一种基于金修饰的钴酸镍作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器的制备及应用
技术领域
1.本发明涉及一种基于电致化学发光 (ecl) 免疫传感器的制备与应用，具体说是一种以金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，本发明属于新型功能材料、生物传感技术领域。
背景技术：
2.神经和神经内分泌组织中存在的神经元特异性烯醇化酶 (nse) 是参与糖酵解途径的烯醇化酶之一，正常人血清的nse含量为5
‑
15 ng/ml，而小细胞肺癌 (sclc) 患者的nse含量显着升高，临床研究表明，当nse初始水平低于100 ng/ml时，预后良好，存活率高；相反，如果nse的初始水平高于上述值，则预后较差，存活率明显较低；因此，有必要提出一种灵敏、宽线性的检测策略来检测血清中的nse。
3.ecl是将电化学手段与化学发光技术相结合的一种研究方法，近几年在免疫分析等方面受到的广泛地关注；ecl传感器具有高灵敏性、高选择性、高专一性和检出限低等优点，可快速准确的检测待测物的含量。
4.nico2o4具有大的表面积、优异的电导率、生物相容性好、环境友好等优异性能；nico2o4与相应的单组分氧化物相比具有优异的电化学活性，这归因于ni
3
/ni
2
和co
3
/co
2
提供了更丰富的氧化还原反应，从而提高了催化活性，使nico2o4比相应的单独金属氧化物 (nio和co3o4) 具有更好的生物传感效率；基于上述优点使nico2o4成为构建ecl生物传感器传感平台的理想候选材料；通过au修饰nico2o4不仅提高了材料的电导率和加速电子转移，而且还可以增加抗原抗体的结合数量，从而增大发光信号，提高检测的灵敏度和准确性。
5.碳量子点是一类新兴的碳纳米材料，具有非常好的发光性能，由于显示出较低的细胞毒性、较高的稳定性和良好的生物相容性等突出优点，有望在生物传感或成像中得到广泛的应用；目前在电致化学发光传感器中经常应用的量子点有碲化镉量子点、碳量子点、硫化锌量子点、二硫化钼量子点等；本发明中使用低激发电位、高稳定性和良好的生物相容性的新型氮掺杂的碳量子点，过氧化氢 (h2o2) 作为共反应活性物质，碳量子点在溶液中能产生极强的ecl发射；其机理主要是由于nico2o4中的ni
3
/ni
2
和co
3
/co
2
氧化还原电对促进h2o2分解产生大量的o2•−
，生成的大量o2•− 与nhcds
•
反应产生更强的ecl信号响应。
技术实现要素：
6.本发明的目的之一是制备一种以金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器来构建的无标型ecl免疫传感器。
7.本发明的目的之二是将该传感器用于nse的高灵敏、特异性准确检测。
8.本发明的技术方案如下：1.一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器的制备如下：
(1)用抛光粉将玻碳电极打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/l铁氰化钾溶液中，并在
‑
0.2 ~ 0.6 v电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mv；(2)将8 μl，1 ~ 3 mg/ml nico2o4@au@nhcds纳米复合物溶液滴加在电极上，4 ℃下干燥；(3)将8 μl，1 ~ 2 μg/ml nse抗体滴加在电极上，在4 ℃冰箱下干燥之后，用pbs清洗，以除去多余抗体，4 ℃下干燥；(4)将3 μl，质量分数为1 ~ 2 % bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，4 ℃下干燥；(5)将8 μl，0.0001 ~ 100 ng/ml一系列不同浓度的nse抗原标准溶液滴加于电极上，4 ℃下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，4 ℃下干燥，制得一种nico2o4@au材料的无标型电致化学发光免疫传感器。
9.2.一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au材料的制备步骤如下：(1)nico2o4的制备取0.75
‑
3 mmol的cocl2•
4h2o、0.375
‑
1.5 mmol的nicl2•
6h2o和22.5
‑
90 mmol尿素溶于20 ml去离子水中室温下连续搅拌30 min后转移到50 ml的高压反应釜中，120 ℃反应6 h后自然冷却至室温，最后离心、洗涤、干燥；(2)nico2o4@au的制备将25
‑
100 mg制备的nico2o4和1.5
‑
6 ml 2 %的haucl4分散加入10
‑
40 ml去离子水，搅拌5 min后加入3.5
‑
14 mg聚乙烯吡咯烷酮(pvp) 放入溶液中再进行5 min的搅拌，以此来防止金纳米粒子的团聚；然后，将2.5
‑
10 ml 5 mol/l柠檬酸钠溶液和1滴硼氢化钠溶液并继续搅拌12 h，生成物用去离子水和乙醇冲洗沉淀，直到上清液无色，并在50 ℃下干燥一夜。
10.3.一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au@nhcds
‑
ab1材料的制备步骤如下：(1)nhcds的制备在连续搅拌下将1.05
‑
4.2 g柠檬酸溶于5
‑
20 ml dmf中，随后滴加0.5
‑
2 ml水合肼后转移到高压反应釜进行溶剂热反应；180 ℃下进行12 h热处理后自然冷却到室温；得到的溶液离心 (12000 rpm, 10 min) 去除大颗粒残留物，用离子水对溶液进行透析 (1000da)，然后60 ℃真空干燥，最后将获得的黑色粉末储存在4 ℃密闭容器中；(2)nico2o4@au@nhcds的制备将3
‑
12 mg nico2o4@au与1
‑
4 mg nhcds溶解在去离子水中，用震荡机震荡24 h后进行离心、洗涤、干燥，得到目标产物；(3)nico2o4@au@nhcds
‑
ab1的制备称取6 mg nico2o4@au@nhcds复合物，加入1 ml nse
‑
ab
1 (10 μg/ml)，1 mlpbs (ph=7.38)，在
‑
4 ℃恒温振荡12 h后离心处理，向得到的沉淀物中加入1mlpbs溶液得到nico2o4@au@nhcds
‑
ab1。
11.4.nse的检验，步骤如下：(1)使用电化学工作站的三电极体系进行测试，ag/agcl电极作为参比电极，铂丝
电极为对电极，所制备的电致化学发光免疫传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为500 v，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 0.8 v，扫描速率为0.15 v/s；(2)在含20 ~ 80 mm h2o2和10 ml ph为6.47 ~ 9.18的磷酸盐缓冲溶液中 (pbs，1/15 mol/l的kh2po4和1/15 mol/l的na2hpo4)，通过电化学发光方法，检测对不同浓度的nse标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；(3)将待测nse样品溶液代替nse标准溶液进行测定。
12.本发明的有益成果(1)本发明采用nico2o4，其具有大的比表面积，高的电导率，丰富的氧化还原化学性质，能够承载更多的nhcds，nico2o4中的ni
3
/ni
2
和co
3
/co
2
提供了更丰富的氧化还原反应，从而提高了催化活性，通过au修饰nico2o4不仅提高了材料的电导率和加速电子转移，而且还可以增加抗原抗体的结合数量，增强ecl信号，提高了检测nse的灵敏度。
13.(2)采用低激发电位、高稳定性和良好的生物相容性的氮掺杂碳量子点作为发光体，使用h2o
2 作为共反应活性物质，碳量子点在溶液中能产生极强的ecl发射，从而提高了检测nse的准确性与特异性。
14.(3)本发明采用nico2o4@au@nhcds构建的超灵敏无标型电致化学发光免疫传感器，基于此构建的传感器可应用于nse的临床检测，具有操作简单，检测快速，信号线性范围宽 (0.0001 ~ 100 ng/ml)和检出限低 (0.05 pg/ml) 的优点。
具体实施方式
15.实施例1一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au材料的制备步骤如下：(1)nico2o4的制备取0.75 mmol的cocl2•
4h2o、0.375 mmol的nicl2•
6h2o和22.5 mmol尿素溶于20 ml去离子水中室温下连续搅拌30 min后转移到50 ml的高压反应釜中，120 ℃反应6 h后自然冷却至室温，最后离心、洗涤、干燥；(2)nico2o4@au的制备将25 mg制备的nico2o4和1.5 ml 2 %的haucl4分散加入10 ml去离子水，搅拌5 min后加入3.5mg聚乙烯吡咯烷酮 (pvp) 放入溶液中再进行5 min的搅拌，以此来防止金纳米粒子的团聚；然后，将2.5 ml 5 mol/l柠檬酸钠溶液和1滴硼氢化钠溶液并继续搅拌12 h，生成物用去离子水和乙醇冲洗沉淀，直到上清液无色，并在50 ℃下干燥一夜。
16.实施例2一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au材料的制备步骤如下：(1)nico2o4的制备取1.5 mmol的cocl2•
4h2o、0.75 mmol的nicl2•
6h2o和45 mmol尿素溶于20 ml去离子水中室温下连续搅拌30 min后转移到50 ml的高压反应釜中，120 ℃反应6 h后自然冷却至室温，最后离心、洗涤、干燥；(2)nico2o4@au的制备将50 mg制备的nico2o4和3 ml 2 %的haucl4分散加入20 ml去离子水，搅拌5 min
后加入7 mg聚乙烯吡咯烷酮 (pvp) 放入溶液中再进行5 min的搅拌，以此来防止金纳米粒子的团聚；然后，将5 ml 5 mol/l柠檬酸钠溶液和1滴硼氢化钠溶液并继续搅拌12 h，生成物用去离子水和乙醇冲洗沉淀，直到上清液无色，并在50 ℃下干燥一夜。
17.实施例3一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au材料的制备步骤如下：(1)nico2o4的制备取3 mmol的cocl2•
4h2o、1.5 mmol的nicl2•
6h2o和90 mmol尿素溶于20 ml去离子水中室温下连续搅拌30 min后转移到50 ml的高压反应釜中，120 ℃反应6 h后自然冷却至室温，最后离心、洗涤、干燥；(2)nico2o4@au的制备将100 mg制备的nico2o4和6 ml 2 %的haucl4分散加入40 ml去离子水，搅拌5 min后加入14 mg聚乙烯吡咯烷酮 (pvp) 放入溶液中再进行5 min的搅拌，以此来防止金纳米粒子的团聚；然后，将10 ml 5 mol/l柠檬酸钠溶液和1滴硼氢化钠溶液并继续搅拌12 h，生成物用去离子水和乙醇冲洗沉淀，直到上清液无色，并在50 ℃下干燥一夜。
18.实施例4一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au@nhcds
‑
ab1材料的制备步骤如下：(1)nhcds的制备在连续搅拌下将1.05 g柠檬酸溶于5ml dmf中，随后滴加0.5 ml水合肼后转移到高压反应釜进行溶剂热反应；180 ℃下进行12 h热处理后自然冷却到室温；得到的溶液离心 (12000 rpm, 10 min) 去除大颗粒残留物，用离子水对溶液进行透析 (1000da)，然后60 ℃真空干燥，最后将获得的黑色粉末储存在4 ℃密闭容器中；(2)nico2o4@au@nhcds的制备将3 mg nico2o4@au与1 mg nhcds溶解在去离子水中，用震荡机震荡24 h后进行离心、洗涤、干燥，得到目标产物；(3)nico2o4@au@nhcds
‑
ab1的制备称取6 mg nico2o4@au@nhcds复合物，加入1 ml nse
‑
ab
1 (10 μg/ml)，1 mlpbs (ph=7.38)，在
‑
4 ℃恒温振荡12 h后离心处理，向得到的沉淀物中加入1mlpbs溶液得到nico2o4@au@nhcds
‑
ab1。
19.实施例5一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au@nhcds
‑
ab1材料的制备步骤如下：(1)nhcds的制备在连续搅拌下将2.1 g柠檬酸溶于10 ml dmf中，随后滴加1.0 ml水合肼后转移到高压反应釜进行溶剂热反应；180 ℃下进行12 h热处理后自然冷却到室温；得到的溶液离心 (12000 rpm, 10 min) 去除大颗粒残留物，用离子水对溶液进行透析 (1000da)，然后60 ℃真空干燥，最后将获得的黑色粉末储存在4 ℃密闭容器中；(2)nico2o4@au@nhcds的制备将6 mg nico2o4@au与2 mg nhcds溶解在去离子水中，用震荡机震荡24 h后进行离心、洗涤、干燥，得到目标产物；(3)nico2o4@au@nhcds
‑
ab1的制备
称取6 mg nico2o4@au@nhcds复合物，加入1 ml nse
‑
ab
1 (10 μg/ml)，1 mlpbs (ph=7.38)，在
‑
4 ℃恒温振荡12 h后离心处理，向得到的沉淀物中加入1mlpbs溶液得到nico2o4@au@nhcds
‑
ab1。
20.实施例6一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au@nhcds
‑
ab1材料的制备步骤如下：(1)nhcds的制备在连续搅拌下将4.2 g柠檬酸溶于20 ml dmf中，随后滴加2.0 ml水合肼后转移到高压反应釜进行溶剂热反应；180 ℃下进行12 h热处理后自然冷却到室温；得到的溶液离心 (12000 rpm, 10 min) 去除大颗粒残留物，用离子水对溶液进行透析 (1000da)，然后60 ℃真空干燥，最后将获得的黑色粉末储存在4 ℃密闭容器中；(2)nico2o4@au@nhcds的制备将12 mg nico2o4@au与4 mg nhcds溶解在去离子水中，用震荡机震荡24 h后进行离心、洗涤、干燥，得到目标产物；(3)nico2o4@au@nhcds
‑
ab1的制备称取6 mg nico2o4@au@nhcds复合物，加入1 ml nse
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ab
1 (10 μg/ml)，1 mlpbs (ph=7.38)， 在
‑
4 ℃恒温振荡12 h后离心处理，向得到的沉淀物中加入1mlpbs溶液得到nico2o4@au@nhcds
‑
ab1。
21.实施例7一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器包括以下步骤：(1)将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/l铁氰化钾溶液中，并在
‑
0.2 ~ 0.6 v电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mv；(2)将8 μl，2 mg/ml nico2o4@au@nhcds纳米复合物溶液滴加在电极上，4 ℃下干燥；(3)将8 μl，1 μg/ml nse抗体滴加在电极上，在4 ℃冰箱下干燥之后，用pbs清洗，以除去多余抗体，4 ℃下干燥；(4)将3 μl，质量分数为1 % bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，4 ℃下干燥；(5)将8 μl，0.0001 ~ 100 ng/ml一系列不同浓度的nse抗原标准溶液滴加于电极上，4 ℃下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，4 ℃下干燥，制得一种nico2o4@au材料无标型电致化学发光免疫传感器。
22.实施例8一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器包括以下步骤：(1)将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/l铁氰化钾溶液中，并在
‑
0.2 ~ 0.6 v电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mv；(2)将8 μl，1 mg/ml nico2o4@au@nhcds纳米复合物溶液滴加在电极上，4 ℃下干燥；(3)将8 μl，1.5 μg/ml nse抗体滴加在电极上，在4 ℃冰箱下干燥之后，用pbs清洗，以除去多余抗体，4 ℃下干燥；(4)将3 μl，质量分数为1.5 % bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位
点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，4 ℃下干燥；(5)0.0001 ~ 100 ng/ml一系列不同浓度的nse抗原标准溶液滴加于电极上，4 ℃下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，4 ℃下干燥，制得nico2o4@au材料无标型电致化学发光免疫传感器。
23.实施例9一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器包括以下步骤：(1)将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/l铁氰化钾溶液中，并在
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0.2 ~ 0.6 v电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mv；(2)将8 μl，3 mg/ml nico2o4@au@nhcds纳米复合物溶液滴加在电极上，4 ℃下干燥；(3)将8 μl，2 μg/ml nse抗体滴加在电极上，在4 ℃冰箱下干燥之后，用pbs清洗，以除去多余抗体，4 ℃下干燥；(4)将3 μl，质量分数为2 % bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，4 ℃下干燥；(5)0.0001 ~ 100 ng/ml一系列不同浓度的nse抗原标准溶液滴加于电极上，4 ℃下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，4 ℃下干燥，制得nico2o4@au材料无标型电致化学发光免疫传感器。
24.实施例10 nse的检验，步骤如下：(1)使用电化学工作站的三电极体系进行测试，ag/agcl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光免疫传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为500 v，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 0.8v，扫描速率为0.15 v/s；(2)在含20 ~ 80 mm h2o2和10 ml ph为6.47 ~ 9.18的磷酸盐缓冲溶液中 (pbs，1/15 mol/l的kh2po4和1/15 mol/l的na2hpo4)，通过电化学发光方法，检测对不同浓度的nse标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；(3)将待测nse样品溶液代替nse标准溶液进行测定；(4)nse检测的线性范围是0.0001 ~ 100 ng/ml，检测限是0.05 pg/ml。
技术领域
1.本发明涉及一种基于电致化学发光 (ecl) 免疫传感器的制备与应用，具体说是一种以金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，本发明属于新型功能材料、生物传感技术领域。
背景技术：
2.神经和神经内分泌组织中存在的神经元特异性烯醇化酶 (nse) 是参与糖酵解途径的烯醇化酶之一，正常人血清的nse含量为5
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15 ng/ml，而小细胞肺癌 (sclc) 患者的nse含量显着升高，临床研究表明，当nse初始水平低于100 ng/ml时，预后良好，存活率高；相反，如果nse的初始水平高于上述值，则预后较差，存活率明显较低；因此，有必要提出一种灵敏、宽线性的检测策略来检测血清中的nse。
3.ecl是将电化学手段与化学发光技术相结合的一种研究方法，近几年在免疫分析等方面受到的广泛地关注；ecl传感器具有高灵敏性、高选择性、高专一性和检出限低等优点，可快速准确的检测待测物的含量。
4.nico2o4具有大的表面积、优异的电导率、生物相容性好、环境友好等优异性能；nico2o4与相应的单组分氧化物相比具有优异的电化学活性，这归因于ni
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提供了更丰富的氧化还原反应，从而提高了催化活性，使nico2o4比相应的单独金属氧化物 (nio和co3o4) 具有更好的生物传感效率；基于上述优点使nico2o4成为构建ecl生物传感器传感平台的理想候选材料；通过au修饰nico2o4不仅提高了材料的电导率和加速电子转移，而且还可以增加抗原抗体的结合数量，从而增大发光信号，提高检测的灵敏度和准确性。
5.碳量子点是一类新兴的碳纳米材料，具有非常好的发光性能，由于显示出较低的细胞毒性、较高的稳定性和良好的生物相容性等突出优点，有望在生物传感或成像中得到广泛的应用；目前在电致化学发光传感器中经常应用的量子点有碲化镉量子点、碳量子点、硫化锌量子点、二硫化钼量子点等；本发明中使用低激发电位、高稳定性和良好的生物相容性的新型氮掺杂的碳量子点，过氧化氢 (h2o2) 作为共反应活性物质，碳量子点在溶液中能产生极强的ecl发射；其机理主要是由于nico2o4中的ni
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和co
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氧化还原电对促进h2o2分解产生大量的o2•−
，生成的大量o2•− 与nhcds
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反应产生更强的ecl信号响应。
技术实现要素：
6.本发明的目的之一是制备一种以金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器来构建的无标型ecl免疫传感器。
7.本发明的目的之二是将该传感器用于nse的高灵敏、特异性准确检测。
8.本发明的技术方案如下：1.一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器的制备如下：
(1)用抛光粉将玻碳电极打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/l铁氰化钾溶液中，并在
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0.2 ~ 0.6 v电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mv；(2)将8 μl，1 ~ 3 mg/ml nico2o4@au@nhcds纳米复合物溶液滴加在电极上，4 ℃下干燥；(3)将8 μl，1 ~ 2 μg/ml nse抗体滴加在电极上，在4 ℃冰箱下干燥之后，用pbs清洗，以除去多余抗体，4 ℃下干燥；(4)将3 μl，质量分数为1 ~ 2 % bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，4 ℃下干燥；(5)将8 μl，0.0001 ~ 100 ng/ml一系列不同浓度的nse抗原标准溶液滴加于电极上，4 ℃下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，4 ℃下干燥，制得一种nico2o4@au材料的无标型电致化学发光免疫传感器。
9.2.一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au材料的制备步骤如下：(1)nico2o4的制备取0.75
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3 mmol的cocl2•
4h2o、0.375
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1.5 mmol的nicl2•
6h2o和22.5
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90 mmol尿素溶于20 ml去离子水中室温下连续搅拌30 min后转移到50 ml的高压反应釜中，120 ℃反应6 h后自然冷却至室温，最后离心、洗涤、干燥；(2)nico2o4@au的制备将25
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100 mg制备的nico2o4和1.5
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6 ml 2 %的haucl4分散加入10
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40 ml去离子水，搅拌5 min后加入3.5
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14 mg聚乙烯吡咯烷酮(pvp) 放入溶液中再进行5 min的搅拌，以此来防止金纳米粒子的团聚；然后，将2.5
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10 ml 5 mol/l柠檬酸钠溶液和1滴硼氢化钠溶液并继续搅拌12 h，生成物用去离子水和乙醇冲洗沉淀，直到上清液无色，并在50 ℃下干燥一夜。
10.3.一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au@nhcds
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ab1材料的制备步骤如下：(1)nhcds的制备在连续搅拌下将1.05
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4.2 g柠檬酸溶于5
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20 ml dmf中，随后滴加0.5
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2 ml水合肼后转移到高压反应釜进行溶剂热反应；180 ℃下进行12 h热处理后自然冷却到室温；得到的溶液离心 (12000 rpm, 10 min) 去除大颗粒残留物，用离子水对溶液进行透析 (1000da)，然后60 ℃真空干燥，最后将获得的黑色粉末储存在4 ℃密闭容器中；(2)nico2o4@au@nhcds的制备将3
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12 mg nico2o4@au与1
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4 mg nhcds溶解在去离子水中，用震荡机震荡24 h后进行离心、洗涤、干燥，得到目标产物；(3)nico2o4@au@nhcds
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ab1的制备称取6 mg nico2o4@au@nhcds复合物，加入1 ml nse
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1 (10 μg/ml)，1 mlpbs (ph=7.38)，在
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4 ℃恒温振荡12 h后离心处理，向得到的沉淀物中加入1mlpbs溶液得到nico2o4@au@nhcds
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ab1。
11.4.nse的检验，步骤如下：(1)使用电化学工作站的三电极体系进行测试，ag/agcl电极作为参比电极，铂丝
电极为对电极，所制备的电致化学发光免疫传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为500 v，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 0.8 v，扫描速率为0.15 v/s；(2)在含20 ~ 80 mm h2o2和10 ml ph为6.47 ~ 9.18的磷酸盐缓冲溶液中 (pbs，1/15 mol/l的kh2po4和1/15 mol/l的na2hpo4)，通过电化学发光方法，检测对不同浓度的nse标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；(3)将待测nse样品溶液代替nse标准溶液进行测定。
12.本发明的有益成果(1)本发明采用nico2o4，其具有大的比表面积，高的电导率，丰富的氧化还原化学性质，能够承载更多的nhcds，nico2o4中的ni
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提供了更丰富的氧化还原反应，从而提高了催化活性，通过au修饰nico2o4不仅提高了材料的电导率和加速电子转移，而且还可以增加抗原抗体的结合数量，增强ecl信号，提高了检测nse的灵敏度。
13.(2)采用低激发电位、高稳定性和良好的生物相容性的氮掺杂碳量子点作为发光体，使用h2o
2 作为共反应活性物质，碳量子点在溶液中能产生极强的ecl发射，从而提高了检测nse的准确性与特异性。
14.(3)本发明采用nico2o4@au@nhcds构建的超灵敏无标型电致化学发光免疫传感器，基于此构建的传感器可应用于nse的临床检测，具有操作简单，检测快速，信号线性范围宽 (0.0001 ~ 100 ng/ml)和检出限低 (0.05 pg/ml) 的优点。
具体实施方式
15.实施例1一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au材料的制备步骤如下：(1)nico2o4的制备取0.75 mmol的cocl2•
4h2o、0.375 mmol的nicl2•
6h2o和22.5 mmol尿素溶于20 ml去离子水中室温下连续搅拌30 min后转移到50 ml的高压反应釜中，120 ℃反应6 h后自然冷却至室温，最后离心、洗涤、干燥；(2)nico2o4@au的制备将25 mg制备的nico2o4和1.5 ml 2 %的haucl4分散加入10 ml去离子水，搅拌5 min后加入3.5mg聚乙烯吡咯烷酮 (pvp) 放入溶液中再进行5 min的搅拌，以此来防止金纳米粒子的团聚；然后，将2.5 ml 5 mol/l柠檬酸钠溶液和1滴硼氢化钠溶液并继续搅拌12 h，生成物用去离子水和乙醇冲洗沉淀，直到上清液无色，并在50 ℃下干燥一夜。
16.实施例2一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au材料的制备步骤如下：(1)nico2o4的制备取1.5 mmol的cocl2•
4h2o、0.75 mmol的nicl2•
6h2o和45 mmol尿素溶于20 ml去离子水中室温下连续搅拌30 min后转移到50 ml的高压反应釜中，120 ℃反应6 h后自然冷却至室温，最后离心、洗涤、干燥；(2)nico2o4@au的制备将50 mg制备的nico2o4和3 ml 2 %的haucl4分散加入20 ml去离子水，搅拌5 min
后加入7 mg聚乙烯吡咯烷酮 (pvp) 放入溶液中再进行5 min的搅拌，以此来防止金纳米粒子的团聚；然后，将5 ml 5 mol/l柠檬酸钠溶液和1滴硼氢化钠溶液并继续搅拌12 h，生成物用去离子水和乙醇冲洗沉淀，直到上清液无色，并在50 ℃下干燥一夜。
17.实施例3一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au材料的制备步骤如下：(1)nico2o4的制备取3 mmol的cocl2•
4h2o、1.5 mmol的nicl2•
6h2o和90 mmol尿素溶于20 ml去离子水中室温下连续搅拌30 min后转移到50 ml的高压反应釜中，120 ℃反应6 h后自然冷却至室温，最后离心、洗涤、干燥；(2)nico2o4@au的制备将100 mg制备的nico2o4和6 ml 2 %的haucl4分散加入40 ml去离子水，搅拌5 min后加入14 mg聚乙烯吡咯烷酮 (pvp) 放入溶液中再进行5 min的搅拌，以此来防止金纳米粒子的团聚；然后，将10 ml 5 mol/l柠檬酸钠溶液和1滴硼氢化钠溶液并继续搅拌12 h，生成物用去离子水和乙醇冲洗沉淀，直到上清液无色，并在50 ℃下干燥一夜。
18.实施例4一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au@nhcds
‑
ab1材料的制备步骤如下：(1)nhcds的制备在连续搅拌下将1.05 g柠檬酸溶于5ml dmf中，随后滴加0.5 ml水合肼后转移到高压反应釜进行溶剂热反应；180 ℃下进行12 h热处理后自然冷却到室温；得到的溶液离心 (12000 rpm, 10 min) 去除大颗粒残留物，用离子水对溶液进行透析 (1000da)，然后60 ℃真空干燥，最后将获得的黑色粉末储存在4 ℃密闭容器中；(2)nico2o4@au@nhcds的制备将3 mg nico2o4@au与1 mg nhcds溶解在去离子水中，用震荡机震荡24 h后进行离心、洗涤、干燥，得到目标产物；(3)nico2o4@au@nhcds
‑
ab1的制备称取6 mg nico2o4@au@nhcds复合物，加入1 ml nse
‑
ab
1 (10 μg/ml)，1 mlpbs (ph=7.38)，在
‑
4 ℃恒温振荡12 h后离心处理，向得到的沉淀物中加入1mlpbs溶液得到nico2o4@au@nhcds
‑
ab1。
19.实施例5一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au@nhcds
‑
ab1材料的制备步骤如下：(1)nhcds的制备在连续搅拌下将2.1 g柠檬酸溶于10 ml dmf中，随后滴加1.0 ml水合肼后转移到高压反应釜进行溶剂热反应；180 ℃下进行12 h热处理后自然冷却到室温；得到的溶液离心 (12000 rpm, 10 min) 去除大颗粒残留物，用离子水对溶液进行透析 (1000da)，然后60 ℃真空干燥，最后将获得的黑色粉末储存在4 ℃密闭容器中；(2)nico2o4@au@nhcds的制备将6 mg nico2o4@au与2 mg nhcds溶解在去离子水中，用震荡机震荡24 h后进行离心、洗涤、干燥，得到目标产物；(3)nico2o4@au@nhcds
‑
ab1的制备
称取6 mg nico2o4@au@nhcds复合物，加入1 ml nse
‑
ab
1 (10 μg/ml)，1 mlpbs (ph=7.38)，在
‑
4 ℃恒温振荡12 h后离心处理，向得到的沉淀物中加入1mlpbs溶液得到nico2o4@au@nhcds
‑
ab1。
20.实施例6一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器，其所述的nico2o4@au@nhcds
‑
ab1材料的制备步骤如下：(1)nhcds的制备在连续搅拌下将4.2 g柠檬酸溶于20 ml dmf中，随后滴加2.0 ml水合肼后转移到高压反应釜进行溶剂热反应；180 ℃下进行12 h热处理后自然冷却到室温；得到的溶液离心 (12000 rpm, 10 min) 去除大颗粒残留物，用离子水对溶液进行透析 (1000da)，然后60 ℃真空干燥，最后将获得的黑色粉末储存在4 ℃密闭容器中；(2)nico2o4@au@nhcds的制备将12 mg nico2o4@au与4 mg nhcds溶解在去离子水中，用震荡机震荡24 h后进行离心、洗涤、干燥，得到目标产物；(3)nico2o4@au@nhcds
‑
ab1的制备称取6 mg nico2o4@au@nhcds复合物，加入1 ml nse
‑
ab
1 (10 μg/ml)，1 mlpbs (ph=7.38)， 在
‑
4 ℃恒温振荡12 h后离心处理，向得到的沉淀物中加入1mlpbs溶液得到nico2o4@au@nhcds
‑
ab1。
21.实施例7一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器包括以下步骤：(1)将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/l铁氰化钾溶液中，并在
‑
0.2 ~ 0.6 v电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mv；(2)将8 μl，2 mg/ml nico2o4@au@nhcds纳米复合物溶液滴加在电极上，4 ℃下干燥；(3)将8 μl，1 μg/ml nse抗体滴加在电极上，在4 ℃冰箱下干燥之后，用pbs清洗，以除去多余抗体，4 ℃下干燥；(4)将3 μl，质量分数为1 % bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，4 ℃下干燥；(5)将8 μl，0.0001 ~ 100 ng/ml一系列不同浓度的nse抗原标准溶液滴加于电极上，4 ℃下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，4 ℃下干燥，制得一种nico2o4@au材料无标型电致化学发光免疫传感器。
22.实施例8一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器包括以下步骤：(1)将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/l铁氰化钾溶液中，并在
‑
0.2 ~ 0.6 v电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mv；(2)将8 μl，1 mg/ml nico2o4@au@nhcds纳米复合物溶液滴加在电极上，4 ℃下干燥；(3)将8 μl，1.5 μg/ml nse抗体滴加在电极上，在4 ℃冰箱下干燥之后，用pbs清洗，以除去多余抗体，4 ℃下干燥；(4)将3 μl，质量分数为1.5 % bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位
点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，4 ℃下干燥；(5)0.0001 ~ 100 ng/ml一系列不同浓度的nse抗原标准溶液滴加于电极上，4 ℃下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，4 ℃下干燥，制得nico2o4@au材料无标型电致化学发光免疫传感器。
23.实施例9一种基于金修饰的nico2o4作为高效共反应加速器构建的无标型ecl传感器包括以下步骤：(1)将玻碳电极用抛光粉打磨，再使用去离子水清洗，将电极置于5 mmol/l铁氰化钾溶液中，并在
‑
0.2 ~ 0.6 v电位下进行扫描，使峰电位的差值小于110 mv；(2)将8 μl，3 mg/ml nico2o4@au@nhcds纳米复合物溶液滴加在电极上，4 ℃下干燥；(3)将8 μl，2 μg/ml nse抗体滴加在电极上，在4 ℃冰箱下干燥之后，用pbs清洗，以除去多余抗体，4 ℃下干燥；(4)将3 μl，质量分数为2 % bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，4 ℃下干燥；(5)0.0001 ~ 100 ng/ml一系列不同浓度的nse抗原标准溶液滴加于电极上，4 ℃下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，4 ℃下干燥，制得nico2o4@au材料无标型电致化学发光免疫传感器。
24.实施例10 nse的检验，步骤如下：(1)使用电化学工作站的三电极体系进行测试，ag/agcl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光免疫传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为500 v，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 0.8v，扫描速率为0.15 v/s；(2)在含20 ~ 80 mm h2o2和10 ml ph为6.47 ~ 9.18的磷酸盐缓冲溶液中 (pbs，1/15 mol/l的kh2po4和1/15 mol/l的na2hpo4)，通过电化学发光方法，检测对不同浓度的nse标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；(3)将待测nse样品溶液代替nse标准溶液进行测定；(4)nse检测的线性范围是0.0001 ~ 100 ng/ml，检测限是0.05 pg/ml。
再多了解一些
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