一种能够治疗骨关节炎的可注射的温度敏感水凝胶的制作方法

1.本发明涉及骨关节炎治疗，更具体地涉及一种能够治疗骨关节炎的可注射的温度敏感水凝胶。


背景技术：

2.软骨下骨位于软骨下方，主要包括软骨下皮质终板、骨小梁结构、血管及小梁间隙结构，主要生物学功能为吸收应力、缓冲震荡以及维持关节形状以及为软骨提供营养及清除代谢物。软骨下骨和关节软骨形成一个紧密的组合功能单位称为“骨软骨结”，作为一个功能整体维持关节内环境的平衡。软骨下骨的骨小梁在正常的关节中发挥重要的减震和支持性作用，也可能对软骨的营养供应和代谢起重要的作用。软骨下骨区域出现骨髓水肿（bone marrow lesion，bml）的病理改变主要表现下三点：骨基质水肿、纤维组织增生、炎性细胞浸润。其主要是由于软骨下骨组织被大量灌注所致。对软骨下骨发生bml改变的区域进行活检发现：骨小梁间隙增宽，其间有大量水肿液充填，区域内脂肪坏死、纤维血管增生，并伴有不同程度反应性新骨形成。软骨下骨已被认为是有潜力的治疗oa的靶点。
3.骨关节炎(osteoarthritis, oa)的病理特点为软骨变性破坏、软骨下骨硬化、软骨下骨区域出现骨髓水肿、关节边缘形成骨赘、滑膜病变、关节囊挛缩、韧带松弛、肌肉萎缩等。对于骨关节炎患者，现有技术中软骨修复技术均难见效。目前国内外对其治疗重点主要集中在药物对症治疗，其目的在于缓解疼痛、减轻炎症、延缓软骨退化，改善功能，避免或减少畸形，但疗效不理想，最终患者不得不选择人工关节置换术，不仅花费大，而且可能存在术后血栓形成，置换术后感染以致截肢等灾难性并发症，因此骨性关节炎的有效治疗方案已经成为全球临床医生面临的严峻挑战。


技术实现要素：

4.本发明一方面提供一种能够治疗骨关节炎的可注射的温度敏感水凝胶，其包括：胶原蛋白、海藻酸盐、透明质酸、钙盐以及用于形成碱性环境的盐，其中所述透明质酸的体积分数不小于24%。
5.在一些实施方式中，其中所述钙盐为焦磷酸钙、羟基磷灰石或其组合。在一些实施方式中，其中所述用于形成碱性环境的盐为碳酸氢钠。
6.在一些实施方式中，其中所述透明质酸为天然来源的透明质酸。在一些实施方式中，其中所述胶原蛋白包括i型胶原蛋白或ii型胶原蛋白。在一些实施方式中，其中所述胶原蛋白为天然来源的胶原蛋白。
7.在一些实施方式中，所述温度敏感水凝胶不包含交联剂。在一些实施方式中，所述温度敏感水凝胶具有流动性。
8.本发明另一方面提供一种药物组合物，其包含如上所述的水凝胶中任一种和药学上可接受的载体。
9.本发明再一方面提供如上所述的水凝胶中任一种在制备治疗骨关节炎的药物中
的应用。
10.在一些实施方式中，所述骨关节炎为创伤性关节炎、退行性骨关节炎或类风湿性关节炎。
11.上述的水凝胶适用于注射。在特别优选的实施方式中，本发明的制剂用于软骨下骨注射。如图1所示，软骨下骨呈蜂窝状结构，本发明的水凝胶具有一定流动性，能够更好填充该区域并在注射后能在原位固化。本发明的凝胶可通过直接注射进入缺损来施用，其中所述凝胶优选原位形成。在本发明的一个优选实施方式中，软骨下骨注射给予在关节中进行，所述关节选自髋部、膝盖、肘部、腕部、踝部、脊柱、足部、手指、脚趾、手、肩部、肋骨、肩胛骨、大腿、胫部、脚踝和沿脊柱骨节处的关节。在另一个优选的实施方式中，软骨下骨注射给予在髋部或膝盖的关节中进行。
12.本领域技术人员将会理解为了实现可注射凝胶在软骨下骨处的原位停留，则需要解决凝胶的流动性与固化性能的矛盾问题。因为凝胶制剂需要实现在软骨下骨区域注射和填充则要求其具有足够流动性，但为了实现凝胶能够在软骨下骨区域原位停留则要求其足够的固化强度以提供足够力学强度来在软骨下骨处停留。本发明的水凝胶通过其制剂整体上提供了一种既具备足够流动性又具备足够固化强度的水凝胶，来解决现有技术中该矛盾。同时，本发明的发明人通过大量试验发现通过采用本发明的透明质酸体积分数不小于24%的水凝胶，能够避免使用现有技术中常用交联剂，而交联剂通常容易造成交联剂及未反应单体残留而具有毒性。并且，本发明的胶原蛋白和透明质酸均可以是天然来源的而非化学改性的，因此不需要复杂化学改性步骤。因此，而本发明的水凝胶可以显著提升其生物安全性，开发适用性强，具有更好医用前景。
13.本发明的水凝胶能够在不使用交联剂的情况，提供足够流动性以实现软骨下骨注射及填充软骨下骨区域中蜂窝状结构，同时仍能够保持足够固化性能以实现在软骨下骨区域中固化并原位停留。通过兼具流动性与固化性能的本发明水凝胶的填充，能够将软骨下骨区域中例如水肿液及炎性物质从该区域中清除，以减轻或治疗骨关节炎的进程。此外，本发明的水凝胶还至少具有以下优点中一种或多种：具有良好生物相容性及可降解性；能够促进骨的修复。
附图说明
14.图1. 软骨下骨呈蜂窝状结构。
15.图2. （a）根据实施例1制备的水凝胶；（b）根据实施例1制备的水凝胶成胶后的呈现性状。
16.图3. （a）关节软骨的番红固绿染色图；（b）在aclt骨关节炎大鼠模型中，软骨下骨给与水凝胶治疗后，大鼠软骨osrsi评分得到改善。比例尺1mm，*p<0.05。
具体实施方式
17.术语“海藻酸盐”，指任何形式的藻酸盐。可用于本发明内容的形式之一是海藻酸钠。
18.术语“胶原蛋白”是天然产生的蛋白质，i型胶原以及ii型胶原是可用于本发明内容中的优选形式。此外，本发明可采用其它形式的胶原。
19.术语“温度敏感水凝胶 (thermo-sensitive hydrogel)”是一种环境敏感型智能凝胶，在存储和给药前(室)以液体或半固体的形式存在，给药后暴露于机体生理状态，立即在用药部位发生相转变，成为半固体的凝胶状态。温度敏感水凝胶可以感知温度的变化而产生功能性的效应。当环境温度发生变化时，水凝胶的体积会随之发生变化，当达到并超过某临界区域时，其体积会发生称为凝胶的体积相转变的突跃式变化，相应的温度称为相转变温度。本发明的水凝胶的相转变温度优选为37
o
c。
20.在本发明的上下文中，术语“治疗”指对于疾病进展的任何有利影响，包括在疾病开始后减弱、减少和降低或缓解疾病发展。
21.术语“药学上可接受的”旨在涵盖任何运载体，其不干扰活性成分的生物学活性的有效性并且对给予的宿主无毒。例如，对于关节内给药，凝胶可配制为用于在载剂中注射的单位剂型，载剂例如但不限于盐水、右旋糖溶液。
22.本文所用术语“骨关节炎”意指关节炎的最常见形式。术语“骨关节炎”包括原发性骨关节炎和继发性骨关节炎（参见例如《默克手册》，第17版，第449页）。骨关节炎可能是由软骨分解引起的。少量的软骨可能会脱落，从而造成骨与骨之间的关节中的疼痛和膨胀。随时间推移，该软骨可能会完全磨损，使得骨与骨在一起摩擦。骨关节炎可以影响任何关节，但通常涉及手、肩膀和承重关节，例如臀部、膝盖、脚和脊柱。在一个优选的示例中，骨关节炎可以是膝盖骨关节炎或髋骨关节炎。该术语尤其包括骨关节炎的形式，根据oarsi分类系统，骨关节炎的形式分为1级至4级或1级至6级。技术人员将会理解本领域中使用的骨关节炎分类，特别是所述的oarsi评估系统（也称为oochas)。
23.术语“患者”旨在包括(但不限于)哺乳动物，例如人、狗、牛、马、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔或大鼠。更优选地，患者是人。
24.实施例1. 水凝胶的制备1. 制备储备液1） i型胶原蛋白储备液：使用ph=2的hcl，制备5 mg/ml的i型胶原蛋白；2） 海藻酸钠储备液：使用超纯水，制备2.5% w/v海藻酸钠；3） 透明质酸储备液：使用超纯水，制备10 mg/ml的透明质酸溶液；4） 焦磷酸钙储备液：使用ph=2的hcl制备2 mg/ml的焦磷酸钙溶液；5） 碳酸氢钠储备液：使用超纯水制备过饱和的碳酸氢钠储备液，终浓度为7.4 g/l。
25.2. 制备水凝胶（hydrogel）a）每5 ml 的i型胶原蛋白储备溶液，添加1ul焦磷酸钙和10毫克的羟基磷灰石颗粒；b）按照60 ul nahco3、100 ul海藻酸钠，240ul透明质酸储备液，及由步骤（a）所制备的600 ul胶原蛋白储备液（即含有按比例添加的焦磷酸钙和羟基磷灰石颗粒）顺序添加各组分（每加一种组分后，充分涡旋，使组分之间混合均匀），制备出1 ml的水凝胶（如图2a所示，本发明的水凝胶的照片）。
26.3. 成胶验证将水凝胶放入37
o
c细胞培养箱中孵育30分钟，水凝胶将经历溶胶-凝胶转变并变为固体，但由于内部含24％透明质酸，因此无法充分凝胶，仍保持较一定的流动性（图2b）。
27.实施例2 本发明的凝胶对骨关节炎的作用将sd大鼠分为2组：模型组（model）、治疗组（gel-treat）。动物进行前十字韧带截断手
术，以建立骨关节炎模型。即，将sd大鼠麻醉后固定在平台上，将手术侧腿呈90
°
弯曲。用手术刀划开膝盖表层皮肤，钝性分离皮下筋膜，避免皮下血管。从股内侧肌形成髌韧带的连接处剪开股内侧肌，注意避开股内侧肌肌肉内血管，避免出血。随后将髌骨推至外侧，暴露膝关节间隙。用显微镊拉开髌骨下脂肪垫，剪断前交叉韧带即可。后缝合伤口，碘酒外涂抹。手术后注意动物苏醒，放回笼中饲养。手术后模型组不进行治疗，治疗组给予如实施例1所制备的水凝胶于软骨下骨处注射。给药后第10周，分别取材模型组与治疗组的关节软骨。将关节软骨进行番红固绿染色并进行oarsi-modified mankin scores评分。
28.如图3所示，给予本发明的水凝胶治疗后，大鼠的osri评分得到明显改善。本发明的水凝胶能够可以显著保护关节软骨。