转基因的NK细胞在治疗癌症中的用途的制作方法

转基因的nk细胞在治疗癌症中的用途
技术领域
1.本发明涉及生物领域，更具体涉及转基因的nk细胞在治疗癌症的中的用途。


背景技术：

2.nk细胞是具有多种免疫学功能的淋巴样细胞。人类nk细胞为cd56和cd16阳性.cd3、cim和cd19为阴性。少部分nk细胞可以为cd8阳性。小鼠nk细胞为nk1.1和asgm1阳性，cd3、cim和cr18为阴性nk细胞杀伤肿瘤细胞不受mhc限制，也不需预先与抗原接触或显示任何记忆反应。nk细胞对肿瘤的杀伤优势表现为直接溶解和分泌细胞因子两个方面，其杀伤肿瘤既可通过穿孔素又可通过fas配基。nk细胞可以产生tnf
‑
a、ifn
‑
γ和il
‑
1，这些细胞因子在nk细胞抗癌反应中有十分重要地位。nk细胞具有对异体骨髓快速排异的能力，但并不介导实体组织的移植排异。
3.nk细胞具有杀伤细胞活化受体(killeractivatoryreceptor，kar)、杀伤细胞抑制受体(killerinhibitoryreceptor，kir)、杀伤细胞凝集素样受体(killerlectin
‑
likereceptors，klr)和fcγ受体(cd16)共4种受体，前3种受体可抑制或激活nk细胞，使之识别自身组织细胞与体内异常组织细胞的能力，第4种受体主要识别nk细胞表面的igg1和igg3标志物，介导nk细胞识别被抗体包被的靶细胞，从而发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibodydependentcell
‑
mediatedcytotoxicity，adcc)，进而杀伤与igg抗体特异性结合的肿瘤。nk细胞具有较广的抗瘤谱，可杀伤同系、同种或异种肿瘤细胞，其杀伤靶细胞的机制可能有:
①
释放穿孔素和颗粒酶引起靶细胞坏死或凋亡。
②
通过死亡受体调节诱导靶细胞凋亡。
③
分泌多种效应性细胞因子对抗转移肿瘤。
④
激发继发肿瘤免疫效应。
4.nk细胞可以被il
‑
2、il
‑
12、il
‑
15等所活化.其中il
‑
15和fh
‑
3配基在nk细胞分化中尤为重要。活化的nk细胞产生大量的细胞因子，包括il
‑
1、tnf
‑
a、ifng
‑
csf和gm
‑
csf。这些细胞因子极有可能参与造血的正负调节。当活化nk细胞转输体内，小鼠同基因骨髓移植的造血恢复过程明显加快，尤其是粒细胞和血小板的恢复加快，显示出一定的应用前景。
5.研究表明细胞因子基因修饰可增强nk细胞功能。细胞因子il
‑
12可增强nk细胞的增殖能力和效应功能goding等利用小鼠il
‑
12基因来修饰依赖il
‑
2活化的鼠原代nk细胞，从而减少对外源性il
‑
2的需求。该研究利用一种腺病毒载体实现gfp/荧光素酶/β
‑
gal和mll
‑
12基因的瞬时过表达，可使得高达80％的细胞表达绿色荧光蛋白，在转入48h后，这些细胞中il
‑
12的分泌量到达峰值，而紧接下来由于腺病毒载体表达的短暂性，其水平下降。这项研究同时表明，在接受外源性il
‑
2注射的同时，利用表达mll
‑
12的nk细胞治疗b16肺转移瘤小鼠，可显著提高其生存期，这与mll
‑
12
‑
nk细胞功能的增强以及在肿瘤组织的积累有关。另有研究表明，过继转输mll
‑
12修饰的nk细胞能进一步增强未修饰nk细胞的功能，说明nk细胞分泌il.12可以激活邻近的细胞，导致周围的免疫细胞活化，从而提高免疫应答。
6.干细胞因子(scf)联合il
‑
2、il
‑
15可以显著提高nk细胞的增殖能力并促进其进化zhang等采用脂质体将scf载体转染入nk
‑
92细胞，在il
‑
2或il
‑
l5存在条件下进行培养，其增殖能力显著增强；在同样的培养条件下，与未修饰的对照组相比，scf修饰的nk
‑
92细胞对
多种肿瘤细胞的杀伤能力显著增强。这可能与杀伤相关分子的表达升高有关，如穿孔素和fasl等。这种基因修饰方式对nk细胞的表型及其分泌ifn的能力并没有显著影响，但是低剂量il
‑
2时，nk
‑
92
‑
scf细胞应答相对较弱。因此在临床上，利用scf修饰的nk细胞进行治疗时，仍然依赖il
‑
2的存在。
7.但是，目前研究发现在野生的scf活性仍然提高的空间，而且提高nk细胞增殖以及自活化效率是目前研究的重点方向。


技术实现要素：

8.本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种改进的转基因nk细胞及其用于癌症的用途。
9.本发明提供了表达tnf
‑
α的经修饰的nk细胞。
10.任选的，修饰的nk细胞还表达il
‑
15。
11.任选的，所述nk细胞还可以为nk
‑
92细胞。
12.更进一步的，将seq id no：3所示的il
‑
15采用t2a连接子与102l/r突变的seq id no：2的氨基酸序列融合后得到seq id no：5的融合基因表达到nk细胞中。
13.更进一步的，所述tnf
‑
α为突变的蛋白，所述突变对应于seq id no：2的氨基酸序列的102l/r，即第102位的l突变为r。所述突变是根据生物信息学分析肿瘤坏死因子的生物学特点，在结构分析上发现该因子含有死亡结构域，形成一种类似于螺旋
‑
环
‑
螺旋的结构与tnfr1的胞内死亡结构域相互作用。在保证tnf
‑
α三维结合活性条件下，设计了多处对活性有提高预期的突变位点，通过鉴定后获得的突变，所述突变是通过碱性氨基酸侧链常含有可质子化的碱性化学基团来增加极性效果进而促进结合速度和结合效果。
14.更进一步的，在seq id no：2的氨基酸序列存在102l/r突变的基础上，还可以进行保守取代。其中一个类别的氨基酸被另一个相同类别的氨基酸取代，落在所公开的变体的范围内，只要该取代实质上不改变多肽的活性。保守取代对于本领域技术人员是众所周知的。
15.在一些实施方案中，用于转化nk细胞的构建体的序列被密码子优化，以使基因在系统中的表达效率最大化。密码子优化通常通过用在表达系统的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列中的至少一个，一个以上或显著数量的密码子来修饰核酸序列来进行。与使用非优化序列产生的转录物相比，密码子优化可用于翻译速率或产生具有所需性质的重组rna转录物，例如更长的半衰期。密码子优化的方法很容易从thermo fisher scientific(waltham，ma)获得，例如geneart@；优化器，可在http genomes.urv.es/optimizer处免费访问，和来自dna2.0(newark，ca)的genegps表达优化技术。
16.为了产生表达tnf
‑
α以及il
‑
15的修饰的nk
‑
92细胞，例如通过电穿孔将质粒导入nk细胞中。转化的nk
‑
92细胞在不含il
‑
2的培养基中生长，单个克隆可通过限制稀释克隆从转化的nk
‑
92细胞中选择。合适的克隆也可以以与nk细胞基本相似的水平表达表面标志物，例如cd3，cd16，cd54，cd56，nkg2d和/或nkp30。任选地，进行全基因组测序(wgs)以确定转基因整合位点。满足一个或多个这些标准的克隆可被选择用于进一步开发并用于临床治疗患者。
17.本发明进一步的，公开了一种药物组合物，其中含有转基因的nk细胞。
18.本发明的药物组合物还可以包括通常用于制备药物组合物的药学上可接受的载体，赋形剂或稀释剂，并且所述载体可以包括非天然存在的载体。载体，赋形剂和稀释剂的例子包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯树胶，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，尼泊金乙酯，尼泊金丙酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。
19.另外，该药物组合物可以制成片剂，根据常用方法的丸剂，散剂，颗粒剂，胶囊剂，混悬剂，溶液剂，乳剂，糖浆剂，灭菌水溶液，非水溶剂，混悬剂，乳剂，冻干制剂，透皮吸收剂，凝胶剂，洗剂，软膏剂，霜剂，贴剂，巴布剂，糊剂，喷雾剂，皮肤乳剂，皮肤混悬剂，透皮传递贴剂，含药绷带或栓剂。具体地，当配制时，药物组合物可使用稀释剂或赋形剂制备，所述稀释剂或赋形剂例如常用的填料，重量剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂和表面活性剂。口服给药的固体材料包括片剂，丸剂，散剂，颗粒剂，胶囊，但不限于此。这样的固体材料可以通过混合至少一种或多种赋形剂，例如淀粉，碳酸钙，蔗糖，乳糖，明胶等来制备。
20.此外，除了简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂如硬脂酸镁和滑石。除用于口服的液体和液体石蜡外，还可加入各种赋形剂，如润湿剂，甜味剂，香料，防腐剂等。胃肠外给药的制剂包括无菌水溶液，非水溶液，悬浮液，乳剂，冻干制剂和栓剂。丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可注射酯如油酸乙酯等可用作非水溶剂和悬浮剂。witepsol，macrogol，tween 61，可可脂，月桂醇，甘油明胶等可用作栓剂的基质。
21.本公开的药物组合物以药学有效量给药。上述术语“药学有效量”是指足以以适用于医疗的合理的利益/风险比治疗疾病的量，并且可以根据包括对象类型和严重程度的因素来确定有效量水平，年龄，性别，药物活性，药物敏感性，给药时间，给药途径和排泄速率，治疗持续时间，以及同时使用的药物，以及医学领域众所周知的其它因素。例如，该药物组合物约1
×
108至约1
×
10
11
/ml浓度给予所述受试者。在一些实施方案中，本公开提供了治疗受试者癌症的方法，包括给予受试者治疗有效量的组合物，所述组合物包含多种上述修饰的nk
‑
92细胞。在一些实施方案中，所述癌症选自黑色素瘤，乳腺癌，卵巢癌，胃癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，头颈癌，结肠癌，胰腺癌，子宫癌，肾细胞癌，胶质母细胞瘤，成髓细胞瘤，肉瘤和肺癌。在一些实施方案中，细胞静脉内给药。在一些实施方案中，细胞经肿瘤内给药。
22.术语“癌症”指哺乳动物中发现的所有类型的癌症，肿瘤或恶性肿瘤，包括白血病，癌和肉瘤。示例性癌症包括脑癌，乳腺癌，宫颈癌，结肠癌，头颈部癌，肝癌，肾癌，肺癌，非小细胞肺癌，黑色素瘤，间皮瘤，卵巢癌，肉瘤，胃癌，子宫癌和成髓细胞瘤。另外的例子包括，霍奇金氏病，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，神经母细胞瘤，卵巢癌，横纹肌肉瘤，原发性血小板增多症，原发性巨球蛋白血症，原发性脑瘤，癌，恶性胰岛瘤，恶性类癌，膀胱癌，恶性前皮损，睾丸癌，淋巴瘤，甲状腺癌，神经母细胞瘤，食管癌，泌尿生殖道癌，恶性高钙血症，子宫内膜癌，肾上腺皮质癌，内分泌和胰腺外分泌瘤，前列腺癌。
23.有益效果
24.本发明通过针对tnf
‑
α筛选高活性突变位获得了高活性的tnf
‑
α突变蛋白，将所述tnf
‑
α蛋白与il
‑
15一起共表达在nk细胞中能够显著的促进nk细胞的增殖以及杀伤活性，将其用于制备药物组合物可以用于癌症的治疗，具有极好的应用前景。
附图说明
25.图1突变tnf
‑
α活性结果图
26.图2融合结构图
27.图3基因相对表达量结果图
28.图4转基因nk细胞增殖结果图
29.图5nk细胞杀伤效果图
具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：下述实施例中所用材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径获得。
31.实施例1 tnf
‑
alpha高活性突变体的制备及活性验证
32.根据生物信息学分析肿瘤坏死因子的生物学特点，在结构分析上发现该因子含有死亡结构域，形成一种类似于螺旋
‑
环
‑
螺旋的结构与tnfr1的胞内死亡结构域相互作用。在保证tnf
‑
α三维结合活性条件下，设计了6处对活性有提高预期的突变位点，通过碱性氨基酸侧链常含有可质子化的碱性化学基团来增加极性效果进而促进结合速度和结合效果。其中三处包括其中相对于野生型序列seq id no：1所示，其突变分别对应于seq id no：2的氨基酸序列的102l/r，104w/k,106n/r(n/r表示野生型的n替换为r)。具体的，根据野生型tnf
‑
α基因序列，设计上下游引物，具体的上游引物序列为：atgagcactgaaagcatgat，下游引物序列为tcacagggcaatgatcccaa。上游引物加ecor i识别序列,下游引物加bamhⅰ识别序列。以人dna为模板，上、下游引物各1.25pmol。反应参数为:94℃5min；94℃30s,52℃35s,72℃55s,30个循环；72℃、5min。突变型tnf
‑
α采用带突变位点的引物进行扩增后采用本领域常规的重叠pcr进行突变基因构建。
33.将pcr产物与pucm2t(购自上海生工公司)进行连接并转化jm109感受态细胞,设立相应的对照,37℃过夜培养。ecorⅰ/bamhⅰ双酶切及pcr鉴定正确的克隆进行测序。将测序正确的pucm2t/tnfα(野生型及3个102l/r，104w/k,106n/r突变型tnfα)分别克隆入表达载体pbv220并转化到大肠杆菌bl21(de3),再次鉴定筛选阳性重组克隆。阳性菌落按1∶50扩大培养(30℃),当od600达0.4～0.6时,取少量菌体作为对照,剩余菌液诱导表达(42℃,5h),收集菌体,裂解破碎细胞，收集包涵体，采用稀释法进行蛋白复性，调整蛋白浓度保持一致为1mg/ml。
34.细胞毒活性测定采用mtt的方法,即收获对数生长期的l929细胞,细胞数调整为1
×
105·
ml
‑1,接种至96孔平底培养板,孵育24h后,每孔弃部分上清,分别加入100μl稀释的突变型和野生型蛋白,设空白对照,不加蛋白,培养24h后,每孔加入10μl、0.01mol
·
l
‑1mtt继续孵育4h。每孔去上清150μl,加入150μl dmso溶解紫色结晶体,570nm波长下读取吸光度值。以野生型蛋白作为相对基础，突变型的结果如图1所示。
35.根据图1的结果可以看出，102l/r突变tnf
‑
α具有较好的提高的蛋白活性。而104w/k和106n/r都没有表现出提高的效果，相反活性还有大幅度的降低，这也表明不是任意的突变都能够提高蛋白的活性。
36.实施例2 il
‑
15偶联tnf
‑
α转染nk细胞
37.将seq id no：3所示的il
‑
15采用t2a连接子与102l/r突变的seq id no：2的氨基
酸序列融合表达，表达形式如图2所示。具体的，将实施例1制备的102l/r突变质粒进行酶切，与扩增的seq id no：4的il
‑
15采用重叠pcr技术通过t2a接头进行序列拼接，得到全长序列il
‑
15
‑
t2a
‑
102l/r tnf
‑
α，具体序列如seq id no：5所示。
38.将所述融合基因与pcdh
‑
cmv载体一起进行双酶切，随后采用t4 dna ligase进行连接，将连接好反应产物中取8μl加入50μl dh5α感受态细胞中进行质粒转化，随后采用菌落pcr鉴定阳性菌株。将阳性菌株的质粒提取后，将293t细胞进行活化培养，转染前24h内传代293t细胞，依据细胞生长密度和状态对细胞密度进行调整，转染时需细胞密度达到70
‑
80％，且贴壁均匀，生长状态良好。按照pxpax 7.5μg、pmd2g 5μg、质粒10μg比例配置质粒混合液，轻微涡旋，室温静置5min；按照dna：pei＝1:5比例配制转染试剂pei稀释液，涡旋振荡，室温静置5min；5)使用1.5mlep管将质粒混合液与pei稀释液混合，在质粒混合液中缓慢加入等比例的pei稀释液，后立即涡旋震荡使溶液充分混匀，室温静置聚合15min；向饥饿处理的293t细胞缓慢滴加混合液，轻柔晃动培养皿让转染液和培养上清均匀混合，置于二氧化碳培养箱，37℃转染12h；弃去全部上清，加入8ml dmem完全培养基，继续培养72h，收集细胞培养上清，上清即为目的病毒溶液，使用peg8000进行病毒浓缩。
39.取生长状态较好的nk92细胞进行感染，具体感染条件为nk92细胞数量为1
×
106·
ml
‑
1：病毒5
×
106tu，补充nk细胞培养基至6ml，在培养瓶中培养，其中培养为75％memα(成分：含2mm l
‑
谷氨酰胺，1.5g/l碳酸氢钠，不含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)， 12.5％热灭活马血清 12.5％进口胎牛 1％双抗 0.2mm肌醇 0.02mm叶酸 0.1mmβ
‑
巯基乙醇 200u/ml il
‑
2。细胞培养48h后传代换液，同时进行细胞筛选，于培养基中添加嘌呤霉素将无感染成功的细胞致死，使细胞稳定增殖出阳性细胞。
40.通过3周的筛选，细胞阳性率稳定在97％以上即得到可以使用的nk转基因细胞表明基因已经稳定嵌合在细胞内。最终得到稳定表达外源基因的nk92
‑
il
‑
15
‑
t2a
‑
102l/r tnf
‑
α。此外，采用本领域常规的制备方法制备了对照的nk92
‑
102l/r tnf
‑
α和nk92
‑
il
‑
15细胞株。其中三个细胞株相对于nk92细胞中各转基因的相对表达量如图3所示，均得到了过表达。其中nk92
‑
il
‑
15
‑
t2a
‑
102l/r tnf
‑
α的tnf
‑
α相对表达量达到了3.01，il
‑
15达到了2.62。
41.实施例3 nk细胞的增殖实验
42.将nk92
‑
il
‑
15
‑
t2a
‑
102l/r tnf
‑
α、nk92
‑
102l/r tnf
‑
α、nk92
‑
il
‑
15细胞以及nk92细胞株分别调成1
×
105/ml,于24孔板中于37℃培养,分别在第3天和第7天计数1次,每两天半量换液,连续培养7d。结果如图4所示。
43.图4表示在培养条件下,nk92
‑
il
‑
15
‑
t2a
‑
102l/r tnf
‑
α、nk92
‑
102l/r tnf
‑
α、nk92
‑
il
‑
15细胞以及nk92细胞株的增长效果。nk92
‑
il
‑
15
‑
t2a
‑
102l/r tnf
‑
α的增殖能力都显著高于nk92
‑
102l/rtnf
‑
α、nk92
‑
il
‑
15细胞以及nk92细胞株。
44.实施例4 转基因nk细胞的杀伤活性实验
45.以mtt法测定nk细胞的杀伤活性。分别以nk92
‑
il
‑
15
‑
t2a
‑
102l/r tnf
‑
α、nk92
‑
102l/r tnf
‑
α、nk92
‑
il
‑
15细胞以及nk92细胞株为效应细胞,bt474癌细胞为靶细胞,效∶靶比为10∶1,加入96孔板中,每个效靶比设4个复孔,每孔总体积为200μl,并设完全培养基做调零孔。37℃,5％co2培养过夜,加入mtt后继续培养4h。离心,去除100μl上清,并加入100μl 10％sds,37℃孵育过夜。测定570nm的od值，以不加nk细胞治疗的癌细胞孔为对照。按照本
领域常规的计算方法计算nk细胞杀伤活性，结果如图5所示。
46.从图5可以看出，nk92
‑
il
‑
15
‑
t2a
‑
102l/rtnf
‑
α细胞具有最强的杀伤活性，可以达到96.3％，nk92
‑
102l/r tnf
‑
α细胞可以达到88.9％，而nk92
‑
il
‑
15细胞以及nk92细胞效果相差不是特别多。
47.应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。