重组真菌免疫调节蛋白rFIP-glu的应用的制作方法

重组真菌免疫调节蛋白rfip
‑
glu的应用
技术领域
1.本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种重组灵芝真菌免疫调节蛋白(recombinant fip
‑
glu，rfip
‑
glu)在药物化妆品领域的应用。


背景技术：

2.灵芝(ganoderma lucidum)具有滋补强本、固本扶正、养颜安神等功效，其药物疗效逐渐被学者们重视。灵芝中含有多种有效的生物活性成分，包括灵芝多糖、灵芝多肽、灵芝三萜类化合物、蛋白质、氨基酸、微量元素、萜烯酮醇、过氧化麦角甾酵、甘露醇、甾醇、生物碱等。目前，化妆品市场上出现了众多以灵芝为主要添加物的化妆品产品，在化妆品中添加适量的灵芝活性成分正在成为化妆品开发的热点。现有的众多化妆品品牌已经开始利用灵芝提取液进行化妆品开发，多用赤芝或黑灵芝子实体提取物进行开发，添加形式均为子实体提取物，提取效率比较低，导致成本较高以及产品中灵芝提取物添加量偏少，发挥作用有限(王倩,张佳婵,王昌涛,等.灵芝美容护肤作用机制及其在化妆品行业中的发展现状.日用化学工业,2019,049(002):118
‑
125.)。灵芝蛋白种类多样并具有的丰富的生物学功能，其中灵芝真菌免疫调节蛋白(fungal immunomodulatoryprotein from ganoderma lucidum，fip
‑
glu)是灵芝蛋白中研究最多，功能相对比较清晰的一种蛋白，灵芝本身该蛋白的含量就比较低，例如，300g湿重的灵芝菌丝体中仅能分离出约5
‑
10mg纯fip
‑
glu；而编码灵芝蛋白基因的核苷酸序列已经非常清楚，若使用基因工程构建灵芝蛋白工程菌来生产灵芝蛋白，再进行化妆品生产，可以有效减少生产成本。至今为止，编码fips的基因在原核生物和真核生物中都得到了成功表达，在植物、酵母、昆虫细胞中均有fips表达的相关报道，表达量从6.25～191.2mg/l不等。目前在真菌免疫调节蛋白重组表达中所用的毕赤酵母多为gs115菌株，不同基因来源、相同基因来源、不同基因结构以及不同表达形式等，均会对fips的表达量产生较大的影响，要获得一株高产fips的酵母转化子，并非是一件容易的事，需要考虑基因结构、启动子、载体等多种因素(wangxf,su kq,bao tw,cong wr,chen yf,li qz,zhou xw.immunomodulatory effects of fungal proteins.current topicsin nutraceuticalresearch.2012,10(1):1
‑
11)。
3.现有文献分析发现，灵芝化妆品作为一种具有开发潜力和功效性质的化妆品，已经引起了化妆品行业的广泛关注，目前灵芝化妆品的功效性研究主要都集中在抗衰老和抗氧化方面，对其他功效的研究和应用较少，扩大灵芝化妆品功效的研究范围是重要的研究方向。此外，目前灵芝活性成分研究主要集中在灵芝多糖和三萜类成分方面，对其他功效成分，例如多肽、蛋白质的研究应用较少(zhou xw,su kq,zhang ym.applied modern biotechnology for cultivation ofganoderma and development oftheir products.appliedmicrobiologyandbiotechnology.2012,93(3):941
‑
963.)，加大对灵芝其他生物活性成分的研究可以进一步拓宽灵芝在化妆品中的应用。
4.现有专利文献cn202010156003.x提出了一种含灵芝提取物的组合物，将灵芝提取物和灵芝孢子油作为有效成分开发灵芝化妆品；文献一种含有灵芝提取物的化妆品
cn201811239789.0，利用的活性成分也是灵芝及灵芝孢子提取物，文献黑灵芝菌丝发酵液及其制备方法，具有抗氧化及美白功效的化妆品(cn201711251044.1)也利用黑灵芝菌丝发酵液生产多糖和三萜进而应用到化妆品中。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术及应用方向上存在的不足，提供一种重组真菌免疫调节蛋白rfip
‑
glu的应用，通过基因工程构建的重组灵芝免疫调节蛋白rfip
‑
glu在毕赤酵母真核表达系统中进行表达并纯化，给药于小鼠黑色素瘤细胞b16和人角质形成细胞hacat，结果显示重组灵芝免疫调节蛋白rfip
‑
glu能够抑制小鼠黑色素瘤细胞b16的生长，促进人角质形成细胞hacat细胞的生长；在6μg/ml～48μg/ml范围内能降低b16细胞中的黑色素含量，在48μg/ml的高浓度下rfip
‑
glu可以显著抑制b16细胞酪氨酸酶的活性，并对黑色素合成相关通路基因的表达产生一定影响。
6.本发明是通过以下技术方案实现的：
7.本发明涉及一种重组真菌免疫调节蛋白rfip
‑
glu的应用，将其用于制备药妆面膜，从而降低细胞中黑色素含量和促进人角质形成细胞的细胞增殖。
8.所述的药妆面膜，其每100ml中组分及质量百分比含量为：a项：甘油2.0～5.0％、乙二胺四乙酸二钠0.01～0.05％、peg
‑
40氢化蓖麻油0.1～0.2％、黄原胶0.05～0.2％、无水甜菜碱0.25～0.5％、聚乙二醇4002.0～4.0％、羧甲基纤维素钠0.1～0.3％；b项：灵芝蛋白rfip
‑
glu10
‑
20％；c项：烟酰胺0.25～0.50％、维生素c乙基醚0.25～0.50％、d
‑
泛醇0.25～0.50％、对羟基苯甲酸甲酯0.2～0.6％；余量为水。
9.所述的药妆面膜，其制备方法包括：
①
将羧甲基纤维素钠等增稠剂先分散入水中，在75℃水浴锅中加热搅拌至完全溶解，然后向其中加入a项原料；
②
搅拌均匀后降温至40℃再依次加入b项和c项原料，并加水至100ml后搅拌至透明状。
③
用纯棉基布按每份面膜液30
‑
40g充分吸收面膜液，并将基布与剩余的面膜液一起装入面膜袋中，封口即可。
10.所述的重组真菌免疫调节蛋白rfip
‑
glu由通过基因工程构建的重组灵芝免疫调节蛋白毕赤酵母gs115工程菌诱导发酵后分离纯化得到，具体为：首先克隆出灵芝免疫调节蛋白基因(fip
‑
glu)的核苷酸序列，其次经过基因重组技术构建重组质粒rfip
‑
glu，然后把重组质粒转化到毕赤酵母gs115中形成真核表达菌株，经毕赤酵母的发酵表达蛋白，再经过纯化过程得到重组真菌免疫调节蛋白rfip
‑
glu。
11.所述的克隆，得到的重组真菌免疫调节蛋白rfip
‑
glu的氨基酸序列如seq id no.1所示。技术效果
12.本发明rfip
‑
glu能够促进人角质形成细胞hacat的生长，抑制小鼠黑色素瘤细胞b16增长和繁殖、降低b16细胞中的黑色素含量，即rfip
‑
glu蛋白通过影响细胞内酪氨酸酶活性而实现在一定浓度范围降低b16细胞黑色素的合成和含量。
13.与现有技术相比，本发明通过毕赤酵母体外生产获得的rfip
‑
glu，通过工程酵母发酵其rfip
‑
glu产量达453.7mg/l，具有纯度高、能耗小、适合工业化体外生产的显著优势。
附图说明
14.图1为ppic9k::x
‑
his与puc57::fip
‑
glu质粒酶切电泳图；
15.图中：泳道m：dna marker dl 15,000；(a)泳道1：重组质粒ppic9k
‑
x
‑
his酶切前；泳道2：重组质粒ppic9k::x
‑
his酶切后，箭头所示为线性化质粒ppic9k
‑
his；(b)泳道3：重组质粒puc57::fip
‑
glu酶切前；泳道4：重组质粒puc57::fip
‑
glu酶切后，箭头所示为rfip
‑
glu(lz
‑
8)；
16.图2为ppic9k::fip
‑
glu
‑
his大肠杆菌转化子菌落pcr检测电泳图；
17.图中：泳道m：dna marker dl 2,000；泳道1～4：含有重组质粒ppic9k::fip
‑
glu
‑
his大肠杆菌转化子的检测结果；泳道﹣：阴性对照；
18.图3为ppic9k与ppic9k::fip
‑
glu
‑
his转化酵母质粒酶切电泳图；
19.图中：泳道m：dna marker dl 15,000；泳道1：质粒ppic9k酶切前；泳道2：质粒ppic9k酶切后；泳道3：重组质粒ppic9k::fip
‑
glu
‑
his酶切前；泳道4：重组质粒ppic9k::fip
‑
glu
‑
his酶切后；
20.图4为毕赤酵母转化子菌落pcr鉴定示意图；
21.图中：泳道m：dna marker dl 2,000；泳道1～11：含有重组质粒ppic9k::fip
‑
glu
‑
his酵母转化子的检测结果；泳道﹣：阴性对照；泳道 ：阳性对照；
22.图5为rfip
‑
glu毕赤酵母真核表达sds
‑
page与western blotting鉴定示意图；
23.图中：(a)毕赤酵母转化子发酵液的sds
‑
page检测；(b)毕赤酵母转化子发酵液的western blotting检测；泳道m：蛋白质标准分子量；泳道1:原菌株所产rfip
‑
glu；泳道2:突变菌株所产rfip
‑
glu；
24.图6为rfip
‑
glu对小鼠黑色素瘤b16细胞和人角质形成层hacat细胞生长的影响示意图；
25.图中：a：rfip
‑
glu对小鼠黑色素瘤b16细胞生长的影响；b：rfip
‑
glu对人角质形成层hacat细胞生长的影响；c：维生素c对对小鼠黑色素瘤b16细胞生长的影响(阳性对照)；数据表示为means
±
sd(n＝5)；与空白组比较：*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.001；ns：no significance；
26.图7为重组灵芝免疫调节蛋白对b16细胞内黑色素含量的影响示意图；
27.图中：数据表示为means
±
sd(n＝5)；*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.001；ns：no significance；
28.图8为重组灵芝免疫调节蛋白对b16细胞内酪氨酸酶活性的影响示意图；
29.图中：数据表示为means
±
sd(n＝5)；*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.001；ns：no significance；
30.图9rfip
‑
glu对b16细胞内黑色素合成相关基因表达的影响示意图；
31.图中：数据表示为means
±
sd(n＝5)；*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.001；ns：no significance。
具体实施方式
实施例1
32.利用毕赤酵母表达系统生产rfip
‑
glu，具体包括：
33.1)rfip
‑
glu酵母转化子的获得：利用限制性内切酶ecor i和apa i将质粒ppic9k::x
‑
his与含有fip
‑
glu(lz
‑
8)基因的质粒puc57::fip
‑
glu于37℃酶切2h。将ppic9k::his与fip
‑
glu(lz
‑
8)连接，构建重组质粒ppic9k::fip
‑
glu1
‑
his，并转入大肠杆菌dh5α感受态细胞。经菌落pcr鉴定并送测序。提取质粒ppic9k::glu
‑
his，利用限制性内切酶sac i于37℃酶切2h后参照pichia expression kit中提供的转化方法进行酵母转化。转化后挑取酵母转化子进行pcr鉴定并送测序检验。
34.2)rfip
‑
glu的表达、纯化和鉴定：挑取酵母转化子单克隆至bmgy液体培养基，于30以220rpm振荡培养至od600为2～6；于室温以2,500
×
g离心5min以收集细胞，去上清，并将细胞重悬于bmmy液体培养基至od600为1.0；每天向bmmy液体培养基中添加纯meoh至终浓度为1％(v/v)；取出1ml培养基至1.5ml离心管用于sds
‑
page和western blotting检测。
35.3)将剩余培养基于室温以2,500
×
g离心5min以收集上清，并将上清经3.5kd透析袋透析，将透析袋内液冷冻干燥后用lysis buffer溶解；用5倍体积的lysis buffer平衡his60 ni superflow resin柱；装载lysis buffer溶解的物质。用10倍体积wash buffer洗涤，2倍体积elution buffer洗脱并收集洗脱液后，再用5倍体积elution buffer清洗his60 ni superflow resin柱。洗脱液经3.5kd透析袋透析，将透析袋内液冷冻干燥，溶于pbs，备用。待测样品分别进行sds
‑
page与western blotting检测，鉴定rfip
‑
glu蛋白。
36.ppic9k::x
‑
his与puc57::fip
‑
glu质粒酶切电泳结果如图1所示；ppic9k::fip
‑
glu
‑
his大肠杆菌转化子经菌落pcr检测，电泳鉴定结果如图2所示，条带大小与预期相符。ppic9k与ppic9k::fip
‑
glu
‑
his转化酵母的质粒酶切电泳结果如图3所示；毕赤酵母转化子dna经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图4所示，在大于750bp处有一个特异性条带，与预期相符(847bp)。
37.通过sds
‑
page及western blotting检测证明转化子的表达蛋白是正确的，结果如图5所示。经筛选得到的高表达转化子在优化的毕赤酵母表达系统中发酵，rfip
‑
glu的产量达到453.7mg/l。实施例2
38.rfip
‑
glu对小鼠黑色素瘤细胞b16和人角质形成细胞hacat的生长的影响，具体包括：
39.1)将待测样品rfip
‑
glu蛋白，用无菌pbs配制成系列浓度：6μg/ml，12μg/ml，24μg/ml，48μg/ml，过无菌滤膜备用。实验空白组：不加rfip
‑
glu蛋白；样品组：加rfip
‑
glu蛋白；阳性对照组：不加样品，加l
‑
抗坏血酸(维生素c)
40.2)在无菌操作台中将培养皿中生长至80～90％的小鼠黑色素瘤b16细胞人角质形成细胞hacat细胞收集计数。根据计数结果，按照2.0～8.0
×
104cells/well接种至96孔细胞培养板中，每孔90μl，空白组加入10μl pbs，样品组加入上述浓度的rfip
‑
glu蛋白溶液样品，每个浓度设三个平行，培养24h后，将人角质形成细胞hacat细胞从培养箱中取出，每孔加入10μlcck
‑
8检测试剂，在培养箱中放置30min后，酶标仪480nm处读取吸光度值。
41.3)根据吸光度值计算细胞存活率，结果如图6所示。检测结果表明rfip
‑
glu蛋白在6μg/ml～48μg/ml的浓度范围内对小鼠黑色素瘤b16细胞无毒性，具有抑制b16细胞存活率的作用；阳性对照l
‑
抗坏血酸在10μg/ml～80μg/ml浓度范围内对b16细胞无细胞毒性，具有抑制b16细胞存活率的作用。根据抑制率曲线计算出，当b16细胞存活率达到85％时，rfip
‑
glu蛋白的浓度为21.04μg/ml，l
‑
抗坏血酸浓度为24.42μg/ml。同时，rfip
‑
glu蛋白在6μg/ml～48μg/ml的浓度范围内对人角质形成细胞hacat的存活率具有促进作用。实施例3
42.重组灵芝免疫调节蛋白rfip
‑
glu对b16细胞内黑色素含量的影响，具体包括：naoh细胞裂解法测定黑色素含量：将细胞以2
×
105个/ml的浓度接种于6孔细胞培养板，每孔2ml，置于37℃恒温培养箱培养24h；弃去培养基，分别用6、12、24、48μg/ml浓度的rfip
‑
glu处理b16细胞72h，pbs作为空白对照，每个处理设置3个重复。提前配置好1mol/l naoh配制10％的dmso溶液，保存待用，每孔加入200μl 10％dmso溶液，充分吹打，将细胞转移至1.5ml离心管。将离心管置于80℃金属浴反应2h，用96孔酶标板，测定492nm下吸光值，空白对照为10％dmso溶液；计算黑色素含量，黑色素含量＝给药组od值/对照组od值
×
100％。
43.黑色素含量测定结果如图7所示，与对照组相比，6μg/ml rfip
‑
glu能将b16细胞内黑色素含量提高139％(p≤0.01)，12μg/ml rfip
‑
glu处理后的细胞黑色素含量提高137％(p≤0.01)，而24μg/ml rfip
‑
glu黑色素的含量没有显著差异(p≤0.05)。当rfip
‑
glu为48μg/ml时，b16细胞内的黑色素含量下降，为对照组的77％(p≤0.05)。实验结果表明，低浓度(6μg/ml和12μg/ml)的rfip
‑
glu能够促进b16细胞内黑色素生成，高浓度(48μg/ml)的rfip
‑
glu抑制黑色素生成。实施例4
44.重组灵芝免疫调节蛋白rfip
‑
glu对b16细胞内酪氨酸酶活性的影响，即l
‑
dopa氧化法测定酪氨酸酶活性，具体包括：将细胞以1
×
105个/ml的浓度接种于12孔细胞培养板，每孔1ml，置于37℃恒温培养箱培养24h；弃去培养基，分别用6、12、24、48μg/ml浓度的rfip
‑
glu处理b16细胞48h，pbs作为空白对照，每个处理设置3个重复；每孔加入100μl 1％tritonx
‑
100后，立即将细胞培养板放入
–
80℃冰箱，速冻30min，室温融化；12,000rpm，4℃离心30min，保留上清液；用pbs配制2.5mm的l
‑
dopa溶液，注意现用现配，避光保存；取40μl上清液和160μl l
‑
dopa溶液，加入到96孔酶标板中，混合均匀；置于37℃恒温培养箱反应1h，测定492nm处的吸光值。
45.黑色素含量测定结果如图8所示，与对照组相比，6μg/ml rfip
‑
glu能将b16细胞内黑色素含量提高139％(p≤0.01)，12μg/ml rfip
‑
glu处理后的细胞黑色素含量提高137％(p≤0.01)，而24μg/ml rfip
‑
glu黑色素的含量没有显著差异(p≤0.05)。当rfip
‑
glu为48μg/ml时，b16细胞内的黑色素含量下降，为对照组的77％(p≤0.05)。实验结果表明，低浓度(6μg/ml和12μg/ml)的rfip
‑
glu能够促进b16细胞内黑色素生成，高浓度(48μg/ml)的rfip
‑
glu抑制黑色素生成。
46.tyr活性测定结果如图9所示，与对照组相比，当rfip
‑
glu浓度为6、24μg/ml时，tyr活性无显著变化(p>0.05)；当rfip
‑
glu浓度为12μg/ml时，tyr活性为119.91％(p≤0.05)；当rfip
‑
glu浓度为48μg/ml时，tyr活性为76.50％(p≤0.01)。高浓度(48μg/ml)的rfip
‑
glu可以显著抑制b16细胞酪氨酸酶的活性。实施例5
47.rfip
‑
glu对b16细胞内黑色素合成通路相关基因表达的影响
48.1)rna提取：用rnaprep pure cell/bacteria kit试剂盒提取细胞总rna。实验开始前，按照试剂盒说明书配制相关试剂，具体提取操作为：倒出细胞培养液，用1ml pbs清洗
2次；每孔加入350μl buffer rl，充分吹打细胞，将溶液转移至cs吸附柱，12,000rpm离心2min；收集滤液，向滤液中加入350μl 70％乙醇，混匀后，全部转移至cr3吸附柱中，12,000rpm离心1min后，弃滤液；保留滤液，加入350μl 70％乙醇，吹打混匀，转移到cr3吸附柱，12,000rpm离心1min，弃滤液；加入350μl rw1去蛋白液，12,000rpm离心1min，弃滤液；加入80μl dnase i液，于室温静置15min；加入350μl rw1去蛋白液，12,000rpm离心1min，弃滤液；加入500μlrw漂洗液，于室温静置2min，12,000rpm离心1min后，弃滤液；重复漂洗一次；12,000rpm离心2min，弃滤液，将吸附柱于室温静置20min；将吸附柱转移至新的1.5ml rnase
‑
free离心管，向吸附柱中心轻轻加入50μl rnase
‑
free ddh2o，与室温静置2min，12,000rpm离心2min，收集rna。用1％琼脂糖凝胶对所收集的rna进行检测。
49.2)cdna的制备：使用primescripttmrt master mix(perfect real time)试剂盒将所提rna反转录成cdna，反转录体系和反应程序如下，将反转得到的cdna稀释50倍，分装储存于
‑
20℃。
50.反转录体系如下：
51.于37℃反应15min后85℃加热5s灭活反转录酶，得到不同处理细胞的cdna。
52.3)实时荧光定量pcr：按seq id no.2至seq id no.9中所使用的引物进行实时荧光定量pcr(quantitative reverse transcriptase real
‑
time pcr，rt
‑
qpcr)反应。tryp
‑
1、tryp
‑
2、tyr和mitf为四种酪氨酸酶活性相关基因，gapdh作为内参基因。
53.反应体系如下：
54.使用2
‑
δδct
的方法计算表达量，即：δct＝ct
目的基因
‑
ct
内参基因
；δδct＝δct
实验组
‑
δct
对照组
；倍数变化＝2
‑
δδct
。
55.为了进一步评价rfip
‑
glu对b16细胞内黑色素合成的影响，本实施例考察rfip
‑
glu是否能够调节tyr、mitf、tryp
‑
1和tryp
‑
2这四种黑色素合成相关基因的转录。b16细胞经6μg/ml、12μg/ml、24μg/ml和48μg/ml rfip
‑
glu处理6h后，通过rt
‑
qpcr分析这四种基因的mrna水平。结果如图9所示：
56.与对照组相比，tyr的mrna水平在rfip
‑
glu浓度为12μg/ml时，有显著的增长趋势(p≤0.001)；而当rfip
‑
glu浓度为48μg/ml时，tyr的mrna水平有一定程度的下降(p≤0.05)，当rfip
‑
glu为6和24μg/ml时，tyr的mrna水平没有明显变化。对于mitf而言，经6μg/m rfip
‑
glu处理后，mitf的mrna水平有所下降；12μg/ml的rfip
‑
glu对mitf的mrna水平没有显著影响；6μg/ml和24μg/ml的rfip
‑
glu显著提高了mitf的mrna水平(24μg/ml时p≤0.01，48μ
g/ml时p≤0.0001)。在tryp
‑
1的表达方面，低浓度(6μg/ml)的rfip
‑
glu对tryp
‑
1的表达没有明显作用，中高浓度(12μg/ml，24μg/ml和48μg/ml)的rfip
‑
glu能够明显的抑制tryp
‑
1的mrna水平，且呈现剂量依赖性(12μg/ml时p≤0.05，24μg/ml时p≤0.0001，48μg/ml时p≤0.0001)。但是，rfip
‑
glu对tryp
‑
2的表达影响较小，只有在rfip
‑
glu浓度为48μg/ml时，tryp
‑
2的mrna水平有一定水平的增加(p≤0.01)。总的来说，rfip
‑
glu能够通过调节mitf和tryp
‑
1的表达，控制tyr酶的活性，进而影响小鼠b16细胞中黑色素的合成。
57.经cck
‑
8法测试发现：本发明rfip
‑
glu对b16和hacat细胞的细胞活性的影响：6μg/ml
‑
48μg/ml的rfip
‑
glu能够显著抑制b16的细胞活性，且呈现剂量依赖性。在6μg/ml～48μg/ml的浓度范围内对人角质形成细胞hacat的存活率具有促进作用。
58.经l
‑
dopa氧化法测定b16细胞内酪氨酸酶活性发现：6μg/ml
‑
24μg/ml的低浓度的rfip
‑
glu对tyr(酪氨酸酶)活性没有显著影响，而48μg/ml rfip
‑
glu可以明显抑制b16细胞中tyr活性。
59.经qrt
‑
pcr法测定对b16细胞内黑色素合成相关基因tyr、mitf、tryp
‑
1和tryp
‑
2的mrna水平发现：与对照组相比，12μg/ml rfip
‑
glu对tyr的表达有显著的促进作用；而48μg/ml rfip
‑
glu可以促进mitf和tryp
‑
2的表达，抑制tryp
‑
1的表达。
60.上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。