枳壳药材质-量双标控制方法与流程

枳壳药材质
‑
量双标控制方法
技术领域
1.本发明属于中药质量控制技术领域，具体涉及以枳壳对照药材为基准物质，建立一套不依赖于对照品，较为全面控制药材质量的方法，该方法稳定性、精密度良好，可以弥补目前枳壳药材质量控制的不足，能够为枳壳药材质量提升提供新思路。


背景技术：

2.枳壳药材为芸香科植物酸橙citrus aurantium l.及其栽培变种的干燥未成熟果实，主产于四川、江西和浙江，在湖北、湖南和重庆等地也有分布。枳壳的基原植物在历史上变迁复杂，曾有青皮、陈皮和枸橘等伪品作为枳壳入药，影响中药枳壳的临床合理使用。
3.随着现代中药分析手段的进步，枳壳药材质量控制方法主要包括单指标含量测定法、多指标含量测定法和指纹图谱与含量测定结合法，以上方法具有灵敏度高、重复性好的优点，能够为控制枳壳药材提供量化数据，但存在着单一指标不能反映药材整体特征、多指标含量测定依赖于多种对照品且某些指标成分不能反映药效、指纹图谱只能模糊地评价药材相似性不能清晰地判断供试品真伪优劣的不足。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提供一种枳壳药材质
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量双标控制方法。以枳壳对照药材为定性、定量的基准物质，采用高效液相色谱结合q
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tof
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ms技术，建立一套不依赖于对照品，较为全面科学地控制药材质量的方法。
5.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
6.本发明提供了一种枳壳药材质
‑
量双标控制方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1建立枳壳药材特征图谱；步骤2确定枳壳药材的特征峰；步骤3建立枳壳药材特征峰相对含量。
7.进一步地，所述步骤1的具体步骤包括：（1）参照物溶液的制备：取枳壳对照药材，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50倍量的50%甲醇，称定重量，加热回流1h，放冷，补足失重，摇匀，滤过；续滤液挥干，50%甲醇定容，摇匀，过0.22μm滤膜，即得；（2）供试品溶液的制备：取过4号筛的供试药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50倍量50%甲醇，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足失重，摇匀，滤过；续滤液挥干，50%甲醇定容，摇匀，过0.22 μm滤膜，即得；（3）色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的agilent ec
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c
18
色谱柱，色谱柱规格为3.0
×
100mm，2.7
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micron；以0.1%甲酸水为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱；流速1.0 ml/min；柱温30℃；dad检测器在波长330nm下进行检测；进样量5μl；
（4）特征图谱：取参照物溶液和供试品溶液，按色谱条件进样检测，记录330 nm色谱图。
8.进一步地，所述步骤2的具体步骤包括：以枳壳对照药材的图谱为参照谱图，使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，确定20个共有色谱峰，建立枳壳药材的对照谱图；以建立的对照图谱为基准，枳壳对照药材及10批供试药材共有20个特征峰，对照药材及供试药材与对照图谱的相似度均大于0.900～1.000，由此确定枳壳药材的特征峰。
9.进一步地，所述步骤3的具体步骤包括：（1）采用q
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tof
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ms技术鉴定出了枳壳对照药材特征图谱20个特征峰中的11个化学成分分别为3号峰为圣草次苷，4号峰为新北美圣草苷，6号峰为芸香柚皮苷，7号峰为柚皮苷，9号峰为橙皮苷，10号峰为新橙皮苷，11号峰为橙皮素，14号峰为枸橘苷，15号峰为橘皮内酯，19号峰为川陈皮素，20号峰为橘皮素；其中，7号峰分离效果好，峰面积大且保留时间稳定居中，故以其作为参照峰；（2）内标物溶液的制备，取柚皮苷适量，精密称定，用甲醇配制成每1ml含对照品300μg的溶液；（3）取上述内标物溶液，按步骤1中的色谱条件进行测定，并计算枳壳对照药材中柚皮苷的含量为92.8753 mg/g，峰面积为2547.697；其余19个枳壳药材特征峰的相对含量计算方法为：特征峰相对含量=特征峰峰面积
×
（对照药材柚皮苷含量/对照药材柚皮苷峰面积）；（4）根据枳壳对照药材及供试药材特征峰的相对含量，取“平均值
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标准差”作为特征峰相对于内标含量的下限。
10.进一步地，所述步骤2的特征峰均为枳壳发挥其功效及药理作用的特征活性化学成分。
11.进一步地，所述方法通过枳壳药材特征图谱中的特征峰作为枳壳药材的定性标准，能够明确鉴定药材的真伪。
12.进一步地，所述方法通过建立的特征峰相对含量的计算方法确定的各特征峰相对含量的下限，能够区分枳壳的优劣。
13.与现有技术相比本发明的有益效果。
14.（1）本发明首次公开枳壳药材质
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量双标控制方法，可以弥补目前枳壳药材质量控制方法中单一指标不能反映药材整体特征、多指标含量测定依赖于多种对照品且某些指标成分不能反映药效、指纹图谱只能模糊地评价药材相似性不能清晰地判断供试品真伪优劣的不足。
15.（2）本发明利用现代分析检测技术指认出的特征峰化学成分的基本母核为2
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苯基色原酮。其中，芸香柚皮苷具有抗氧化和的小肠推进作用；柚皮苷具有抗胃溃疡的生物活性；橙皮苷可促进胃肠动力；新橙皮苷具有胃肠激素调节作用；枸橘苷可抑制胃癌细胞增殖；川陈皮素具有抗炎和调节胃肠动力等药理作用；橘皮素对结肠癌具有一定的治疗作用。上述化学成分均为枳壳发挥其“理气宽中、行滞消胀”功效和抗炎、抗氧化。抗癌药理作用的活性化学成分，能全面科学地反映中药枳壳的内在质量。
附图说明
16.图1是枳壳对照药材及10批枳壳供试药材的特征图谱。
17.图2是枳壳特征图谱共有模式。
18.图3陈皮药材与枳壳对照药材特征图谱。
具体实施方式
19.以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。
20.实施例1枳壳对照药材（批号：120981
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201605，中国食品药品检定研究所）。枳壳药材供试品（江西宜春、江西吉安、江西樟树、浙江衢州、浙江金华、四川巴中、湖南沅江、重庆大别山、湖北孝感、河北保定）经辽宁中医药大学许亮教授鉴定为芸香科植物酸橙citrus aurantium l.及其栽培变种的干燥未成熟果实。根据2020版《中华人民共和国药典》枳壳“含量测定”项下方法检测，10批产地供试品中，除来自于湖北孝感的供试品以外，其余供试品均能符合药典规定（含柚皮苷不得少于4.0%，新橙皮苷不得少于3.0%）。
21.1.参照物溶液的制备：取枳壳对照药材0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，称定重量，加热回流1h，放冷，补足失重，摇匀，滤过。续滤液挥干，50%甲醇定容至5ml容量瓶，摇匀，过0.22μm滤膜，即得。
22.2.供试品溶液的制备：取供试药材粉末（过4号筛）1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足失重，摇匀，滤过。续滤液挥干，50%甲醇定容至10ml容量瓶，摇匀，过0.22μm滤膜，即得。
23.3.特征图谱的建立。
24.3.1色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：agilent ec
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c
18
色谱柱（3.0
×
100mm，2.7
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micron）；流动相：0.1%甲酸水（a）
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乙腈（b），进行梯度洗脱；梯度洗脱程序：0～10 min，5%
→
15%b；10～15 min，15%
→
18%b；10～25 min，18%
→
50%b；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；dad检测器波长：330 nm；进样量：5μl。
25.本发明所述的中药枳壳质量控制方法，将供试品溶液，每份样品平行2次，按色谱条件依次进样检测，将330nm波长下的图谱数据由分析检测仪器中导出，获得枳壳药材的hplc特征图谱，见图1。以枳壳对照药材的图谱为参照谱图，使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，确定20个共有色谱峰，建立枳壳药材的对照谱图，色谱图见图2。
26.本发明所述的枳壳药材质量控制方法，得到的枳壳药材特征图谱可以用于判断枳壳药材的真伪。
27.3.2方法学考察。
28.3.2.1精密度实验：精密吸取同一供试品溶液5μl，按色谱条件测定，连续进样6次，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小
于1.0%，表明仪器精密度良好。
29.3.2.2稳定性实验：精密吸取同一供试品溶液5μl，按色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24h进样6次检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于2.4%，表明供试品溶液在24h内稳定。
30.3.2.3重复性实验：按供试品溶液制备方法制备6份供试样品，按色谱条件，分别进样检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.9%，表明方法重复性良好。
31.4.含量测定。
32.4.1线性关系考察：配制柚皮苷的6个质量浓度溶液，按色谱条件，分别进样检测，以质量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得到线性回归方程（y=1327.2x 87.58）、相关系数（r=0.990）和线性范围（0.6800～5.7800μg）。结果表明进样量范围内与峰面积呈良好的线性关系。
33.4.2精密度实验：精密吸取同一供试品溶液5μl，按色谱条件测定，连续进样6次，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于2.2%，表明仪器精密度良好。
34.4.3稳定性实验：精密吸取同一供试品溶液5μl，按色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24h进样6次检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于2.7%，表明供试品溶液在24h内稳定。
35.4.4重复性实验按供试品溶液制备方法制备6份供试样品，按色谱条件，分别进样检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.5%，表明方法重复性良好。
36.计算除湖北孝感枳壳外，枳壳对照药材及其余9批枳壳供试药材特征峰的相对含量，取“平均值
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标准差”作为特征峰相对于内标含量的下限。1号特征峰含量不得低于1.3975mg/g；2号特征峰含量不得低于2.6439mg/g；3号特征峰含量不得低于8.4466mg/g ；4号特征峰含量不得低于2.6317mg/g；5号特征峰含量不得低于7.2282mg/g；6号特征峰含量不得低于8.2781mg/g；8号特征峰含量不得低于8.0920mg/g；9号特征峰含量不得低于6.2699mg/g；10号特征峰含量不得低于77.5915mg/g；11号特征峰含量不得低于2.8459mg/g；12号特征峰含量不得低于2.1630mg/g；13号特征峰含量不得低于1.4016mg/g；14号特征峰含量不得低1.4143mg/g；15号特征峰含量不得低于1.3831mg/g；16号特征峰含量不得低于1.3217mg/g；17号特征峰含量不得低于2.4227mg/g；18号特征峰含量不得低于6.7383mg/g；19号特征峰含量不得低于1.5885mg/g ；20号特征峰含量不得低于5.1964 mg/g。
37.实施例2枳壳药材伪品的鉴别。
38.（1）取陈皮药材粉末（过4号筛）1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲
醇50ml，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足失重，摇匀，滤过。续滤液挥干，50%甲醇定容至10ml容量瓶，摇匀，过0.22μm滤膜，备用。
39.（2）精密吸取步骤（1）中的溶液5μl，注入液相色谱仪，色谱条件如下：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的agilent ec
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c
18
色谱柱，色谱柱规格为3.0
×
100 mm，2.7
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micron；以0.1%甲酸水为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱；流速1.0 ml/min；柱温30℃；dad 检测器在波长330nm下进行检测。
40.陈皮来源于芸香科植物橘，是较为常见的枳壳药材混伪品种。陈皮药材与枳壳对照药材特征图谱相比，不具有5、10、14、15、16、17号特征峰。以枳壳药材特征图谱中的特征峰作为枳壳药材的定性标准，能够区分出伪品，说明建立的特征图谱可以鉴别枳壳药材的真伪，能够解决枳壳多基原、多产地导致柑橘属混伪品导致临床用药混乱的问题，见图3。
41.实施例3湖北孝感枳壳供试品的鉴别。
42.（1）参照物溶液的制备：取枳壳对照药材0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，称定重量，加热回流1h，放冷，补足失重，摇匀，滤过。续滤液挥干，50%甲醇定容至5 ml容量瓶，摇匀，过0.22μm滤膜，即得。
43.（2）供试品溶液的制备：取供试药材粉末（过4号筛）1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足失重，摇匀，滤过。续滤液挥干，50%甲醇定容至10ml容量瓶，摇匀，过0.22μm滤膜，即得。
44.（3）取供试品溶液，按色谱条件进样检测，记录330nm色谱图，呈现与枳壳对照药材特征图谱一致的20个特征峰。
45.（4）计算湖北孝感枳壳供试品各特征峰的相对含量，特征峰化学成分相对含量=特征峰峰面积
×
（对照药材柚皮苷含量/对照药材柚皮苷峰面积），其中2、5、8、10、11、12、13号特征峰相对含量分别为0.4488mg/g、0.4812mg/g、1.8363mg/g、7.3723mg/g、0.3882mg/g、1.1415mg/g、1.1743mg/g，低于下限。
46.由于芸香科入药植物亲缘十分相近，橘属混伪品长期作为枳壳入药，容易造成鉴别困难与临床用药混乱的现象。以枳壳药材特征图谱中的特征峰作为枳壳药材的定性标准，能够明显区分出伪品，说明建立的特征图谱可以鉴别枳壳的真伪，能够解决枳壳多基原、多产地导致柑橘属混伪品导致临床用药混乱的问题。前期药效实验表明湖北孝感枳壳供试品促进胃肠动力作用不明显。说明建立的特征峰相对含量下限可以区分枳壳的优劣，能够解决劣质枳壳导致临床药效不佳的问题。本发明能清晰地判断供试品的真伪优劣，弥补目前枳壳药材质量控制的不足，达到全面控制枳壳药材的目的。