一种慢病毒试剂盒的制作方法

1.本实用新型属于生物学技术领域，具体涉及一种慢病毒试剂盒。


背景技术：

2.慢病毒(lentivirus)载体是以人类免疫缺陷型病毒(hiv)为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。基因工程改造的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
3.慢病毒介导的基因表达或rna干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有鲜明的特色。慢病毒有望成为理想的基因转移载体。
4.目前慢病毒包装主要是用脂质体和pei等试剂转染包装质粒到293细胞系来生产慢病毒。脂质体转染效率较高但价格昂贵，pei转染效率偏低且细胞毒性较大。故开发一种能够低成本生产高滴度慢病毒且携带方便操作简单的慢病毒试剂盒是十分必要的。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本实用新型提供一种慢病毒试剂盒。该试剂盒包括盒体和可盖合在盒体上的盒盖；盒体内设有试剂瓶容置区，试剂瓶容置区内设有五个下沉式的容置孔，每个容置孔内均放置有试剂瓶。
6.进一步地，盒体还内设有操作区；操作区内设有至少一个下沉式的离心管插孔。
7.进一步地，在操作区内还设有至少一个下沉式的器械容置盘。
8.进一步地，盒体与盒盖相互枢接，盒盖可相对盒体旋转180
°
打开；盒盖打开至180
°
时，盒体底端与盒盖顶端齐平。
9.进一步地，在盒盖的四角处均设有挂钩。
10.进一步地，在盒盖上还设有至少一个可将盒盖锁止在盒体上的卡扣。
11.进一步地，盒体两侧还设有一对提手。
12.进一步地，五个试剂瓶内可分别盛装有papax2、pmd2g质粒、40％peg4000、2.5m ca2cl2、dmem培养基。
13.有益效果：本实用新型提供的慢病毒试剂盒，操作简单方便且便于携带搬运，可以稳定生产出高滴度的慢病毒，重复性好。
附图说明
14.图1为本实用新型打开状态的俯视图。
15.图2为本实用新型打开状态的正视图。
16.图3为挂钩处的结构示意图。
17.图中，盒体1、盒盖2、试剂瓶容置区11、试剂瓶12、操作区13、离心管插孔14、容置盘15、挂钩21、卡扣22、提手16。
具体实施方式
18.下面通过具体实施例进一步阐明本实用新型，这些实施例是示例性的，旨在说明问题和解释本实用新型，并不是一种限制。
19.在本实用新型的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。
20.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本实用新型的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确的限定。
21.在本实用新型中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本实用新型中的具体含义。
22.在本实用新型中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
23.实施例1
24.一种慢病毒试剂盒，如图1至3所示，包括盒体1和可盖合在盒体1上的盒盖2；盒体1内设有试剂瓶容置区11，剂瓶容置区11优选由发泡材料制成，试剂瓶容置区11内设有五个下沉式的容置孔，每个容置孔内均放置有试剂瓶12。
25.本实施例中，盒体1还内设有用于辅助操作的操作区13，操作区13优选由塑料材质制成；操作区13内设有多个下沉式的离心管插孔14，和多个下沉式的器械容置盘15。
26.本实施例中，盒体1与盒盖2相互枢接，盒盖2可相对盒体旋转180
°
打开；盒盖2打开至180
°
时，盒体1底端与盒盖2顶端齐平，便于打开后平放在工作台上。
27.本实施例中，在盒盖2的四角处均设有挂钩21，可以将废弃物收纳袋挂设在四个挂钩21上，操作过程中产生的废弃物可随手放入废弃物收纳袋中。
28.本实施例中，在盒盖2上还设有一对卡扣22，可以将盒盖2锁止在盒体1上，锁止后
更加方便搬运和携带。
29.本实施例中，盒体1两侧还设有一对提手16。
30.使用方式
31.对于上述慢病毒试剂盒，五个试剂瓶12中可以分别盛装papax2、pmd2g质粒、40％peg4000、2.5m ca2cl2、dmem培养基，并示例性地介绍一种使用方法，实际使用时可根据实际情况合理调整，而不是必须按照完全相同的方法进行操作。
32.293t细胞复苏与培养
33.从液氮罐中取出冻存的hek293t细胞，将冻存管迅速放入37℃水浴锅中融化，将融化的细胞重悬液加入含9ml dmem
‑
10的15ml离心管中，1000rpm离心5min，吸去上清，然后用1ml dmem
‑
10吹起细胞，来回吹吸几次，以混匀。将上述1ml细胞重悬液加至培养皿中，“十”字型混匀后，置于co2培养箱中培养。细胞经过两次传代，直至细胞状态可以供慢病毒包装用。
34.293t细胞的铺制
35.取上述可供包装用的293t细胞，待其丰度扩增至80
‑
90％后，沿培养皿侧壁加入1ml 0.25％胰酶。“十”字型混匀，室温静置一会，加入3ml dmem
‑
10终止消化。将细胞轻柔的从皿上吹打下来，移至离心管1000rpm离心5min，吸掉上清，根据细胞数加入dmem
‑
10重悬细胞，并用计数板计数，计算每孔加入应加入的细胞重悬液体积。(5
×
106个/10cm)。于第二天，观察细胞整体状态，待细胞丰度扩增至70
‑
80％左右时，包装病毒为宜。
36.病毒的包装
37.包装条件：lenti：papax2：pmd2g＝4：3：1，以10cm板为例，质粒总量为30ug。如表1，50ul 40％peg4000 50ul 2.5m cacl2 质粒 ddh2o，混匀，取500ul 2
×
hbs加入15ml离心管，将离心管管放在振荡器上涡旋，将cacl2‑
dna混合物逐滴加到离心管中，室温静置20min，12h左右换液，48h收集第一次病毒上清，72h收集第二次病毒上清。1000rpm离心5min收集病毒上清。
38.表1
[0039][0040]
慢病毒感染hek283t细胞
[0041]
于第二次收集病毒上清前的6
‑
12h，从培养箱中取出培养的hek293t细胞，吸去培养基，加入3ml pbs润洗一遍，加入1ml 0.25％胰酶，培养箱静置1
‑
2min，加入3ml dmem培养基终止消化，移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，加入5ml dmem重悬，计数,铺置6孔板，每孔2
×
105个细胞。吸去培养液，加入1ml新鲜的培养和1ml病毒上清，感染24h更换新鲜的培养基，48h后在荧光显微镜下观察荧光。
[0042]
以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本实用新型的保护范围。