用于增肌减脂和推迟老化的阿扎伊尔果发酵物的制作方法

1.本发明涉及一种阿扎伊尔果发酵物，特别是涉及一种以阿扎伊尔果发酵物制备具有抑制淀粉酶活性、促进脂肪代谢和推迟老化的组合物的用途。


背景技术：

2.由微生物发酵的食品具有更易于消化、香味增加、储藏时间提升等优势。例如：泡菜、纳豆、水果醋等等都是广受欢迎的发酵类食品。饮品界中，发酵饮品愈来愈受到消费者的喜爱。发酵饮品常以乳品、蔬菜、水果、豆类等为原料基底，再经由不同种类的微生物作用而制得。
3.阿扎伊尔果(学名：euterpe oleracea)又称巴西莓，为棕榈科花椰属物种，是一种原产于巴西亚马逊地区的棕榈科植物，其果实类似蓝莓，可食用。成年阿扎伊尔果的高度可超过25米，叶可长3米。阿扎伊尔果的棕榈叶可制成帽子、垫子、或篮子，因其树干具抗虫特性，树枝可用于建筑。


技术实现要素：

4.在一些实施例中，一种阿扎伊尔果发酵物用以制备减重的组合物的用途，其中所述阿扎伊尔果发酵液是由一阿扎伊尔果浸提液经多个菌种发酵后所制得，多个菌种包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。在一些实施例中，所述阿扎伊尔果发酵物系通过减少个体淀粉之吸收来达到所述减重的功效。
5.在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物具有减少一个体淀粉吸收的能力。
6.在一些实施例中，一种阿扎伊尔果发酵物用以制备抑制淀粉酶活性的组合物的用途，其中所述阿扎伊尔果发酵液是由一阿扎伊尔果浸提液经多个菌种发酵后所制得，多个菌种包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
7.在一些实施例中，一种阿扎伊尔果发酵物用以制备抑制葡萄糖苷酶活性的组合物的用途，其中所述阿扎伊尔果发酵液是由一阿扎伊尔果浸提液经多个菌种发酵后所制得，多个菌种包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
8.在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物具有抑制淀粉酶活性的能力。
9.在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物具有抑制葡萄糖苷酶活性之能力。
10.在一些实施例中，一种阿扎伊尔果发酵物用以制备促进脂肪分解的组合物的用途，其中所述阿扎伊尔果发酵液是由一阿扎伊尔果浸提液经多个菌种发酵后所制得，多个菌种包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
11.在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物具有促进脂肪分解的能力。
12.在一些实施例中，一种阿扎伊尔果发酵物用以制备提升肌肉生长的组合物的用途，其中所述阿扎伊尔果发酵液是由一阿扎伊尔果浸提液经多个菌种发酵后所制得，多个菌种包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
13.在一些实施例中，一种阿扎伊尔果发酵物用以制备促进肌纤维增生的组合物之用
途，其中所述阿扎伊尔果发酵液是由一阿扎伊尔果浸提液经多个菌种发酵后所制得，多个菌种包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
14.在一些实施例中，一种阿扎伊尔果发酵物用以制备抗氧化的组合物之用途，其中所述阿扎伊尔果发酵液是由一阿扎伊尔果浸提液经多个菌种发酵后所制得，多个菌种包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。在一些实施例中，所述阿扎伊尔果发酵物系通过减少细胞内自由基之含量以达到所述抗氧化。在一些实施例中，所述阿扎伊尔果发酵物细通过提升细胞内谷胱甘肽(glutathione，以下简称：gsh)合成量以达到所述抗氧化之功效。
15.在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物具有提升以下基因中至少一基因的表现量的能力：krt1基因、krt10基因及krt14基因。
16.在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物具有提升肌肤保湿能力之能力。
17.在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物的多酚含量至少为291μg/ml。
18.在一些实施例中，阿扎伊尔果浸提液是由阿扎伊尔果基液在50℃
‑
100℃下静置0.5小时
‑
1.5小时所制得。
19.在一些实施例中，阿扎伊尔果基液包括阿扎伊尔果溶液及相对于阿扎伊尔果溶液总重10％的葡萄糖，阿扎伊尔果溶液包括1重量份的阿扎伊尔果汁及15重量份的水。
20.综上所述，根据任一实施例的阿扎伊尔果发酵物，其可用以制备减重的组合物。其中，阿扎伊尔果发酵物是将阿扎伊尔果浸提液以多个菌种发酵所得之。在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物的多酚含量至少为291μg/ml。在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物可借由抑制淀粉酶活性或葡萄糖苷酶，降低受体吸收淀粉或葡萄糖之能力，进而使受体体重降低。在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物可借由分解受体细胞内脂肪以达到减脂或减重之功效。在一些实施例中，阿扎伊尔果酵素可分解受体细胞内脂肪以达到减脂或减重之功效。
21.根据任一实施例的阿扎伊尔果发酵物，其可用以制备提升肌肉增生的组合物。根据任一实施例的阿扎伊尔果发酵物，其可用以制备提升细胞抗氧化能力的组合物。在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物可借由减少受体细胞内自由基之含量、或提升细胞合成gsh之能力以达到所述抗氧化之提升。
22.根据任一实施例的阿扎伊尔果发酵物，其可用以制备提升肌肤保湿能力的组合物。在一些实施例中，阿扎伊尔果酵素可提升保湿相关基因之基因表现量。在一些实施例中，保湿相关基因为krt1基因、krt10基因及/或krt14基因。
23.以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。
附图说明
24.图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着。
25.图1是阿扎伊尔果发酵物中与阿扎伊尔果浸提液的总多酚含量比较图；
26.图2是抑制淀粉酶活性的实验结果图；
27.图3是抑制葡萄糖苷酶活性的实验结果图；
28.图4是细胞内脂肪相对堆积的实验结果图；
29.图5是骨骼肌细胞相对增生活性的实验结果图；
30.图6是细胞内自由基含量的实验结果图；
31.图7是细胞内gsh合成量的实验结果图；以及
32.图8是保湿相关基因表现量的实验结果图。
具体实施方式
33.以下将描述本案的部分具体实施态样。在不背离本案精神下，本案尚可以多种不同形式之态样来实践，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。
34.本案使用excel软件进行统计分析。数据以平均值
±
标准偏差(sd)表示，各组之间的差异以学生t检验(student’s t
‑
test)进行分析。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着。
35.本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。
36.于下列实施方式的说明中，除非另有相关说明，则「％」符号是指重量百分比。
37.在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物是由阿扎伊尔果浸提液经过多个菌种发酵所制得。举例来说，多个菌种包括酵母菌(yeast)、乳酸杆菌(lactobacillus)及醋酸菌(acetobacter aceti)。
38.在一些实施例中，阿扎伊尔果浸提液可以以阿扎伊尔果(euterpe oleracea)之果汁、水及葡萄糖来制备。举例来说，阿扎伊尔果浸提液可以以阿扎伊尔果基液经浸提程序后所得，而阿扎伊尔果基液可由阿扎伊尔果溶液及相对于所述阿扎伊尔果溶液10％的葡萄糖混合而成。在一些实施例中，阿扎伊尔果溶液包括1重量份的阿扎伊尔果果汁、15重量份的水，而阿扎伊尔果果汁系由阿扎伊尔果果实粗碎汁液而成。
39.在一些实施例中，将阿扎伊尔果果汁及水混合以形成阿扎伊尔果溶液。接着，于阿扎伊尔果溶液中加入相对阿扎伊尔果溶液总重10％的葡萄糖，以得到阿扎伊尔果基液。并且，将阿扎伊尔果基液进行浸提程序以得到阿扎伊尔果浸提液。于此，由于进行浸提程序前，阿扎伊尔果基液中的葡萄糖为完全溶解或未完全溶解。因此，通过浸提程序有助于将阿扎伊尔果基液内的葡萄糖完全溶解。
40.在一些实施例中，将阿扎伊尔果及水混合以形成阿扎伊尔果溶液后进行浸提程序，并于浸提程序后加入葡萄糖以形成阿扎伊尔果浸提液。于此，先将阿扎伊尔果溶液先行进行浸提程序，有助于阿扎伊尔果溶液中的阿扎伊尔果内的有效成分释出。
41.在一些实施例中，浸提程序为于50℃
‑
100℃下静置0.5小时
‑
1.5小时。举例来说，浸提程序系指将阿扎伊尔果基液或阿扎伊尔果溶液维持在95℃并静置1小时。
42.在一些实施例中，阿扎伊尔果浸提液的糖度为9
°
bx～10
°
bx。于此，足够的糖度可以确保后续发酵的顺利进行，并使菌种有足够的养分生长。
43.接着，加入多个菌种至阿扎伊尔果浸提液中进行发酵7～15.5日以得到阿扎伊尔果发酵物。其中，多个菌种包括0.01％～0.5％的酵母菌、0.01％～0.25％的乳酸菌及3～10％的醋酸菌(acetobacter aceti)。在一些实施例中，于发酵前不滤除阿扎伊尔果浸提液中的固形物(即，进行浸提程序后的阿扎伊尔果)。换言之，是直接将菌种加入阿扎伊尔果浸提液进行发酵，借以利用菌种进一步提取固形物中的活性成分。
44.在一些实施例中，酵母菌可以是市售的啤酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。举例而言，向财团法人食品工作发展研究所所采购寄存编号bcrc20271(国际寄存
atcc26602)菌株的啤酒酵母。
45.在一些实施例中，乳酸菌可以为市售的胚芽乳酸杆菌(lactobacillus plantarum)、市售的嗜热链球菌(streptococcus thermophiles)或植物乳杆菌。举例而言，采用寄存编号bcrc910805(国际寄存dsm33108)菌株的胚芽乳酸杆菌tci028或寄存编号bcrt910760(国际寄存dsm32451)菌株的胚芽乳酸杆菌tci378。再举例而言，采用寄存编号bcrc910636(国际寄存dsm28121)菌株的嗜热链球菌tci633。在一较佳实施例中，采用寄存编号bcrc910983(国际寄存dsm33504)菌株的植物乳杆菌tci405(lactobacillus plantarum tci405)。
46.在一些实施例中，醋酸菌可以为向美国菌种中心(american type culture collection,atcc)采购寄存编号atcc15973(中国台湾寄存编号bcrc11688)的醋酸菌。
47.在一些实施例中，于阿扎伊尔果浸提液中加入酵母菌后进行发酵1日～2.5日后形成第一初发酵液。基此，通过先添加酵母菌至阿扎伊尔果浸提液中，可于酵母菌发酵过程中产生酒精，并有利于提取出阿扎伊尔果内不同的有效成份。在一些实施例中，第一初发酵液的酸碱值(ph值)小于4，且其糖度约为9
°
bx。
48.加入乳酸菌至第一初发酵液后进行发酵1日～3日后形成第二初发酵液。基此，通过添加乳酸菌至第一初发酵液中可使其内的葡萄糖被进一步消耗而降低糖度，并产生乳酸以降低第一初发酵液的ph值。并且，降低ph值有利于进一步提取出阿扎伊尔果内其他不同的有效成分。在一些实施例中，第二初发酵液的ph值小于3.5，且其糖度约为6
°
bx。
49.加入醋酸菌至第二初发酵液后进行发酵3日～10日后形成第三初发酵液。基此，通过添加醋酸菌至第二初发酵液可使其内的酒精被消耗，并一步降低葡萄糖的含量。在一些实施例中，第三初发酵液的ph值小于3.5，且其糖度为约为3
°
bx。
50.在一些实施例中，将第三初发酵液过滤并浓缩以得到阿扎伊尔果发酵物。举例来说，过滤方式可以是以200mesh过滤，且浓缩方式可以采取在60℃下的减压浓缩。于此，阿扎伊尔果发酵物的ph值小于3.5。
51.在一些实施例中，添加寡糖至阿扎伊尔果发酵物以使其糖度达到40
°
bx以形成阿扎伊尔果发酵饮品。于此，寡糖系指由3个～10个单醣分子聚合而成的低聚糖。其中，寡糖可为果寡糖、半乳寡糖、木寡糖、异麦芽寡糖等。在一些实施例中，所添加的寡糖可为含40％～70％异麦芽寡糖的寡糖溶液。
52.在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物具有抑制淀粉酶活性之能力。在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物具有抑制葡萄糖苷酶活性之能力。
53.在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物具有促进脂肪分解之能力。
54.在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物具有提升肌纤维增生量之能力。
55.在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物具有减少细胞内自由基之能力。
56.在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物具有促进gsh合成量之能力。
57.在一些实施例中，抗氧化系指减缓或防止氧化作用。而氧化系是一种使电子自物质转移至氧化剂的化学反应，过程中可生成自由基，进而启动链反应。当链反应发生于细胞中，细胞易受到破坏或凋亡。在一些实施例中，阿扎伊尔果发酵物能去除自由基，终止连锁反应并且抑制其它氧化反应。在一些实施例中，自由基之产生系因为光照、化学物质、或生物体自然衰老之过程中所产生。在一些实施例中，前述化学物质包含醣化终产物。
agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。关于选用之载剂的种类与数量是落在熟习此项技术之人士的专业素养与例行技术范畴内。在一些实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,pbs)、或含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。
67.在一些实施例中，前述之任一组合物可为食用产品。换言之，食用产品包含特定含量的阿扎伊尔果发酵物。在一些实施例中，食用产品可为一般食品、保健食品或膳食补充品。
68.在一些实施例中，前述之食用产品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于口服的剂型。在一些实施例中，前述之一般食品可为食用产品本身。在一些实施例中，一般食品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)或调味料。
69.在一些实施例中，所得的阿扎伊尔果发酵物可进一步作为食品添加物(food additive)，以制得含有阿扎伊尔果发酵物的食品组合物。于此，能借由习知方法于原料制备时添加任一实施例的阿扎伊尔果发酵物，或是于食品的制作过程中添加任一实施例的阿扎伊尔果发酵物，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食用产品(即食品组合物)。
70.例1：阿扎伊尔果发酵物的制备
71.首先，准备1重量份的阿扎伊尔果(产地来源：巴西)及15重量份的水，并将其粉碎并混合均匀以形成阿扎伊尔果溶液。接着，加入相对于阿扎伊尔果溶液10％总重的葡萄糖，以形成阿扎伊尔果基液。并且，将阿扎伊尔果基液于95℃下静置1小时，以形成阿扎伊尔果浸提液。
72.于静置后，待阿扎伊尔果浸提液冷却后(低于38℃)加入0.1％的bcrc20271菌株之啤酒酵母，并于30℃下进行发酵1天以形成第一初发酵液。再加入0.05％的bcrc910983菌株的植物乳杆菌至第一初发酵液中，并于30℃下进行发酵1天以形成第二初发酵液。接着，加入5％的bcrc11688菌株之醋酸菌至第二初发酵液中，并于30℃下进行发酵5天以形成第三初发酵液。于此，第三初发酵液的ph值小于3.5，且其糖度为约为3
°
bx。
73.接着，以200mesh过滤第三初发酵液后，于60℃下减压浓缩，以得到本发明之阿扎伊尔果发酵物。
74.例2：总多酚含量测试
75.标准曲线绘制：
76.首先，将10mg的没食子酸(gallic acid，ga)(购自sigma，料号：g7384)溶于水中，并添加10ml的体积至量瓶中，得到1000μg/ml浓度的没食子酸溶液后，将所述溶液储存于
‑
20℃作为储备溶液。之后，将储备溶液稀释10倍至100μg/ml的浓度，而未使用完之液体则储存于
‑
20℃之环境。接着，于玻璃试管中分别配制0μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml及100μg/ml的没食子酸标准溶液，配制方式显示如下表一：
77.表一：没食子酸标准溶液配置方法
[0078][0079]
之后，添加500μl的佛萧酚试剂(folin
‑
ciocalteu’s phenol reagent)(购自merck，料号：1.09001.0100)、混合均匀并静置3分钟，接而添加400μl的7.5％碳酸钠(sodium carbonate)(sigma 31432，溶于水中)、混合均匀并反应30分钟。接着，经由涡旋(vortex)确保无气泡后取200μl的标准溶液于750nm下测量吸光值，并绘制标准曲线。
[0080]
样品总多酚定量实验：
[0081]
于此，例1所得的阿扎伊尔果发酵物为样本(实验组)，并以未经发酵程序的阿扎伊尔果浸提液作为比较组。将各组分别以水稀释20倍至1200μl并取100μl的体积至玻璃试管中，每组样品需三重复。之后，添加500μl的佛萧酚试剂、混合均匀并静置3分钟。
[0082]
接而添加400μl的7.5％碳酸钠、混合均匀并反应30分钟～1小时。再经由涡旋确保无气泡后取200μl的各组反应溶液于750nm下测量吸光值，并以内差法算出浓度后再回乘稀释倍数以取得原浓度。
[0083]
图1是本发明阿扎伊尔果酵素的总多酚含量检测数据图。由图1可见，比较组(未经发酵程序之阿扎伊尔果浸提液)之总多酚含量为217.32μg/ml。而本发明之阿扎伊尔果酵素之总多酚含量为291.12μg/ml与比较组(未经发酵程序之阿扎伊尔果浸提液)相较之下，阿扎伊尔果酵素的总多酚含量具有显着的提升。具体而言，实验组的总多酚含量提升34％。由此可知，通过多个菌种发酵后可显着提高阿扎伊尔果发酵物的总多酚含量。因此，相较于服用阿扎伊尔果浸提液，当受体服用阿扎伊尔果发酵物或以其制备的组合物时，更有助于受体增肌减脂及改善受体肌肤状态的能力。
[0084]
例3：α
‑
淀粉酶活性测试
[0085]
溶液配置：
[0086]
含有6mm氯化钠的0.02穆尔浓度(m)磷酸钠缓冲溶液(sodium phosphatebuffer)(以下简称nacl
‑
pi缓冲溶液)：将0.7356克的磷酸一氢钠(购自j.t.baker，编号3828
‑
01)、0.5492克的磷酸二氢钠(购自sigma，编号04270)及1.7532克的氯化钠(购自第一化工，编号c4b07)混合并溶于500毫升的水(h2o)中，以配置含有6mm氯化钠且酸碱值(ph)为6.3的nacl
‑
pi缓冲溶液。
[0087]
2当量浓度(n)氢氧化钠(naoh)溶液：以8克氢氧化钠(购自macron，编号7708
‑
10)溶于100毫升水中，以配置2n的氢氧化钠溶液。
[0088]
二硝基水杨酸颜色试剂(dinitrosalicylic acid color reagent，以下称终止剂)：将1克3,5
‑
二硝基水杨酸(购自sigma，编号d0550)溶入50毫升去离子水中，再缓慢加入30克酒石酸钾钠(sodium potassium tartrate tetrahydrate，购自sigma，编号32312)及缓慢加入20毫升2n氢氧化钠溶液，并以去离子水定量至100毫升。于此，可得到终止剂。
[0089]
1％淀粉溶液：秤取1克淀粉(购自sigma，编号s9765)至100毫升nacl
‑
pi缓冲溶液并缓慢加热使淀粉完全溶解于nacl
‑
pi缓冲溶液中，待加热后的含有淀粉的nacl
‑
pi缓冲溶液降至室温后，以水定量至100毫升。于此，可得到1％淀粉溶液。
[0090]
α
‑
淀粉酶(α
‑
amylase)溶液(5单位/毫升)：将0.0096克α
‑
淀粉酶(购自sigma，编号a3176)溶解于25毫升nacl
‑
pi缓冲溶液。于此，可得到每毫升5单位的α
‑
淀粉分解酶溶液。
[0091]
测试流程：
[0092]
于此，以例1之方法所制备之阿扎伊尔果发酵物与阿扎伊尔果浸提液作为测试样品，其中阿扎伊尔果发酵物为实验组，阿扎伊尔果浸提液为比较组，而将淀粉溶液、α
‑
淀粉酶及测试样品混合后，在反应时间点为0分钟时为空白组，其系代表α
‑
淀粉酶并无与淀粉产生反应的情况，而反应时间点10分钟时为实验组(以阿扎伊尔果发酵物为测试样品的组别)与比较组(以阿扎伊尔果浸提液为测试样品的组别)，其系代表α
‑
淀粉酶、淀粉与测试样品已进行10分钟反应的。于此。实验进行三次重复。
[0093]
流程如下，取200μl的测试样品至离心管中，接着于离心管中加入200μl的α
‑
淀粉酶溶液(5单位/毫升)，并进行震荡以将离心管内的测试样品及α
‑
淀粉酶溶液混合均匀以形成待反应溶液。接着，将离心管置于25℃环境下反应10分钟。
[0094]
将反应起始点(0分钟)的空白组加入400μl的终止剂至离心管中与待反应溶液混合均匀，再加入200μl的1％淀粉溶液并于25℃下静置10分钟以形成未反应溶液。换言之，在反应起始点(0分钟)的空白组别中，α
‑
淀粉酶不会与淀粉产生反应。
[0095]
将反应终止点(10分钟)的实验组与比较组别加入200μl的1％淀粉溶液至离心管中，使1％淀粉溶液与待反应溶液混合均匀以形成混合溶液。将装有混合溶液的离心管置于25℃下反应10分钟以形成反应溶液，然后再加入400μl的终止剂与反应溶液混合均匀，以停止淀粉与α
‑
淀粉酶的反应。
[0096]
接着，将所有组别置于沸水(100℃)中反应5分钟，并冷却至室温(25℃)，以形成待测溶液。从各组别分别取出150μl待测溶液与850μl水混合以稀释待测溶液。接着取200μl稀释后的待测溶液至96孔盘中，并测量其在540nm下之吸光值。
[0097]
实验结果：
[0098]
根据下列公式计算实验组相对于空白组的淀粉酶活性，如图2所示。换言之，是将空白组的淀粉酶活性视为100％，来计算实验组的淀粉酶活性。
[0099][0100]
其中，α
‑
amylase活性代表淀粉酶活性；a540nm(sample 10min
‑
sample0min)代表反应终止点(10分钟)的待测溶液在540nm下之吸光值与反应起始点(0分钟)的待测溶液在540nm下之吸光值之间的差值，且此测试组别为实验组。a540nm(control 10min
‑
control 0min)代表反应终止点(10分钟)的空白组在540nm下之吸光值与反应起始点(0分钟)的空白组在540nm下之吸光值之间的差值。
[0101]
请参阅图2。相较于空白组(即其淀粉酶活性视为100％)，比较组的淀粉酶活性为92％，而实验组的淀粉酶活性为56％。换言之，实验组的淀粉酶活性除了相对于空白组明显下降44％之外，亦与比较组(即未经发酵程序之阿扎伊尔果浸提液)相比，下降36％。由此可知，本发明之阿扎伊尔果发酵物对于淀粉酶的活性具有很高的抑制能力，进而能用于制备抑制淀粉酶活性、减重、减少淀粉吸收等组合物。
[0102]
例4:α
‑
葡萄糖苷酶活性测试
[0103]
溶液配置：
[0104]
0.1穆尔浓度(m)磷酸钠缓冲溶液(sodium phosphate buffer，以下简称pi缓冲溶液)：将4.7283克的磷酸一氢钠(购自j.t.baker，编号3828
‑
01)及2.0028克的磷酸二氢钠(购自sigma，编号04270)混合并溶于400毫升的逆渗透水(ro水)中，并以定量瓶定量至500毫升，以得到酸碱值(ph)为7.0的pi缓冲溶液。
[0105]
2.5mm对硝基苯酚
‑
β
‑
d葡萄糖苷(p
‑
nitrophenylβ
‑
d
‑
glucopyranoside,pnpg)：秤取0.0377克pnpg以逆渗透水(ro水)定量至100毫升。
[0106]
0.2m碳酸钠(na2co3)：秤取2.1198克碳酸钠(购自sigma，编号31432)以ro水定量至100毫升，作为葡萄糖苷酶的终止剂。
[0107]
0.2单位/毫升(units/ml)α
‑
葡萄糖苷酶(α
‑
glucosidase，购自sigma chemical co.(st.louis,mo,g5003
‑
100un))溶液：取3.85毫克的固态α
‑
葡萄糖苷酶以2.0毫升的0.1m pi缓冲溶液溶解，以得到50u/毫升之α
‑
葡萄糖苷酶原液。接着，取0.1毫升50u/毫升之α
‑
葡萄糖苷酶原液并以ro水定量至25毫升，即可得到0.2u/毫升α
‑
葡萄糖苷酶溶液。
[0108]
测试流程：
[0109]
于此，以例1所制备的阿扎伊尔果发酵物作为测试样品的组别为实验组，以例1所制备的阿扎伊尔果浸提液作为测试样品的组别为比较组，而未加入测试样品之组别为空白组。并且，各组依反应时间点分为实验组(0分钟)、比较组(0分钟)、空白组(0分钟)、实验组(15分钟)、比较组(15分钟)及空白组(15分钟)。其中，实验组(0分钟)、比较组(0分钟)及空白组(0分钟)代表葡萄糖苷酶并无与pnpg反应的组别(以下称反应起始点(0分钟))，而实验组(15分钟)、比较组(15分钟)及空白组(15分钟)代表葡萄糖苷酶与pnp进行15分钟反应的组别(以下称反应终止点(15分钟))。
[0110]
表二
[0111]
测试组别测试样品反应酵素实验组(0分钟)阿扎伊尔果发酵物pi缓冲溶液实验组(15分钟)阿扎伊尔果发酵物葡萄糖苷酶比较组(0分钟)阿扎伊尔果浸提液pi缓冲溶液比较组(15分钟)阿扎伊尔果浸提液葡萄糖苷酶空白组(0分钟)(无)pi缓冲溶液空白组(15分钟)(无)葡萄糖苷酶
[0112]
依照表二，取160μl的测试样品至96孔盘中，接着分别于各孔中加入20μl pi缓冲溶液以形成待反应溶液。
[0113]
反应起始点(0分钟)的测试组别：加入20μl的pi缓冲溶液至对应的孔中与待反应溶液混合均匀并于25℃下反应10分钟。于反应10分钟后，于每孔中加入20μl的2.5mm pnpg，并将待反应溶液、pi缓冲溶液及pnpg混合均匀后置于37℃下反应15分钟以形成0分钟组反应溶液。于0分钟组反应溶液中加入80μl终止剂。接着，于0分钟组反应溶液与终止剂混合均匀后，测量其在405nm下之吸光值。
[0114]
反应终止点(15分钟)的测试组别：将加入20μl的0.2单位/毫升α
‑
葡萄糖苷酶溶液至对应的孔中与待反应溶液混合均匀并于25℃下反应10分钟，以活化α
‑
葡萄糖苷酶。于反应10分钟后，再于每孔中加入20μl的2.5mm pnpg，并将待反应溶液、α
‑
葡萄糖苷酶溶液及pnpg混合均匀后置于37℃下反应15分钟，使活化的α
‑
葡萄糖苷酶与pnpg作用，以形成15分
钟组反应溶液。于15分钟组反应溶液中加入80μl终止剂，以中止α
‑
葡萄糖苷酶的活性。接着，于15分钟组反应溶液与终止剂混合均匀后，测量其在405nm下之吸光值。
[0115]
实验结果：
[0116]
根据下列公式计算各组的葡萄糖苷酶活性，如图3所示。换言之，是将空白组的葡萄糖苷酶活性视为100％，来计算实验组的葡萄糖苷酶活性。
[0117][0118]
其中，α
‑
glucosidase活性代表葡萄糖苷酶活性；a405nm(sample15min
‑
sample 0min)代表反应终止点(15分钟)的实验组(或空白组)在405nm下之吸光值与反应起始点(0分钟)的实验组(或比较组)在405nm下之吸光值之间的差值。a405nm(control 15min
‑
control 0min)代表反应终止点(15分钟)的空白组在405nm下之吸光值与反应起始点(0分钟)的空白组在405nm下之吸光值之间的差值。
[0119]
请参阅图3，相较于空白组(即其葡萄糖苷酶活性视为100％)，实验组的葡萄糖苷酶活性趋近于0(图示中n.d.系指no detection)。换言之，实验组的葡萄糖苷酶活性相对于空白组明显下降约100％。而实验组与比较组(即未经发酵程序的阿扎伊尔果浸提液)相比，更下降107％。由此可知，本发明之阿扎伊尔果发酵物对于葡萄糖苷酶活性的抑制能力非常高，可用于制备抑制葡萄糖苷酶活性、抑制糖类分解、减重之组合物。
[0120]
例5：抑制脂肪堆积功效试验
[0121]
脂肪细胞内以油滴(lipid droplet)的形式贮存脂肪。基此，本次试验分析染色后的油滴，以观察细胞内油滴的数量，借以确认脂肪堆积的状态。后续，再将染剂溶出并分析以作为量化的数值指标。
[0122]
本次试验采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称op9细胞)，op9细胞购自美国典型培养物保存中心(american type culture collection，)之op9细胞株(atcc crl
‑
2749)。
[0123]
实验步骤：
[0124]
首先，取24孔培养盘将每孔接种8
×
104个op9细胞及500μl培养基(medium)，培养基其中包含90％之memam(minimum essential medium alpha medium，购自gibco，美国)细胞培养液、20％之胎牛血清(fetal bovine serum，购自gibco，美国，cat#10437
‑
028)，且加入0.1％之青霉素/链霉素(penicillin
‑
streptomycin，购自gibco，美国)，在37℃下培养7天。此7天的细胞培养期间每隔3天更换培养基。7天后，以显微镜(zeiss；放大倍率400x)观察细胞内油滴形成，借以确认细胞已完全分化为脂肪细胞。
[0125]
然后，将分化完成的脂肪细胞分为三组：实验组、比较组与空白组。
[0126]
实验组：依照每孔500μl培养基含有5μl的阿扎伊尔果发酵物(以例1之方式制备而成)的比例(即，浓度为1vol％)将阿扎伊尔果发酵物添加至含分化后的培养基中，在37℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
[0127]
比较组：依照每孔500μl培养基含有5μl的阿扎伊尔果发酵物(以例1之方式制备而成)的比例(即，浓度为1vol％)将阿扎伊尔果浸提液添加至含分化后的培养基中，在37℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
[0128]
空白组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含分化后的脂肪细胞的分化
培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
[0129]
接下来，依据下列步骤进行油红o的染色。于7天细胞处理后，将培养基移除，以1ml之磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,pbs)清洗脂肪细胞两次，再加入1ml之10％甲醛并于室温下反应30分钟以固定脂肪细胞。接着移除甲醛后以1ml之pbs轻轻地清洗脂肪细胞两次，接着于每孔细胞内加入1ml之60％异丙醇，反应1分钟后，移除异丙醇并加入1ml之油红o作用溶液与脂肪细胞反应，于室温下反应1小时，接着移除与脂肪细胞作用的油红o作用溶液并迅速地以1ml之60％异丙醇进将脂肪细胞行脱色5秒钟。
[0130]
后续，将染色后的各组再依下列步骤进行油红o的定量。加入100％异丙醇于染色之细胞中，并置于振荡器上反应10分钟以溶解油滴，接着取100μl至96孔培养盘中，以测量elisa读取仪(biotek)读取各组之od510nm读值。其中，利用excel软件进行student t
‑
test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显着差异，如图5所示(图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着)。
[0131]
实验结果：
[0132]
参考图4。将空白组的脂肪油滴含量视为1(即100％)时，比较组的脂肪油滴含量为88.67％，而实验组的脂肪油滴含量为51.45％，且达统计上之显着差异。意即经由阿扎伊尔果发酵物处理后能显着地减少48.55％的脂肪堆积量，且与未经发酵程序的阿扎伊尔果浸提液相比效果更显着。此结果显示，本发明之阿扎伊尔果发酵物能有效阻断脂肪细胞的增大，以减少脂肪细胞中油滴的含量，而达到抑制脂肪堆积功效。由此可知，本发明阿扎伊尔果发酵物可用于制备减脂、减重、减少脂肪堆积、促进脂肪分解之组合物。
[0133]
例6：增加骨骼肌细胞增生实验
[0134]
为测试本发明之阿扎伊尔果发酵物对于肌肉生长之影响，于此利用细胞增殖elisa套组检测本发明之阿扎伊尔果发酵物对于骨骼肌细胞增生的影响。
[0135]
本实验所采用之系细胞为小鼠肌母细胞(skeletal muscle cells，以下简称：c2c12细胞)，购自美国典型培养物保存中心(american type culture collection，cat.crl
‑
1772)。
[0136]
试剂/材料准备：
[0137]
1. 1x dpbs：将10x dpbs(购自gibco；cat.14200
‑
075)以灭菌后的ddh2o稀释10倍。
[0138]
2. 1x胰蛋白酶：将10x胰蛋白酶(购自gibco；cat.15400
‑
054)以1x dpbs稀释10倍。
[0139]
3.培养基：dulbecco’s modified eagle’s medium(dmem)(购自gibco；cat.11965
‑
092)加入10％fbs(购自gibco；cat.10437
‑
028)和1％青霉素
‑
链霉素(购自gibco；cat.15140122)。
[0140]
4.细胞增殖elisa套组(购自roche；cat.11647229001)。
[0141]
5.brdu labeling solution(10x)：以细胞培养液稀释brdu labeling reagent(细胞增殖elisa套组内附)100倍达到最终浓度100μm。
[0142]
6.anti
‑
brdu
‑
pod stock solution(100x)：于anti
‑
brdu
‑
pod管(细胞增殖elisa套组内附)中加入1.1ml ddh2o，混和均匀(此步骤须静置10分钟使其完全溶解)。
[0143]
7.anti
‑
brdu
‑
pod working solution(1x)：以antibody dilution solution(细胞增殖elisa套组内附)稀释anti
‑
brdu
‑
pod stock solution 100倍。
[0144]
8.washing solution(1x)：以ddh2o稀释washing buffer(细胞增殖elisa套组内附)10倍。
[0145]
实验步骤：
[0146]
于96孔细胞培养盘中每孔种入5
×
103个c2c12细胞，并于37℃下培养2小时。接着，加入100μl/well的1x brdu labeling solution和每毫升培养基有10微升的测试样品(即1vol％)，于37℃下培养24小时。实验共分三组进行，其中，实验组之测试样品为例1之阿扎伊尔果发酵物；比较组之测试样品为例1中未经发酵程序之阿扎伊尔果浸提液；而空白组则不另外加入任何溶液或化合物。
[0147]
而后，去除培养液，加入200μl/well的fixdenat，于常温下处理30分钟。接着，去除上清液，用1x dpbs冲洗细胞1次。
[0148]
再去除上清液，加入100μl/well的anti
‑
brdu
‑
pod working solution，于常温下处理90分钟。接着，去除上清液，用200
‑
300μl/well的washing solution冲洗3次。同样去除上清液后，加入100μl/well的substrate solution(细胞增殖elisa套组内附)，于常温下处理5
‑
30分钟。
[0149]
加入25μl/well的1m h2so4水溶液，置于震荡器上，以300rpm震荡1分钟。最后，以分光亮度计测得o.d.450值，并以「空白组」的结果为基准，计算其他各组骨骼细胞增生的相对活性，结果示于图5。前述数据系参考细胞增殖elisa套组中之使用说明书进行计算，并使用excel软件进行统计分析，以学生t(student’s t
‑
test)检验是否达到统计学上的显着性。
[0150]
实验结果：
[0151]
请参照图5。将空白组之骨骼肌细胞量视为100％时，比较组(即未经发酵程序之阿扎伊尔果浸提液)之骨骼肌细胞数量为40.0％，而实验组(即经发酵程序之阿扎伊尔果发酵物)之骨骼肌细胞数量为170.％。由此可见，本发明之阿扎伊尔果发酵物具有增加骨骼肌细胞增生之功效，可用于制备增肌、提升肌肉密度等组合物。
[0152]
例7：细胞抗氧化能力试验
‑
抑制ros生成(双氧水处理)
[0153]
于此，以荧光探针dcfh
‑
da配合流式细胞仪，测定人类皮肤纤维母细胞ccd
‑
966sk经本发明之阿扎伊尔果发酵物处理后，其活性氧物质含量的变化。
[0154]
材料与仪器：
[0155]
1.细胞株：人类皮肤纤维母细胞ccd
‑
966sk(生物资源保存及研究中心(bcrc)，no.60153)，以下简称ccd
‑
966sk细胞。
[0156]
2.培养基：含有10vol％fbs(fetal bovine serum，购自gibco)之基础培养基。其中，基础培养基是由eagle’s最低限度基本培养基(eagle’s minimum essential medium(mem)，购自gibco，产品编号15188
‑
319)额外添加成分使其含有1mm丙酮酸钠(sodium pyruvate，购自gibco)、1.5g/l碳酸氢钠(sodium bicarbonate，购自sigma)及0.1mm非必需胺基酸(non
‑
essential amino acid solution，购自gibco)所配制而成。
[0157]
3.磷酸缓冲盐溶液(pbs溶液)：购自gibco，产品编号10437
‑
028。
[0158]
4.dcfh
‑
da溶液：将二氯二氢荧光素二乙酸酯(2,7
‑
dichloro
‑
dihydro
‑
fluorescein diacetate，dcfh
‑
da；产品编号si
‑
d6883，购自sigma)溶于二甲基亚砜
(dimethyl sulfoxide，dmso，购自sigma，产品编号si
‑
d6883
‑
50mg)以配制成5mg/ml的dcfh
‑
da溶液。
[0159]
5.流式细胞仪(flow cytometry)，bd accuri
tm c6 plus flow cytometer产品编号660517。
[0160]
6.双氧水(h2o2)：购自sigma
‑
aldrich，产品型号95299
‑
1l。
[0161]
7.胰蛋白酶(trypsin
‑
edta)：10x trypsin
‑
edta(购自gibco)以1x pbs溶液稀释10倍。
[0162]
8.本发明之阿扎伊尔果发酵物：此实验中所使用的阿扎伊尔果发酵物系以例1之方式制备而成。
[0163]
9.未经发酵程序之阿扎伊尔果浸提液：此实验中所使用的阿扎伊尔果浸提液系以例1之方式制备而成。
[0164]
实验步骤：
[0165]
实验将会分为实验组、空白组(未添加阿扎伊尔果发酵物或阿扎伊尔果浸提液、亦无经过双氧水处理的组别)、以及比较组a(未添加阿扎伊尔果发酵物或阿扎伊尔果浸提液，但经过双氧水处理的组别)、比较组b(添加阿扎伊尔果浸提液，且经过双氧水处理的组别)，以及实验组(添加阿扎伊尔果发酵物，且经过双氧水处理的组别)四组进行，各组分别进行二重复试验：
[0166]
1.将ccd
‑
966sk细胞以每孔1
×
105个的方式，接种于每孔含2ml培养基之6孔培养盘中。
[0167]
2.将培养盘置于5％co2、37℃下，培养24小时。
[0168]
3.移除培养基。
[0169]
4.加入2ml实验培养基至培养盘的各孔中，并于37℃下培养1小时。其中，实验组的实验培养基为添加有20μl的例1得到的阿扎伊尔果发酵物之2ml细胞培养基(即阿扎伊尔果发酵物占细胞培养基的体积百分比为1％)。比较组b的实验培养基为添加有20μl的例1得到的阿扎伊尔果浸提液(未经发酵程序)之2ml细胞培养基(即阿扎伊尔果浸提液占细胞培养基的体积百分比为1％)。比较组a与空白组的实验培养基均为单纯的2ml细胞培养基(即不含阿扎伊尔果发酵物或阿扎伊尔果浸提液)。
[0170]
5.添加浓度为5μg/ml的dcfh
‑
da溶液2μl于每孔中的细胞培养基，使dcfh
‑
da处理细胞15分钟。
[0171]
6.于dcfh
‑
da处理后，于实验组的实验培养基以及比较组的实验培养基分别加入h2o2，并于37℃下反应1小时。具体来说，35％wt的双氧水先稀释成100mm(将10μl的双氧水加入990μl的二次蒸馏水)，再取20μl的100mm的双氧水加入2ml的细胞培养盘中。
[0172]
7.反应后，每孔以1ml的1x pbs溶液润洗2次。
[0173]
8.将200μl胰蛋白酶加至每孔中并在暗处反应5分钟。反应后，添加6ml细胞培养基终止反应。
[0174]
9.将各孔中之细胞与细胞培养基收集至个别对应的1.5ml离心管内，并将含有细胞与培养基之离心管以400xg离心5分钟。
[0175]
10.离心后，移除上清液，并以1x pbs溶液回溶细胞沉淀物。
[0176]
11.再以400xg离心5分钟。
[0177]
12.离心后，移除上清液，于暗处以每离心管200μl的1x pbs溶液再次悬浮细胞，以得到待测细胞液。
[0178]
13.使用流式细胞仪侦测各孔的待测细胞液中dcfh
‑
da的荧光信号。进行荧光侦测之激发波长为450
‑
490nm，放射波长为510
‑
550nm。由于dcfh
‑
da进入细胞后会先被水解为dcfh(二氯二氢荧光素)，再被活性氧物质氧化为可发出绿色荧光的dcf(二氯荧光素)，经dcfh
‑
da处理之细胞的荧光强度可反映细胞内活性氧物质含量，并借此得知细胞内活性氧物质高度表现的细胞数占原细胞数的比例。因实验系进行二重复，故将各组的二重复实验之量测结果平均以取得平均值，然后以空白组的平均值为100％之相对ros的生成量，将比较组与实验组的平均值换算为相对ros的生成量，如图6所示。
[0179]
实验结果：
[0180]
如图6所示，由比较空白组、比较组a的结果可知，在经过双氧水处理后，相对ros的生成量(高荧光表现)会大幅增加(约244.1％)；其显示双氧水处理确实会导致细胞内产生活性氧物质，进而对人类皮肤纤维母细胞产生后续伤害。另一方面，根据比较组a与比较组b之结果可知，当细胞经过阿扎伊尔果浸提液处理后，ros相对生成量大幅减少。然更甚者，根据实验组的结果可知，当细胞经过阿扎伊尔果发酵物处理后，相对ros的生成量明显减少至17.8％，低于未经发酵程序之阿扎伊尔果浸提液之比较组a。由此显示本发明之阿扎伊尔果发酵物可有效减少活性氧物质在细胞内的产生或累积。换言之，发明之阿扎伊尔果发酵物可作为一种活性氧物质清除剂。亦即，发明之阿扎伊尔果发酵物可通过降低细胞内活性氧物质含量，减少细胞受到活性氧物质等所导致的氧化伤害，进而达到推迟老化等功效。
[0181]
例8：细胞抗氧化能力试验
‑
谷胱甘肽(gsh)含量检测
[0182]
实验材料：
[0183]
1.细胞株：人类周边血单核球细胞(human peripheral blood mononuclear cell，hpbmc)。
[0184]
2.培养基：x
‑
vivo10培养基(购自lonza，型号04
‑
380q)。
[0185]
3.gsh检测试剂(购自abcam，型号ab112132)。
[0186]
4.阿扎伊尔果浸提液：此实验中所使用的阿扎伊尔果浸提液是通过如上例1所获得。
[0187]
5.阿扎伊尔果发酵物：此实验中所使用的阿扎伊尔果发酵物是通过如上例1所获得。
[0188]
实验步骤：
[0189]
1.于6孔培养盘中，每孔培养基中植入2x106个人类周边血单核球细胞(于后方步骤中将略称为细胞)。
[0190]
2.于37℃培养24小时。
[0191]
3.将细胞分为三组：空白组、比较组与实验组。其中，比较组加入阿扎伊尔果浸提液，使加入阿扎伊尔果浸提液后，整体溶液中的阿扎伊尔果浸提液浓度为1vol％；实验组则加入阿扎伊尔果发酵物，使加入阿扎伊尔果发酵物后，整体溶液中的阿扎伊尔果发酵物浓度为1vol％；而空白组则不另外加入测试样品。接着，将三组细胞于37℃培养24小时。
[0192]
4.收集细胞后，用磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate
‑
buffered saline，pbs)(购自gibco)冲洗一次。
[0193]
5.重悬浮细胞(resuspend cells)于1毫升的pbs。
[0194]
6.以gsh试剂(1：1000)将细胞染色15分钟。
[0195]
7.用pbs冲洗一次后，重悬浮细胞(resuspend cells)于200微升的pbs。
[0196]
8.通过流式细胞仪(购自bd accuri，型号c6 plus)分析相对的荧光异硫氰酸盐(fitc)讯号。
[0197]
9.侦测出之数值以微软excel软件，利用student t检定分析数值间的统计显着性，其结果如图7所示。其中，相较于空白组，***表示p<0.001。
[0198]
由图7结果可知，若视空白组织gsh含量为100％，加入阿扎伊尔果浸提液的比较组的细胞，其gsh含量提升至212.5％，而加入阿扎伊尔果发酵物之实验组的细胞，gsh含量则是相较于空白组明显提升至238.3％，较未经发酵程序的阿扎伊尔果浸提液之gsh含量来得高。需特别说明的是，gsh是由麸胺酸、胱胺酸和甘胺酸所组成的三胜肽，其硫醇基(
‑
sh)与氧化还原相关，主要功能为细胞内生性抗氧化的防御，可以对抗ros的氧化伤害。因此，由图7的结果亦可证实，添加本案例1而得之阿扎伊尔果发酵物，确实可提升细胞中gsh含量，增加细胞内氧化还原的能力，以达到细胞抗氧化的功效，且其效果更胜未经发酵程序之阿扎伊尔果浸提液。
[0199]
例9：保湿相关基因试验
[0200]
此范例以rna萃取套组、反转录酶、kapa fast qpcr试剂组配合定量pcr仪，测定人类表皮角质细胞hpek
‑
50经本发明之阿扎伊尔果发酵液处理后，细胞中保湿相关基因的变化。
[0201]
材料与仪器
[0202]
1.角质细胞专用之无血清培养基(keratinocyte
‑
sfm；购自thermo，产品编号17005042)。
[0203]
2.人类表皮角质细胞(以下简称hpek
‑
50细胞或角质细胞；购自cellntec)。
[0204]
3.rna萃取试剂套组(购自geneaid公司，中国台湾，lot no.fc24015
‑
g)。
[0205]
4.反转录酶(iii reverse transcriptase)(invitrogen公司，美国，编号18080
‑
051)。
[0206]
5.测量目标基因引子，其中包含krt1基因、krt10基因及krt14基因，另包括内部空白组(tbp基因)。
[0207]
6.kapafast qpcr试剂组(购自sigma公司，美国，编号38220000000)。
[0208]
7.abi steponeplustm实时pcr系统(abi steponeplustm real
‑
time pcr system(thermo fisher scientific公司，美国))。
[0209]
8.阿扎伊尔果浸提液：此实验中所使用的阿扎伊尔果浸提液是通过如上例1所获得。
[0210]
9.阿扎伊尔果发酵物：此实验中所使用的阿扎伊尔果发酵物是通过如上例1所获得。
[0211]
实验步骤：
[0212]
细胞培养的实验流程如下：
[0213]
1.于此，培养基采用角质细胞专用之无血清培养基。
[0214]
2.首先以每孔1
×
105个细胞量培养于含有2ml上述培养液之六孔培养盘中，并在37℃下培养16小时，然后将hpek
‑
50细胞分为实验组、比较组与空白组。
[0215]
3.实验组：每毫升培养液含有10μl例1之方式制备而成之阿扎伊尔果发酵物的比例(即，浓度为1vol％)制得含发酵物的培养液，将hpek
‑
50细胞更换为含发酵物的培养液中继续培养。
[0216]
4.比较组每毫升培养液含有10μl例1之方式制备而成之阿扎伊尔果浸提液的比例(即，浓度为1vol％)制得含浸提液的培养液，将hpek
‑
50细胞更换为含浸提液的培养液中继续培养。
[0217]
5.空白组：不做任何处理，即不额外添加其他化合物至含有培养后的hpek
‑
50细胞的培养液中。
[0218]
6.实验组、比较组与空白组于培养6小时后，将培养后的实验组、比较组与空白组细胞以rna萃取试剂套组的细胞裂解液分别裂解细胞膜以形成三组的细胞溶液。
[0219]
聚合酶连锁反应的实验流程如下：
[0220]
1.使用rna萃取试剂套组分别收集三组细胞溶液内之rna。
[0221]
2.接着，每组取2000奈克(ng)所萃取出的rna为模板，借由iii反转录酶以表2中之引子(primer)黏合进行反转录作用产生相应之cdna。
[0222]
3.后续利用abi steponeplustm real
‑
time pcr system，以及kapa sybr fast将三组反转录后产物分别以表三之组合引子进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real
‑
time reverse transcription polymerase chain reaction)，以观察实验组和空白组的hpek
‑
50细胞的基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个循环。
[0223]
4.尔后，使用2
‑
δδct方法测定目标基因的相对表现量。所谓相对表现量定义为实验组之一目标基因相对于空白组或比较组之同一基因的rna表现量倍数变化。所述方法以tbp基因的循环阈值作为内部对照之参考基因的循环阈值(ct)，按照以下公式计算倍数变化：
[0224]
ct＝ct
实验组之目标基因/空白组或比较组之目标基因
‑
ct
tbp
[0225]
△
ct＝
△
ct
实验组之目标基因
‑△
ct
空白组之目标基因
[0226]
倍数变化＝2
‑
δδct平均值
[0227]
5.最终，利用excel软件之stdev公式计算标准偏差，并在excel软件中以单尾student t
‑
test分析是否具有统计上显着差异(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。其中，krt1基因对应的引子对为krt1
‑
f以及krt1
‑
r，krt10基因对应的引子对为krt10
‑
f以及krt10
‑
r，krt14基因对应的引子对为krt14
‑
f以及krt14
‑
r，tbp基因对应的引子对为tbp
‑
f以及tbp
‑
r。
[0228]
表三
[0229]
引子名称序列编号序列krt1
‑
fseq id no:1agagtggaccaactgaagagtkrt1
‑
rseq id no:2attctctgcatttgtccgcttkrt10
‑
fseq id no:3tcctacttggacaaagttcggg
krt10
‑
rseq id no:4cccctgatgtgagttgccakrt14
‑
fseq id no:5ttctgaacgagatgcgtgackrt14
‑
rseq id no:6gcagctcaatctccaggttctbp
‑
fseq id no:7tataatcccaagcggtttgctbp
‑
rseq id no:8gctggaaaacccaacttctg
[0230]
实验结果
[0231]
参照图8。图8为经本发明阿扎伊尔果发酵物(实验组)处理、经阿扎伊尔果浸提液(比较组)处理与未经本任何处理之空白组之krt1基因、krt10与krt14基因之相对表现量之直方图。(图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着)。
[0232]
由图8可知，当空白组之krt1基因、krt10基因与krt14基因表现量为100％时，比较组之krt1基因、krt10基因与krt14基因表现量分别为4220％、122％及334％，而实验组之krt1基因、krt10基因与krt14基因表现量分别为702％、185％及502％。换言之，与空白组相较之下，比较组与实验组的角质细胞中的之krt1基因、krt10基因与krt14基因均大幅提升，且实验组(经发酵制程之阿扎伊尔果发酵物)之基因表现量均各自大于比较组(未经发酵制程之阿扎伊尔果浸提液)。
[0233]
如前所述，krt1基因、krt10基因与krt14基因所转录出之蛋白质则有助于维持角质结构紧密完善、及/或能达到保护肌肤及减少肌肤水分散失之能力。
[0234]
因此，由上述图及叙述可知，本案之阿扎伊尔果发酵物可通过提升krt1基因、krt10基因及krt14基因之表现量，达到支撑肌肤的结构、防止肌肤水分过度散失、促进皮肤表皮细胞紧密排列，减少水分经由皮肤细胞间之缝隙散失之比例、增强肌肤保湿度之功效。
[0235]
综上所述，根据本发明任一实施例的阿扎伊尔果发酵物可用以制备减重、减脂、增肌及/或抗老的组合物。经多个菌种发酵的阿扎伊尔果发酵物具有较高含量的多酚含量，且具有下列一种或多种的功能：抑制淀粉酶活性、抑制葡萄糖苷酶活性、促进脂肪分解、抑制脂肪堆积、提升骨骼肌增生、提升肌肤保湿、减少细胞内自由基含量、提升gsh生成、提升krt1基因表现量、提升krt10基因表现量、提升krt14基因表现量。
[0236]
虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神所作些许之更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。
[0237]
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
[0238]
[0239]
[0240]