一种固定化尿酸酶活性的方法与流程

1.本发明属于尿酸监测技术领域，特别涉及一种测定固定化尿酸酶活性的方法。


背景技术：

2.尿酸氧化酶的活性测定原理主要是通过尿酸在290
‑
293nm有最大吸收峰而其终产物尿囊素在该区域未有吸收峰的差异来建立的。故在早期的关于尿酸酶文献或是专利中，尿酸酶活性测定的分析方法主要是采用分光光度法，即通过在尿酸氧化酶存在下尿酸溶液在290
‑
293nm的吸收值降低来计算酶活性。
3.但是，采用上述办法后，有以下两个缺点：1、由于尿酸不会完全溶于血浆，其溶解度不稳定，测定结果并不精确，因此很难在常温下不易测定尿酸酶分解血液中尿酸的含量。2、修饰在树脂上的尿酸酶基本不会脱落在在水和血液中，难以测定固定化后的尿酸酶活力大小和半衰期。


技术实现要素：

4.本发明提出一种测定固定化尿酸酶活性的方法，能够解决上述问题。
5.本发明的技术方案是这样实现的：一种测定固定化尿酸酶活性的方法，其操作方法如下：
6.步骤1、a试管中加入尿酸溶液，并于40℃的水浴中保温5min；
7.步骤2、向a试管中加入适当稀释的尿酸酶液，搅拌均匀，使其反应完全；
8.步骤3、向a试管中加入20％的koh用于停止尿酸酶的反应，并通过紫外分光光度计于290nm处测定吸光度；
9.步骤4、b试管中加入水溶液，并于40℃的水浴中保温5min；
10.步骤5、向b试管中加入适当稀释的尿酸酶液，搅拌均匀，使其反应完全；
11.步骤6、向b试管中加入20％的koh用于停止尿酸酶的反应，并通过紫外分光光度计于290nm处测定吸光度；
12.步骤7、c试管中加入尿酸溶液，并于40℃的水浴中保温5min后，加入固定化尿酸酶并搅拌均匀，使其反应完全；
13.步骤8、将固定化尿酸酶通过滤膜过滤后，通过紫外分光光度计于290nm处测定吸光度；
14.步骤9、d试管中加入水溶液，并于40℃的水浴中保温5min后，加入固定化尿酸酶并搅拌均匀；
15.步骤10、将固定化尿酸酶通过滤膜过滤后，通过紫外分光光度计于290nm处测定吸光度；
16.步骤11、将所得的吸光度代入至标准曲线中计算尿酸含量。
17.作为一种优选的实施方式，步骤2和步骤5中尿酸酶液的浓度为1mg/ml。
18.作为一种优选的实施方式，步骤1中加入的尿酸溶液的体积为10ml，浓度为100mg/
l；步骤7中加入的尿酸溶液的体积为10ml。
19.作为一种优选的实施方式，步骤4中加入的水溶液的体积为10ml，酸碱度为ph8.5，步骤9中加入的水溶液的体积为10ml，酸碱度为ph8.5。
20.作为一种优选的实施方式，步骤7中加入的固定化尿酸酶体积为1g，步骤9中加入的固定化尿酸酶体积为1g。
21.作为一种优选的实施方式，步骤11中的标准曲线为y＝12.976x
‑
0.1957。
22.作为一种优选的实施方式，步骤11中标准曲线的制作方法包括如下步骤：
23.步骤110、抽取母液25ml放于烧杯中，另外加入等体积的基底液进行稀释，得到混合物a；
24.步骤111、抽取混合物a25ml放于烧杯中，另外加入等体积的基底液进行稀释，得到混合物b，并同理继续进行稀释，直至稀释9次，得到混合物c；
25.步骤112、将紫外分光光度计打开预热20分钟，并机器进行自检；
26.步骤113、机器开盖后按调零键，合上盖子将波长调至293nm，加空白溶液，调满度，透射比为100，测其9次稀释溶液的吸光度，每次测3个重复；
27.步骤114、根据9次稀释溶液的吸光度，制作标注曲线。
28.作为一种优选的实施方式，母液为100mg/l的尿酸溶液，基底液为ph＝8.5的碱液，其中碱液为300mg naoh和5l纯水的混合物。
29.作为一种优选的实施方式，母液的配置方法为：将100mg的尿酸加入ph＝8.5的基底液中，并放于37.5℃中，溶解3h，直至溶液变为清澈，并且无白色颗粒，放置一天后，用于标准溶液的配制。
30.采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
31.1、通过测定具体固定化的尿酸酶分解溶液中尿酸的含量来达到对尿酸酶分解尿酸的量产化。
32.2、测定分光度用标准曲线可以得出溶液里尿酸的含量，来计算固定化酶反应的尿酸。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1为本发明的标准曲线图。
具体实施方式
35.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.如图1所示，一种测定固定化尿酸酶活性的方法，其操作方法如下：
37.步骤1、a试管中加入尿酸溶液，并于40℃的水浴中保温5min；
38.步骤2、向a试管中加入适当稀释的尿酸酶液，搅拌均匀，使其反应完全；
39.步骤3、向a试管中加入20％的koh用于停止尿酸酶的反应，并通过紫外分光光度计于290nm处测定吸光度；
40.步骤4、b试管中加入水溶液，并于40℃的水浴中保温5min；
41.步骤5、向b试管中加入适当稀释的尿酸酶液，搅拌均匀，使其反应完全；
42.步骤6、向b试管中加入20％的koh用于停止尿酸酶的反应，并通过紫外分光光度计于290nm处测定吸光度；
43.步骤7、c试管中加入尿酸溶液，并于40℃的水浴中保温5min后，加入固定化尿酸酶并搅拌均匀，使其反应完全；
44.步骤8、将固定化尿酸酶通过滤膜过滤后，通过紫外分光光度计于290nm处测定吸光度；
45.步骤9、d试管中加入水溶液，并于40℃的水浴中保温5min后，加入固定化尿酸酶并搅拌均匀；
46.步骤10、将固定化尿酸酶通过滤膜过滤后，通过紫外分光光度计于290nm处测定吸光度；
47.步骤11、将所得的吸光度代入至标准曲线中计算尿酸含量。
48.步骤2和步骤5中尿酸酶液的浓度为1mg/ml。
49.步骤1中加入的尿酸溶液的体积为10ml，浓度为100mg/l；步骤7中加入的尿酸溶液的体积为10ml。
50.步骤4中加入的水溶液的体积为10ml，酸碱度为ph8.5，步骤9中加入的水溶液的体积为10ml，酸碱度为ph8.5。
51.步骤7中加入的固定化尿酸酶体积为1g，步骤9中加入的固定化尿酸酶体积为1g。
52.步骤11中的标准曲线为y＝12.976x
‑
0.1957。
53.步骤11中标准曲线的制作方法包括如下步骤：
54.步骤110、抽取母液25ml放于烧杯中，另外加入等体积的基底液进行稀释，得到混合物a；
55.步骤111、抽取混合物a25ml放于烧杯中，另外加入等体积的基底液进行稀释，得到混合物b，并同理继续进行稀释，直至稀释9次，得到混合物c；
56.步骤112、将紫外分光光度计打开预热20分钟，并机器进行自检；
57.步骤113、机器开盖后按调零键，合上盖子将波长调至293nm，加空白溶液，调满度，透射比为100，测其9次稀释溶液的吸光度，每次测3个重复；
58.步骤114、根据9次稀释溶液的吸光度，制作标注曲线。
59.母液为100mg/l的尿酸溶液，基底液为ph＝8.5的碱液，其中碱液为300mg naoh和5l纯水的混合物。
60.母液的配置方法为：将100mg的尿酸加入ph＝8.5的基底液中，并放于37.5℃中，溶解3h，直至溶液变为清澈，并且无白色颗粒，放置一天后，用于标准溶液的配制。
61.本发明通过测定具体固定化的尿酸酶分解溶液中尿酸的含量来达到对尿酸酶分解尿酸的量产化。
62.本发明通过测定分光度用标准曲线可以得出溶液里尿酸的含量，来计算固定化尿酸酶反应的尿酸，并根据计算结果确定固定化尿酸酶的最佳反应条件，本发明1g固定化尿酸酶的最佳反应条件为40℃，ph为8.5，反应时间为5min。
63.1g固定化酶在10ml的尿酸母液中反应5min后，测其吸光度三个重复的均值为0.078，将其带入标准曲线y＝12.976x
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0.1957，x为0.078，y为浓度，计算可知y为0.8164mg/l。浓度由100mg/l降至0.8164mg/l。尿酸母液为100mg/l，10ml中含有1mg的尿酸，0.8164mg/l中的尿酸含量为0.008164mg。1g的固定化酶在10ml的尿酸母液中反应5min后，反应掉0.991836mg的尿酸。
64.以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。