K252c衍生物的制备方法和在制备抗肿瘤转移药物中的应用与流程

k252c衍生物的制备方法和在制备抗肿瘤转移药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及k252c衍生物的制备方法和在制备抗肿瘤转移药物中的应用。


背景技术：

2.肿瘤转移是一个复杂的连续的生物学过程，包括细胞从原发肿瘤病灶脱落进入淋巴和血液循环、细胞在循环中存活、被新器官捕获、渗透进入周围组织、定殖在新组织并生长增殖。
3.90％以上的癌症死亡病例与肿瘤转移有关，然而由于对肿瘤转移机理的了解还不够充分，在抑制肿瘤转移方面的突破非常有限，尚未有成功的药物上市。
4.发明人前期从海洋链霉菌次级代谢产物中发现了系列吲哚咔唑类天然产物(参见公开号为cn 108164537 a的专利说明书)，其中化合物i
‑
1(在本发明中命名为thk01)具有较强的rock2抑制活性，ic
50
为6nm，可作为rock2抑制剂。
5.目前已有的研究结果是，rho
‑
rock信号通路在肌动蛋白细胞骨架重塑、控制应激纤维形成、f
‑
actin稳定和网络组装以及微管稳定中起着关键作用(feng,y.；lograsso,p.v.；defert,o.；li,r.rho kinase(rock)inhibitors and their therapeutic potential.j.med.chem.2016,59,2269
‑
2300.)。
6.然而，至今仍没有发现rock2抑制剂与抗肿瘤转移之间是否有必然的关联性。例如，目前仅有的4种获批上市的rock抑制剂药物，其中fasudil、ripasudil和netarsudil主要应用于治疗青光眼、高眼压症等，belumosudil用于治疗12岁以上的慢性移植物抗宿主病患者，这些上市药物在抗肿瘤转移方面效果并不理想。


技术实现要素：

7.本发明研究了一系列k252c衍生物，结构式和相应命名如下：
[0008][0009]
本发明深入研究了thk01的药效学，发现该化合物在细胞及动物水平上均具有显著的抗肿瘤转移作用，且效果优于阳性对照药y27632。因此本发明可为该类型化合物抗肿瘤转移相关药物的开发提供参考。
[0010]
本发明提供了thk01在制备抗乳腺癌细胞转移的药物中的应用。thk01具有明显的抗肿瘤转移作用，可用来开发用于治疗抗肿瘤转移相关疾病的药物或者肿瘤疾病的辅助性治疗药物，应用前景广阔。
[0011]
本发明还提供了一种抗乳腺癌细胞转移的药物，含有有效量的thk01。
[0012]
所述乳腺癌细胞优选为人乳腺癌细胞mda
‑
mb
‑
231细胞。
[0013]
所述的抗乳腺癌细胞转移的药物，给药方式优选为静脉注射。
[0014]
本发明对上述k252c衍生物进行了全合成，研究发现这些化合物均具有一定的rock2激酶抑制作用。
[0015]
本发明提供了一种k252c衍生物的制备方法，整体合成路线包括：
[0016]
所述制备方法以邻硝基苯甲醛或其衍生物经化学合成而来，反应共5
‑
7步，反应产率高，易于操作和实施，具体包括步骤：
[0017]
1)wittig反应：化合物a与磷叶立德在无水乙腈中反应，反应温度为60℃，得到化合物b；
[0018]
2)化合物b与叔丁基二甲基硅烷基三氟甲烷磺酸酯在无水二氯甲烷和三乙胺中反应，反应温度为50℃，得到化合物c；
[0019]
3)diels
‑
alder反应：化合物c与马来酰亚胺在甲苯中反应，反应温度为100℃，得到化合物d；
[0020]
4)cadogan反应：化合物d在亚磷酸三乙酯兼作反应物和溶剂的条件下生成吲哚衍生物，反应温度为160℃，得到化合物e；
[0021]
5)fischer吲哚合成反应：化合物e与苯肼衍生物在乙醇和乙酸混合溶剂(乙醇和乙酸优选体积比为1:1)中生成吲哚或吲哚衍生物，反应温度为80℃，得到化合物f；
[0022]
所述化合物a为邻硝基苯甲醛，所述苯肼衍生物为对甲氧基苯肼盐酸盐，所述化合物f为thk02；
[0023]
或者，所述化合物a为邻硝基间甲氧基苯甲醛，所述苯肼衍生物为对甲氧基苯肼盐酸盐，所述化合物f为thk06；
[0024]
或者，所述化合物a为邻硝基苯甲醛，所述苯肼衍生物为对甲基苯肼盐酸盐，所述化合物f为thk13；
[0025]
或者，所述化合物a为邻硝基苯甲醛，所述苯肼衍生物为对叔丁基苯肼盐酸盐，所述化合物f为thk16；
[0026]
或者，所述化合物a为邻硝基苯甲醛，所述苯肼衍生物为邻甲氧基苯肼盐酸盐，所
述化合物f为thk19；
[0027]
或者，所述化合物a为邻硝基苯甲醛，所述苯肼衍生物为间甲氧基苯肼盐酸盐，所述化合物f为thk23、thk24。
[0028]
所述的制备方法在步骤5)基础上，可再进行步骤6)脱甲基反应或6)还原反应。
[0029]
6)还原反应：化合物f中5或7位的羰基经锌粉/盐酸还原成亚甲基，反应温度为100℃，得到化合物j和/或化合物k；
[0030]
所述化合物f为thk02，得到化合物j thk05，化合物k thk04；
[0031]
或者，所述化合物f为thk06，得到化合物j thk09；
[0032]
或者，所述化合物f为thk13，得到化合物j thk15，化合物k thk14；
[0033]
或者，所述化合物f为thk16，得到化合物j thk18，化合物k thk17。
[0034]
6)脱甲基反应：化合物f的甲氧基在三溴化硼的作用下脱去甲基生成羟基，反应温度为室温，得到化合物g；
[0035]
所述化合物f为thk02，所述化合物g为thk03；
[0036]
或者，所述化合物f为thk06，所述化合物g为thk07、thk10；
[0037]
或者，所述化合物f为thk19，所述化合物g为thk20；
[0038]
或者，所述化合物f为thk24，所述化合物g为thk25。
[0039]
所述的制备方法在步骤6)脱甲基反应基础上，可再进行步骤7)还原反应或7)甲基化反应。
[0040]
7)还原反应：化合物g中5或7位的羰基经锌粉/盐酸还原成亚甲基，反应温度为100℃，得到化合物h和/或化合物i；
[0041]
所述化合物g为thk03，得到化合物h thk01；
[0042]
或者，所述化合物g为thk07，得到化合物h thk08；
[0043]
或者，所述化合物g为thk10，得到化合物h thk12，化合物i thk11；
[0044]
或者，所述化合物g为thk20，得到化合物h thk22，化合物i thk21；
[0045]
或者，所述化合物g为thk25，得到化合物h thk27，化合物i thk26。
[0046]
7)甲基化反应：thk03的nh、oh在碘甲烷的作用下被甲基化，反应温度为室温，得到thk28。
[0047]
本发明与现有技术相比，主要优点包括：本发明所涉及的化合物合成路线简单，反应产率高，易于操作和实施；细胞和动物水平实验表明thk01对细胞的毒性较小，在较小的剂量下可显示出显著的抗肿瘤转移作用，且效果优于现有的处在临床研发阶段的阳性药物y27632。
附图说明
[0048]
图1为thk01抑制乳腺癌细胞mda
‑
mb
‑
231的迁移及增殖能力分析，(a，b)thk01抑制mda
‑
mb
‑
231细胞的迁移，(c)thk01抑制mda
‑
mb
‑
231细胞的ic
50
曲线；
[0049]
图2为thk01体内抑制乳腺癌细胞mda
‑
mb
‑
231的转移，(a)小鼠模型实验设计，(b)小鼠体内生物素荧光成像(第45天)，(c)荧光信号(图b)的定量分析，(d)不同处理组小鼠的体重变化情况。
具体实施方式
[0050]
下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中用于细胞和动物实验的化合物thk01纯度在98％以上。
[0051]
实施例1.thk01的全合成
[0052][0053]
称取10g(66mmol)邻硝基苯甲醛(a，2
‑
nitro
‑
benzaldehyde)和21g(66mmol)磷叶立德(phosphorus ylides)于250ml反应瓶中，加入50ml无水乙腈，60℃下搅拌回流反应12h。tlc检测反应进程直到原料消失，减压浓缩反应产物并经硅胶柱色谱分离(流动相为二氯甲烷)得到淡黄色固体b(12.6g，100％)。
[0054][0055]
称取12.6g(66mmol)产物b于三颈反应瓶中，加入40ml无水二氯甲烷使其溶解。连接好装置使其反应体系中充满n2，依次滴加26.7g(264mmol)三乙胺和34.9g(132mmol)叔丁基二甲基硅烷基三氟甲烷磺酸酯(tbdmsotf)，50℃下搅拌回流反应4h，加入三乙胺(6.7g，66mmol)，终止反应。产物经饱和碳酸钠萃取、水洗、无水硫酸钠除水后通过硅胶柱色谱分离(流动相为石油醚:二氯甲烷＝8:1)得到淡黄色固体c(17.1g，85％)。
[0056][0057]
称取17.1g(56mmol)产物c和5.5g(56mmol)马来酰亚胺(maleimide)于250ml反应瓶中，加入50ml甲苯，100℃下避光回流反应9h。减压浓缩反应产物并通过硅胶柱色谱分离(流动相依次为二氯甲烷:石油醚＝8:1,1:0；二氯甲烷:乙酸乙酯＝10:1,5:1)得到淡黄色固体d(18.1g，80％)。
[0058][0059]
称取10g(24.9mmol)产物d于250ml反应瓶中，加入16.5g(99.6mmol)亚磷酸三乙酯(triethyl phosphite)，160℃搅拌回流4h。产物通过减压蒸馏去除溶剂后经饱和碳酸氢钠萃取、水洗、无水硫酸钠除水后通过硅胶柱色谱分离(流动相为二氯甲烷:乙酸乙酯＝6:1，4:1)得到淡黄色固体e(3.5g，55％)。
[0060][0061]
称取产物e 1g(3.9mmol)和0.7g(5mmol)对甲氧基苯肼盐酸盐(4
‑
methoxyphenylhydrazine hydrochloride)于250ml反应瓶中，加入50ml溶剂(体积比acoh:etoh＝1:1)，80℃搅拌回流12h。产物经减压蒸馏除去溶剂后通过硅胶柱色谱分离(流动相为石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得到黄色固体thk02(0.88g，63％)。
[0062][0063]
称取1g(2.8mmol)产物thk02于三颈反应瓶中，加入40ml无水二氯甲烷使其溶解。连接好装置使其反应体系中充满n2，0℃下滴加7g(28mmol)三溴化硼(boron tribromide)，室温反应48h。待反应完成后加水终止反应，反应混合物经饱和碳酸钠萃取、水洗、无水硫酸钠除水后通过硅胶柱色谱分离(流动相为二氯甲烷:甲醇＝20:1)得到橙黄色固体thk03(0.91g，95％)。
[0064][0065]
称取1g(2.9mmol)产物7于100ml反应瓶中，加入5ml乙酸，加入过量活化好的锌粉/粒，100℃搅拌回流，待温度升至100℃时向反应体系中滴加浓盐酸2ml。反应完成后加入适
量饱和碳酸氢钠溶液并用乙酸乙酯萃取，水洗，减压蒸干产物。通过硅胶柱色谱(流动相为二氯甲烷:甲醇＝10:1)除去剩余的锌粉及其它杂质，得到产物thk01及其异构体混合物。混合物经hplc高压液相制备(35％乙腈水，agilent pursuit c18column，10μm，21.2
×
250mm)得到白色固体thk01(t
r
＝25min)。thk01产量为0.34g，产率为35％。
[0066]
实施例2.衍生物的合成
[0067]
根据上述合成路线，通过更换step1或者step5步骤的反应底物等获得thk01的衍生物，反应条件及纯化方式一致。具体路线可参照合成路线。
[0068]
thk04、thk05：将thk02通过还原反应得到thk04和thk05，还原产物经hplc高压液相制备(35％乙腈水，agilent pursuit c18 column，10μm，21.2
×
250mm，下述未特殊说明的均使用的是此制备柱)得到白色固体thk04(t
r
＝54min，产率45％)和thk05(t
r
＝70min，产率44％)。
[0069]
thk06、thk07、thk08：将第1步反应底物更换为邻硝基间甲氧基苯甲醛，其余操作同合成thk01。分别经硅胶柱色谱分离得到thk06(第5步反应，产率68％)和thk07(第6步反应时间48h，产率90％)；第7步反应产物经hplc高压液相制备(50％甲醇水)得到白色固体thk08(t
r
＝16min，产率83％)。
[0070]
thk09：thk06经还原反应得到thk09。第7步反应产物经hplc高压液相制备(50％甲醇水)得到白色固体thk09(t
r
＝38min，产率92％)。
[0071]
thk10、thk11、thk12：thk06经三溴化硼脱甲基室温反应24h，可得到thk10(产率90％)，还原后经hplc高压液相制备(33％乙腈水)得到白色固体thk11(t
r
＝20min，产率43％)和thk12(t
r
＝27min，产率45％)。
[0072]
thk13、thk14、thk15：将第5步反应底物更换为对甲基苯肼盐酸盐，其余操作同合成thk01。第5步反应产物经硅胶柱色谱分离得到thk13(产率75％)；无需进行第6步反应；第7步反应产物经hplc高压液相制备(40％乙腈水)得到白色固体thk15(t
r
＝23min，产率41％)和thk14(t
r
＝26min，产率42％)。
[0073]
thk16、thk17、thk18：将第5步反应底物更换为对叔丁基苯肼盐酸盐，其余操作同合成thk01。第5步反应产物经硅胶柱色谱分离得到thk16(产率78％)；无需进行第6步反应；第7步反应产物经hplc高压液相制备(55％甲醇水)得到白色固体thk18(t
r
＝11min，产率43％)和thk17(t
r
＝15min，产率44％)。
[0074]
thk19、thk20、thk21、thk22：将第5步反应底物更换为邻甲氧基苯肼盐酸盐，其余操作同合成thk01。第5步反应产物经hplc高压液相制备(85％甲醇水)得到黄色固体thk19(t
r
＝13min，产率60％)；第6步反应产物经hplc高压液相制备(75％甲醇水)得到黄色固体thk20(t
r
＝12min，产率93％)；第7步反应产物经hplc高压液相制备(30％乙腈水，agilent zorbax c18 column，5μm，9.4
×
250mm)得到白色固体thk22(t
r
＝30min，产率33％)和thk21(t
r
＝33min，产率35％)。
[0075]
thk23、thk24、thk25、thk26、thk27：将第5步反应底物更换为间甲氧基苯肼盐酸盐，其余操作同thk01。第5步反应产物经hplc高压液相制备(75％甲醇水)得到黄色固体thk23(t
r
＝16min，产率16％)和thk24(t
r
＝20min，产率69％)；第6步反应产物经hplc高压液相制备(60％乙腈水)得到黄色固体thk25(t
r
＝10min，产率95％)；第7步反应产物经hplc高压液相制备(30％乙腈水，agilent zorbax c18column，5μm，9.4
×
250mm)得到白色固体
thk27(t
r
＝19min，产率35％)和thk26(t
r
＝25min，产率33％)。
[0076]
thk28：thk03经碘甲烷甲基化反应得到。反应产物经hplc高压液相制备(70
‑
100％乙腈水)得到黄色固体thk28(t
r
＝28min，产率95％)。
[0077]
所有纯化的化合物干燥后，置于
‑
20或
‑
80℃保存。
[0078]
实施例3.化合物的鉴定
[0079]
thk01：白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m h]

m/z328.1080(计算值为328.1086)，分子式为c
20
h
14
n3o2。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.78(1h,s),11.29(1h,s),8.96(1h,s),8.62(1h,d,j＝2.5hz),8.44(1h,s),8.01(1h,d,j＝7.7hz),7.74(1h,d,j＝8.1hz),7.49(1h,d,j＝8.6hz),7.45(1h,t,j＝8.1hz),7.28(1h,t,j＝7.7hz),6.91(1h,dd,j＝2.6,8.6hz),4.93(2h,s).合成的化合物thk01谱图数据同前期分离提取得到的天然产物一致(bioactive indolocarbazoles from the marine
‑
derived streptomyces sp.dt
‑
a61[j].j.nat.prod.2018,81,949
‑
956.)。
[0080]
thk02：黄色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 378.0848(计算值为378.0855)，分子式为c
21
h
13
n3o3。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.80(1h,s),11.63(1h,s),10.97(1h,s),8.99(1h,d,j＝7.9hz),8.58(1h,d,j＝2.5hz),7.80(1h,d,j＝8.1hz),7.74(1h,d,j＝8.8hz),7.54(1h,t,j＝8.1hz),7.35(1h,d,j＝7.8hz),7.21(1h,dd,j＝2.6,8.8hz).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ171.4,171.4,153.8,140.2,135.2,129.7,129.1,126.6,124.2,122.1,121.6,120.2,119.9,119.5,116.0,115.5,115.2,112.8,112.0,106.6,55.5.
[0081]
thk03：橙色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 364.0696(计算值为364.0698)，分子式为c
20
h
11
n3o3。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.72(1h,s),11.47(1h,s),10.92(1h,s),9.22(1h,s),8.97(1h,d,j＝7.9hz),8.41(1h,d,j＝2.4hz),7.79(1h,d,j＝8.1hz),7.61(1h,d,j＝8.7hz),7.53(1h,t,j＝8.1hz),7.34(1h,t,j＝7.6hz),7.04(1h,dd,j＝2.4,8.7hz).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ171.4,171.4,151.5,140.2,134.3,129.7,129.0,126.6,124.2,122.4,121.7,120.1,120.0,119.2,116.5,115.4,115.1,112.4,112.0,108.8.
[0082]
thk04：白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 364.1059(计算值为364.1062)，分子式为c
21
h
15
n3o2。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ12.15(2h,br s),9.20(1h,d,j＝7.9hz),8.47(1h,br s),7.65(2h,m),7.50(1h,d,j＝1.8hz),7.39(1h,t,j＝8.0hz),7.20(1h,d,j＝7.7hz),7.10(1h,dd,j＝2.4,8.7hz),4.97(2h,s),3.91(3h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ172.6,153.8,139.1,134.2,133.1,128.8,125.7,125.2,124.8,123.0,122.9,118.7,118.3,115.2,114.0,113.9,112.5,111.3,103.9,55.7,45.3.
[0083]
thk05：白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 364.1061(计算值为364.1062)，分子式为c
21
h
15
n3o2。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ12.70(1h,s),12.29(1h,s),8.83(1h,d,j＝2.6hz),8.39(1h,s),8.01(1h,d,j＝7.8hz),7.71(1h,d,j＝8.1hz),7.56(1h,d,j＝8.7hz),7.44(1h,t,j＝8.1hz),7.27(1h,t,j＝7.4hz),7.06(1h,dd,j＝2.6,8.7hz),4.94(2h,s),3.86(3h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ172.6,152.8,139.4,137.0,134.3,132.3,128.3,126.4,124.7,123.2,122.6,121.0,119.6,118.6,115.4,114.3,113.8,111.8,107.5,55.5,45.3.
[0084]
thk06：黄色固体。hresims给出准分子离子峰为[m h]

m/z 386.1139(计算值为386.1141)，分子式为c
22
h
15
n3o4。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.55(2h,s),10.96(1h,s),8.56(2h,d,j＝2.6hz),7.72(2h,d,j＝8.8hz),7.19(2h,dd,j＝2.6,8.8hz),3.90(6h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ171.4,153.8,135.1,129.6,122.1,119.6,115.9,115.3,112.7,106.5,55.5.
[0085]
thk07：黄色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 380.0634(计算值为380.0647)，分子式为c
20
h
11
n3o4。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.41(2h,s),10.85(1h,s),9.20(2h,s),8.39(2h,d,j＝2.4hz),7.58(2h,d,j＝8.6hz),7.02(2h,dd,j＝2.4,8.6hz).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ171.4,151.4,134.2,129.6,122.4,119.4,116.3,115.0,112.3,108.8.
[0086]
thk08：灰白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 366.0854(计算值为366.0855)，分子式为c
20
h
13
n3o3。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.39(2h,br s),8.96(2h,br s),8.61(1h,d,j＝2.5hz),8.33(1h,s),7.54(1h,d,j＝8.6hz),7.46(1h,d,j＝8.6hz),7.32(1h,d,j＝2.3hz),6.95(1h,dd,j＝2.3,8.6hz),6.90(1h,dd,j＝2.5,8.6hz),4.86(2h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ172.6,151.4,150.3,133.4,133.3,132.5,128.8,126.3,123.6,123.4,118.1,115.0,114.7,114.2,113.5,112.2,111.4,109.7,105.7,45.1.
[0087]
thk09：白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 394.1169(计算值为394.1168)，分子式为c
22
h
17
n3o3。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.37(1h,s),11.18(1h,s),8.83(1h,d,j＝2.6hz),8.43(1h,s),7.68(1h,d,j＝8.8hz),7.61(1h,d,j＝8.8hz),7.49(1h,d,j＝2.5hz),7.10(1h,dd,j＝2.5,8.8hz),7.06(1h,dd,j＝2.6,8.8hz),4.96(2h,s),3.91(3h,s),3.86(3h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ173.1,154.4,153.5,134.6,134.5,133.4,129.2,126.7,123.9,123.6,119.0,116.0,114.9,114.5,114.4,113.1,112.4,108.1,104.4,56.2,56.0,45.8.
[0088]
thk10：黄色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 394.0805(计算值为394.0804)，分子式为c
21
h
13
n3o4。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.53(2h,br s),10.90(1h,s),9.21(1h,s),8.56(1h,d,j＝2.6hz),8.40(1h,d,j＝2.5hz),7.70(1h,d,j＝8.8hz),7.60(1h,d,j＝8.6hz),7.18(1h,dd,j＝2.6,8.8hz),7.03(1h,dd,j＝2.5,8.8hz),3.90(3h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ171.5,171.4,153.8,151.5,135.1,134.3,129.7,129.6,122.4,122.2,119.7,119.3,116.4,115.8,115.2,115.1,112.7,112.3,108.8,106.6,55.5.
[0089]
thk11：灰白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 380.1008(计算值为380.1011)，分子式为c
21
h
15
n3o3。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.42(1h,s),11.32(1h,s),9.12(1h,s),8.82(1h,d,j＝2.7hz),8.36(1h,s),7.59(1h,d,j＝8.7hz),7.56(1h,d,j＝8.6hz),7.33(1h,d,j＝2.3hz),7.05(1h,dd,j＝2.6,8.7hz),6.96(1h,d,j＝2.3,8.6hz),4.89(2h,s),3.86(3h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ172.6,152.9,151.4,134.1,133.2,132.8,128.7,126.2,123.4,123.3,118.1,115.2,114.3,114.2,113.7,112.3,111.8,107.5,105.7,55.5,45.1.
[0090]
thk12：灰白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 380.1005(计算值为380.1011)，分子式为c
21
h
15
n3o3。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.56(1h,s),11.31(1h,s),8.88(1h,s),8.61(1h,d,j＝2.5hz),8.43(1h,s),7.65(1h,d,j＝8.8hz),7.47(2h,m),7.08
(1h,dd,j＝2.5,8.8hz),6.90(1h,dd,j＝2.5,8.6hz),4.94(2h,s),3.90(3h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ172.6,153.8,150.4,134.0,133.4,132.5,128.8,126.2,123.6,123.1,118.4,115.2,114.8,113.7,113.7,112.5,111.5,109.7,103.8,55.7,45.2.
[0091]
thk13：黄色固体。hresims给出准分子离子峰为[m h]

m/z 340.1076(计算值为340.1086)，分子式为c
21
h
13
n3o2。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.72(1h,s),11.62(1h,s),10.95(1h,s),8.97(1h,d,j＝7.9hz),8.78(1h,s),7.78(1h,d,j＝8.2hz),7.68(1h,d,j＝8.2hz),7.54(1h,m),7.38(1h,dd,j＝1.6,8.4hz),7.34(1h,t,j＝7.6hz),2.53(3h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ171.5,171.5,140.5,138.8,129.4,129.2,129.2,128.4,127.0,124.4,124.1,121.9,121.7,120.4,120.0,119.8,115.6,115.5,112.2,111.9,21.5.
[0092]
thk14：白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m h]

m/z 326.1288(计算值为326.1293)，分子式为c
21
h
15
n3o。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ12.01(1h,s),11.93(1h,s),9.20(1h,d,j＝8.0hz),8.45(1h,s),7.83(1h,s),7.67(1h,d,j＝8.0hz),7.63(1h,d,j＝8.0hz),7.40(1h,t,j＝7.8hz),7.29(1h,d,j＝8.2hz),7.20(1h,d,j＝7.6hz),4.94(2h,m),2.53(3h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ172.5,139.1,137.5,132.9,128.5,128.3,126.2,125.6,125.1,124.8,122.8,122.8,120.9,118.7,118.5,115.2,113.8,111.5,111.2,45.3,21.2.
[0093]
thk15：白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 348.1105(计算值为348.1113)，分子式为c
21
h
15
n3o。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.71(1h,s),11.42(1h,s),9.01(1h,s),8.46(1h,s),8.03(1h,d,j＝7.8hz),7.76(1h,d,j＝8.0hz),7.59(1h,d,j＝8.2hz),7.46(1h,t,j＝7.5hz),7.29(1h,d,j＝7.5hz),7.25(1h,d,j＝8.2hz),4.94(2h,s),2.51(3h,m).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ172.7,139.5,137.7,133.0,128.3,127.6,126.7,126.0,125.2,125.1,123.3,122.9,121.4,120.1,119.1,115.6,114.2,112.1,111.3,45.5,21.7.
[0094]
thk16：黄色固体。hresims给出准分子离子峰为[m h]

m/z 382.1547(计算值为382.1556)，分子式为c
24
h
19
n3o2。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.74(1h,s),11.63(1h,s),10.96(1h,s),9.10(1h,d,j＝2.4hz),8.99(1h,d,j＝8.6hz),7.80(1h,d,j＝8.3hz),7.73(1h,d,j＝8.6hz),7.64(1h,d,j＝2.2,8.6hz),7.55(1h,m),7.35(1h,m),1.45(9h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ171.4,171.3,142.7,140.2,138.4,129.3,129.0,126.7,124.8,124.2,121.6,121.4,120.3,120.2,119.9,119.6,116.0,115.4,112.0,111.5,34.5,31.8.
[0095]
thk17：白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 390.1574(计算值为390.1582)，分子式为c
24
h
21
n3o。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.42(1h,s),11.35(1h,s),9.21(1h,d,j＝8.6hz),8.48(1h,s),7.94(1h,d,j＝2.2hz),7.70(2h,dd,j＝2.3,8.4hz),7.55(1h,dd,j＝2.1,8.7hz),7.41(1h,m),7.22(1h,t,j＝8.1hz),4.99(2h,s),1.44(9h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ172.5,142.4,139.0,137.3,132.9,128.1,125.4,125.1,124.9,123.0,122.8,122.4,118.9,118.6,116.8,115.4,114.3,111.4,111.3,45.3,34.4,31.8.
[0096]
thk18：白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 390.1573(计算值为390.1582)，分子式为c
24
h
21
n3o。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.58(1h,s),11.28(1h,s),9.33(1h,d,j＝2.6hz),8.39(1h,s),8.03(1h,d,j＝8.4hz),7.76(1h,d,j＝8.4hz),7.61
(1h,d,j＝8.8hz),7.50(1h,d,j＝2.3,8.7hz),7.46(1h,t,j＝8.3hz),7.30(1h,t,j＝8.3hz),4.95(2h,s),1.43(9h,s).
13
c nmr nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ172.4,141.3,139.1,137.2,132.6,127.9,125.7,124.9,123.0,122.6,122.6,121.3,121.1,119.8,118.8,115.9,113.9,111.79,110.7,45.2,34.5,31.9.
[0097]
thk19：黄色固体。hresims给出准分子离子峰为[m h]

m/z 356.1032(计算值为356.1035)，分子式为c
21
h
13
n3o3。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ12.00(1h,s),11.66(1h,s),10.97(1h,s),8.98(1h,d,j＝8.0hz),8.54(1h,d,j＝8.0hz),7.83(1h,d,j＝8.1hz),7.55(1h,t,j＝7.4hz),7.35(1h,t,j＝7.4hz),7.27(1h,t,j＝7.8hz),7.16(1h,d,j＝7.8hz),4.08(3h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ171.3,171.2,145.7,139.9,130.3,129.3,128.7,126.7,124.3,122.6,121.5,120.7,120.2,120.0,119.9,116.7,115.6,115.1,112.1,107.2,55.6.
[0098]
thk20：橙色固体。hresims给出准分子离子峰为[m h]

m/z 342.0873(计算值为342.0879)，分子式为c
20
h
11
n3o3。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.73(1h,s),11.50(1h,s),10.94(1h,s),10.25(1h,s),8.98(1h,d,j＝8.0hz),8.43(1h,d,j＝8.0hz),7.82(1h,d,j＝8.0hz),7.55(1h,t,j＝8.0hz),7.35(1h,t,j＝8.0hz),7.14(1h,t,j＝7.9hz),6.99(1h,d,j＝7.9hz).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ171.3,171.2,143.4,139.9,130.3,129.2,128.7,126.6,124.3,123.0,121.6,120.8,120.2,120.0,119.7,115.9,115.3,115.1,112.0,111.0.
[0099]
thk21：白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 350.0896(计算值为350.0905)，分子式为c
20
h
13
n3o2。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.48(1h,s),11.16(1h,s),10.15(1h,s),9.20(1h,d,j＝7.9hz),8.43(1h,s),7.71(1h,d,j＝8.0hz),7.49(1h,d,j＝7.7hz),7.41(1h,t,j＝8.0hz),7.22(1h,t,j＝7.8hz),7.10(1h,t,j＝7.5hz),6.92(1h,d,j＝7.8hz),4.91(2h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ172.4,138.7,133.0,128.9,127.5,125.5,125.1,124.8,124.0,122.8,120.6,118.8,118.7,115.1,114.5,112.1,111.2,109.7,45.2.
[0100]
thk22：白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 350.0905(计算值为350.0905)，分子式为c
20
h
13
n3o2。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.53(1h,s),11.38(1h,s),9.96(1h,s),8.64(1h,d,j＝7.9hz),8.41(1h,s),8.03(1h,d,j＝7.9hz),7.76(1h,d,j＝8.1hz),7.46(1h,t,j＝7.9hz),7.29(1h,t,j＝7.4hz),7.00(1h,t,j＝7.7hz),6.87(1h,d,j＝7.4hz),4.94(2h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ172.4,143.0,138.8,132.7,129.1,128.1,125.1,124.8,124.2,122.5,121.1,119.7,119.2,118.8,116.3,115.9,113.6,111.7,109.3,45.2.
[0101]
thk23：黄色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 378.0845(计算值为378.0855)，分子式为c
21
h
13
n3o3。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ12.15(1h,s),11.93(1h,s),10.69(1h,s),9.08(1h,d,j＝7.9hz),7.78(1h,d,j＝8.2hz),7.53(1h,t,j＝8.2hz),7.47(1h,t,j＝8.2hz),7.33(1h,t,j＝6.6hz),6.81(1h,d,j＝7.9hz),4.01(3h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ170.7,168.6,155.7,142.0,140.4,129.0,129.0,127.9,126.6,124.8,121.6,121.5,120.0,119.4,114.9,112.8,112.0,111.8,104.2,101.6,99.4,55.0.
[0102]
thk24：黄色固体。hresims给出准分子离子峰为[m h]

m/z 356.1028(计算值为
356.1035)，分子式为c
21
h
13
n3o3。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.69(1h,s),11.54(1h,s),10.92(1h,s),8.97(1h,d,j＝7.9hz),8.82(1h,d,j＝8.6hz),7.78(1h,d,j＝8.1hz),7.53(1h,m),7.33(1h,m),6.97(1h,dd,j＝2.3,8.7hz),3.92(3h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ171.4,171.3,159.4,141.9,140.3,128.9,128.7,126.6,125.1,124.2,121.6,120.1,119.6,118.8,116.0,115.4,115.1,111.9,109.8,95.3,55.4.
[0103]
thk25：橙色固体。hresims给出准分子离子峰为[m h]

m/z 342.0870(计算值为342.0879)，分子式为c
20
h
11
n3o3。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.59(1h,s),11.44(1h,s),10.89(1h,s),9.76(1h,s),8.96(1h,d,j＝8.0hz),8.74(1h,d,j＝8.5hz),7.77(1h,d,j＝8.2hz),7.52(1h,t,j＝8.2hz),7.32(1h,t,j＝7.8hz),7.11(1h,d,j＝2.1hz),6.83(1h,dd,j＝2.1,8.2hz).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ171.4,171.3,157.6,142.3,140.4,128.8,128.6,126.6,125.2,124.2,121.7,120.0,119.3,118.6,116.4,115.1,114.5,111.9,110.3,97.2.
[0104]
thk26：白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 350.0896(计算值为350.0905)，分子式为c
20
h
13
n3o2。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.71(1h,s),11.66(1h,s),9.58(1h,s),9.17(1h,d,j＝7.9hz),8.38(1h,s),7.79(1h,d,j＝8.4hz),7.62(1h,d,j＝8.1hz),7.38(1h,t,j＝7.7hz),7.18(1h,d,j＝7.5hz),7.06(1h,d,j＝2.0hz),6.79(1h,dd,j＝2.1,8.4hz),4.87(2h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ172.5,156.1,140.7,138.8,131.7,127.4,125.5,125.0,124.6,122.8,121.7,118.6,118.4,115.4,114.5,114.4,110.9,109.6,97.2,45.2.
[0105]
thk27：白色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 350.0904(计算值为350.0905)，分子式为c
20
h
13
n3o2。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.87(1h,s),11.52(1h,s),9.43(1h,s),8.93(1h,d,j＝8.6hz),8.39(1h,s),7.99(1h,d,j＝7.8hz),7.71(1h,d,j＝8.2hz),7.43(1h,t,j＝7.6hz),7.26(1h,t,j＝7.6hz),7.00(1h,d,j＝1.9hz),6.70(1h,dd,j＝2.0,8.5hz),4.91(2h,s).
13
c nmr(151mhz,dmso
‑
d6):δ172.6,156.1,140.9,139.3,132.3,128.0,125.9,124.8,124.6,122.7,120.9,119.5,117.9,116.2,115.9,113.1,111.6,109.0,96.4,45.2.
[0106]
thk28：黄色固体。hresims给出准分子离子峰为[m na]

m/z 420.1321(计算值为420.1324)，分子式为c
24
h
19
n3o3。1h nmr(600mhz,cdcl3):δ9.22(1h,d,j＝7.9hz),8.81(1h,d,j＝2.3hz),7.61(1h,t,j＝8.2hz),7.48(1h,d,j＝8.2hz),7.42(1h,t,j＝7.4hz),7.38(1h,d,j＝8.8hz),7.23(1h,dd,j＝2.4,8.8hz),4.13(3h,s),4.10(3h,s),4.04(3h,s),3.18(3h,s).
13
c nmr(151mhz,cdcl3):δ170.1,169.9,155.1,144.7,139.8,133.1,132.6,127.4,125.5,123.1,122.7,121.4,119.8,119.7,119.6,119.3,117.5,110.8,109.9,106.8,55.9,37.1,36.8,29.7.
[0107]
实施例4.化合物的激酶抑制活性实验
[0108]
rock2激酶抑制活性均采用基于时间分辨荧光技术的htrf kinease kit测定。平行设置3个复孔。具体操作步骤为：
[0109]
于白色384孔板中每孔依次加入4μl待测化合物或缓冲液、2μl反应底物、2μl蛋白激酶和2μl atp。置于37℃孵育箱中孵育30min。依次加入5μl链激酶素标记的xl
‑
665及5μl euk标记的抗磷酸化的蛋白激酶抗体，室温反应60min，采用tecan多功能酶标仪检测荧光信
号。在λ＝665nm处所测的样品孔的荧光强度值为f1，λ＝620nm处的荧光强度值为f2，信号比率计算公式为：信号比率＝f1/f2
×
104。待测化合物对蛋白激酶的抑制率计算公式为：抑制率(％)＝[1
–
(待测化合物信号比率
–
最小信号比率)/(最大信号比率
–
最小信号比率)]
×
100。其中最大信号比率为溶剂对照，最小信号比率为不加链激酶素标记的xl
‑
665孔的信号比率。运用graphpad prism8软件计算ic
50
值。
[0110]
表1代表性k252c衍生物的rock2激酶抑制活性(μm)
[0111]
化合物rock2化合物rock2thk01(对照)0.006thk150.55thk020.35thk16>0.5thk030.46thk17>0.5thk04>0.5thk18>0.5thk05>0.5thk19>0.5thk06>0.5thk20>0.5thk070.007thk21>0.5thk080.003thk220.26thk09>0.5thk230.36thk100.11thk240.36thk110.46thk250.53thk120.12thk260.20thk13>0.5thk270.023thk14>0.5thk28>0.5
[0112]
结果表明，本发明提供的化合物均有一定的抑制rock2激酶的活性，其中化合物thk01、thk07、thk08和thk27具有非常显著的rock2激酶抑制能力。说明该类型化合物可用于进一步开发rock2抑制剂。
[0113]
实施例5.伤口愈合能力分析
[0114]
采用伤口愈合2孔硅胶插件进行乳腺癌细胞mda
‑
mb
‑
231的迁移能力研究。将处于对数生长期的细胞消化后，用l15完全培养液制备单个细胞悬液，计数后，将细胞密度调整至5
×
105cells/ml，取70μl接种到已放置插件的培养皿中。培养24小时后，用镊子小心移出插件，pbs清洗2
–
3次，去除漂浮的细胞，再加入1ml l15完全培养基。加入药物使其终浓度为0、0.625、1.25、2.5、5和10μm，于药物作用0和48h时在光学显微镜下拍摄伤口愈合情况。采用image
‑
pro plus 6.0软件计算迁移平均宽度。
[0115]
实施例6.细胞毒性评价
[0116]
细胞活性评价采用磺酰罗丹明b(srb)法检测化合物对人乳腺癌细胞mda
‑
mb
‑
231细胞的增殖抑制作用，具体操作过程如下：
[0117]
取对数生长期的mda
‑
mb
‑
231细胞，配置成细胞浓度为5
×
104cells/ml的细胞悬液，以100μl/孔接种于96孔板中，平行设置3个复孔，于37℃含5％co2的培养箱中培养24h。将待测化合物用dmso溶解配制成浓度为10mm的母液，将母液用细胞培养液稀释。取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品，平行设3个复孔，置于co2培养箱中继续培养72h。取出培养板，弃去培养液，每孔加入100μl 4℃冰箱预冷的质量百分数10％的三氯醋酸
(tca)固定，静置5min后，再将培养板移至4℃冰箱过夜。取出培养板，倒掉固定液，用去离子水洗涤6遍，甩干，空气干燥。以70μl/孔加入srb溶液，室温放置20min，弃去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。结合的srb用100μl/孔的10mm tris碱液(ph 10.5)振荡溶解。置于酶标仪中测定各孔光吸收值(od值)，测定波长为515nm。
[0118]
根据od值计算药物对细胞增殖抑制率：抑制率＝[1
–
(od
515
给药孔/od
515
对照孔)]
×
100％，根据各浓度抑制率计算半数抑制浓度ic
50
。
[0119]
细胞实验结果表明作用时间为48h时，随着thk01浓度的增加，mda
‑
mb
‑
231的伤口愈合能力显著降低，伤口愈合率分别为93.3％(对照)、88.6％、57.4％、44.7％和15.6％(图1)。thk01对mda
‑
mb
‑
231细胞具有较弱的毒性，作用时间为72小时时，其ic
50
值为7.19μm(图1)，说明thk01在细胞毒性较低的浓度下即可有效抑制mda
‑
mb
‑
231细胞的迁移。
[0120]
实施例7.乳腺癌转移动物实验
[0121]
实验小鼠：6周龄、spf级、体重20g左右的balb/c裸鼠，雌性，购买自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。
[0122]
药物配制：称取一定质量的thk01加入一定体积的乙醇，涡旋振荡后加入相同体积的聚氧乙烯蓖麻油(cremophor el)，涡旋振荡使固体物质完全溶解，配制7.5mg/ml的储备液。临用前取适量储备液至玻璃瓶中，加入适量体积的pbs，使得乙醇:cremophor el:pbs＝1:1:1(v/v/v)，涡旋振荡使液体混合均匀，得终浓度为1.5mg/ml的给药制剂。0.2μm滤膜过滤除菌后
‑
20℃避光保存备用。y27632用pbs配成1.5mg/ml的给药制剂，d
‑
luciferin用pbs配成15mg/ml。
[0123]
实验方法：实验小鼠随机分成3组(溶剂组、thk01组和y27632组)，每组8只。y27632为处于临床研发阶段的rock2抑制剂。收集mda
‑
mb
‑
231
‑
luciferase
‑
mcherry细胞重悬于pbs中，使其浓度为1
×
107cells/ml，每只小鼠尾静脉注射1
×
106cells(100μl)，并进行标记。注射细胞后立即通过尾静脉注射相应浓度的化合物或溶剂，此后每天称重并尾静脉注射相应剂量的化合物或溶剂。给药剂量均为15mg/kg/day，溶剂组给予相同体积的溶剂(乙醇:cremophor el:pbs＝1:1:8)。在种瘤后第19、30、45天进行荧光素酶活体成像，按10μl/g的比例，腹腔注射相应体积的15mg/ml荧光素工作液，5
–
10分钟后使用小动物活体荧光影像分析系统进行成像分析。
[0124]
动物实验结果表明thk01在小鼠体内可以显著抑制乳腺癌细胞mda
‑
mb
‑
231的肺部转移，且在较低的给药剂量下效果优于阳性药y27632(图2)。给药过程中，各组间小鼠的体重变化无明显差异，说明该剂量对小鼠产生的毒性较弱(图2)，具有良好的实际应用前景。
[0125]
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。