℃以 8,000
×
g的转速离心30分钟。利用离心收集细胞，并将沉淀物(pellets)储存于
ꢀ‑
80℃备用。收集并利用电泳分析菌体沉淀物。为了纯化蛋白，菌体沉淀物先 再悬浮于pbs
中，置于冰上利用超音波溶解菌体。上述细胞悬浮液以13,000
×ꢀ
g的转速离心30分钟。含有包涵体的沉淀物再悬浮于结合缓冲液(bindingbuffer，含有8m尿素，0.5m nacl，以及20mm tris
‑
hcl，ph 6.95)中，置于 冰上利用超音波再次溶解，然后在4℃以13,000
×
g的转速离心45分钟使反 应液澄清。将含有可溶性蛋白的上清液注入镍离子管柱(ni
2
column)。利用冲 洗缓冲液[washing buffer，含有8m尿素，0.5m nacl，20mm tris
‑
hcl，以及 120mm咪唑(imidazole)，ph 6.95]冲洗管柱。利用冲提缓冲液(eluting buffer， 含有8m尿素，0.5m nacl，20mm tris
‑
hcl，以及300mm咪唑，ph 6.95) 冲提出his标签(his
‑
tagged)蛋白。上述蛋白经纯化后，利用sds
‑
page检验。 纯化后的蛋白于再折叠缓冲液[含有50mm tris
‑
hcl，250mm nacl，1mmedta，250mm l
‑
精氨酸，10％甘油，10mm gsh与1mm gssg，ph 6.95] 中进行透析，使其不含尿素，再利用amicon ultra(millipore)离心并浓缩。
[0062]
为了混合抗原与铝盐，此实施例先将imject铝盐(pierce biotechnology, rockford,il)逐滴加入抗原溶液并与其混合，使imject铝盐与抗原溶液的最终 体积比为1:1(100μl imject铝盐比上100μl抗原溶液)。之后，在4℃混合 至隔夜，使imject铝盐与抗原吸附完全。其他选殖株(clones)系利用上述方法 选出，且其序列相似度(sequence identities)如表1所示。
[0063]
表1
[0064][0065]
细胞培养
[0066]
幼仓鼠肾细胞株(baby hamster kidney cells，bhk
‑
21)培养于含有抗生素及 5％fbs的dmem(invitrogen,carlsbad,ca)中。c6/36细胞与l929细胞培养 于含有抗生素及10％fbs的dmem中。由小鼠淋巴结收集到的淋巴细胞则 培养于含有抗生素、10％fbs、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、50μm2
‑
巰基 乙醇(2
‑
mercaptoethanol，2
‑
me)的rpmi
‑
1640培养液中，在37℃及5％co2下 培养。hmec
‑
1细胞是由美国疾病管制与预防中心(centers for disease controland prevention,usa)取得，培养在添加1μg/ml氢化皮质酮(hydrocortisone)、10ng/ml表皮生长因子(epidermal growth factor)、3ng/ml碱性纤维母细胞生 长因子(basic fibroblast growth factor)、10μg/ml肝素(heparin)以及抗生素的内 皮细胞生长培养液m200(endothelial cell growth medium m200；invitrogen)中， 以培养瓶(culture flasks)继代。利用含有1000u/ml胰蛋白酶(trypsin)与0.5mmedta的脱离缓冲液(detaching buffer)使细胞分离(detached)。
[0067]
病毒培养
[0068]
第二型登革病毒病毒株454009a(denv2 strain 454009a)最初是由登革病 患体
内分离出，并感染c6/36细胞株以维持此病毒株。简言之，以0.01的感 染倍数(multiplicity of infection，moi)的denv2与c6/36单层细胞培养于28℃ 及5％co2中5天。利用1000
×
g的转速离心10分钟，以收取培养基并移除细 胞残骸。收集病毒悬浮液并储存于
‑
70℃备用。病毒力价为利用bhk
‑
21细胞 进行溶斑分析法(plaque assay)测定。简言之，将bhk
‑
21细胞种入12孔细胞 培养盘(12
‑
well plates，8
×
104细胞/孔)，在富含co2(co2‑
enriched)的条件下培 养于dmem中。加入序列稀释的病毒并吸收1小时后，将接种的细胞更换为 新鲜的dmem[含有2％fbs与0.8％甲基纤维素(methyl cellulose)]。感染5天 后，移除细胞培养液，将细胞固定并利用结晶紫(crystal violet)溶液(由1％结晶 紫、0.64％nacl及2％福尔马林组成)染色。
[0069]
溶斑分析法(plaque assay)
[0070]
将bhk
‑
21细胞种入12孔细胞培养盘(12
‑
well plates，1
×
105细胞/孔)，培 养于含5％fbs的dmem中，在37℃含5％co2的条件下培养至隔夜。移除 培养液，将以含2％fbs的dmem序列稀释的病毒上清液(0.4ml/孔)加入细 胞，培养在37℃达1小时。然后，将接种的细胞更换为含2％fbs与0.8％甲 基纤维素的dmem，将培养盘置于37℃培养5天。感染5天后，移除细胞培 养液，将细胞固定并利用结晶紫溶液(含1％结晶紫、0.64％nacl及2％福尔马 林)在室温染色1.5小时后，使溶斑可视化。病毒浓度以pfu/ml表示，并用于 感染实验中计算感染倍数(moi)。
[0071]
溶斑减少中和试验(plaque reduction neutralizing test，prnt)
[0072]
溶斑减少中和试验(prnt)为利用第一型登革病毒病毒株8700828 (denv1strain 8700828)、第二型登革病毒病毒株16681(denv2 strain 16681)、 第三型登革病毒病毒株8700829(denv3 strain 8700829)以及第四型登革病毒 病毒株8700544(denv4strain 8700544)，以不同的血清接种bhk
‑
21细胞，利 用上述溶斑分析法进行。将二倍序列稀释的血清(经56℃处理1小时使补体不 活化)与50
‑
80pfu/孔的denv在室温混合1小时。接着，将病毒
‑
血清混合物 加入bhk
‑
21单层细胞1小时，再更换成含有2％fbs与0.8％甲基纤维素的 dmem予以覆盖。5天后，移除覆盖物，将细胞固定并利用结晶紫溶液(含1％ 结晶紫、0.64％nacl及2％福尔马林)染色在室温染色3小时后，使溶斑可视化。 最后，相对于无血清病毒的溶斑，减少50％溶斑的血清浓度称为prnt50，可 使用prism软件绘制。
[0073]
判定抗体力价
[0074]
0.2μg/孔的dj ns1或ns3蛋白溶于涂布缓冲液中(含na2co
3 1.59g， nahco
3 2.93g，ph 9.6，最后加ddh2o到1l)，加入96孔细胞培养盘中，于 4℃涂布至隔夜。上述培养盘更换为含5％bsa的pbs，于4℃阻隔(blocked) 隔夜后，再利用含0.05％tween 20的pbs润洗三次。小鼠血清经序列稀释后， 加入蛋白涂布的孔内，于4℃培养隔夜。上述培养盘经润洗三次后，每孔加入 hrp
‑
共轭的抗
‑
小鼠igg(cell signaling,danvers,ma)或igm(kpl, gaithersburg,md)，于室温下培养2小时。上述培养盘经润洗后，每孔加入 abts，并利用微量盘读取仪(emax microplate reader；molecular devices, sunnyvale,ca)测量405nm的吸光值。
[0075]
分析树突状细胞以及cd4

t细胞与cd8

t细胞的活化
[0076]
在离体研究中，合并的淋巴结细胞可利用pe
‑
共轭的抗cd11c抗体 (ebioscience,san diego,ca)，结合apc
‑
共轭的抗cd40抗体或抗cd86抗体 (biolegend,san diego,ca)、
pe
‑
cy7
‑
共轭的抗cd80抗体(biolegend)及fitc
‑ꢀ
共轭的抗mhc第i或ii型(class)抗体(biolegend)，进行双重染色或三重染色， 以判定树突状细胞的活化。上述细胞利用流式细胞仪(cytoflexs,beckmancoulter,brea,ca)进行分析。
[0077]
合并的淋巴结细胞(5
×
105cells/ml)培养于24孔细胞培养盘，利用dj ns1 或ns3(5μg/ml)刺激3天。收取细胞并利用pe共轭的抗cd25抗体 (ebioscience)、fitc
‑
共轭的抗cd4抗体以及pe
‑
cy7
‑
共轭的抗cd80抗体(bdbiosciences,san jose,ca)进行三重染色，以判定t细胞的活化。上述细胞利用 流式细胞仪(cytoflexs)进行分析。
[0078]
分析cd8

t细胞的表面cd107a
[0079]
合并的淋巴结细胞(5
×
105cells/ml)培养于24孔细胞培养盘，利用dj ns1 或ns3(5μg/ml)刺激3天。在第3天，利用抗cd3/cd28抗体(0.5μg/ml； ebioscience)再刺激细胞，在刺激前，将percp/cy5.5
‑
共轭的cd107a抗体 (biolegend)加入细胞。上述培养物在分泌型抑制剂的存在下，于37℃于5％ co2下培养4小时，其中分泌型抑制剂为布雷非德菌素(brefeldin；biolegend) 与莫能菌素(monensin；bd biosciences)可抑制细胞毒性颗粒酸化及受体介导的 胞吞作用，使cd107a留在细胞表面。之后，收取细胞，并利用pe
‑
cy7
‑
共轭 的抗cd80抗体(bd biosciences)进行三重染色，以判定t细胞的去颗粒化。上 述细胞利用流式细胞仪(cytoflexs)进行分析。
[0080]
l929细胞表现ns3的细胞内染色
[0081]
利用pbs润洗表现ns3的l929细胞(5
×
105cells/ml)，并利用含4％三聚 甲醛(paraformaldehyde)的pbs于室温固定细胞10分钟。经pbs润洗后，利用 通透缓冲液[permeabilized buffer，500ml pbs含0.5g皂素(saponin)、5g bsa 及0.5g nan3]使细胞透化，再利用抗ns3抗体于4℃染色至隔夜。利用通透缓 冲液润洗后，将细胞与alexa
‑
488
‑
共轭的抗小鼠igg(invitrogen,carlsbad,ca) 培养于室温达1小时。最后以pbs润洗二次后，利用流式细胞仪(cytoflexs) 进行分析细胞。
[0082]
主动免疫反应及denv感染小鼠模式
[0083]
将25μg/小鼠的dj ns1蛋白混合铝盐、12.5μg/小鼠的ns3蛋白混合铝盐、 25μg/小鼠的dj ns1蛋白与12.5μg/小鼠的ns3蛋白混合铝盐、单独铝盐、 以及pbs控制组，在第0天与第14天，对三周龄的小鼠进行皮下注射(s.c.) 免疫。在第21天收集小鼠血清与淋巴结细胞进行分析。针对denv感染模式， 在第17天，小鼠利用静脉注射(i.v.)denv2(1
×
108pfu/小鼠)攻毒，在第19 天牺牲并收集血浆及组织。
[0084]
病毒力价分析
[0085]
为了判定小鼠血清中的病毒力价，进行荧光聚焦分析法(fluorescent focusassay，ffa)。简言之，血清利用含2％fbs的rpmi培养液经序列稀释后，与 bhk
‑
21细胞培养于37℃达2小时。然后，更换单层细胞的培养液为含2％fbs 与0.8％甲基纤维素的dmem，于37℃培养。经2
‑
3天后，移除覆盖物，利用 抗ns1抗体33d2(取自叶才明博士)染病毒病灶(virus foci)。上述细胞加入alexa 488
‑
共轭的山羊抗小鼠igg(invitrogen)，并利用荧光显微镜观察。
[0086]
ns1定量型elisa
[0087]
利用自制ns1三明治式elisa，定量ns1在小鼠血液中的浓度。简言之， 将5μg/ml的抗ns1单株抗体(mab)33d2涂布于96孔细胞培养盘，培养至 隔夜。上述培养盘利用含1％bsa
的pbs阻隔1小时后，每孔加入小鼠血清 (1：5稀释)与1μg/ml的生物素
‑
共轭的抗ns1单株抗体31b2(取自叶才明博 士)，于37℃共培养1
‑
2小时。每孔加入hrp
‑
标定的链霉亲和素(streptavidin) 溶液(1:40稀释)(r&d systems,minneapolis,mn)，于37℃培养20分钟。在利 用pbst(pbs含有0.01％tween 20)润洗三次后，利用四甲基联苯胺 (tetramethylbenzidine，tmb)显色并观察。加入终止溶液(2n h2so4)后，利用微 量盘读取仪(emax microplate reader,molecular devices)测量每孔在450nm的吸 光值。
[0088]
出血时间
[0089]
在denv感染后2天，于安乐死前检测出血时间。将小鼠尾巴的尾尖切 去3mm，以检测出血时间。每30秒用滤纸收集血滴。当血斑直径小于0.1mm 时，记录出血时间。
[0090]
酵素结合免疫吸附分析法(enzyme
‑
linked immunosorbent assay，elisa)
[0091]
100μl的重组蛋白(cediii、ns1δc、dj ns1或cediii
‑
ns1δc)以涂布缓 冲液稀释成2μg/ml的浓度后，涂布于elisa培养盘。上述培养盘于4℃培 养隔夜。上述培养盘加入200μl含5％bsa的涂布缓冲液，于室温下培养2 小时，再利用200μl的pbst(pbs含有0.01％tween 20)润洗三次。加入二倍 序列稀释的抗血清(100μl)，于37℃培养2小时或于4℃培养隔夜。上述培养 盘利用200μl的pbst润洗三次。加入hrp
‑
共轭的二级抗体(100μl，以1:5000 稀释于pbs中)，于37℃培养2小时。上述培养盘利用200μl的pbst润洗 三次后，加入abts(100μl)观察反应结果。在充分显色后，利用微量盘读取 仪测量每孔在415nm的吸光值。
[0092]
抗体依赖型补体介导的细胞溶解分析
[0093]
将hmec
‑
1细胞种入96孔细胞培养盘(5
×
103细胞/孔)后，于37℃及5％ co2培养箱培养至隔夜。移除上清液后，hmec
‑
1细胞与denv(moi＝20)于 m200培养液中培养48小时。利用pbs润洗细胞二次后，将未免疫小鼠的血 清(mock serum)、以铝盐免疫的血清(alum serum)、以cediii
‑
ns1δc混合铝盐 免疫的血清(cediii
‑
ns1δc serum)或以dj ns1混合铝盐免疫的血清(dj ns1 serum)利用无酚红的m200培养液以1：200倍稀释后，在存在或不存在 low
‑
tox
‑
m兔补体(1:20倍稀释)下，与细胞培养于37℃及5％co2下达6小时， 以促使补体介导的细胞裂解(complement
‑
mediated cell lysis)。利用市售套组(细 胞毒杀性检测套组)检测释放出的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，ldh)，其 为一种细胞质酶，借此测定细胞溶解(cytolysis)。利用微量盘读取仪测量每孔 在490nm的吸光值。
[0094]
免疫及denv
‑
感染小鼠模式
[0095]
以铝盐混合重组cediii
‑
ns1δc，经皮下免疫c3h/hen小鼠。在第一次免 疫后7天、第二次及第三次免疫后3天，收集小鼠血清并测定抗体力价。在第 三次免疫后4天，denv经皮内(intradermally)接种至c3h/hen小鼠的上背部。 在感染后3天，测量小鼠尾部出血时间并牺牲小鼠，亦收集小鼠血清并存放于
ꢀ‑
20℃。
[0096]
利用哺乳动物细胞293f与果蝇s2细胞(drosophila s2 cells)的表现系统， 表现ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf与ns1fδc
‑
ns3cf重组蛋白
[0097]
二种重组蛋白(ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf与ns1fδc
‑
ns3cf，分子量分别为49 kda及35kda)选殖至ptt5载体，其中ptt5载体表现的蛋白两端带有his
‑
tag。 上述质体转染至293f细胞，由293f细胞将重组蛋白分泌至上清液中。转染 后5天收集具有重组蛋白的上清液，并利用镍离子管柱(ni
2
column)纯化上清 液。纯化之后，将重组蛋白冻干并存放于
‑
20℃。上述由293f细胞所得的重 组蛋白是由伟乔生医股份有限公司(leadgene biomedical,
inc)所设计及提供。 另外，为了以较稳定且纯化较佳的条件生产重组蛋白，上述蛋白是选殖至 pmt/bip/v5载体中，其中pmt/bip/v5载体表现的蛋白两端分别带有his
‑
tag 及strep
‑
tag，并将上述质体转染至果蝇s2细胞中。上述果蝇s2细胞的重组蛋 白表现稳定细胞株是由叶才明老师实验室所建立。首次培养细胞时，于含有 20ml的施耐德果蝇培养基(schneider's drosophila medium)的直立式75t培养 瓶中，在室温下以65rpm的转速进行震动培养。当细胞生长至浓度1.5至2
×
107细胞/ml后，将4个75t培养瓶的细胞移到1000ml的塑料制三角椎瓶中培 养细胞。细胞以80rpm的转速震动培养3天，直到细胞在含有500ml培养液 的塑料制三角椎瓶中生长至浓度3至5
×
106细胞/ml。在上述培养液中加入 500μl的500mm硫酸铜，在室温下诱导重组蛋白达3天。为了分析重组蛋白 的表现，将上述样本在室温下以1500rpm的转速离心，以收集上清液。所得 的500ml上清液与50ml的结合缓冲液(含50mm nah2po4、300mm nacl， ph 8.0)混合，然后通过滤杯(cup filter)。含有重组蛋白的上清液注入含有 strep
‑
tactin琼脂糖(strep
‑
tactin sepharose)的管柱。利用清洗缓冲液(washingbuffer，含50mm nah2po4、300mm nacl，ph 8.0)流洗管柱。利用冲提缓冲 液(含50mm nah2po4、300mm nacl、2.5mm脱硫生物素(desthiobiotin)，ph 8.0)冲提出带有strep
‑
tag的重组蛋白。在纯化后，利用12％sds
‑
page及西方 墨点(western blot)分析法检验上述蛋白，并利用截流分子量10k的透析膜(10kdialysis membrane)隔夜透析至pbs碱(base)中。伟乔生医股份有限公司将透析 后的蛋白利用布拉德福蛋白分析法(bradford protein assay)定量后冻干。
[0098]
病灶减少中和试验(focus reduction neutralization test，frnt)
[0099]
bhk
‑
21细胞种入96孔细胞培养盘(1
×
104细胞/孔)，置于37℃培养箱培 养12
‑
16小时，至细胞满度达60
‑
70％。从免疫小鼠取得的血清利用含2％fbs 的dmem稀释10倍，将50μl含50
‑
100溶斑的病毒培养液加入稀释血清中， 于室温培养1小时。接下来，移除96孔培养盘的培养液，将100μl的血清
‑ꢀ
病毒混合物加入含有bhk
‑
21细胞的各孔中，置于37℃培养箱培养1
‑
1.5小时。 然后，将100μl的甲基纤维素培养液(methyl cellulose medium)直接加入各孔 中，培养2
‑
2.5天。利用4％三聚甲醛在37℃固定细胞1小时，而后将初级抗 体(抗ns1单株抗体33d2加上抗denv血清型1
‑
4型抗体，配制于0.5％tritonx
‑
100溶液中)加入各孔中，于4℃染色至隔夜。利用fitc
‑
共轭的山羊抗小 鼠igg将病毒病灶(virus foci)染色，并利用荧光显微镜观察。
[0100]
统计分析
[0101]
数值以平均值
±
sd表示。所有数值利用prism软件(graphpad,san diego, ca)分析。出血时间及病毒力价利用单因子变异数分析(one
‑
way anova)。补 体依赖型细胞溶解分析则利用双因子变异数分析(two
‑
way anova)。统计显著 性设定为p<0.05。
[0102]
结果
[0103]
利用cediii
‑
ns1δc重组蛋白免疫，可诱导抗体对cedii及ns1δc蛋白专 一性的反应
[0104]
用于此实施例的蛋白图式包括cediii、ns1δc、dj ns1以及线性融合的 cediii
‑
ns1δc重组蛋白(如图9a所示)。利用cediii
‑
ns1δc、dj ns1或dj ns1 加上cediii，并混合铝盐作为佐剂，皮下免疫6至8周龄的c3h/hen小鼠(如 图9b所示)。在牺牲小鼠后，测定抗体力价。此实施例为分别涂布cediii、 dj ns1以及ns1δc蛋白于96孔细胞培养盘，并加入小
鼠血清作为初级抗体， 再利用elisa分析，获得免疫第二次剂量及第三次剂量的抗体力价的测定结 果(如图9c所示)。
[0105]
以cediii
‑
ns1δc免疫的小鼠血清可中和四种血清型的denv
[0106]
由cediii
‑
ns1δc诱导的小鼠血清含有抗ns1δc及抗cediii抗体。因为 抗e抗体在中和denv中发挥作用，在此实施例中可用于评估以 cediii
‑
ns1δc免疫的小鼠血清是否能中和四种血清型的denv。为了验证免 疫后的小鼠血清的中和能力，此实施例进行溶斑减少中和试验(prnt)。将未 免疫血清(mock serum)、以铝盐免疫的血清(alum serum)、以cediii
‑
ns1δc免 疫的血清(cediii
‑
ns1δc serum)及以dj ns1免疫的血清(dj ns1 serum)经二倍 序列稀释，与denv1、denv2、denv3或denv4混合，加入12孔细胞培 养盘种入的bhk
‑
21细胞中。只有以cediii
‑
ns1δc免疫的小鼠血清的组别能 中和denv1、denv2、denv3及denv4，且具有剂量相关性，其中以1:128 稀释的血清显示可减少50％的溶斑数。然而，以dj ns1免疫的小鼠血清不能 中和任何一种血清型的denv(如图10a至图10d所示)。
[0107]
以cediii
‑
ns1δc免疫的小鼠血清可经由抗体
‑
补体介导的细胞溶解而破 坏被四种血清型denv感染的细胞
[0108]
ns1在内质网腔内经转译后修饰成双体化(dimerized)，并表现在受感染细 胞的表面。发明人先前研究显示，抗ns1δc抗体在活体外能通过补体介导的 细胞毒杀作用提供保护。因此，此实施例欲得知含有抗ns1δc抗体的 cediii
‑
ns1δc免疫的血清(cediii
‑
ns1δc serum)是否能对四种血清型denv 造成补体介导的细胞溶解。为此，此实施例进行抗体依赖型补体介导的细胞毒 杀分析。将hmec
‑
1细胞种入96孔细胞培养盘，以denv1、denv2、denv3 或denv4感染细胞。然后，将未免疫小鼠血清(mock serum)、以铝盐免疫的 血清(alum serum)、以cediii
‑
ns1δc混合铝盐免疫的血清(cediii
‑
ns1δc serum) 或以dj ns1混合铝盐免疫的血清(dj ns1 serum)以1：200倍稀释后，在存在 或不存在补体下，与细胞培养。通过检测释放出的乳酸脱氢酶(ldh)，测定细 胞溶解(cytolysis)。相较于其他组别，以cediii
‑
ns1δc及dj ns1免疫的小鼠 血清与补体混合后，可引起被四种不同血清型denv感染的细胞溶解(如图 11a至图11d所示)。因为ns1δc是由denv2的ns1产生的，上述结果显示 denv2 ns1δc对所有血清型denv都具有交叉保护力。
[0109]
以cediii
‑
ns1δc蛋白免疫可降低denv引起小鼠的出血时间延长
[0110]
以铝盐混合cediii
‑
ns1δc重组蛋白对c3h/hen小鼠皮下免疫三次(如图12a所示)。测定抗cediii及dj ns1的血清抗体(如图12b所示)。然后，将不 同血清型denv由静脉注射(i.v.)接种小鼠，测试cediii
‑
ns1δc蛋白的保护效 果。结果显示，相较于单独以denv或以denv混合铝盐免疫的小鼠，以 cediii
‑
ns1δc免疫的小鼠可降低由四种不同血清型denv所引起的鼠尾出血 时间(如图13a
‑
13d所示)。
[0111]
以cediii
‑
ns1δc蛋白免疫可降低小鼠血清的denv力价
[0112]
为了确认cediii
‑
ns1δc免疫对病毒复制的效果，测定小鼠血清的病毒力 价。结果显示，相较于单独以denv或以denv混合铝盐免疫的小鼠，以 cediii
‑
ns1δc蛋白免疫的小鼠，可降低由不同血清型denv感染所测到的病 毒力价(如图14a
‑
图14d所示)。
[0113]
以dj ns1及ns3免疫，可于离体与dj ns1或ns3抗原产生反应，诱 导树突状细胞及特定cd4

与cd8

t细胞的活化
[0114]
此实施例分析cd11c

淋巴结树突状细胞(cd11c

lymph node dendriticcells，
lndcs)细胞中cd40、cd80、cd86、mhc i及mhc ii的表现，以评 估免疫后树突状细胞(dendritic cell，dc)的活化。结果显示，大多的cd11c
lndcs表现mhc第i型，相较于单独以铝盐、单独以dj ns1以及单独以ns3 免疫的其他组别，以25μg dj ns1及12.5μg ns3免疫的小鼠诱导的lndcs， 可表现出显著更高的mhc第i型。单独以dj ns1或单独以ns3免疫的小鼠， 表现mhc第ii型的cd11c

lndcs会增加；虽不具统计显著性，但在结合 dj ns1加上ns3免疫的小鼠中有增加的趋势。虽不具统计显著性，但单独以 dj ns1、单独以ns3、或以dj ns1加上ns3主动免疫的小鼠，在cd11c

lndcs 中诱导cd40的表现有增加的趋势。相较于第21天的pbs免疫控制组，单独 以dj ns1、单独以ns3、或结合dj ns1加上ns3的主动免疫组，其cd11c
lndcs的cd80表现皆有显著增加。相较于单独以铝盐免疫组及pbs免疫控 制组，只有结合dj ns1加上ns3的主动免疫组增加cd11c

lndcs的cd86 的表现具有统计显著性。故此，由于检测到表现协同刺激受体(co
‑
stimulatoryreceptors)的dcs增加，这些结果指出dj ns1加上ns3主动免疫能诱导dc 活化(数据未呈现)。
[0115]
为了评估dj ns1与ns3是否能诱导抗原专一性t细胞反应，从被免疫的 小鼠收集淋巴结细胞，并利用5μg/ml的dj ns1或ns3蛋白再刺激3天。对 所有组别施予抗cd3与抗cd28抗体，以部分仿真tcr讯息并放大反应。相 较于单独以铝盐或pbs控制组，单独以dj ns1或以dj ns1加上ns3主动免 疫的小鼠，可对dj ns1抗原的刺激产生反应，并显著诱导cd4

t细胞活化(如 图15a所示)。相较于其他组别，只有以dj ns1加上ns3主动免疫的小鼠可 对ns3抗原的刺激产生反应，并显著诱导cd4

t细胞的活化(如图15b所示)。 相较于其他组别，以dj ns1加上ns3主动免疫的小鼠亦可对dj ns1抗原的 刺激(如图15c所示)及对ns3抗原的刺激(如图15d所示)产生反应，并显著诱 导cd8

t细胞的活化。因此，以dj ns1加上ns3主动免疫能对dj ns1或 ns3抗原的刺激产生反应，并同时诱导cd4

与cd8

t细胞活化。
[0116]
以dj ns1及ns3主动免疫可诱导专一性ctl反应
[0117]
先前研究显示，cd8

t细胞能直接有助于预防denv。在发明人先前研 究中，以dj ns1加上ns3主动免疫可诱导cd8

t细胞活化(如图15c至图 15d)。为了检测是否能诱导ctl反应，此实施例从被免疫的小鼠分离出淋巴 结细胞，以dj ns1或ns3蛋白再刺激后，与表现dj ns1或ns3的l929细 胞(作为目标)共培养4小时(如图16a所示)。为了产生表现ns3的l929细胞， 此实施例建立表现野生型ns2b3或蛋白水解不活化突变型ns2b3
‑
s135a (rodriguez
‑
madoz et al.,2015)的l929细胞。由于表现ns2b3
‑
s135a的l929 细胞的表现量较佳(数据未呈现)，就以该细胞作为目标细胞。结果显示，只有 从以dj ns1加上ns3免疫的小鼠取得的ctls能溶解表现ns1的l929细胞， 但相较于其他组别并未具有统计显著性(如图16b所示)。另一方面，单独以 ns3免疫或以dj ns1加上ns3免疫的小鼠取得的ctls能显著溶解表现ns3 的l929细胞(如图16c所示)。
[0118]
此外，为了证明对目标细胞的ctl活性，此实施例更直接检测作用细胞 (effector cells)的细胞毒杀活性。cd8

t细胞内的细胞毒杀性颗粒的脂双层含 有溶酶体相关的膜醣蛋白(lysosomal
‑
associated membrane glycoproteins， lamps)，包括cd107a(lamp
‑
1)；因此，ctl去颗粒化(degranulation)造成细 胞表面累积并暴露出cd107a。在tcr刺激后，活化的cd8

t细胞会快速发 生去颗粒化，根据这项事实，从被免疫小鼠分离出的淋巴结细胞可再以dj ns1 或ns3蛋白刺激3天，并与抗cd3与抗cd28抗体培养，以在最后的4小时 部分仿真tcr讯息。相较于单独以ns3免疫、单独以dj ns1免疫、单独以 铝盐免疫以及pbs控制
组，以dj ns1加上ns3主动免疫组可对dj ns1(图 17a)与ns3(图17b)的刺激产生反应，显著增加cd8

t细胞表面cd107a的 表现量。相较于单独以铝盐免疫以及pbs控制组，以ns3免疫的小鼠可对ns3 的刺激产生反应，显著增加其cd8

t细胞表面cd107a的表现量，但低于以 dj ns1加上ns3免疫的小鼠cd8

t细胞表面的cd107a表现量(如图17b所 示)。由图16a至17b的结果显示，以dj ns1加上ns3主动免疫能诱导对 抗原专一性的ctl反应。
[0119]
以dj ns1加上ns3主动免疫提供抗denv感染的保护效果
[0120]
接下来，此实施例建立denv感染模式，借此评估以dj ns1加上ns3 主动免疫提供的保护效果，结果如图18a所示。
[0121]
发明人先前的研究证实以高力价denv接种小鼠可以产生例如出血时间 延长及局部出血的病征(wan et al.,2014)。因此，此实施例通过判断测定denv 引起的出血时间延长，借此评估以dj ns1加上ns3主动免疫提供的保护效果。 结果显示，不论单独感染denv或结合铝盐感染，在感染48小时后，皆能引 起小鼠的出血时间延长。相较于单独感染denv的组别，以dj ns1、ns3、 或dj ns1加上ns3主动免疫，则显著降低denv引起小鼠的出血时间延长(如 图18b所示)。
[0122]
此实施例在第19天测定病毒力价。dj ns1蛋白能诱导抗体反应，以对 denv感染的细胞引发抗体依赖型补体介导的细胞溶解(wan et al.,2017)。跟 发明人先前的发现一致，相较于单独感染denv2或铝盐控制组感染，单独以 dj ns1主动免疫即能显著降低病毒力价(如图18c所示)。相较于单独以djns1主动免疫，单独以ns3主动免疫可更显著降低病毒力价。在此实施例显 示的ns3专一性t细胞反应有助于清除病毒。以dj ns1加上ns3主动免疫 与单独以ns3主动免疫相比，二者免疫后所降低的病毒力价相当。
[0123]
这些结果指出，以dj ns1或以dj ns1加上ns3主动免疫，对于血管渗 漏可提供更好的保护。
[0124]
讨论
[0125]
以dj ns1加上ns3主动免疫对于denv感染提供保护效果
[0126]
根据上述实施例，对于抗病毒策略而言，cediii
‑
ns1δc重组蛋白可做为 次单位疫苗的候选物。以非复制型蛋白为主的次单位疫苗而言，这类疫苗被认 为是更安全的选择。
[0127]
考虑重组cediii
‑
ns1δc的结构变化可能会影响免疫疗效，以下并用 cediii与dj ns1蛋白，借此与融合蛋白进行比较。在上述实施例中，以并用 cediii(5μg)与dj ns1(20μg)对小鼠免疫，所引起对cediii与dj ns1蛋白专 一性的抗体力价较佳，且与以cediii
‑
ns1δc(25μg)对小鼠免疫引起的抗体力 价(数据未显示)相似。以下选择cediii
‑
ns1δc作为抗体策略。
[0128]
ediii对异种血清型的denv引起交叉反应抗体的能力较低，暗示这与重 症的致病机转有关(chin et al.,2007)。根据四种病毒株设计denv ediii重组 蛋白，并以denv ediii重组蛋白免疫小鼠以产生血清型专一性igg1中和抗 体，并可检测到这些抗体在带有fcγr的细胞中对denv的活性增强。以基因 工程denv2为主的表面重建型(resurfaced)ediiis(rsdiiis)蛋白的结果显示， rsdiiis会降低与抗原决定位不适合的抗体的结合，但对denv通用型中和抗 体则维持高度亲和性。cediii含有四种血清型denv的ediii的共有序列 (consensus sequence)，亦可视为潜在的次单位疫苗候选物。过去曾报导以cediii 免
疫小鼠的抗体显示具有中和所有血清型denv的能力。以cediii个别免疫 猴子也显示可提高血清里中和抗体的含量(chen et al.,2013；leng et al.,2009)。 在此实施例中，cediii重组蛋白诱导c3h/hen小鼠产生的中和抗体，不仅可 于活体外抵抗四种血清型denv，亦可于活体内保护小鼠抵御denv感染的 功效。另外也观察到，在感染denv后，相较于单独感染denv的组别，以 cediii
‑
ns1δc免疫的小鼠可降低病毒力价以及血清中可溶性ns1的含量。
[0129]
近来的研究以各种机转强调denv ns1的致病作用。因此，ns1被认为 是适合的对象物，用来对抗denv引起的致病机转。利用抗ns1 mab治疗可 逆转ns1诱导的内皮高通透性(endothelial hyperpermeability)(chen et al., 2016)。以ns1疫苗接种亦可预防由denv ns1引起的内皮通透性及血管渗漏 (beatty et al.,2015)。先前研究鉴定出denv ns1的c端区域是主要交叉反应 性的抗原决定位(cheng et al.,2009)。因此，去除c端的ns1蛋白可避免自体 免疫，被视为是较安全的次单位疫苗候选物。发明人的先前研究显示，对 ns1δc专一性的抗体具有抗体介导的补体依赖型细胞毒杀性(wan et al., 2014)。以cediii
‑
ns1δc免疫小鼠不仅能诱导抗体以破坏被四种血清型denv 感染的细胞，亦可减少由denv诱导小鼠的出血时间延长。
[0130]
虽然t细胞在denv感染疾病中确切的角色仍未确定，但在目前人类及 小鼠的研究中，很多证据支持t细胞在denv感染中扮演保护的角色 (katzelnick et al.,2017；kao 2019)。非结构性蛋白已被报导含有许多t细胞活 化的抗原决定位。ns1也被提到在活化cd4

及cd8

t细胞保护抵御denv 时扮演关键的角色。因此，未来可进一步研究cediii
‑
ns1δc蛋白的专一性t 细胞反应。并用ns1δc与ns3已尝试作为抗denv感染的疫苗策略(kao et al., 2019)。在未来，cediii
‑
ns1δc加上ns3蛋白可作为疫苗开发的候选物。由于 含有prm与e基因，但不含denv的非结构蛋白，因此不会产生 对denv ns1蛋白专一性的抗体，也不会产生对非结构蛋白专一性有效的t 细胞反应。在这些实施例中，cediii含有四种血清型denv的ediii的共有 序列，而ns1δc则是由denv2的ns1产生，这些结果显示，cediii
‑
ns1δc 对四种血清型denv都具有交叉反应性。
[0131]
基于上述结果，cediii
‑
ns1δc蛋白可诱导对外膜蛋白及ns1蛋白专一性 的高抗体反应，以中和及补体依赖型细胞溶解的功能，分别抵御denv及被 denv感染的细胞。在保护小鼠的模式中，以cediii
‑
ns1δc蛋白进行预处理， 也可以诱导小鼠产生对膜蛋白及ns1蛋白具有专一性且力价高的抗体。再者， 以cediii
‑
ns1δc免疫的组别在感染四种不同血清型的denv后，降低denv 引起的出血时间延长及小鼠血清的病毒力价。因此，cediii
‑
ns1δc蛋白是有 潜力的疫苗候选物，以抵御denv感染。以全球发病率及经济影响而言，登 革热是人类重要的蚊媒病毒疾病(bhatt et al.,2013)。尽管登革热造成全球的负 担，但对于登革热尚无特定的治疗方式或更安全有效的疫苗，目前的预防仅限 于病媒防治措施。对于开发登革热疫苗及抗病毒药物仍有一些障碍。其一就是 致病机转复杂，仍未完全解决。另一个困难则是缺少适合的动物模式(coller etal.,2011；wan et al.,2013)。近来，有几个团队生产了四价活性减毒疫苗，不过 安全性及保护效力仍有待验证。在这些实施例中，前述具体例生产了cediii
‑
ns1δc融合蛋白，以作为抗病毒策略的次单位病毒。以cediii
‑
ns1δc 重组蛋白免疫产生的抗体，有能力中和denv并破坏被denv感染的细胞。 以cediii
‑
ns1δc蛋白免疫亦可减少因denv诱导出血的趋势，也降低小鼠血 浆中可溶性ns1
的浓度。由cediii
‑
ns1δc引起的抗体的可能的模式或作用， 也许涉及中和能力以及抗体介导的补体依赖型细胞溶解。
[0132]
有几种对种型(type)及亚型(subtype)专一性的中和抗体，已定位到ediii (gromowski et al.,2007；wahala et al.,2009；guzman et al.,2010)，而且抗ediii 抗体也已被认为是对病毒感染力最强的阻断剂(gromowski et al.,2007)。抗 ediii抗体存在于原发性(primary)及续发性(secondary)denv免疫的人类血清 中。然而，在与denv结合的免疫血清中，抗ediii抗体只占有抗体总量的一 小部分(wahala et al.,2009)。ediii被认为是负责与受体结合(kuhn et al.,2002； klein et al.,2013)。暴露在病毒颗粒表面的ediii容易接触，而ediii重组蛋白 可以抑制病毒的感染力(chin et al.,2007；guzman et al.,2010；coller et al., 2011)。重要的是，ediii对异种血清型的denv引起交叉反应的抗体的潜力 较低，暗示这与重症的致病机转有关(chin et al.,2007；guzman et al.,2010)。
[0133]
在临床前开发中，有许多以ediii为主的重组次单位疫苗候选物。印度的 基因工程及生物技术国际中心发展出以毕赤酵母(pichia pastoris)表现的四价嵌 合ediii融合蛋白。四价嵌合ediii融合蛋白由denv1、denv2、denv3 及denv4的ediii功能域(domain)所组成，中间以弹性胜肽连接符相接。四 价疫苗候选物添加蒙特奈特(montanide)佐剂免疫小鼠后，结果产生中和抗体反 应，可对抗所有血清型denv。生产四价登革疫苗的成本必须合算，才能使世 界上资源匮乏的地区负担得起疫苗。为了制造出单一多价的成分，cediii含有 四种血清型denv的ediii的共有序列，会是很好的疫苗候选物(leng et al., 2009；chen et al.,2013)。以重组cediii免疫小鼠，可产生对抗所有血清型 denv的中和抗体。
[0134]
以cediii
‑
ns1δc蛋白免疫所诱导的另一群抗体，则是抗ns1δc抗体。 本案发明人已确认主要交叉反应抗原决定位在denv ns1的c端(cheng et al., 2009；chen et al.,2009,wan et al.,2008)。因此，去除c端的ns1可避免自体 免疫，是更安全的次单位疫苗候选物。其次，发明人先前研究证实，抗ns1δc 抗体具有抗体介导的补体依赖型细胞毒杀作用的能力(wan et al.,2014)。在此 实施例中，以cediii
‑
ns1δc免疫的小鼠血清，对于被四种不同血清型denv 感染的hmec
‑
1细胞，可造成细胞溶解。除了抗体介导的补体依赖型细胞毒 杀作用之外，还需要进一步确认抗ns1δc抗体协助抵御denv攻击的其他机 转，例如防止ns1引起的血液通透性。
[0135]
理想的疫苗或抗病毒药物必须能抵御四种血清型denv的任何一种，而 且没有ade的风险(wan et al.,2013)。抗denv e与抗denv prm的非中和 抗体或亚中和(sub
‑
neutralizing)抗体会与四种血清型denv交叉反应，会增进 病毒的进入及感染。denv ns1并不是病毒表面的结构蛋白，所以抗ns1抗 体不会造成ade。在此实施例中，前述具体例验证了cediii
‑
ns1δc血清可中 和所有四种血清型denv，并通过抗体介导的补体依赖型细胞溶解作用，破坏 被denv感染的hmec
‑
1细胞。为了进一步验证cediii
‑
ns1δc蛋白的保护 效力，以cediii
‑
ns1δc蛋白混合铝盐免疫后，可降低因denv感染引起的出 血时间延长，提供保护效力。
[0136]
仅含有denv的prm与e基因，没有denv ns蛋白，因此 不能产生对ns1蛋白专一性的抗体，也没有对ns蛋白专一性t细胞反应的 功效。反之，cediii
‑
ns1δc protein蛋白不仅产生中和抗体，也产生对ns1蛋 白专一性的抗体，从而能更全面抵御denv
感染。关于cediii
‑
ns1δc蛋白的 专一性t细胞反应需要更深入研究。此外，有报导指出以接种有 不良反应。cediii
‑
ns1δc蛋白是denv蛋白次单位疫苗，但并不是完整的病 毒颗粒，因此引起严重副作用的机会是远低于其他活性减毒疫苗。
[0137]
登革疫苗的价格应该要让世界上资源匮乏的地区最需要疫苗的个体能负 担得起。在此实施例中，cediii蛋白与ns1δc蛋白融合，可节省成本，并加 速蛋白纯化。其次，denv ns3引起的cd8

t细胞反应显示，可保护抵御异 型(heterotypic)denv的再度感染，故可减少ade的风险。因此，值得尝试以 cediii
‑
ns1δc加上ns3蛋白作为疫苗开发的候选物。由于在大肠杆菌中表现 的次单位疫苗缺乏糖基化，前述具体例已在哺乳动物细胞及果蝇细胞中表现上 述重组蛋白。
[0138]
图9a至图18c的结果摘录于表2。关于抑制病毒力价、减少sns1含量 以及降低出血时间延长，cediii
‑
ns1δc融合蛋白能提供的免疫保护力优于或 类似于重组蛋白dj ns1与ns3的混合物。
[0139]
表2
[0140][0141]
在上述具体例中，新颖的疫苗策略可并用修饰的ns1与ns3，以研究所 观察到小鼠抗denv的保护效果的机转。非复制型重组蛋白为主的次单位疫 苗被认为更安全，且更容易重新调制。为了解决次单位疫苗的共同问题，也就 是高纯化抗原的免疫原性较差，前述具体例将ns1蛋白与免疫显性的 (immunodominant)ns3蛋白结合。结果显示，ns3蛋白可协同诱导更有效的免 疫反应，包括不仅产生ns3专一性的ctl反应，更可促进ns1专一性的t 细胞反应及抗体力价。相较于单独以ns1免疫或单独以ns3免疫，以dj ns1 加上ns3主动免疫的免疫反应及保护力较佳(如图19所示)。
[0142]
利用frnt的活体外分析以及利用鼠尾出血时间的活体内分析，判断以重 组ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf及ns1fδc
‑
ns3cf蛋白免疫抗denv感染的保护效果
[0143]
承上所述，denv ns3诱导cd8

t细胞的反应，可保护抵御异型 (heterotypic)denv的再度感染，从而减少抗体依赖型增强作用(ade)的风险。 因此，cediii、ns1δc与ns3的融合蛋白亦可评估作为疫苗发展的候选物。 如图20a至图20d所示，ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf与ns1fδc
‑
ns3cf蛋白利用哺 乳动物细胞293f(如表3所示)及果蝇细胞s2(如表4所示)表现。如图21a及 图22a所示，将25μg的ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf或ns1fδc
‑
ns3cf蛋白与铝盐 作为佐剂，对c3h/hen小鼠皮下注射(s.c.)免疫三次。在第二次及第三次免疫 后，收集小鼠血清，检测抗dj ns1、ns3及cediii的抗体力价(如表3及表4 所示)。在对小鼠第三次免疫后，
ns1fδc
‑
ns3cf融合蛋白能刺激的抗体力价， 高于ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf融合蛋白。
[0144]
表3
[0145][0146]
表4
[0147][0148]
进行病灶减少中和测试(focus reduction neutralization test，frnt)，以验证 免疫小鼠血清的中和能力。将稀释10倍的未免疫血清(mock serum)、单独以铝 盐免疫的血清、以ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf免疫的血清及以ns1fδc
‑
ns3cf免疫 的血清，与denv混合后，加入种于96孔细胞培养盘的bhk
‑
21细胞中。以 ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf免疫的小鼠血清可中和denv，但以ns1fδc
‑
ns3cf免 疫的血清、以铝盐免疫的血清或未免疫控制血清(mock control serum)则否(如图 21b与图22b所示)。
[0149]
ns1表现于受感染细胞表面。发明人欲得知以ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf与以 ns1fδc
‑
ns3cf免疫的含有抗ns1δc抗体的小鼠血清是否能对被denv感染 的细胞造成补体介导的细胞溶解。将huh
‑
7细胞种入96孔细胞培养盘，以 denv2感染。接下来，利用1:20稀释的未免疫血清、单独以铝盐免疫的血清、 以ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf免疫的血清及以ns1fδc
‑
ns3cf免疫的血清，分别混 合或不混合补体，借此感染细胞。由释放出的乳酸脱氢酶(ldh)，检测细胞溶 解。相较于其他组别，与补体混合的以ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf免疫的小鼠血清 与以ns1fδc
‑
ns3cf免疫的血清，二者皆可对被denv感染的细胞造成细胞溶 解(如图21c及图22c所示)。
[0150]
之后，发明人欲检测经静脉注射(i.v.)接种denv的小鼠，再以 ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf及ns1fδc
‑
ns3cf蛋白免疫后提供的保护效力。结果显 示，相较于单独感染denv或denv加上铝盐感染的组别，以 ns1fδc
‑
cediii
‑
ns3cf及ns1fδc
‑
ns3cf蛋白免疫小鼠，可降低由denv引起 的鼠尾出血时间(如图21d与图22d所示)。
[0151]
先前研究显示，以产生ifn
‑
γ为主的th1细胞(th1
‑
biased)的反应，与较 不严重的继发性denv感染有关，而t细胞产生的tnfα则与较严重的感染 有关。其他研究已确认denv2 ns3重组蛋白会诱导ifn
‑
γ/tnfα较高量的th1 反应。然而，先前临床研究证实，强烈的t细胞反应与登革出血热(dhf)相关， 特别是与抗ns3有关。这项差异需要进一步调查。在发明人的研究中，以djns1加上ns3主动免疫，针对dj ns1刺激的反应，可诱导cd8

t细胞的表 面上表现出cd107a，显示并用dj ns1与ns3可促使针对dj ns1的细胞毒 杀作用。与ctl分析的结果一致，以dj ns1加上ns3主动免疫可诱导针对 表现dj ns1的l929细胞的细胞毒杀作用，而非针对只表现ns3的l929细 胞。先前研究指出，ifn
‑
γ与cd107a表现的同时，连同新合成的穿孔素(perforin) 蛋白，可促进抗原专一性的cd8

t细胞的细胞毒杀性。然而，细胞毒杀作用 详细的机转仍有待厘清。
[0152]
由于以ns3主动免疫也会诱导较高力价的抗ns3 igm以及igg，前述具 体例不能排除抗ns3抗体在此感染模式中可能扮演的角色。先前研究显示， 由抗体直接对抗ns3可产生保护效果。虽然抗ns3抗体并不是中和抗体，但 可在原发性与继发性denv感染的病患血清中检测到抗ns3抗体，因此抗ns3 抗体的作用尚待进一步研究。
[0153]
感染denv的临床表征，可从无症状、典型登革热到严重危及生命的出 血性登革热(dhf)，其主要特征在于血管渗漏增加，而导致出血、低血容量症 (hypovolemia)、低血压甚至休克症候群(shock syndrome)。在denv感染模式 中，小鼠呈现病毒血症、出血时间延长、血管病变及出血。出血时间延长可能 会反应出凝血异常，包括血小板减少症(thrombocytopenia)及凝血系统受到破 坏。在成人，血小板的数量与denv感染的出血表现具有显著相关性。在denv 感染过程中，尽管已提出一些假说，但血小板减少症与出血所涉及的机转并不 完全清楚。在上述denv感染模式中，不论以dj ns1或ns3主动免疫，皆 可缩短denv有关的出血时间延长(如图18b所示)。dj ns1诱导的ns1中和 抗体可直接阻断sns1的致病机转(数据未显示)，亦可与抗ns1抗体对denv 感染的细胞引起补体介导的细胞溶解(wan et al.,2017)。另一方面，以ns3主 动免疫可诱导ns3专一性的ctl，降低血清中病毒力价及sns1含量，从而使 出血时间延长得以缩短。综言之，以dj ns1加上ns3主动免疫能通过多重机 转，显著缩短denv造成的出血时间延长。
[0154]
血管渗漏及出血的致病机转及防御是很复杂的。sns1可引导补体攻击内 皮细胞
并诱导内皮细胞凋亡(amorimetal.,2014)。近来研究显示，sns1可结合至tlr4，促使细胞释放促炎细胞激素，导致血管渗漏(modhiranetal.,2015)。sns1也显示可活化tlr2与tlr6，使得促炎细胞激素的生成量增加(chenetal.,2015)。此外，由denv或ns1感染诱导的巨噬细胞迁移抑制因子，可通过自噬(autophagy)加强denv复制，亦可通过破坏人类及小鼠的内皮细胞紧密连接，以促使血管渗漏(chenetal.,2018；chuangetal.,2011；chenetal.,2016)。ns1亦可直接破坏内皮糖萼(glycocalyx)，导致通透性增高(hyperpermeability)(puerta
‑
guardoetal.,2016；chenetal.,2018)。因此，sns1可以是直接或间接导致血管渗漏及出血的主要因子。如结果所示，单独以djns1主动免疫或以djns1加上ns3主动免疫，可显著避免denv相关的血管通透性改变。反之，单独以ns3主动免疫无法避免血管变化。这些结果突显出ns1中和抗体在预防血管渗漏及出血中扮演重要的角色。
[0155]
根据临床观察，登革疾病在续发性异型感染中较为严重，任何成功的疫苗需要同时诱导出对四种denv血清型具保护性及持续性的免疫反应，以避免ade(pangetal.,2017)。以djns1加上ns3的疫苗候选物不会引起ade。其次，前述具体例已证实以djns1加上ns3主动免疫可诱导专一性cd8

t细胞反应，近来显示能抵御异型denv再感染。在兹卡病毒(zikavirus，zikv)感染大流行之后，一些研究显示，先前感染过denv，再感染zikv后，denv专一性抗体会引起ade。另一方面，另一实施例证实，五株denv
‑
抗原表位专一性cd8

t细胞可提供交叉保护，以抵抗后续zikv感染(wenetal.,2017)。候选疫苗ns3成分含有五种抗原表位之一者，其可介导交叉保护抵御后续zikv感染，且可避免zikv的ade。然而，疫苗候选物提供对zikv感染的交叉保护力，则需要进一步研究。
[0156]
综言之，本发明揭露一种新颖的denv疫苗策略，其结合cediii
‑
ns1δc融合蛋白以及ns3蛋白，加强对登革病毒攻击及相关病理反应的保护。
[0157]
虽然本发明已以数个特定实施例揭露如上，但可对前述揭露内容进行各种润饰、各种更动及替换，而且应可理解的是，在不脱离本发明的精神和范围内，某些情况将采用本发明实施例的某些特征但不对应使用其他特征。因此，本发明的精神和权利要求范围不应限于以上例示实施例所述。
[0158]
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