基于卵泡液蛋白表达作为不明原因复发性流产的预警方法与流程

1.本发明属于生殖医学领域，具体是一种不明原因复发性流产患者的预警方法。


背景技术：

2.在育龄期夫妇中，单次妊娠发生流产的几率大约为15
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25％，并且大多数流产发生于妊娠早期。约有2
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5％的育龄期夫妇会经历2次及以上的流产。通常将3次或3次以上在妊娠28周之前的胎儿丢失称为复发性流产，复发性流产的病因复杂，孕早期复发性流产的常见病因包括遗传因素，解剖结构异常，感染因素，自身免疫疾病、内分泌异常、血栓前状态及环境因素等等。尽管如此，约有一半以上的rsa病例无法得到确切的病因学诊断，被称为不明原因的复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，ursa)，由于病因未明，此类病人的个体化治疗及预防流产的再发是目前妇产科学和生殖医学临床工作中的重大难题。
3.研究统计显示，再次妊娠发生的流产的风险随着既往流产的次数而增加：初次妊娠的孕妇流产率为11％，而3次及3次以上流产史的妇女，其再次妊娠流产的发生率升高至40％。因此，我国专家建议，连续发生2次流产，其再次出现流产的风险与3次者相近，即应重视并予评估。然而，目前关于不明原因复发性流产的发病机制研究尚不明确，缺乏特异性的治疗手段，并且临床工作中关于复发性流产的再发风险的预判尚缺乏有效的分子标记物及评估体系，因此，研究建立流产发生的预警机制对于rsa患者的处理十分重要。
4.随着近年来各类高通量组学技术的发展，蛋白组学、代谢组学等技术在ursa发病机制的探索及分子标记物的寻找中发挥着重要的作用。已有文献报道利用蛋白组学、rna
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seq及生物信息学分析等技术检测复发性流产患者流产绒毛、蜕膜及子宫内膜组织的蛋白组学改变；但绒毛、蜕膜及子宫内膜组织成分复杂，且大样本的取材收集及验证的困难较大，难以用于临床上对于再妊娠风险的评估。另一方面，血清等体液是作为分子标记物检测的常用样本，近年来已有研究报道，利用itraq蛋白组学和prm技术及(1)h nmr技术对ursa患者的血清样本进行了蛋白组学、代谢组学的研究，发现了一系列潜在分子标志物。然而，由于女性生殖相关的激素、蛋白等关键因子受月经周期影响较大，血清样本的取样时间难以较好统一，并且其受全身其它系统的影响较大，为后续大样本的验证带来了困难。


技术实现要素：

5.本发明的目的是克服上述背景技术的不足，基于前期不明原因复发性流产患者行ivf的卵泡液蛋白组学研究，及后期扩大样本验证，提供一种基于卵泡液hrg、c4b蛋白表达水平作为不明原因复发性流产的预警方法，该种方法应能对ursa患者的妊娠结局有一定的预测价值。
6.本发明提供的技术方案是：
7.一种基于卵泡液hrg、c4b蛋白表达水平作为不明原因复发性流产的预警方法，所述方法非用于疾病诊断治疗；包括如下步骤：
8.1)卵泡液的收集、保存
9.对收集到的卵泡液在恒温下进行卵冠丘复合物的拾取后将剩余的卵泡液收集，进行1500rpm离心取上清、分装，冻存于
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80℃；
10.2)c4b、hrg卵泡液蛋白浓度elisa测定
11.采用相应蛋白的elisa检测试剂盒，对卵泡液进行相应蛋白浓度的检测；
12.3)结果统计及分析
13.对检测获得的卵泡液elisa蛋白浓度数据；与ursa患者卵泡液分子标记物的roc(receiver operator characteristic curve)曲线进行分析比对；
14.若检测获得的卵泡液蛋白的hrg浓度<35.80mg/dl时，患者本次取卵周期能获得活产的概率较低；或/和，若检测获得的卵泡液蛋白的c4b浓度>2739.7ng/ml时，患者本次取卵周期能获得活产的概率较低；
15.或者，用同一患者卵泡液蛋白的hrg浓度及c4 b浓度做logistic回归计算获得的预测概率值(predicted probability)作为检验变量，患者本次取卵周期是否获得活产作为状态变量绘制roc曲线；当患者的预测概率值>0.5816时，患者本次取卵周期能获得活产的概率较低。
16.步骤3)中，卵泡液蛋白的hrg浓度<35.80mg/dl，以及卵泡液蛋白的c4b浓度>2739.7ng/ml，分别由hrg浓度的roc曲线的cut
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off值以及c4b浓度的roc曲线的cut
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off值导出；
17.而hrg浓度的roc曲线以及c4b浓度的roc曲线，则分别由多个正常对照及ursa患者的卵泡液蛋白hrg浓度以及卵泡液蛋白c4b浓度作为检验变量，对应患者本次取卵周期是否获得活产作为状态变量绘制而成。
18.步骤3)中，患者的预测概率值>0.5816(对应的蛋白浓度为hrg<39.84mg/dl,c4b>2374.47ng/ml)，由预测概率值roc曲线的cut
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off值导出；预测概率roc曲线，由多个正常对照样本及ursa患者卵泡液蛋白的hrg浓度及c4b浓度做logistic回归计算获得的预测概率值作为检验变量，对应患者本次取卵周期是否获得活产作为状态变量绘制而成。
19.步骤3)中，所述患者的预测概率值>0.5816，对应的蛋白浓度为hrg<39.84mg/dl,c4b>2374.47ng/ml。
20.所述分析比对利用graphpad prism 7软件进行作图及统计分析，并且利用medcalc(medcalc software ltd，belgium)软件进行roc曲线的绘制及统计分析。
21.所述步骤1)卵泡液的收集，取样时间统一为hcg扳机，即lh高峰后36小时，再经阴道取卵术中获得。
22.本发明的有益效果是：本发明利用进行辅助生育的不明原因复发性流产患者的卵泡液作为检测样本，通过tmt蛋白组学及扩大样本elisa验证，建立了hrg及c4b作为预测再生育风险的分子标记物的体系。主要包括：
23.1、本发明在样本收集过程中结合了不明原因复发性流产患者的既往病史及本次行辅助生育治疗结局，首次利用tmt技术对不明原因复发性流产再生育未获得正常临床妊娠的患者卵泡液蛋白水平的改变进行蛋白组学对比分析；针对性地筛选了对再生育结局有预测价值的差异蛋白。
24.2、首次发现在既往有ursa，本次行ivf/icsi仍未获得正常妊娠的患者卵泡液中
hrg表达下降、c4b表达上升；在扩大样本进行验证的同时，利用roc曲线分析，进一步证实了hrg、c4b在卵泡液中的蛋白表达水平对ursa患者的妊娠结局有一定的预测价值。
25.3、首次利用roc曲线分析，并且计算出相应蛋白表达预测辅助生殖妊娠结局的cut
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off值，具有实际应用价值。
附图说明
26.图1是本发明实施例的卵泡液蛋白hrg浓度elisa检测结果。
27.图2是hrg卵泡液浓度为检验变量，取卵周期患者是否获得活产为状态变量的roc曲线。
28.图3是本发明实施例的卵泡液蛋白c4b浓度elisa检测结果。
29.图4是c4b卵泡液浓度为检验变量，本次取卵周期患者是否获得活产为状态变量的roc曲线。
30.图5是以预测概率值(predicted probability)为检验变量，取卵周期患者是否获得活产为状态变量绘制roc曲线(预测概率值通过同一样本hrg及c4b做logistic回归计算后获得)。
具体实施方式
31.发明人分别收集了不明原因的复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，ursa)且本次取卵周期未获得正常临床妊娠，以及管性因素不孕且本次取卵周期获得活产的患者作为正常对照(healthy control)，通过tmt(tandem mass tag)技术，对卵泡液进行蛋白组学水平的差异表达蛋白的测定。通过对差异表达蛋白进行初步筛选，并且进行进一步扩大样本的elisa验证，发现hrg在ursa患者中呈低水平表达，c4b呈高水平表达。进一步roc(receiver operator characteristic curve)曲线分析，结果显示，以hrg卵泡液浓度为检验变量、本次取卵周期患者是否获得活产为状态变量绘制roc曲线，其曲线下面积(area under curve,auc)为0.785(p<0.01)，以c4b卵泡液浓度为检验变量、本次取卵周期患者是否获得活产为状态变量绘制roc曲线，auc为0.710(p<0.01)。以上结果进一步明确了相应蛋白对临床妊娠结局的预测价值。提示上述两种蛋白可作为ursa患者的辅助生殖结局具有预警的分子标记物。
32.以下结合附图所示实施例对本发明进一步说明。
33.1、卵泡液的收集：
34.本发明收集的样本均为拟进行体外受精(ivf)治疗的患者的成熟卵泡卵泡液，患者接受控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation)的治疗，在此期间通过阴道b超监测卵泡大小、血清e2、p、lh、fsh值等指标检测卵巢反应，并根据患者个体反应适当调整药物剂量。当主导卵泡群中至少2个优势卵泡直径>18mm，并参考患者雌激素水平，在合适时单次注射hcg5000～10000单位或hcg 达比佳诱导排卵，并于36小时后行经阴超声引导下取卵术。在术中用单腔管对卵泡进行抽吸，收集到的卵泡液在恒温下进行卵冠丘复合物的拾取后将剩余的卵泡液收集，进行1500rpm离心、分装，冻存于
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80℃。本发明共收集了44例hc及43例ursa患者的卵泡液，对hrg、c4b蛋白浓度进行了扩大样本检测。
35.2、c4b、hrg卵泡液蛋白浓度elisa测定。
36.购买相应蛋白的elisa检测试剂盒，按厂家建议的操作步骤进行相应蛋白浓度的检测。使用的试剂盒主要包括：hrg(cloud
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clone corp，sec534hu)、c4b(cloud
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clone corp，seb305hu)。
37.3、结果统计及分析。
38.卵泡液elisa蛋白浓度结果利用graphpad prism 7软件(graphpad software,san diego,california,usa)进行作图及统计分析。
39.4、数据处理分析
40.(1)卵泡液蛋白hrg浓度elisa检测结果(参见图1)。
41.(2)以hrg卵泡液浓度为检验变量，取卵周期患者是否获得活产为状态变量绘制roc曲线，纵坐标为灵敏度，横坐标为1
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特异度，auc为曲线下面积，cut
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off值为<35.80mg/dl；即当卵泡液中hrg浓度<35.80mg/dl时，患者本次取卵周期能获得活产的概率较低，其检测灵敏度为56.1％，准确性为88.6％(参见图2)。
42.(3)卵泡液蛋白c4b浓度elisa检测结果(参见图3)。
43.(4)以c4b卵泡液浓度为检验变量，本次取卵周期患者是否获得活产为状态变量绘制roc曲线，纵坐标为灵敏度，横坐标为1
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特异度，auc为曲线下面积，cut
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off值为>2739.7ng/ml；即当卵泡液中c4b浓度>2739.7ng/ml时，患者本次取卵周期能获得活产的概率较低，其检测灵敏度为56.4％，准确性为78.4％(参见图4)。
44.(5)以多个正常对照样本及ursa卵泡液蛋白的hrg浓度及c4b浓度做logistic回归计算预测概率值(predicted probability)，以该预测概率值为检验变量，本次取卵周期患者是否获得活产为状态变量绘制roc曲线。***p<0.001，*p<0.05。预测概率值的cut
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off值为>0.5816，其对应的hrg<39.84mg/dl,c4b>2374.47ng/ml；即当患者的预测概率值>0.5816时，患者本次取卵周期能获得活产的概率较低，其检测灵敏度为77.8％，准确性为81.8％(参见图5)。
45.本发明的特点：
46.1、利用成熟卵泡的卵泡液作为检测样本，其取样时间统一为hcg扳机，即lh高峰后36小时，再经阴道取卵术中获得，样本均一性较好，对于进行辅助生育的患者来说，能在行取卵术时获得足量样本，取样方便，且卵泡液在取卵术后属于丢弃样本，不会对患者造成损伤。并且卵泡液的成份为卵子发育、受精的等重要的生殖生理过程所必须，相较于血清来说更为稳定；用卵泡液进行检测分析，克服了血清、尿液等样本取样时间、月经周期及机体其它系统的影响，能更直观的反应卵泡生长微环境的状态。
47.2、本发明在样本收集过程中结合了不明原因复发性流产患者的既往病史及本次行辅助生育治疗结局，针对性地筛选了对再生育结局有预测价值的差异蛋白。
48.3、在扩大样本进行验证的同时，利用roc曲线分析，进一步证实了hrg、c4b在卵泡液中的蛋白浓度对生育结局有一定的预测价值，且计算出了两者在分别单独预测以及联合预测生育结局的cut
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off值，并且，当使用hrg与c4b蛋白表达水平进行联合预测时，其准确性及灵敏度均有较大提高。
49.本发明通过前期对ursa患者的卵泡液tmt蛋白组学分析，利用大数据组学的手段揭示了ursa患者卵泡液的差异表达蛋白谱，并通过go功能富集分析、kegg通路富集分析及蛋白互作网络分析(ppi)等生物信息分析方法，以及既往的文献研究，筛选出c4b及hrg作为
ursa的候选分子标记物，有更好的创新性及针对性，本发明通过扩大样本elisa验证及roc(receiver operator characteristic curve)曲线分析，进一步明确相应蛋白对临床妊娠结局的预测价值，有较强的理论及实验依据。