一种慢病毒滴度检测试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明涉及慢病毒滴度检测技术领域，具体涉及一种慢病毒滴度检测试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.慢病毒载体为真核细胞的基因修饰提供了有效手段，被广泛应用到各种实验室研究、工业生产和临床基因治疗等领域。研究者一般通过病毒载体比活来评估慢病毒载体的质量。病毒载体比活是指病毒滴度与病毒物理滴度的比值，病毒滴度是指单位体积的病毒样品内具有感染功能的病毒载体的含量，病毒物理滴度是指单位体积的病毒样品内病毒表面特异性抗原p24的含量。
3.人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，hiv)是一种逆转录病毒，分为1型和2型。其中p24是hiv
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1的核心蛋白，构成病毒的核衣壳，现已被广泛用于艾滋病的临床早期诊断、艾滋病治疗效果评价、hiv感染细胞培养物中病毒生长的指示检测等。
4.慢病毒是逆转录病毒的一类，因其具有可以感染分裂细胞和非分裂细胞的特点，已成为有效的基因转移载体，是转基因动物和基因治疗研究的重要工具。由于hiv
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1慢病毒载体具有容纳外源性目的基因的片段大，可感染非分裂期细胞，可在体内长期稳定整合，较少发生基因沉默现象，免疫反应小，安全性较好等优点，hiv
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1已成为目前应用最广泛的慢病毒。另外，在hiv研究领域，hiv
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1假病毒的建立也是一种安全可靠、重要的研究技术手段，可用于研究病毒与宿主细胞的相互关系、评价疫苗临床免疫效果、筛选和评价抗病毒药物以及研究病毒调节基因功能等。
5.由于个体差异、各种病毒蛋白的浓度和抗原性强弱不同及不同个体对不同抗原成分的反应性均有所不同，因此相应抗体的产生时间和不同个体对相同抗原成分的免疫应答强度等存在一定差别，此外，检测方法和使用试剂的敏感性不同对hiv
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1抗体的检出时间产生一定影响。在感染hiv
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1后，患者血清中最先出现p24抗原，继之，各种hiv
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1抗原可达到高峰，2
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6周后，随着hiv
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1抗体产生及浓度的不断增加，hiv
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1抗原渐趋降低或检测不出。在hiv感染后期，抗原量不断增加，往往预后不佳，至少约有50％左右的病人发展为艾滋病。
6.目前用于hiv抗体检测的第三代elisa试剂窗口期为3
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4周，在该期病毒抗体不能被检出，但可检测到病毒相关抗原或分离出病毒，故在窗口期检测p24抗原是早期辅助诊断和进一步缩短窗口期的一种方法。p24抗原的检测，大约可以使抗体窗口期缩短1周，因为估计检测p24抗原到检出p24抗体间隔只有1周时间。hiv
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1p24抗原检测一般用elisa双抗体夹心法试剂。
7.长久以来，病毒滴度的测定一直是基因治疗研究工作中一项重要的工作。
8.hiv
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1慢病毒载体构建和hiv
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1假病毒包装是基因工程中常用的重要技术手段，慢病毒滴度的检测和包装效率评估是其中的一个重要环节。通常在构建慢病毒/假病毒载体时，加入特定的易检测的标志基因，如绿色荧光蛋白或萤火虫荧光素酶等基因，在转染细胞后收集上清，梯度稀释，在荧光显微镜下观察并统计病毒滴度。该方法操作复杂，统计结果
误差较大，准确度不高。通过检测hiv
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1p24蛋白含量和核酸拷贝数来评估包装效率，相比于之前的方法更为准确，灵敏度也更高。传统的慢病毒/假病毒包装效率检测的方法有elisa法(检测p24蛋白含量)和real
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time pcr法(检测核酸拷贝数)，这两种方法均操作复杂、耗时费力、成本高。
9.常规的操作需要用离心管将病毒原液进行适当倍数的稀释，然后将各稀释液加入到24孔板/48孔板中对应的检测孔，该操作需要进行前期的试剂耗材、实验设备仪器的准备，同时还需要在离心管中对病毒原液进行稀释，最终将稀释好的稀释液加入到对应的每孔检测孔中，且为了实验数据的准确性与可靠性，一般都会设置平行孔。常规操作，整个物料准备、检测过程复杂，用时过长，只能检测一个样本。
10.双抗体夹心法，是将含有已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，洗涤一次；加待测抗原，如两者是特异的，则发生结合，再加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体，使一单位的抗原同时结合两单位的抗体形成“夹心”；最后加入该酶的底物，根据产生的有色酶解产物颜色的深浅来判断待测抗原的含量。


技术实现要素：

11.本发明的目的在于提供一种慢病毒滴度检测试剂盒及其检测方法，以解决上述背景技术中提出的物料准备、检测过程复杂，用时过长，只能检测一个样本的问题。
12.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
13.一方面，本发明提供一种慢病毒滴度检测试剂盒，包括盒体和盒盖，所述盒体包括内盒和外盒，所述内盒与所述外盒设置为抽拉式组合，所述外盒底部设置有底板，所述底板临近所述内盒的边缘设置有缺口，所述内盒底部设置有支板，所述支板与所述底板的缺口吻合，所述外盒内放置有检测试剂和酶标仪，所述内盒内设置有微孔板。
14.作为本发明的一种优选技术方案，所述检测试剂包括抗体、生物素标记的单抗、底物显色剂、终止反应物和pbst液。
15.作为本发明的一种优选技术方案，所述抗体设置为抗hiv
‑
1p24的单克隆抗体，所述生物素标记的单抗设置为生物素标记的抗hiv
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1p24单抗，所述底物显色剂设置为链霉亲和素标记的底物液，所述终止反应物设置为硫酸。
16.作为本发明的一种优选技术方案，所述微孔板设置为酶标板，所述微孔板上的反应孔为矩形阵列设置，所述微孔板边缘根据反应孔的横纵行数均作有对应标记。
17.作为本发明的一种优选技术方案，所述内盒内设置有操作盘，所述操作盘设置为内凹的槽盘，所述操作盘的形状不做限定。
18.作为本发明的一种优选技术方案，所述内盒的侧壁设置有拉手，所述拉手设置为有遮板的凹槽。
19.作为本发明的一种优选技术方案，所述内盒滑动插接于所述外盒下部内，所述内盒的侧壁所在的面与所述外盒侧壁所在的面重叠。
20.第二方面，本发明提供一种慢病毒滴度检测试剂盒检测方法，具体包括以下步骤：
21.s1、将抗hiv
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1p24的单克隆抗体包被于所述微孔板；
22.s2、将待测样本加入已包被的所述微孔板的反应孔内孵育；
23.s3、加入生物素标记的单抗：加入生物素标记的抗hiv
‑
1p24单抗，继续孵育；
24.s4、加入底物显色剂：使用链霉亲和素标记的底物反应显色；
25.s5、加入终止反应物并测定：用硫酸终止反应，用酶标仪测定od值。
26.作为本发明的一种优选技术方案，在终止反应之前，每次加入新的检测试剂后，均使用pbst液进行洗涤。
27.综上所述，由于采用了上述技术，本发明的有益效果是：
28.本发明中，通过将盒体设置为内外双层的设置减少盒体体积，充分利用了空间，通过外盒与内盒抽拉式组合，便于检测时的操作，便于在等待时给微孔板提供避光环境，通过支板和底板的配合，便于内盒拉出后本身的稳定，防止内盒重心不稳而导致微孔板摇晃造成试验失误，同时本发明中样本无需特殊处理即可用于检测，减少检测时长，并且可同时进行多种样本检测。
附图说明
29.图1为本发明的立体结构示意图；
30.图2为本发明的盒体示意图；
31.图3为本发明的内盒抽出后立体示意图；
32.图4为本发明的侧视结构示意图；
33.图5为本发明的方法流程框图。
34.图中：1、盒盖；2、盒体；3、外盒；4、内盒；5、底板；6、支板；7、隔板；8、微孔板；9、操作盘；10、酶标仪；11、抗体；12、生物素标记的单抗；13、底物显色剂；14、终止反应物；15、pbst液；16、拉手。
具体实施方式
35.为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
36.在本发明的描述中，需要理解的是，指示方位或位置关系的术语为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
37.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据说明书具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
38.实施例1
39.请参阅图1
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图4，本发明提供了一种慢病毒滴度检测试剂盒，包括盒体2和盒盖1，所述盒体2可设置为矩形或圆形盒体，盒盖1的规格与所述盒体对应，盒盖1与盒体2上下滑动分体式连接。盒体2包括内盒4和外盒3，内盒4与外盒3设置为抽拉式组合，内盒4滑动插接于外盒3下部内，内盒4的侧壁所在的面与外盒3侧壁所在的面重叠。外盒3底部设置有底板5，底板5设置为硬橡胶板，底板5的面积比盒体2大一圈，盒盖1的底边可与底板5边缘一圈接触。
40.底板5临近内盒4的边缘设置有缺口，内盒4底部设置有支板6，支板6与底板5的缺口吻合，外盒3内放置有检测试剂和酶标仪10，内盒4内设置有微孔板8。将内盒4拉出，可进行微孔板8上的操作，当微孔板8的物质需进行避光处理时，可将内盒4推回，进而将微孔板8置于外盒3内部。支板6与底板5的设置，为盒体2提供稳固性，尤其是支板6的作用很重要，由于内盒4可被抽拉，当内盒4抽拉出后，若微孔板8上放置有检测对象，加上内盒4本身具有重量，若将内盒4完全拉出，内盒4拉出的部分重量超过在外盒3内的内盒4部分的重量，导致内盒4的平衡被打破，使得内盒4整体向外倾斜，进而导致微孔板8倾斜，使得检测环境不稳定。设置了支板6后，即使内盒4被完全拉出，内盒4边缘底部有支板6支撑，使得内盒4底面始终保持平稳，进而不会出现平衡被打破重心不稳的情况。
41.检测试剂包括抗体11、生物素标记的单抗12、底物显色剂13、终止反应物14和pbst液15。
42.抗体11设置为抗hiv
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1p24的单克隆抗体，抗体11在盒内为冻干粉状态，生物素标记的单抗12设置为生物素标记的抗hiv
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1p24单抗，生物素标记的单抗12在盒内也为冻干粉状态，底物显色剂13设置为链霉亲和素标记的底物液，终止反应物14设置为硫酸，需要说明的是，上述提到的检测试剂的制备方法均为现有技术。
43.微孔板8设置为酶标板，微孔板8上的反应孔为矩形阵列设置，微孔板8边缘根据反应孔的横纵行数均作有对应标记。x轴使用阿拉伯数字标记，y轴使用大写英文字母进行标记，两者配合使用可对微孔板8内的反应孔进行记录，便于在检测多种样本时，进行归纳整理，避免混淆。
44.为便于工具规整，外盒3内设置有隔板7，检测试剂均放在隔板7左边，酶标仪10放置在隔板7右边。
45.内盒4内设置有操作盘9，操作盘9设置为内凹的槽盘，操作盘9的形状不做限定。操作盘9可用于溶液稀释等处理。
46.内盒4的侧壁设置有拉手16，拉手16设置为有遮板的凹槽。拉动拉手16便可将内盒4拉动。
47.本发明中，通过将盒体2设置为内外双层的设置减少盒体体积，充分利用了空间，通过外盒3与内盒4抽拉式组合，便于检测时的操作，便于在等待时给微孔板8提供避光环境，通过支板6和底板5的配合，便于内盒4拉出后本身的稳定，防止内盒4重心不稳而导致微孔板8摇晃造成试验失误，同时本试剂盒可同时检测多种样本，减少使用的时长，提高检测效率。
48.一种慢病毒滴度检测试剂盒检测方法，具体包括以下步骤：
49.s1、将抗hiv
‑
1p24的单克隆抗体包被于微孔板8；
50.s2、将待测样本加入已包被的微孔板8的反应孔内孵育；
51.s3、加入生物素标记的单抗：加入生物素标记的抗hiv
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1p24单抗，继续孵育；
52.s4、加入底物显色剂：使用链霉亲和素标记的底物反应显色；
53.s5、加入终止反应物：用硫酸终止反应，用酶标仪测定od值。
54.在终止反应之前，每次加入新的检测试剂后，均使用pbst液进行洗涤。
55.hiv变异株，hiv抗体检则一直具有极大的挑战性。hiv
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1p24抗原在不同的hiv类型和群中是最保守的蛋白质，因此，检则p24可以更广泛地进行hiv基因型的检则。
56.具体操作时，见图5，采用双抗体夹心法测定hiv
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1p24蛋白，将浓度为8
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18μg/ml的抗hiv
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1p24的单克隆抗体包被于微孔板8上，95
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125μl/孔，pbst液洗涤一次，330μl/孔。然后将待测样品进行稀释，并将稀释液加入反应孔中，37℃孵育，pbst液洗涤一次，330μl/孔。若标本中含有hiv
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1p24蛋白，则该蛋白与孔内的抗体形成抗原抗体复合物，进行下一步操作，加入生物素标记的抗hiv
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1p24单抗，90
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110μl/孔，37℃孵育，pbst液洗涤一次，330μl/孔。孵育后，酶标抗体与抗原抗体复合物上的抗原结合，再与链霉亲和素标记的底物反应显色，100μl/孔，37℃将内盒4推进外盒3内避光反应15min。链霉亲和素与生物素具有极高的亲和力，反应呈高度专一性。每个链霉亲和素分子具有4个生物素分子结合位点，因此，它可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物，通过标记的hrp催化底物显色，具有多级放大作用。与亲和素相比，链霉亲和素不带糖基、等电点低，在使用中表现出更低的背景和更高的检测灵敏性。最后加入硫酸终止反应，100μl/孔，使用酶标仪10在490nm处测定od值。
57.本方法在微孔板8上包被抗体对中的一个抗体并完成封闭，比传统检测方法更简单，整个流程时间更短，并且单克隆抗体作为包被抗体，特异性强，所使用链霉亲和素与生物素标记显色在使用中表现出更低的背景和更高的检测灵敏性。结合本发明提出的试剂盒，打开盒盖1后将所使用的检测试剂抗体11、生物素标记的单抗12、底物显色剂13、终止反应物14和pbst液15取下，通过拉手16拉出内盒4，在微孔板8上进行操作，在需要避光处理时，可将内盒4推进外盒3中，样本无需特殊处理即可用于检测，减少检测时长，并且可同时进行多种样本检测。
58.需要说明的是：酶标仪10的型号规格需根据该装置的实际规格等进行选型确定，具体选型计算方法采用本领域现有技术，故不再详细赘述。
59.酶标仪10其供电及其原理对本领域技术人员来说是清楚的，在此不予详细说明。
60.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
61.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。