人参中皂苷含量的检测方法及园参和野山参的鉴别方法与流程

1.本发明涉及一种人参中皂苷含量的检测方法及园参和野山参的鉴别方法。


背景技术：

2.人参是驰名中外的名贵药材，具有保肝、调节免疫、抗疲劳、抗糖尿病、抗肿瘤、抗抑郁、治疗心脑血管和神经系统疾病的功效。根据人参生长环境和栽培方式的不同，可以分为园参、林下山参、野山参和野生人参4类。自然传播、生长于深山密林的原生态人参，称为野生人参。野生人参是人参中的极品，产量极少，资源濒临枯竭，且不允许私自采挖和买卖，因此市场上以栽培人参和半栽培人参为主，其中人工栽培的人参俗称“园参”，商品年限多在4～5年，一般不超过6年；播种在山林野生状态下自然生长的人参称“林下山参”，习称“籽海”，商品年限多在10年以上；依据《野山参鉴定及分等质量gb/t 18765
‑
2015》国家标准规定，播种后自然生长于深山密林15年以上的人参，可称为野山参，商品年限多在15年以上20年左右。越来越多的研究证明，野山参具有明显优于园参而与野生人参更为接近的内在品质和药用价值，价值不菲，经常单支售价过万，而园参的批发价格仅为每公斤数百至千元，二者价格差异悬殊，因此野山参与园参的科学鉴别具有重要意义。
3.目前，野山参与园参的判别仍以经验鉴别为主，芦、艼、体、纹、须、皮、点等方面的外观特征是其主要的鉴别要点，但该方法对鉴定者的鉴别经验有极高的要求，评价结果也因人而异，过于主观，不具备可重复性，且对于野山参、园参的粉末性原料样品几乎没有判别能力。
4.近年来得益于现代科技的快速发展，与人参判别相关的技术方法层出不穷，经前期文献整理发现，除人参原支外观性状鉴别外，野山参和园参的鉴别还包括显微特征物的体积和数量及木质部比例检查、红外光谱形状和强度的比较、液相色谱指纹图谱的拟合、分子生物学基因测序、人参皂苷含量的分析和基于分析化学的代谢组学研究等方法。但上述方法无论是在原料药的鉴别还是成品检验的日常质量控制工作中均存在一定的局限性，较难实现真正意义上的产学研成果转化，尤其是在面临人参市场需求量逐年攀升的情况下，迫切的需要一个更简单的、更方便的、具有较好判别性质的质量控制指标。
5.2015版国家标准《野山参鉴定及分等质量》中仅规定，野山参或野山参粉中人参皂苷rb1的含量应大于0.40％，人参皂苷re和rg1含量之和应大于0.60％，人参总皂苷含量应大于4.40％，而这一标准和《中国药典》(2020版)对人参项下园参和林下山参含量控制标准本质是一致的，均只对3个主要的皂苷成分进行了最低含量限制，而且还存在园参和林下山参标准共用混用的情况，这使得人们在实际应用中很难将三者进行有效区别。详见表1。
6.表1人参标准对人参皂苷的含量规定
[0007][0008]
此外，文献中报道的基于分析化学的代谢组学研究的相关成果，如《identification of mountain
‑
cultivated ginseng and cultivated ginseng using uplc/oa
‑
tof mse with a multivariate statistical sample
‑
profiling strategy》(doi：10.1016/j.jgr.2015.11.001)，《基于nmr和uplc
‑
qtof
‑
ms/ms技术的林下山参化学成分研究》(朱海林.[d].吉林大学，2017)，《nontargeted metabolomics approach for the differentiation of cultivation ages of mountain cultivated ginseng leaves using uhplc/qtof
‑
ms》(doi：10.1016/j.jpba.2017.04.009)，《基于uplc
‑
q
‑
tof/ms的植物代谢组学技术鉴别林下山参的生长年限》(中国中药杂志，2016，41(19)：3609
–
3614)，《uplc
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qtof/ms
‑
based nontargeted metabolomic analysis of mountain
‑
and garden
‑
cultivated ginseng of different ages in northeast china》(doi：10.3390/molecules24010033)均存在所得差异性、特异性代谢标志物过多，分析检测方法对仪器有较高要求，且无明确含量标准和指标的缺点，这些结果或许在科学研究中具有一定的意义，但尚未明确指出适用于药品大规模生产情况下日常检验等实际工作场景中的判别指标和限量范围，导致科学研究和实际生产应用产生不可忽视的脱节情况。
[0009]
而专利《一种利用人参皂苷成分含量及其比例鉴别人参种类及其生长年限的方法》(申请号：201811572380.0)虽然明确指出了re/rg1、rb1/rg1和rf/rg1三个比值可以鉴别样品的种类和生长年限，且分别规定了3年以下园参、3年至5年的园参、6年及以上的园参、8年至12年的林下参、13年至15年的林下参、16年以上的林下参、8年至10年的野山参、11年至14年的野山参、15年至19年的野山参、20年至25年的野山参、26年至29年的野山参、30年以上的野山参中rg1、re/rg1、rb1/rg1和rf/rg1含量范围。但是就整个判别方法而言依然存在许多问题，首先，专利中对各类人参的称谓令人存疑，“林下参”应为“林下山参”，15年以上的林下山参可称为“野山参”，而“野山参”是否采用的是“野生人参”的样本并未明确指出；其次，判别指标采用了rg1、re/rg1、rb1/rg1和rf/rg1进行范围限量，判定方法极其繁杂，判定参数过多且范围过窄，在日常药品检验等工作中普适性和可行性不高，而且由于人参生长过程中极易受到环境的影响，方法的可重复性也并不好，准确率较低。
[0010]
另有专利《鉴别野山参与园参、林下山参与园参的方法》(申请号cn202010868017.4)对人参皂苷rb1的含量和rb1/ro的比值进行了考量，用以判别野山参与园参、林下山参与园参，规定当rb1的含量占样品重量的百分比≥0.6％，rb1/ro≥2.0，则样品为野山参(生长年限≥15年的林下山参)，而园参无法同时满足上述两个条件；当rb1/ro≥2.0，林下山参(5
‑
14年)80％以上的样品符合此标准，而园参中90％以上的样品不符合此标准。相对而言，林下山参(5
‑
14年)的判别率较低，而且其检测方法中采用超高效液相色谱仪进行分析，虽然检测时间大幅度缩短，但对仪器要求较高，导致方法普适性稍差。
[0011]
而其它对仪器要求不高、可测成分多、分离度也较好的文献方法，却不可避免的会存在检测时间过长、试剂成本高等缺点。如《hplc法测定不同年生野山参中9种人参皂苷含量》(人参研究，2020，32(04)：7
‑
10)，该文献在同时检测9种皂苷成分过程中，每次进样需耗时130min才能完成相应分析，而《中国药典》(2020版)中人参项下及《野山参鉴定及分等质量》(gb/t18765
‑
2015)中附录a项下的分析方法一致，每次进样均需耗时100min，严重影响了日常检验周期。


技术实现要素：

[0012]
本发明为了解决现有技术中人参样品检测过程中对仪器要求高、检测成分少、分离度低、耗时长、普适性差、可重复性低，以及难以准确鉴别园参和野山参等缺陷，从而提供了一种人参中皂苷含量的检测方法及园参和野山参的鉴别方法。本发明所述的人参中皂苷含量的检测方法对仪器要求不高、可测成分多、分离度高、耗时短，所述园参和野山参的鉴别方法快速、高效、准确，具有简便和明确标准参数。
[0013]
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0014]
本发明提供一种人参中皂苷含量的检测方法，其包括以下步骤：采用高效液相色谱法检测人参样品待测液中的皂苷含量；其中，
[0015]
所述高效液相色谱法的检测条件包括：采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱；所述流动相a为甲酸与乙腈的混合液，其中，所述甲酸占所述流动相a总体积的0.01％～0.5％；所述流动相b为甲酸与水的混合液，其中，所述甲酸占所述流动相b的总体积的0.01％～0.5％；
[0016]
所述皂苷包括r1、rg1、re、rf、rb1、ro、rb2、rb3和rd中的一种或多种。
[0017]
本发明中，较佳地，所述甲酸占所述流动相a总体积的0.1％。
[0018]
本发明中，较佳地，所述甲酸占所述流动相b的总体积的0.1％。
[0019]
本发明中，所述梯度洗脱的洗脱程序较佳地为表2：
[0020]
表2洗脱梯度表
[0021][0022]
本发明中，较佳地，所述高效液相色谱法的检测条件包括：c18色谱柱，流速1.0ml/min，检测波长203nm，柱温30℃，进样量1～10μl。其中，所述c18色谱柱的型号较佳地为agilent poroshell 120ec
‑
c18(4.6
×
150mm,2.7μm)。
[0023]
本发明中，所述人参样品待测液可采用本领域常规的方法制备，一般包括：先将人参样品粉碎后过2～8号筛，烘干至恒重，称取样品加入甲醇
‑
水混合液或乙醇
‑
水混合液中超声或回流提取，提取液经过滤膜过滤，即得所述人参样品待测液。
[0024]
其中，较佳地，所述人参样品粉碎后过4号筛。
[0025]
其中，所述甲醇
‑
水混合液中甲醇的体积分数可为30～90％，例如70％。
[0026]
其中，所述超声的时间可为10～120min，较佳地为100min。
[0027]
其中，所述超声的温度可为10～80℃，较佳地为50℃。
[0028]
其中，所述过滤膜的孔径较佳地为0.22μm。
[0029]
本发明中，所述高效液相色谱法还可包括对照品溶液的制备。所述对照品溶液的制备按照本领域常规的方法进行即可。
[0030]
本发明中，所述高效液相色谱法可采用本领域常规的液相色谱仪进行，例如高效液相色谱仪、超高效液相色谱仪或高效液相色谱
‑
质谱联用仪。
[0031]
本发明基于前述人参中皂苷含量的检测方法，同时测定多批次野山参(野山参原支或野山参粉)、园参样品中9种皂苷的含量，在此基础上通过数学模型分析，探究其主要成分之间的关系和规律，建立一种园参和野山参的鉴别方法。
[0032]
本发明还提供一种园参和野山参的鉴别方法，其包括以下步骤：检测人参样品中皂苷rb1和ro的含量，计算rb1/ro的含量比例，即可判断人参种类，判断标准为：
[0033]
(1)当rb1的含量≥0.4％，且rb1/ro≥1.6，则所述人参样品为野山参；
[0034]
(2)当rb1的含量≥0.55％，则所述人参样品为野山参；
[0035]
(3)当rb1/ro大于等于1.8～3.0之间的任何值时，则所述人参样品为野山参。
[0036]
本发明中，所述皂苷rb1和ro的含量的检测方法可为本领域常规，较佳地为本发明前述人参中皂苷含量的检测方法。
[0037]
本发明中，所述野山参可为野山参原支或野山参粉。
[0038]
对于判断标准(1)，当所述野山参为野山参粉时，判断准确率为100％；当所述野山参为野山参原支时，判断准确率为94％，仅有6％的园参满足判断标准(1)。
[0039]
对于判断标准(2)，当所述野山参为野山参粉时，判断准确率为100％；当所述野山参为野山参原支时，判断准确率为89％，仅有6％的园参满足判断标准(2)。
[0040]
对于判断标准(3)，当所述野山参为野山参粉时，判断准确率为80％～100％；当所述野山参为野山参原支时，判断准确率为83％～89％，仅有6％的园参满足判断标准(2)。
[0041]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0042]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0043]
本发明的积极进步效果在于：
[0044]
1、建立了一种对仪器要求不高、可测成分多、分离度高、耗时短的高效液相色谱法，可以同时测定人参中9种皂苷成分(三七皂苷r1，人参皂苷rg1、re、rf、rb1、ro、rb2、rb3、rd)的含量，更具普适性，准确度更高，色谱峰保留时间更短(采用一般高效液相色谱仪测定在45min内即可出峰完毕)。
[0045]
2、本发明通过比较rb1的含量和rb1/ro的比值，给出了简便和明确标准参数，可以快速、高效、准确地判别野山参与园参，准确率高；同时也在日常药品检验等工作中具有较高的普适性和可行性，有利于市售人参的质量控制和产品发展。
附图说明
[0046]
图1为本发明实施例1的样品的色谱分析图。
具体实施方式
[0047]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0048]
实验仪器
[0049]
lc
‑
20ad岛津高效液相色谱仪，配备二元溶剂系统、自动进样管理器、柱温箱、uv检测器和labsolutions色谱工作站；xs204四位电子天平(mettler toledo)，xs205五位电子天平(mettler toledo)；超声波清洗机(sk2200bt)；hws
‑
26恒温水浴锅
[0050]
实验试剂及材料
[0051]
甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，merck公司)；纯净水；皂苷标准品(中国食品药品检定研究院)
[0052]
实施例1：人参中皂苷含量的检测
[0053]
(1)人参样品待测液的制备
[0054]
先将待测人参样品粉碎，全部过4号筛，然后精密称取待测人参样品2g，精密加入70％甲醇
‑
水混合液20ml，密封，初始温度50℃超声处理100min，待冷却至室温后，摇匀，过滤，弃去初滤液，精密量取续滤液10ml，80～85℃水浴蒸干，残渣加70％甲醇
‑
水混合液溶解并转移至5ml容量瓶中，加70％甲醇
‑
水混合液稀释至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
[0055]
(2)对照品溶液的制备
[0056]
分别精密称取对照品皂苷r1、rg1、re、rf、rb1、ro、rb2、rb3和rd，置同一5ml容量瓶中，加70％甲醇
‑
水混合液溶解并稀释至刻度线，混匀，即得对照品贮备液。再取适量该贮备液，加70％甲醇
‑
水混合液逐级稀释2倍，共稀释5次，即得系列混合对照品溶液。
[0057]
(3)高效液相色谱检测
[0058]
色谱柱agilent poroshell 120ec
‑
c18(4.6
×
150mm,2.7μm)，流速1.0ml/min，检测波长203nm，柱温30℃，进样量10μl；采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，梯度洗脱程序见表2。
[0059]
按照上述方法分别检测野山参粉、野山参原支和园参中皂苷的含量，检测所得的色谱图如图1所示。其中，a为野山参粉，b为野山参原支，c为园参；1
‑
三七皂苷r1，2
‑
人参皂苷rg1，3
‑
人参皂苷re，4
‑
人参皂苷rf，5
‑
人参皂苷rb1，6
‑
人参皂苷ro，7
‑
人参皂苷rb2，8
‑
人参皂苷rb3，9
‑
人参皂苷rd。
[0060]
另外，对照品和样品的分离度数据如表3所示。
[0061]
表3对照品和样品的分离度
[0062]
[0063]
[0064][0065]
实施例2：园参和野山参的鉴别方法
[0066]
随机选取的17批次园参、18批次野山参(原支)和10批次野山参(粉)，采用实施例1中的检测方法，检测上述样品中rb1和ro的含量，计算rb1/ro的含量比例，测定的数据如下表4所示。
[0067]
其中，在实施例1中的检测方法基础上，对照品溶液的制备如下：
[0068]
精密称取人参皂苷rb1对照品50mg、人参皂苷ro对照品25mg，置同一5ml容量瓶中，加70％甲醇
‑
水混合液溶解并稀释至刻度线，混匀，即得对照品贮备液。再取适量该贮备液，加70％甲醇
‑
水混合液逐级稀释2倍，共稀释5次，即得系列混合对照品溶液。
[0069]
表4人参样品中皂苷的含量(％)和比值(n＝2)
[0070]
[0071][0072][0073]
通过对上述结果的分析可得园参和野山参的判断标准，如表5所示。当rb1的百分含量≥0.4％，且rb1/ro≥1.6，则野山参(粉)100％的样品符合此参数条件，野山参(原支)
94％的样品符合此参数条件，而仅有6％的园参同时满足上述两个条件；当rb1的百分含量≥0.55％，则野山参(粉)100％的样品符合此参数条件，野山参(原支)89％的样品符合此参数条件，而仅有6％的园参满足上述条件；当rb1/ro大于等于1.8～3.0之间的任何值时，则野山参(粉)80％～100％的样品符合此参数条件，野山参(原支)83％～89％的样品符合此参数条件，而仅有6％的园参满足上述条件。
[0074]
表5园参和野山参的判断标准
[0075][0076]
随后，经过补充数据验证和盲测实验，以验证上述设置的参数正确率。