一种检测异位胸腺组织的方法及应用与流程

1.本发明涉及一种检测异位胸腺组织的方法及应用，属于生物医学检测技术领域。


背景技术：

2.重症肌无力是一种神经肌肉接头间传递功能障碍的自身免疫性疾病，是以体液免疫为主，细胞免疫为辅，补体参与的过程，主要累及横纹肌的神经
‑
肌肉接头处突触后膜上的乙酰胆碱受体，全身其他部位和组织也可受累。患者体内b细胞增殖分化为浆细胞并产生分泌自身免疫性抗体如乙酰胆碱受体(achr)抗体，与神经肌肉接头处突触后膜上achr的结合，通过激活补体系统导致降解、封闭，使突触后膜结构破坏，从而出现肌肉无力、易疲劳的临床表现。重症肌无力的发病与胸腺关系十分密切，70
‑
80％的患者存在胸腺组织的异常，其中85％为患者胸腺增生，15％为胸腺瘤。胸腺切除术是重症肌无力的一种常用且有效的治疗手段，术后大部分患者临床症状得到明显改善，但是一部分患者处于症状无缓解或缓解慢的问题，这意味着一部分胸腺组织或异位胸腺残留在患者体内。为使重症肌无力患者获得良好的手术预后，切除这些非解剖学上的胸腺组织显得十分重要且必要。
3.胸腺属于中枢免疫器官，是t淋巴细胞发育、成熟的主要场所，也是免疫系统维持自身内环境稳定以及自身免疫耐受的主要器官。胸腺胚芽在下降过程中受限停留于某一部位或有小块组织残留于某一部位，形成胸腺组织“岛屿”，这些组织有可能会引起一些病症，如胸腺囊肿、胸腺瘤和异位胸腺。为此弄清异位胸腺的分布情况有助于解决获得切除胸腺无缓解的原因，以减少对患者造成不必要的伤害。以往的研究中均是通过免疫组化的方法区分异位胸腺，但是这种方法存在许多缺陷，如耗时、费力、成本高、工作量大，最致命的缺点是检测结果不精准，这是因为这些形成胸腺组织的“岛屿”比较大且富含脂肪组织，切片即产生很大的随机性，很可能使样品漏检，影响结果的准确性，因此建立一种高效的异位胸腺鉴别系统十分必需的。


技术实现要素：

4.本发明的目的是解决如何更方便快捷地准确检测异位胸腺组织的技术问题。
5.为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种检测异位胸腺组织的方法，包括以下步骤：
6.步骤1：处理组织样品，获得重悬细胞；
7.步骤2：通过流式细胞仪进行cd4和cd8检测；
8.步骤3：如果组织样品中没有cd4

和cd8

双阳性t细胞，则通过流式细胞仪对组织样品中cd69和cd62l进行检测；
9.步骤4：对检测结果进行分析，如果组织样品中有cd4

和cd8

双阳性t细胞，则鉴定组织样品为异位胸腺组织；如果组织样品中cd4

和cd8

双阳性t细胞没有，则加做cd69、cd62l检测，如果样品中有cd69

和cd62l
‑
t细胞，则鉴定组织样品为异位胸腺组织，反之，组织样品不是异位胸腺组织。
10.本发明提供一种检测异位胸腺组织的方法在制备胸腺组织检测试剂盒中的应用。
11.本发明提供一种检测异位胸腺组织的方法在重症肌无力患者经胸腺切除术治疗后的预后中的应用。
12.本发明提供一种检测异位胸腺组织的方法在制备重症肌无力患者经胸腺切除术治疗后预后诊断试剂盒的应用。
13.本发明提供一种检测异位胸腺组织的方法在非诊断方法和非治疗方法上的应用。
14.相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
15.本发明与现有技术相对比，方法简单、可靠，其准确性高于现有的检测异位胸腺的检测方法。本发明通过流式细胞术建立了一种鉴别异位胸腺组织的方法，并以此可进一步研究我国胸腺异常患者的异位胸腺分布规律，从而为针对胸腺的相关治疗提供精准的临床依据。
16.本发明具有以下优点：在技术层面上，现有技术中主要是经免疫组化检测异位胸腺组织，需要通过每6μm切片染色得到结果，而疑似异位胸腺的组织多数是脂肪组织，这就使得每一张片子中不可能均有胸腺组织细胞，最终致使实验结果的随机性提高，而本发明是通过流式细胞术进行的，可精准到单个细胞的表型，并且所研磨的样品至少是免疫组化样品的上千倍，这就大大提高了结果的可靠性和精确性。
附图说明
17.图1为流式细胞仪对组织cd4

cd8

分析结果图。
18.其中a图为非异位胸腺图，b图为异位胸腺图；b图中显示具有cd4

cd8

双阳性t细胞特征的组织为异位胸腺组织。
19.图中dn为cd4
‑
cd8
‑
双阴性t细胞；dp为cd4

cd8

双阳性t细胞。
20.图2为流式细胞仪对组织cd69

cd62l
_
分析结果图。
21.图中具有cd69

cd62l
_
t细胞特征的组织为异位胸腺组织。
22.图3为疑似异位胸腺组织位置图。
具体实施方式
23.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，作详细说明如下：
24.本发明提供提供一种检测异位胸腺组织的方法，包括以下步骤：
25.步骤1：处理组织样品，获得重悬细胞；
26.步骤2：通过流式细胞仪进行cd4和cd8检测；
27.步骤3：如果组织样品中没有cd4

和cd8

双阳性t细胞，则通过流式细胞仪对组织样品中cd69和cd62l进行检测；
28.步骤4：对检测结果进行分析，如果组织样品中有cd4

和cd8

双阳性t细胞，则鉴定组织样品为异位胸腺组织；如果组织样品中cd4

和cd8

双阳性t细胞没有，则加做cd69、cd62l检测，如果样品中有cd69

和cd62l
‑
t细胞，则鉴定组织样品为异位胸腺组织，反之，组织样品不是异位胸腺组织。
29.本发明提供一种检测异位胸腺组织的方法在制备胸腺组织检测试剂盒中的应用。
30.本发明提供一种检测异位胸腺组织的方法在重症肌无力患者经胸腺切除术治疗
后的预后中的应用。
31.本发明提供一种检测异位胸腺组织的方法在制备重症肌无力患者经胸腺切除术治疗后预后诊断试剂盒的应用。
32.本发明提供一种检测异位胸腺组织的方法在非诊断方法和非治疗方法上的应用。
33.骨髓产生的t细胞前体选择性地迁移至胸腺并在其微环境的作用下经过双阴性细胞dn(double negative cells)cd4
‑
cd8
‑
和双阳性细胞dp(double positive cells)cd4

cd8

后最后发育成单阳性具有功能的t淋巴细胞(cd4

或cd8

)。在此过程中，双阴性细胞dn(cd4
‑
cd8
‑
)经t细胞(抗原)受体(t cell receptor,tcr)tcr重排，cd3和tcrαβ逐渐开始表达，随后形成双阳性细胞dp(cd4

cd8

)，再经自身主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)mhc选择形成单阳性细胞，cd3和tcrαβ表达水平达到顶峰，受tcr刺激影响单阳性细胞表面分子cd69呈阳性。因此，这些表面分子在胸腺组织和淋巴组织之间有明显的差别，可作为异位胸腺的判断指标。
34.本发明应用流式细胞学的方法，对获取的胸腺及可疑胸腺组织进行上述表面分子的检测，依据下面的标准判定该组织是否为异位胸腺组织：1)如果该组织样品具有cd4

cd8

双阳性t细胞，则该组织样品为异位胸腺组织(如图1)；2)如果该组织样品中的cd4

cd8

双阳性t细胞没有或者不能确定，则加做cd69、cd62l检测，如果该样品中具有cd69

cd62l
‑
t细胞，则该组织样品为异位胸腺组织(如图2)。反之，则该组织样品不是异位胸腺组织。
35.人类胸腺起源于第三咽囊，随后内胚层细胞增殖形成胸腺始基，胸腺始基定位于心包和主动脉弓的腹侧面，仅头端的极小部分留在颈部。胎儿出生后，胸腺继续发育，在儿童期处于下降过程中，若在此过程中受限停留于某一部位或有小块组织残留于某一部位，则形成异位胸腺组织。在疑似异位胸腺的组织中，有一部分组织具有双阳性dp(cd4

cd8

)细胞，这部分细胞lineage分子cd20表现为阴性，体积偏小，而且表面分子cd3的表达水平偏低，这些与胸腺组织淋巴细胞的表型相一致，因此双阳性dp(cd4

cd8

)t细胞的出现可作为异位胸腺的一个直接指标。
36.本发明的检测方法得到的异位胸腺所占比例远远高于其他研究报道，与现有文献报道的方法相比，本发明具有以下优点：(1)从技术层面：以往的研究主要是经免疫组化判定，通过每6μm切片染色得到结果，而疑似异位胸腺的组织多数是为脂肪组织，这就使得每一张片子不可能均有胸腺组织细胞，最终致使实验结果的随机性再次提高，而本发明通过流式细胞术进行的，可精准到单个细胞的表型，并且所研磨样品量至少是免疫组化样品量的上千倍，这就大大提高结果的可靠性和精确性。(2)从研究地域层面：现有技术中的研究均集中在欧美国家，本发明是针对中国人的，更具有临床实践意义。
37.实施例
38.依据正常胸腺的分布范围，收集胸腺瘤和胸腺囊肿患者的可能含有异位胸腺的手术切除组织样品，共分为7个部位(如图3)，分别为：右心膈角脂肪组织1、左心膈角脂肪组织2、心包前脂肪组织3、右膈神经外侧脂肪组织4、左膈神经外侧脂肪组织5、颈浅脂肪组织6、颈深脂肪组织7，其中以肿瘤组织或瘤旁组织为对照。
39.共收集到45份胸腺及可疑胸腺组织样品。在这些组织样品中，共计38份1号位组织(右心膈角脂肪组织1)、30份2号位组织(左心膈角脂肪组织2)、26份3号位组织(心包前脂肪组织3)、6份4号位组织(右膈神经外侧脂肪组织4)、7份5号位组织(左膈神经外侧脂肪组织
5)、4份6号位组织(颈浅脂肪组织6)和8份7号位组织(颈深脂肪组织7)。在这些组织样品中，分别有26份右心膈角脂肪组织1(占比68.4％)、15份左心膈角脂肪组织2(占比50％)、17份心包前脂肪组织3(占比65.4％)、5份右膈神经外侧脂肪组织4(占比83.3％)、5份左膈神经外侧脂肪组织5(占比71.4％)、4份颈浅脂肪组织6(占比100％)和7份颈深脂肪组织7(占比87.5％)，经本发明提供的方法检测是异位胸腺组织。而现有文献报道的应用传统的免疫组化法检测出的异位胸腺组织比例是：24.1％的右心膈角脂肪组织1、22.4％的左心膈角脂肪组织2和12.1％
‑
32％的颈部脂肪组织是异位胸腺组织。
40.因此，应用本发明的流式细胞学方法检测出的异位胸腺组织比例明显高于现有文献报道的免疫组化法，本发明方法明显优于传统的免疫组化法，更具有临床指导意义。
41.本发明的工作过程：
42.1)称取胸腺组织样品于5ml培养基中，其中肿瘤或瘤旁组织为0.01g，疑似异位胸腺组织重量随机为所有组织的一半；
43.2)剪碎组织，研磨组织，加5mltcm，过滤于15ml离心管中；
44.3)涡旋混合震荡器上涡旋震荡：350g，4℃，7min；
45.4)弃上清，涡旋震荡
46.5)加10ml staining buffer，涡旋震荡：350g，4℃，7min；
47.6)弃上清，涡旋震荡；加相应抗体染色，涡旋震荡，冰上置30min；
48.7)加2ml pbs，涡旋震荡：350g，4℃，7min；
49.8)弃上清，涡旋震荡，加70μl alive/dead(300
×
稀释于pbs)，室温避光染10min；
50.9)加2ml staining buffer，350g，4℃，7min；
51.10)弃上清，涡旋震荡，加350μl staining buffer重悬细胞；
52.11)上机，用相应荧光通道流式分析样品；
53.12)flowjo(流式细胞分析软件)分析结果。
54.以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。