用于通过电子显微术或关联显微术表征生物样品的造影溶液的制作方法

1.本发明涉及用于制备生物样品的物质的领域，该生物样品必须借助于电子显微术或关联显微术(correlative microscopy)来表征。更准确地，本发明涉及一种造影溶液(contrast solution)，该造影溶液是用于通过关联显微术(clem)或电子显微术(em)表征生物样品的乙酸双氧铀的替代品。
现有技术
2.近年来，关联显微表征方法在诊断和研究领域已经引起了极大的兴趣，这首先是由于整合来自不同显微方法的信息的可能性。最感兴趣的技术中的一种是所谓的关联光
‑
电子显微术(correlative light
‑
electron microscopy)(clem)，一种组合荧光显微术(fm)或光学显微术(lm)和电子显微术(em)的技术。这种技术能够从单个样品中外推出通常彼此不关联的数据，从而引入同时理解在单个实验中分析的生物样品的功能和结构的可能性。
3.例如，clem技术可以被用于获得细胞和组织样品中特定分子的位置，以便与关于样品的超微结构的信息相关联。如在通过“常规”电子显微术表征生物样品的情况下，clem技术要求保留超微结构和对比度，但同时该技术的使用引入保留样品的荧光信号的需求。为了达到这个目的，需要考虑的一个方面是关于样品的超微结构必须通过固定被完全保留的事实。固定操作通常基于物理和/或化学方法(通常包括采用醛的处理—化学的；或冷冻工艺—物理的)，其为了将生物样品中存在的分子固定在它们的自然状态和它们在体内被发现的位置，同时防止它们分解的目的被实施。
4.在clem技术的情况下，最佳的固定方法似乎是在低温温度用有机溶剂对水进行高压冷冻/置换(freezing/substitution)(hpf/fs—高压冷冻/冷冻置换)。该技术基于降低醛类化合物的总浓度，并且通过利用低温方法，即物理固定方法，该技术能够使荧光信号被保留，而同时保持所分析的生物样品的超微结构完整。
5.然而，目前在该领域中使用的这种方法和其他类似的方法在关联显微术的情况下未产生令人满意的结果，因为它们未提供足以允许通过电子显微术(em)使样品可视化的对比度，并且必须需要包含重原子的造影剂(contrast agent)的存在。
6.如众所周知的，在电子显微术中，对比度取决于样品中存在的原子的原子序数。原子序数越高，电子将越分散并且获得的对比度越大。生物分子包含具有很低的原子序数的原子(碳、氢、氧、氮、磷、硫等)，并且由于这个原因，通常使用包含重金属的高浓度的造影剂。
7.在现有技术中，在电子显微术中通常被用作用于生物样品的造影介质(contrast medium)的参照的造影介质(或造影剂)是乙酸双氧铀。然而，乙酸双氧铀及其衍生物的放射性质从安全角度来看造成了严格的限制。此外，由于乙酸双氧铀衍生物所受到的日益严格的监管，其递送和处置成本极高。
8.此外，这种类型的造影剂不适合于光学显微术，并且因此也不适合于关联显微术，
这都是由于在光谱的红色和绿色区域中的充足的背景(自体)荧光(background(auto)fluorescence)以及大多数合成的荧光团和基于蛋白质的荧光团对荧光信号的猝灭作用。
9.基于这些考虑，明显的是，基于乙酸双氧铀的传统造影剂的使用对样品具有两种相反的效果：在一方面，在电子显微术的情况下，其使得能够更好地可视化，在另一方面，其负面地影响对荧光的光学检测，因此抑制进行关联显微术实验的可能性。
10.然而，迄今为止，乙酸双氧铀仍然还是最常用于相关目的的造影剂，即使它对于这种技术来说不是最佳的，因为它必须以相对高的浓度使用，由于高的背景信号，这与基于荧光的技术不完全兼容。在这点上，在现有技术状态中，最常用的应急手段是保持造影剂的浓度尽可能低，然而这对样品对比度不利，因为已知乙酸双氧铀(ua)如果在低浓度使用不提供令人满意的结果。
11.至于目前可商购的作为乙酸双氧铀的替代品的造影介质(诸如例如“uranyless”、“336乙酸双氧铀替代品”、“nanow”和“铂蓝(platinum blue)”)，尽管它们能够克服处理放射性材料的问题，但它们在造影效率方面表现不佳，并且因此它们的使用在关联显微术的情况下甚至是更不利的。
12.因此，在本领域中存在以下强烈感觉到的需求：确定适用于常规电子显微术和关联显微术两者的情况的造影介质，以及最重要的是确定不是衍生自贫化铀并示出比迄今为止使用的乙酸双氧铀更高的造影效率，但是同时可以在荧光显微术中给出令人满意的结果并因此还可以在关联显微术实验中使用的造影介质。
13.自20世纪70年代初以来，已经研究和开发了使用不同于乙酸双氧铀及其类似物(例如，甲酸双氧铀)的物质进行的生物样品造影和阴性对比程序(negative contrast procedure)。目前最广泛地被用作乙酸双氧铀的替代品的程序在出版物basic techniques for transmission electron microscopy(m.a.hayat,academic press,1986)中描述，并且主要基于过渡金属的使用。
14.可以替代乙酸双氧铀并且具有与该化合物相似的性质的可能的造影介质最近已经是研究的主题。例如，在研究new versatile staining reagents for biological transmission electron microscopy that substitute for uranyl acetate.nakatoshi等人journal of electron microscopy 60(6):401
‑
407(2011)中，作者测试了呈乙酸盐形式的钐和钆，用于造影动物样品和植物样品两者，因为这两种元素在原子半径方面的尺寸与铀的尺寸相似。在结果的讨论中，据称在薄切片造影(thin section contrast)(切片后染色(post
‑
sectioning staining))中，测试的化合物可以是乙酸双氧铀的优良替代品，但是，至于造影效率，它们仅提供了一般的结果。此外，测试的化合物表明没有乙酸双氧铀的固定性质。
15.为了改善测试的化合物的造影能力，作者建议包含可以具有积极影响的补充物质。然而，在现有技术中，难以确定当加入镧系元素盐时能够形成具有低化学风险的化学稳定溶液并且使得可以获得至少就电子显微术而言更好的图像或者至少与用乙酸双氧铀可获得的图像相当的图像的物质。在这方面，磷钨酸(以首字母缩略词pta缩写)已经非常经常地在光学显微术中作为染色剂与其他物质组合使用，具有良好的结果，如例如在专利申请gb2372811中报告的。在该文献中，pta在醇溶液中与曙红或合成偶氮染料组合使用，但是决不与镧系元素或其盐组合使用。在另一方面，考虑到pta在造影技术中在透射电子显微术
(tem)中的使用，科学出版物examination of electron stains as a substitute for uranyl acetate for the ultrathin sections of bacterial cells.tgamuchu等人journal of electron microscopy 59(2):113
‑
118(2010)报告了pta和作为乙酸双氧铀的替代品的其他造影剂之间的比较研究。从这项研究中显现的是，没有一种测试的化合物(即，除了pta外，还有铂蓝、乌龙茶提取物和高锰酸钾)提供与乙酸双氧铀相当的造影结果。特别地，在革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌两者的测试中，pta提供低质量的图像。
16.专利wo2017/017428涉及样品的制备，特别是组织样品的制备，通过扫描电子显微术(sem)或透射电子显微术(tem)对其进行表征。特别地，为了提高通过电子显微术获得的图像的分辨率的目的，该公布设想了将二次电子发生体(secondary electron generator)(诸如例如，选自alcl3、ticl3、ticl4、crcl3、gacl3、ycl3、mocl3、agcl、incl3、sbcl3、hfcl3、tacl3、wcl3、oscl3、ircl3、aucl、haucl4、hgcl2、cecl3、ndcl3和ercl3)以及可能的造影介质(诸如例如，磷钨酸、磷钼酸、硝酸镧和/或其组合)并入待分析的样品中的可能性。所述专利还设想了并入自愈合材料的可能性，以便减少在成像期间对样品造成的可能的附带损伤。
17.然而，这些替代品中没有一种在关联显微术领域中被充分地测试，因为，如先前所提及的，目前可用于电子显微术的造影剂不总是适合于clem技术的最佳实施。事实上，本领域中的理想造影剂必须能够在相对低的浓度也完全地保留对比度，同时实现在荧光测量中优良的灵敏度。
18.本发明通过以下解决该问题：提供基于镧系元素盐和杂多酸的溶液及其在关联显微术(clem)和常规电子显微术(em)两者中作为造影溶液的用途。
19.申请人事实上已经发现，通过将镧系元素盐与杂多酸组合，有可能获得不仅与标准乙酸双氧铀的造影效率相当的而且甚至更好的造影效率，所述杂多酸通常在光学显微术中使用，但同时被认为在电子显微术中表现不佳。
20.因此，申请人开发了一种新的造影剂，该造影剂包含在合适的水/有机溶剂混合物或有机溶剂中的杂多酸和镧系元素盐，其受益于前述成分之间的协同效应。获得的令人惊讶的结果表明，本发明的造影溶液不仅提供比作为乙酸双氧铀的替代品的其他造影溶液更好的结果，而且在造影效率方面甚至超过乙酸双氧铀本身的性能，同时在荧光图像中保持良好的信号水平。事实上，本发明的造影溶液的更好的效率使得其还能够在低浓度使用，因此保持通过关联显微术表征的可能性。
21.因此，本发明的溶液可以替代目前在造影剂市场上可获得的商业替代品，用于关联clem表征和em表征两者，并且还代表目前市场上基于乙酸双氧铀的造影剂的经济替代品。
22.发明概述
23.本发明涉及一种溶液，其包含：在由水/有机溶剂混合物或有机溶剂组成的溶剂中的杂多酸和镧系元素盐。任选地，该溶液还可以包含具有包括在4
‑
6的区间内的ph的有机缓冲液或无机缓冲液，或强碱或强酸。本发明的目的还包括所述溶液及其组分之间的反应的任何产物作为用于生物样品的造影介质的用途，以及用于制备生物样品的方法，该方法在至少一个步骤中使用所述溶液，用于通过关联显微术(clem)或常规电子显微术(em)进行分析。
附图说明
24.图1示出了在用于在低温温度用有机溶剂置换水(fs—冷冻置换)的方案中由自动包埋器(automated embedder)使用的参数，该参数被用于制备生物样品，以根据实施例2借助于clem技术来表征。
25.图2示出了用于比较根据实施例2用不同造影方案制备的细胞的共焦显微镜图像。使用的置换(fs)介质是：100％丙酮，“未染色的”(a)；丙酮中0.1％乙酸双氧铀，“ua”(b)；按照实施例1获得的储备溶液，被冷冻干燥并且在丙酮中以相对于冷冻干燥之前的溶液的体积的1/10(v/v)比被重构，“x sol 1/10”(c)；按照实施例1获得的储备溶液，被冷冻干燥并且在丙酮中以相对于冷冻干燥之前的溶液的体积的1/16(v/v)比被重构，“x sol 1/16”(d)；以及按照实施例1获得的储备溶液，被冷冻干燥并且在丙酮中以相对于冷冻干燥之前的溶液的体积的1/30(v/v)比被重构，“x sol 1/30”(e)。
26.图3示出了按照实施例2通过荧光显微术观察的相同细胞、借助于透射电子显微术(tem)技术获得的图像。使用的置换(fs)介质是：100％丙酮，“未染色的”(a)；丙酮中0.1％乙酸双氧铀，“ua”(b)；按照实施例1获得的储备溶液，被冷冻干燥并且在丙酮中以相对于冷冻干燥之前的溶液的体积的1/10(v/v)比被重构，“x sol 1/10”(c)；按照实施例1获得的储备溶液，被冷冻干燥并且在丙酮中以相对于冷冻干燥之前的溶液的体积的1/16(v/v)比被重构，“x sol 1/16”(d)；以及按照实施例1获得的储备溶液，被冷冻干燥并且在丙酮中以相对于冷冻干燥之前的溶液的体积的1/30(v/v)比被重构，“x sol 1/30”(e)。
27.图4示出了在图2和图3中所示的细胞借助于透射电子显微术(tem)技术在较高放大倍数下获得的代表性图像。置换(fs)介质是根据本发明的优选的介质，即按照实施例1获得的储备溶液，其被冷冻干燥并且在丙酮中以相对于冷冻干燥之前的溶液的体积的1/10(v/v)比被重构，“x sol 1/10”。
28.图5示出了按照实施例3的应用于用实施例2中描述的技术使用乙醇代替丙酮作为有机溶剂制备的样品(果蝇卵母细胞(drosophila oocyte))的clem程序。
29.详述
[0030]“常规电子显微术”意指不利用光作为辐射源，而是利用电子束的显微术。“常规电子显微术”的实例是扫描电子显微术(sem)和透射电子显微术(tem)。因此，为了本发明的目的，根据上文给出的定义，术语“常规电子显微术”被用作“电子显微术(em)”的同义词。
[0031]
为了本发明的目的，“有机溶剂”意指相对于有机化合物和无机化合物的含量，具有包括在70％(v/v)和100％(v/v)(所谓的“绝对的”)之间的纯度并且具有包括在50％(v/v)和0％(v/v)(所谓的“无水的”)之间的含水量的任何有机溶剂。
[0032]
在第一方面中，本发明涉及一种溶液，该溶液包含：
[0033]
a)具有通式h3pm
12
o
40
的杂多酸，其中m是钨或钼；
[0034]
b)具有通式ln(iii)a
x*
nh2o的镧系元素盐，其中ln是属于镧系元素系列的不是钷的元素，a是有机阴离子或无机阴离子，x是大于或等于1的整数，并且n是大于或等于0的整数；
[0035]
c)溶剂，所述溶剂由水/有机溶剂混合物或有机溶剂组成，其中所述有机溶剂选自酮和醇，并且在水/有机溶剂混合物的情况下，所述有机溶剂相对于在酮的情况下的混合物的总体积以包括从1％(v/v)至99％(v/v)、优选地从20％(v/v)至99％(v/v)、更优选地从
90％(v/v)至95％(v/v)的量存在，或者所述有机溶剂相对于在醇的情况下的混合物的总体积以包括从71％(v/v)至99％(v/v)、优选地从80％(v/v)至95％(v/v)、更优选地从90％(v/v)至95％(v/v)的量存在。
[0036]
按照a)点，杂多酸或络合酸优选地是具有式h3pw
12
o
40
的磷钨酸或具有式h3pmo
12
o
40
的磷钼酸，它们是可商购的；或是它们的包含磷和钨或者磷和钼的已知前体，诸如，例如：具有式na2wo4的钨酸钠或具有式na2moo4的钼酸钠，两者都将与正磷酸和盐酸混合。
[0037]
按照b)点的镧系元素盐优选地具有作为阳离子的选自镱、铕、铽和钆的元素；镱是特别优选的。
[0038]
对应的阴离子优选地是卤化物，甚至更优选地，其是氯化物。镧系元素盐可以呈无水形式，在该情况下n等于0，或者呈水合形式。在后一种情况下，所述盐优选地包含数值n等于6的结晶水分子。
[0039]
本溶液的组分a)和组分b)之间的摩尔比率(b/a摩尔比率)优选地包括在0.1
‑
100、优选地在1
‑
50、甚至更优选地在1
‑
15的区间内。
[0040]
组分b)在溶剂c)中的浓度优选地包括在从0.01mm至250mm、优选地从0.1mm至100mm、甚至更优选地从1mm至50mm。事实上，在这些区间之外，人们观察到样品的非特异性对比度(nonspecific contrast)增加，这导致信噪比的降低。
[0041]
在本发明的优选的实施方案中，溶剂c)由水/有机溶剂混合物或有机溶剂组成，其中所述有机溶剂是酮，并且其中在水/有机溶剂混合物的情况下，有机溶剂相对于水/酮混合物的总体积以包括从1％(v/v)至99％(v/v)、优选地从20％(v/v)至99％(v/v)、更优选地从90％(v/v)至95％(v/v)的量存在。
[0042]
所述酮选自具有包括从1至4、优选地从1至3的碳原子数的酮。优选地，所述酮是丙酮。
[0043]
在本发明的一种实施方案中，溶剂c)由水/有机溶剂混合物或有机溶剂组成，其中所述有机溶剂是醇，并且其中在水/有机溶剂混合物的情况下，有机溶剂相对于水/醇混合物的总体积以包括从71％(v/v)至99％(v/v)、优选地从80％(v/v)至95％(v/v)、更优选地从90％(v/v)至95％(v/v)的量存在。所述醇选自具有包括从1至4、优选地从1至3的碳原子数的醇。所述醇优选地选自甲醇和乙醇。
[0044]
水和有机溶剂混合物具有优化造影剂渗透到生物样品中的优点，并且所述混合物的含水部分使得造影溶液的制备在上文描述的组分a)和组分b)的溶解方面更简单。
[0045]
任选地，在本发明的一些实施方案中，除了组分a)的固有缓冲力之外，还可以使用缓冲溶液或强酸或强碱来达到4
‑
6的ph区间。在缓冲溶液的情况下，其选自本领域技术人员已知的缓冲溶液，并且可以是有机缓冲液或无机缓冲液，诸如例如，2
‑
[n
‑
吗啉代]乙磺酸(mes)、卡可酸盐、乙酸盐或甲酸盐。
[0046]
在特别优选的实施方案中，根据本发明的溶液包含：
[0047]
a)具有式h3pw
12
o
40
的磷钨酸；
[0048]
b)具有式ybcl
3*
6h2o的氯化镱六水合物；
[0049]
c)由水/丙酮混合物组成的溶剂，该水/丙酮混合物包含相对于水/丙酮混合物的总体积的从90％(v/v)至95％(v/v)的丙酮；
[0050]
迄今为止所描述的包含组分a)至组分c)的溶液具有作为造影介质用于表征在悬
浮液中(阴性对比)或被包埋入树脂中的生物样品的应用，其被处理用于关联显微术(clem)或常规电子显微术(em)。
[0051]
在第二方面中，本发明涉及在环境压力和环境温度条件下并且在包括在4
‑
6的区间内的ph、由上文描述的组分a)和组分b)之间的反应可获得的化合物作为造影介质用于对生物样品通过关联显微术(clem)或常规电子显微术(em)进行分析的用途。
[0052]
由组分a)和组分b)之间的反应可获得的化合物意指包含源自组分a)的氧原子、磷原子和m原子以及源自组分b)的ln的化学物质，并且该化合物在前述条件下在溶剂c)的溶液中本身表现为热力学稳定的，并且可以在关联显微术(clem)技术和常规电子显微术(em)两者中使用，优选地在关联显微术(clem)技术中使用。
[0053]
根据优选的实施方案，所述化合物由等摩尔量的作为组分a)的磷钨酸和作为组分b)的氯化镱之间的反应获得，并且具有式[ybpw9o
34
]6‑
。该物质被定义为镧系元素多金属氧酸盐。
[0054]
在第三方面中，本发明涉及用于制备生物样品用于通过关联显微术(clem)或常规电子显微术(em)进行分析的方法，并且包括以下步骤：
[0055]
i)按照高压冷冻(hpf)方法，对待分析的生物样品进行物理固定；
[0056]
ii)在步骤(i)中获得的冷冻生物样品中进行在低温温度用有机溶剂置换水的技术(fs
‑
冷冻置换)，其中置换介质是包含如上文定义的组分a)至组分c)的溶液。
[0057]
按照步骤ii)的溶液当其具有包括在从0.01mm至250mm、优选地从0.1mm至100mm、甚至更优选地从1mm至50mm的组分b)的浓度时，证明是特别有效的。事实上，在这些区间之外，人们观察到样品的非特异性对比度增加，这导致信噪比的降低。
[0058]
在一种实施方案中，包含根据本发明的组分a)至组分c)的、按照步骤ii)的溶液可以从包含溶解在溶剂c')中的组分a)和组分b)的溶液开始获得，其中所述溶剂c')是包含至多70％(v/v)醇的含水溶剂或水醇溶剂，优选地包含至多70％(v/v)乙醇的水醇溶剂。包含组分a)、组分b)和组分c')的所述溶液代表中间溶液，并且为了本发明的目的，被称为“储备溶液”。在根据本发明的用于制备生物样品的方法的优选实施方案中，所述储备溶液事实上被干燥，优选地通过冷冻干燥，并且随后在合适量的如先前定义的溶剂c)中被重构，从而获得包含根据本发明的组分a)
‑
组分c)的溶液。
实施例
[0059]
实施例1
[0060]
pta
‑
ybcl3溶液(储备溶液)的制备
[0061]
制备磷钨酸(浓度3.2mm)在包含20％(v/v)乙醇的10ml的水/乙醇中的溶液。用氢氧化钠1m使该溶液的ph达到约5。向该溶液中加入相等体积的在包含20％(v/v)乙醇的乙醇/水中的氯化镱六水合物48mm(最终浓度)溶液。用氢氧化钠1m再次将ph调节至5。将混合物在室温在搅拌下保持过夜。如此获得的溶液被称为“x溶液1.5”，并且显示出沉淀物。通过过滤除去沉淀物，并且通过加入20mm的mes的溶液再次将ph调节至约5。然后将溶液再次在搅拌下保持过夜，并且再次过滤，这次是通过具有200nm的孔径的膜，以便获得无沉淀物的溶液，并且被称为“储备溶液”。然后将储备溶液在4℃的温度储存在黑暗中，直到使用时。
[0062]
实施例2
[0063]
使用根据本发明的溶液作为造影介质用于使用hpf/fs方案通过关联显微术(clem)表征生物样品
[0064]
将按照实施例1获得的储备溶液(0.2ml)冷冻干燥，并且在2ml(“x sol 1/10”)、3.2ml(“x sol 1/16”)或6ml(“x sol 1/30”)的包含95％(v/v)丙酮的水/丙酮混合物中重构，以便分别获得以三种不同浓度的根据本发明的溶液。
[0065]
将每种溶液离心，并且将上清液用作在用与内质网缀合的荧光蛋白稳定转染的细胞系上在标准hpf/fs方案(在图1中图示)中的置换介质。这些被用作用于关联方案的标准样品。用该方案包埋入的细胞借助于在低温温度用有机溶剂高压冷冻/置换水的技术(hpf/fs)进行处理。对样品切片(通过使用超微切片机切割)进行关联分析并且收集在支持物上用于电子显微术(铜网)。其上收集上述切片的相同网通过用于选择感兴趣的区域的共焦光学显微术和随后借助于超微结构方法(ultrastructural approach)两者进行分析。在源自相同样品的两种类型的图像之间的关联是关联方法的基本原理，即功能数据(functional data)(内质网的标记)与结构数据(当相同的细胞对荧光信号呈现阳性时)的结合。
[0066]
使用共焦光学显微术技术(图2)和透射电子显微术tem(图3)技术两者观察获得的多个样品，并且将结果与使用乙酸双氧铀(“ua”)作为造影剂或在没有造影剂(“未染色的”)的情况下获得的结果进行比较。
[0067]
图4示出了使用根据本发明的优选的造影溶液的样品的tem图像，造影溶液即从实施例1中描述的储备溶液开始，被冷冻干燥并且在丙酮中以相对于冷冻干燥之前的溶液的体积的1/10(v/v)比被重构来获得的溶液。在这些图像中，可以观察到细胞超微结构是如何正好由于造影效率的提高而被极好地分辨。特别地，在这种情况下，使用根据本发明的溶液使得有可能使使用传统造影剂例如基于乙酸双氧铀通常不可观察到的亚细胞细节(诸如例如细胞骨架)可视化。
[0068]
实施例3
[0069]
使用根据本发明的溶液作为造影剂用于使用hpf/fs方案、通过关联显微术(clem)表征生物样品(果蝇卵母细胞)
[0070]
使用果蝇卵母细胞作为生物样品并且使用乙醇作为有机溶剂代替丙酮，进行与实施例2中描述的实验类似的实验。获得的图像在图5中示出。
[0071]
由此获得的图像示出，本发明的溶液能够获得在荧光发射方面相当的结果，然而同时确保比当使用包含乙酸双氧铀的溶液时更好的对比度，因此证明在通过关联显微术(clem)表征的情况下更有效。