用于经口递送生物活性剂的组合物
1.本技术是申请号为201480073399.4，申请日为2014年11月20日，发明名称为“用于经口递送生物活性剂的组合物”的发明专利申请的分案申请。
2.相关申请的交叉引用本技术要求于2013年12月6日提交的美国申请no. 61/912,958的优先权权益，其通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本发明涉及一种组合物，特别是涉及一种用于经口递送生物活性剂的组合物。
背景技术：
4.经口施用药物和疫苗提供了多个优点。剂量可通过食物或水以最小的约束和劳动力向大量动物施用。约束还使动物紧张，致使药物或疫苗接种不太有效且提高传染病的风险。对于产肉动物，经口施用的另一个优点在于其避免了注射部位反应。断针、注射部位污染或使用高反应性佐剂可诱导损害畜体和皮肤的脓肿。这些反应降低了动物在屠宰时的价值。在需要将鱼从其池中或开口的海水网箱中捕获出来并单独注射的鱼疫苗接种程序中，这也是问题。经口接种快速且有效，并消除了对动物进行多种处理以施用随后的加强接种的需要。经口施用之后的不良免疫反应也不太可能发生，因此更安全。
5.经口疫苗接种是鱼水产养殖系统中以最小的应激或劳动力同时给大量的鱼接种疫苗或治疗的特别节约成本的方式。当经口施用疫苗可通过喂食/饮用期间的摄入实现时尤其如此。另外，因为产生经口疫苗所需的纯化步骤较少，所以与可注射疫苗制剂相比，可以更经济有效地制造经口疫苗。经口疫苗接种还提供了副作用较少（例如对注射的应激或其它反应）的优点。
6.尽管经口施用药物特别是疫苗具有优点，但是该技术的发展由于缺乏适当的疫苗递送系统而延迟。在没有合适的递送系统的情况下，大多数经口疫苗在胃肠（gi）道中（特别是在低ph胃条件下）发生降解，导致吸收有限，这进而导致免疫应答不足。
7.从历史上看，免疫依赖于通过肠胃外施用疫苗诱导体液免疫。然而，通过肠胃外施用诱导的抗体不一定达到粘膜表面（大多数感染原的进入位点）。粘膜免疫是防御感染原的重要的第一道防线，由于抗原与粘膜组织的接触，所述粘膜免疫在粘膜表面（包括肠、肺、口、眼、乳腺和泌尿生殖道）以及鱼的皮肤和鳃上形成。
8.已开发了多种将药物或疫苗递送至肠粘膜组织的载体。可生物降解聚合物（例如聚(dl
‑
丙交酯)和聚(dl
‑
丙交酯
‑
共
‑
乙交酯））已用于生产用于经口施用抗原的组合物。然而，这些聚合物颗粒的生产需要使用可损害脆弱抗原的溶剂。此外，溶剂的使用阻止减毒的活生物体（例如病毒或细菌）并入到这些组合物中。
9.开发适当的经口递送系统的其它挑战包括需要仅选择食品级或饲料级和可生物降解的化合物和佐剂以及需要持久且稳健的免疫应答。
技术实现要素：
10.在一个方面，本发明提供了用于向水生或陆生物种经口施用生物活性剂的组合物，其包含这样的颗粒：每个颗粒包含分散在油滴中的生物活性剂，所述油滴分散在包含肠溶包衣聚合物的基质中，其中所述颗粒各自还包含粘膜粘附聚合物。
11.在另一个方面，本发明提供了向动物胃后（post gastric）递送生物活性剂的方法，其包括向动物经口施用如上所述组合物的步骤，其中所述生物活性剂是免疫原。
12.在另一个方面，本发明提供了给水生或陆生物种接种疫苗的方法，其包括向所述物种经口施用如上所述组合物的步骤，其中所述组合物为疫苗的递送载体。
13.在另一个方面，本发明提供了制备组合物的方法。所述方法依次包括：(a) 形成包含分散或溶解的生物活性剂的水性混合物；(b) 使步骤(a)的水性混合物在油中均质化以产生水性混合物在油中的乳液；(c) 使步骤(b)的产物在包含肠溶包衣聚合物的水溶液中形成浆液；以及(d1) 将步骤(c)的浆液喷射、滴入或注入到包含肠溶包衣聚合物的交联剂的水溶液中以形成颗粒，其中步骤(a)的水性混合物还包含粘膜粘附聚合物，或者(d2) 由步骤(c)的浆液形成颗粒，其中步骤(b)还包括形成所述乳液在水性粘膜粘附聚合物中的液滴，并使所述粘膜粘附聚合物交联以形成中间颗粒。
具体实施方式
14.除非本文另有定义，否则在本公开内容中使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员一般理解和使用的含义。此外，如本文和权利要求中使用的术语“至少一个/种”和“一个/种或更多个/种”具有相同的含义，并且包括一个/种、两个/种、三个/种或更多个/种。除非另外指出，否则组合物中组分的百分比或份数均以重量计。术语“分散”意指悬浮和/或溶解。
[0015]“经口疫苗接种”被定义为通过喂食免疫原性物质来经口施用以刺激动物的全身免疫系统从而形成对病原体的特异性免疫应答。
[0016]“交联”及其变体指两种或更多种原料和/或物质（包括任何本文中公开的那些）通过一个或更多个共价和/或非共价（例如，离子）缔合的连接。交联可自然（例如，胱氨酸残基的二硫键）或者通过合成或半合成路径来实现。带电聚合物的交联可通过与带相反电荷的多价抗衡离子的离子缔合来实现。可通过这样的交联制备牢固的固体结构（例如水凝胶）。
[0017]“胃保护”指保护生物活性剂不被胃破坏而失去活性。
[0018]
本发明的组合物包含含有生物活性剂和粘膜粘附聚合物的颗粒材料，其中所述生物活性剂分散在油中。所述油滴进而包埋在肠溶包衣聚合物的外部基质中或被其包覆。外部基质包围油滴，保护内容物不暴露于动物胃中的低ph条件，原因是聚合物在低ph下仍然是不溶解的并且作为保护涂层或层仍然是完整的。颗粒的平均几何尺寸（有时称为直径）通常为10
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m至5000
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m，并且颗粒可直接形成所述尺寸范围或者通过研磨、磨碎或其它手段减小到该尺寸。通常，颗粒的直径小于100
ꢀµ
m，优选小于50
ꢀµ
m。
[0019]
在一些实施方案中，将粘膜粘附聚合物和生物活性剂混合在一起并使其相互接触，在进而分散在油滴中的颗粒内缔合在一起。这些颗粒中的一个或更多个存在于单个油滴内，并且一个或更多个油滴存在于外部基质内。粘膜粘附聚合物和/或肠溶包衣聚合物可
以是交联或未交联的。
[0020]
在另一些实施方案中，生物活性剂如上分散在油滴内，然后将这些油滴包埋在粘膜粘附聚合物中。进而将所得颗粒包埋在肠溶包衣聚合物的外部基质中。粘膜粘附聚合物和/或肠溶包衣聚合物可以是交联或未交联的。
[0021]
在一些实施方案中，本发明提供了用于经口施用疫苗以刺激水生和陆生物种中针对特定疾病的免疫应答的组合物。所述组合物包含有效量的作为生物活性剂的抗原。本组合物被设计用于提供用于与动物的肠粘膜接触以刺激摄取和粘膜免疫的生物活性物质。根据本发明的组合物经口施用，通常与饲料或可药用载体（包括例如水（例如动物饮用水）、片剂、胶囊剂、大丸剂型（bolus dosage forms）、颗粒饲料）一起或作为食品添加剂以将所述组合物运送到靶物种的肠道中。
[0022]
本发明的组合物在向对象递送生物活性剂方面提供了多个优点。首先，制备递送系统的方法避免了通过其它方法制备颗粒通常所需的有机溶剂或高温和高ph的使用。在本组合物的整个制备期间通过将水环境维持在温和的ph条件和低温下，可经口递送敏感的生物活性物质，例如活的减毒细菌或病毒。第二，肠溶包衣聚合物的附加层保护生物活性剂在胃肠道中不被降解。在免疫原的情况下，这允许以更少量的抗原/疫苗刺激相同的免疫应答。第三，油分散体包围生物活性剂，防止在制备期间以及在胃暴露期间小的生物活性分子（例如蛋白质、肽和药物）浸出到水环境中。另外，粘膜粘附聚合物本身提供佐剂作用。最后，可容易地配制该递送系统用于有效递送至水生和陆生物种两者。
[0023]
通常，用于制备本发明组合物的所有组分是食品级、无毒且可生物降解的，并且通常是天然存在的。可用于制备所述组合物的物质的描述如下。
[0024]
生物活性剂生物活性剂可以是天然存在的、合成或半合成的物质（例如，化合物、发酵物、提取物、细胞结构），其能够直接或间接地引发一种或更多种物理、化学和/或生物学效应。生物活性剂可以预防、缓解、治疗和/或治愈活体的异常和/或病理状况，例如通过破坏寄生生物体或者通过限制疾病或异常的影响。根据效果和/或其应用，生物活性剂可以是药剂（例如预防剂或治疗剂）、诊断剂和/或美容剂，并且包括但不限于：疫苗、药物、前药、亲和分子、合成有机分子、激素、抗体、聚合物、酶、低分子量分子蛋白质化合物、肽、维生素、类固醇、类固醇类似物、脂质、核酸、碳水化合物、其前体及其衍生物。生物活性剂还可以是营养补充剂。非限制性的营养补充剂包括蛋白质、碳水化合物、水溶性维生素（例如，维生素c、维生素b复合物等）、脂溶性维生素（例如，维生素a、d、e、k等）、矿物质和草本提取物。生物活性剂可以商购和/或通过已知的技术制备。
[0025]
本发明中的生物活性剂包括但不限于疫苗（疫苗也可以作为免疫刺激复合物的一部分，抗原与霍乱毒素及其b亚单位、凝集素和佐剂的缀合物递送）、抗生素、亲和分子、合成有机分子、聚合物、低分子量蛋白质化合物、肽、维生素、类固醇、类固醇类似物、脂质、核酸、碳水化合物、其前体及其衍生物。生物活性剂还可以是农药，例如灭鼠剂。
[0026]
生物活性剂可以是免疫原，即，能够在动物中引起特异性免疫应答的物质。免疫原的实例包括抗原和疫苗。例如，免疫原可包括免疫原性肽、蛋白质或重组蛋白质（其包含含有免疫原性肽和/或蛋白质和细菌（例如，菌苗）的混合物）；完整无活性、减毒和传染性的病毒颗粒；完整杀伤、减毒和传染性的原核生物；包括其任何生命周期阶段的完整杀伤、减毒
和传染性的原生动物，及完整灭活、减毒和传染性的多细胞病原体、重组亚单位疫苗以及递送和表达编码免疫原性蛋白（例如dna疫苗）的基因的重组载体。
[0027]
一种或更多种生物活性剂通常占颗粒（不包括水）重量的至少0.1%、或至少1%、或至少5%。通常，其占至多40%、或至多20%、或至多10%。
[0028]
粘膜粘附聚合物粘膜粘附聚合物是这样的聚合物：其与粘膜组织特异性地结合，并帮助保持生物活性剂紧靠粘膜，从而改善施用。合适的实例包括合成的聚合物，例如聚(丙烯酸)、羟丙基甲基纤维素和聚(丙烯酸甲酯)、羧基官能化的聚合物、硫酸盐官能化的聚合物、胺官能化的聚合物，及其衍生物或修饰物；以及天然存在的聚合物，例如角叉菜胶（carrageenan）、透明质酸、壳聚糖（chitosan）、阳离子瓜尔胶和藻酸盐（alginate）。也可以使用天然存在的聚合物的衍生的或以其它方式修饰的版本，并且许多这样的聚合物是本领域中已知的。非限制性实例包括藻酸丙二醇酯和果胶、羧甲基壳聚糖、羧甲基甲壳素、甲基乙二醇壳聚糖、三甲基壳聚糖等。
[0029]
优选的粘膜粘附聚合物是壳聚糖和修饰的或衍生的壳聚糖，其可通过甲壳素（甲壳类动物中外骨骼的主要化合物）的脱乙酰作用获得。壳聚糖[α
‑
(1~4)
‑2‑
氨基
‑2‑
脱氧
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖]（与纤维素密切相关的粘多糖）表现出由分子量、脱乙酰度和粘度所决定的化学特性。壳聚糖可形成可通过与交联剂（例如磷酸盐离子、戊二醛或硫酸盐离子）的化学反应结合大量抗原的微粒和纳米颗粒。
[0030]
尽管在一些优选的实施方案中使用壳聚糖，但是可使用其它聚合物来实现类似的粘膜粘附功能。这些聚合物包括但不限于明胶、藻酸盐、葡聚糖、透明质酸、琼脂和抗性淀粉。
[0031]
一种或更多种粘膜粘附聚合物通常占颗粒（不包括水）重量的至少1%、或至少10%、或至少15%。通常，其占至多50%、或至多30%、或至多20%。
[0032]
油在典型的传统产物中，大量的生物活性剂在其制备期间和通过胃通道通过浸出颗粒而损失到水环境中，特别是小分子尺寸的生物活性剂，例如病毒、蛋白质、药物、抗生素、农药等。在本发明中，生物活性剂从颗粒中的浸出通过包含分散在油中或被油包覆的试剂的离散颗粒、区域或相大大地消除。任何类型的油（包括液体或固体形式的植物油、动物油或合成油和脂肪，或蜡）可用于包覆生物活性剂。用于本发明的植物来源的油包括但不限于：蓖麻油、椰子油、可可脂、玉米油、棉籽油、橄榄油、橄榄角鲨烷、棕榈油、花生油、菜籽油、红花油、芝麻油、大豆油、向日葵油、硬脂酸脂、巴西棕榈蜡及其混合物。用于本发明的动物来源的油包括但不限于：鱼油、鲨鱼角鲨烷、乳脂、蜂蜡、羊毛脂、猪油等。在某些情况下，分散油是橄榄或鲨鱼角鲨烷与任何其它类型的油、脂肪或蜡的混合物。通常，油的质量大于生物活性剂和粘膜粘附聚合物的组合质量。
[0033]
在典型的过程中，使包含生物活性剂和粘膜粘附聚合物的水溶液与油以按重量计1份溶液比1.1至5份油的比例均质化直至产生均匀的乳液。为了帮助形成均匀且稳定的乳液，可添加非离子表面活性剂。合适的非离子表面活性剂包括但不限于：乙氧基化脂肪醇、聚氧乙烯表面活性剂和羧酸酯等。一旦形成稳定的乳液，通过粘膜粘附聚合物的化学或物理反应使分散在油中的水滴固化。例如，通过降低温度或改变乳液的ph使明胶和琼脂聚合
物固化；而通过将乳液的ph提高到6.5以上和/或通过添加抗衡离子例如三聚磷酸钠（tripolyphosphate，tpp）使壳聚糖固化。
[0034]
一种或更多种油通常占颗粒（不包括水）重量的至少1.5%、或至少10%、或至少20%。通常，其占至多40%、或至多30%、或至多25%。
[0035]
肠溶包衣聚合物油分散体的液滴（包含粘膜粘附聚合物或被其包覆）分散在肠溶包衣聚合物的基质中，所述肠溶包衣聚合物提供胃保护和生物活性剂完整的胃后释放或递送，即，在肠中释放。
[0036]
示例性的肠溶包衣聚合物包括在足够高ph下可溶于水但在低ph下不溶解的聚合物。通常，其在大于5.0的ph下是可溶的，而在小于4.0的ph下是不溶解的。合适的聚合物在动物肠（生物活性物质待在此处释放）的相对温和的ph条件下为基本上可溶或可消化的，但在胃中不溶解且难消化，此处肠溶包衣聚合物的外部基质保护敏感的生物活性剂不被破坏。在某些情况下，肠溶包衣聚合物是交联的，例如与二价阳离子交联，以防止在胃中溶解或消化。
[0037]
合适的肠溶包衣聚合物可选自任何大量的亲水性聚合物，包括例如聚丙烯酸、聚(甲基)丙烯酸酯、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素和水溶性的天然或合成多糖胶。一个示例性的合成肠溶包衣聚合物是eudragit
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fs30d（evonik industries）。海藻酸钠和果胶由于其温和的交联条件是优选的水溶性胶。
[0038]
特别地，由于藻酸盐易于用于形成固体凝胶组合物，其提供了胃敏感的生物活性剂的优选的亲水性载体基质。当藻酸盐溶液与二价阳离子结合或混合时，藻酸盐溶液形成固体凝胶。但是，在某些实施方案中，藻酸盐是未交联的，但在胃环境中仍然难消化和不溶解，因此当在动物胃的低ph条件下时保护颗粒内容物。
[0039]
藻酸盐包含不同比例的1,4
‑
连接的β
‑
d
‑
甘露糖醛酸（m）、α
‑
l
‑
古洛糖醛酸（g）和交替（mg）嵌段。藻酸盐溶液的粘度主要由m/g嵌段的分子比决定。低粘度藻酸盐通常包含至少50%的甘露糖醛酸单元，并且其粘度为20
‑
200 mpa。中等和高粘度藻酸盐包含至少50%的古洛糖醛酸单元，并且其粘度通常大于200 mpas。
[0040]
在一些实施方案中，形成基质的聚合物是藻酸盐、果胶或其混合物。优选低粘度等级藻酸盐和低甲氧基果胶。典型的低甲氧基果胶的甲基化程度小于50%，并且这些低甲氧基果胶通常与二价阳离子（例如ba、ca、mg、sr或zn）交联。
[0041]
一种或更多种肠溶包衣聚合物通常占颗粒（不包括水）重量的至少10%、或至少20%、或至少30%。通常，其占至多70%、或至多50%、或至多40%。
[0042]
可选成分在一些实施方案中，除了主要的生物活性剂以外，组合物任选地包含营养物、营养食品、诱食剂和/或掩味化合物。还可包含渗透促进剂或佐剂以引起强烈的免疫应答并改善粘膜淋巴细胞对抗原的摄取。一个示例性的佐剂是β葡聚糖。
[0043]
制备组合物制备颗粒的第一种通用方法如下。使包含分散的生物活性剂和粘膜粘附聚合物的水性混合物与油均质化以产生水性混合物在油中的乳液。通常，使用按重量计1份水性混合物比1.1至5份油的比例来制备乳液。然后，使乳液在包含肠溶包衣聚合物的水溶液中浆化，
biopolymers inc.）溶解在100 ml 0.5n冰醋酸溶液中。用氢氧化钠将溶液的ph调节至5.8，并使该溶液冷却至室温。添加了吐温80（0.2%, sigma, st louis, mo）和消泡剂（antifoam）（0.5%, sigma, st louis, mo），并将壳聚糖溶液保持在4℃下直至使用。将30 ml包含300 mg卵清蛋白（“ova”，模型疫苗）的溶液添加到壳聚糖溶液中以产生混合物。将所得溶液添加到195 g包含5% span
‑
80（sigma）的橄榄油中，并在冰浴中以10,000 rpm匀化30分钟以形成油包水乳液。在搅拌下将20 ml水性三聚磷酸钠（5%）和0.5n naoh缓慢添加到连续油相中包含卵清蛋白和交联壳聚糖微粒的生物活性剂乳液中。使颗粒硬化至少2小时但不从油相中移除。
[0052]
将颗粒在油中的分散体搅拌进330 ml的9%低粘度等级藻酸钠（fmc biopolymers inc.）水溶液中，所述溶液还包含66 g寡糖（速溶菊粉，cargill, minneapolis，mn）、10 g卵磷脂和3 g吐温80。将所得水性分散体注入到包含5% cacl2的交联溶液中以形成藻酸盐基质珠，每个珠包含多个油滴，每个油滴进而包含卵清蛋白和交联壳聚糖的微粒。将珠冷冻干燥并研磨成尺寸小于150
ꢀµ
m的颗粒以获得本发明的干组合物。
[0053]
实施例1b形成本发明组合物的一种替代方法利用水性生物活性溶液在油中的乳液。将10 ml包含100 mg卵清蛋白的水溶液与15 g包含5% span
‑
80的芥花油合并并均质化以形成微细的油包水乳液。将该乳液与100 ml 3%水性壳聚糖溶液混合，并将分散体注入到包含5%三聚磷酸盐（tripolyphosphate）溶液（5% tpp）的交联溶液中。使颗粒硬化至少2小时。所得的固体交联的壳聚糖颗粒包含包埋的油滴，并且每个这些油滴进而包含分散的小于10 μm的水性卵清蛋白液滴。固体颗粒通过过滤分离并微细地分散在400 ml的9%低粘度等级藻酸盐水溶液中。将所得水性分散体注入到包含5% cacl2的交联溶液中以形成藻酸盐基质珠。将珠冷冻干燥并研磨成尺寸小于150
ꢀµ
m的颗粒以获得本发明的干组合物。
[0054]
实施例2免疫原性组合物的制备在50℃下将壳聚糖（3 g，fmc biopolymer）溶解在100 ml 0.5 n冰醋酸溶液中。用氢氧化钠将溶液的ph调节至5.8，并使该溶液冷却至室温。将10 ml包含100 mg作为模型疫苗的卵清蛋白（ova）的溶液与50 mg免疫刺激剂（β葡聚糖，ahd international, atlanta, ga）混合并添加到壳聚糖溶液中。以10,000 rpm将所得混合物在150 g包含5% w/w span
‑
80的鲨鱼角鲨烷油（jedwards international）中乳化30分钟以形成ova、壳聚糖和β葡聚糖的水滴在连续油相中的乳液。在搅拌下将该乳液添加到400 ml的9%低粘度等级藻酸钠在0.5 n naoh中的水溶液中，所述水溶液还包含寡糖（40 g，速溶菊粉）。将所得乳液注入到5% cacl2溶液中以交联藻酸盐，得到本发明的免疫原性组合物。将该组合物冷冻干燥并研磨成尺寸小于250
ꢀµ
m的颗粒。
[0055]
实施例3用于治疗/预防鱼寄生虫感染的组合物的制备制备了包含用于治疗鱼中寄生虫感染的蛋白质抗原或杀寄生虫化合物的组合物。将10 mg生物活性剂溶解在10 ml如上述实施例2中描述的3%水性壳聚糖溶液中，并在15 g包含75%橄榄油、20%角鲨烷油和5% span
‑
80的油混合物中乳化。
[0056]
使1 ml的水性5%三聚磷酸钠、0.5 n naoh溶液在1 g橄榄油中乳化并混合到生物
活性剂乳液中，得到包含生物活性剂和交联壳聚糖的颗粒在油中的分散体。使该分散体静置2小时以硬化交联的壳聚糖。在搅拌下将所得的颗粒在油中的分散体添加到20 ml包含9%低粘度等级藻酸钠、1%低甲氧基果胶、30% w/w速溶菊粉和1%吐温80的溶液中。将所得混合物注入到包含3% cacl2的交联溶液中以形成包含包埋的分散油滴的藻酸盐
‑
果胶基质珠，每个油滴进而包含生物活性剂和交联壳聚糖的微粒。将珠冷冻干燥并研磨至小于150
ꢀµ
m以获得本发明的干组合物。
[0057]
实施例4包含药物的组合物的制备制备了用于治疗结肠疾病的包含药物（糖皮质激素，例如地塞米松（dexamethasone）或甲基泼尼松龙（methyl prednisolone））的组合物。将药物添加到如上述实施例1或2中描述的壳聚糖溶液中，并在95%角鲨烷油和5% span
‑
80的混合物中乳化。制备了包含0.5 n naoh中5%三聚磷酸钠在角鲨烷油中的碱性乳液并将其缓慢混合（20% w/w）到生物活性乳液中以交联壳聚糖，并使混合物静置至少2小时以硬化交联的颗粒。以1:3乳液/eudragit液体的比例将壳聚糖微粒的油分散体混入到包含肠溶包衣聚合物（30% w/w eudragit
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fs30d, evonik industries）的液体中并喷雾干燥以形成本发明的干微粒组合物。
[0058]
实施例5本发明组合物中生物活性剂的包封效率使用卵清蛋白（ova）模拟典型的蛋白质药物或疫苗评估了本发明组合物中的附加油分散体和肠溶包衣聚合物基质的作用。制备了三种包含ova（sigma）的组合物。组合物1由结合ova的壳聚糖微粒构成，其如下制备：将100 mg ova溶解在10 ml 3%壳聚糖溶液中，并将该溶液注入到10%水性tpp中以形成交联的珠，随后保持2小时以使珠硬化，随后冷冻干燥并研磨。组合物2如下制备：使10 ml包含100 mg ova的水溶液在15 g包含3% span
‑
80的角鲨烷油中乳化，并使所得乳液在20 ml 3%壳聚糖溶液中混合。然后将所得浆液注入到10% tpp溶液中以形成珠，随后如上所述硬化、冷冻干燥并研磨。组合物3由根据本发明如实施例2中制备的结合ova的壳聚糖微粒构成。
[0059]
如下测定了三种类型的组合物中ova的包封效率。将500 mg的每种组合物分散在10 ml ripa缓冲液中并在室温下孵育30分钟。将悬浮液涡旋5分钟，然后在3000 rpm下离心15分钟。如下所述使用蛋白质印迹分析测定了上清液的ova含量。
[0060]
蛋白质印迹法：将组合物用如上所述的ripa缓冲液裂解，将相当于每种样品12 μg蛋白质的计算量上样到10% sds
‑
聚丙烯酰胺梯度凝胶（sds
‑
page, bio
‑
rad, hercules, ca）上。将蛋白质转移到pvdf膜（bio
‑
rad）上，并在包含0.5%吐温20的pbs（pbs
‑
t）中用5%脱脂乳封闭1小时。在室温下将印迹用以1:5000稀释度的合适的一抗孵育1小时。在用pbs
‑
t（3
×
10 ml，每次5分钟）洗涤后，将膜用以1:5000稀释度的合适的hrp缀合的二抗（emd millipore corporation, billerica, ma, usa）孵育1小时。用pbs
‑
t（3
×
10 ml，每次5分钟）洗涤后，用ecl底物（amsheram biosciences）使化学发光膜显影。ova（初始量的ova的保留%）的包封效率列于表1中。
[0061]
表1组合物包封效率（%）
170295395
[0062]
结果证明组合物2和3中的油分散体在防止生物活性剂浸出（损失）到简单的水环境中的保护作用。然而，当在胃条件下测试时发现对比组合物2和本发明组合物3之间的显著差异，如下实施例7中所述。
[0063]
实施例6未受保护的蛋白质抗原活性在模拟胃液中的降解为了评估在典型的胃暴露之后蛋白质抗原活性的损失，在37℃下在振动器上使未包封的ova（10 mg）在10 ml 包含0.08%胃蛋白酶的模拟胃液中（ph
‑
2）孵育2小时。在15分钟、30分钟、60分钟和120分钟的孵育时间处取出培养基，并如上所述使用蛋白质印迹分析分析了剩余ova的量。表2示出了暴露于模拟胃液2小时后ova的降解，表示为相对于暴露前活性的剩余活性%。
[0064]
表2时间（分钟）剩余活性（%）1561305560381202
[0065]
这些结果表明，未受保护的基于蛋白质的抗原或生物活性剂的活性在动物消化道中会完全降解。
[0066]
实施例7本发明组合物中生物活性剂的胃保护为了评估胃暴露后蛋白质抗原的剩余活性，如实施例5中所述制备了三种组合物。在37℃下在振动器上使每种500 mg的三种组合物各自在10 ml 包含0.08%胃蛋白酶的模拟胃液中（ph
‑
2）孵育2小时。在2小时的暴露结束时，取出胃液并如实施例5中所述测量了组合物中ova的剩余活性。表3示出了暴露于模拟胃液2小时后各组合物中ova的剩余活性。
[0067]
表3组合物剩余活性（%）110220390
[0068]
这些结果清楚地表明本发明组合物3相对于现有技术组合物1和2的优异的胃保护作用。
[0069]
实施例8组合物中藻酸盐的粘度等级对胃保护的影响根据上述实施例2制备了包含9%低等级粘度藻酸盐（50 cp）、6%中等等级粘度藻酸盐（300 cp）和1%高等级粘度藻酸盐（800 cp）的三种组合物。如实施例7中所述将三种组合物暴露于模拟胃液，并如实施例5中所述测量了组合物中ova的剩余活性。表4示出了暴露于
模拟胃液2小时后各组合物中ova的剩余活性。
[0070]
表4藻酸盐粘度等级剩余活性（%）高（800cp）25中等（300cp）40低（50cp）90
[0071]
这些结果表明，包含低粘度等级藻酸盐的组合物在模拟动物消化道中为基于蛋白质的抗原或生物活性剂提供更高的保护。
[0072]
实施例9本发明组合物的最佳粒径在本实施例中，对干燥且磨碎的本发明组合物的粒径在模拟胃环境中的保护作用进行了评估。如实施例5中所述制备了ova组合物，随后将干粉末分离成2种粒径：通过50
ꢀµ
m筛的小颗粒，和在50
ꢀµ
m筛上捕获但通过100
ꢀµ
m筛的大颗粒。 表5示出了暴露于模拟胃液2小时后各粒径组合物中ova的剩余活性。
[0073]
表5粒径剩余活性（%）50
‑
100
µ
m90<50
µ
m40
[0074]
这些结果表明，当将干组合物研磨成50
ꢀµ
m以上的粒径时提供最佳的胃保护。
[0075]
实施例10向小鼠经口施用ova组合物向小鼠经口施用了卵清蛋白以测试本发明组合物在诱导免疫应答中的效力。
[0076]
动物：使用十至十二周龄的雌性balb/c小鼠。小鼠随意进食。将每个实验组放在单独的笼子中。
[0077]
卵清蛋白组合物：将卵清蛋白（1 mg/g卵清蛋白，sigma, st. louis, mo.）并入如实施例5中描述的本发明组合物中。将三组小鼠，每组4只如下接种：1）组合物中的卵清蛋白（ova），经口施用，2）ova溶液，皮下（sc）施用，3）经口施用不含抗原的组合物。在第0周和第3周给小鼠接种。每个剂量施用总计100 mg以1:2 w/w的干组合物/油的比例与玉米油混合的涂覆在颗粒饲料上的干组合物。在第4周，使每只小鼠安乐死并收获血清和脾细胞。
[0078]
免疫学测定：通过elisa测定血清的igg和iga。使用吸附到聚苯乙烯板上的ova进行elisa。对于血清，将样品以1:25稀释度一式三份地置于孔中。使用与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠抗体，随后是邻苯二胺底物（sigma, st. louis, mo., u.s.a.）。每个孔的光密度通过将板置于微量滴定板分光光度计上并在490 nm处读取板来测定。使用前述技术，对脾细胞的ova特异性的抗体分泌细胞（antibody secreting cells，asc）进行测试。
[0079]
通过测定光密度随时间的增加对ova特异性igg和iga抗体进行定量。预计接种ova的每只小鼠的ova特异性血清和iga igg和asc分泌细胞在注射ova并经口喂食本发明组合物的那些小鼠中同样地增加。预计在喂食不含抗原的组合物的小鼠中不会检测到ova特异性igg或iga抗体。因此，预计所述组合物在经口施用后可有效地诱导免疫应答。
[0080]
实施例11
向鸡经口施用包含抗原的组合物肠炎沙门氏菌（salmonella enteritidis）是产蛋母鸡发病的主要原因。感染降低产量并提高成群死亡率。此外，肠炎沙门氏菌可通过卵传递给小鸡，感染后代或食用经感染鸡蛋的人类。因为感染以这种细菌附着并侵入肠粘膜开始，且长期感染涉及肠淋巴组织的感染，所以必须要刺激粘膜免疫来控制这种疾病。
[0081]
为了评估给鸡接种本发明的疫苗组合物的效力，将肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白（主要的免疫原）并入到根据实施例2的组合物之中，不同之处在于以1:2 w/w的比例将疫苗乳液混合到碱性藻酸钠相中并将浆液喷雾干燥。将干燥的组合物涂覆在饲料表面上并向鸡经口施用。十周龄的鸡以2周的时间间隔接受3次经口施用装载有300
ꢀµ
g肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白抗原或牛血清白蛋白的组合物。在抗原的最后一次经口施用后一周，收集血清和肠液并通过elisa测定鞭毛蛋白特异性抗体。预计结果表明经口接种疫苗的禽的血清中鞭毛蛋白特异性抗体显著增多。
[0082]
实施例12向牛犊经口施用包含抗原的组合物证明了经口施用根据本发明制备的包含卵清蛋白的组合物在牛犊肺中刺激免疫应答的效力。
[0083]
将卵清蛋白并入如实施例1a中描述的组合物中。对于向牛犊经口施用，将包含40
ꢀµ
g卵清蛋白/mg剂量的组合物施加到饲料中。每个实验组使用四只牛犊，并且每只牛犊接受5 mg卵清蛋白/剂，持续5天。
[0084]
使用两组牛犊来评估经口施用卵清蛋白诱导特异性免疫应答的效力。组1间隔3周通过皮下（sc）注射给予2个剂量的不完全弗氏佐剂（freund’s adjuvant）中的卵清蛋白。该组充当肠胃外对照，其为常规地用于任何疫苗的疫苗接种方法。组2间隔3周接受2次包含卵清蛋白的组合物的经口给药方案。评估血清同种型抗体对卵清蛋白的应答。预计结果表明，在经口喂食包含ova的组合物的牛犊中产生大量ova特异性igg和iga。所预计的很高水平的血清iga预测在刺激牛全身性免疫应答中具有高效力。
[0085]
实施例13向鱼经口施用包含弧菌抗原的组合物溶藻弧菌（vibrio alginolyticus）是水产养殖中严重的细菌感染，在虹鳟鱼中尤为严重。其现在在所有的鳟鱼生产国地方性流行，在这些国家中其可导致严重的经济损失。其也正在成为养殖鲑鱼（主要是在淡水生长阶段）的更显著的病原体但是已报道其在海洋中同样造成损失。疫苗接种可防止溶藻弧菌对鲑鱼养殖周期的任何阶段产生重大影响。典型的疫苗接种方案包括2至5 g鱼苗的初次接种和初次接种后4
‑
6个月经口加强接种。 然而，理想的疫苗接种方案将仅包括定期向鱼提供一种类型的接种疫苗以保持整个培养期间鱼血清中的有效抗体滴度。
[0086]
实验设计：证明了经口施用根据本发明制备的包含erm疫苗的组合物在鳟鱼血清中刺激免疫应答的效力。
[0087]
将减毒的溶藻弧菌并入到如实施例1b中描述的组合物中。对于向鱼经口施用，将包含2
ꢀµ
g溶藻弧菌疫苗/mg剂量的组合物施加到饲料中。每个实验组使用20条平均大小为5 g的鱼，并且每条鱼在饲料配给中接受1剂量的溶藻弧菌疫苗，持续5天。
[0088]
使用三组鱼来评估相对于通过注射的标准疫苗接种，经口施用溶藻弧菌疫苗诱导免疫应答的效力。使用通过注射方案的疫苗接种给组1接种疫苗。该组充当肠胃外对照，其为常规地用于任何疫苗的疫苗接种方法。组2接受1次包含溶藻弧菌疫苗的组合物的经口给药方案。组3接受1次不含疫苗的组合物的经口给药方案。疫苗接种后6周评估血清对溶藻弧菌的同种型抗体应答。预计结果表明，在经口喂食包含溶藻弧菌的组合物的鱼中产生大量的溶藻弧菌特异性iga。预计经口接种疫苗的鱼和注射接种疫苗的鱼二者血清中的免疫应答是相当的。所预计的很高水平的血清iga预测在刺激鱼全身性免疫应答中具有高效力。
[0089]
实施例14包含灭鼠剂的组合物杀鼠灵（warfarin）是用于控制大鼠和小鼠侵扰的最常见灭鼠剂。摄取包含杀鼠灵的诱饵的啮齿动物在15至30分钟内表现出明显的中毒症状，并且在1至2小时内失去意识。然而，由于其快速起效，啮齿动物通常摄取亚致死量的杀鼠灵并且在8小时内恢复过来。包封杀鼠灵可延迟症状的发作，允许消耗完全致死剂量。
[0090]
实验方法：使用10至12周龄的雌性balb/c小鼠。小鼠随意进食。将每个实验组放在单独的笼子中。
[0091]
本发明的杀鼠灵组合物：将杀鼠灵（400 mg/g组合物，sigma, st. louis, mo.）并入到如实施例3中一般描述的组合物中。三组小鼠，每组4只各自随意如下喂食：1）本发明的杀鼠灵组合物，以4%杀鼠灵活性混合到诱饵中，2）未包封的杀鼠灵，以4%活性混合到饵料中，3）包含如实施例3中的组合物但不包含杀鼠灵或其它生物活性剂的诱饵。监测摄食量和对小鼠的杀伤效果。
[0092]
结果表明，组1和组3的摄食量相似，而组2（未包封的杀鼠灵）中的摄食量小25%以上。预计组1中所有小鼠在喂食8小时后全部死去，而所有组2小鼠在喂食8小时后仍然存活。
1.本技术是申请号为201480073399.4，申请日为2014年11月20日，发明名称为“用于经口递送生物活性剂的组合物”的发明专利申请的分案申请。
2.相关申请的交叉引用本技术要求于2013年12月6日提交的美国申请no. 61/912,958的优先权权益，其通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本发明涉及一种组合物，特别是涉及一种用于经口递送生物活性剂的组合物。
背景技术：
4.经口施用药物和疫苗提供了多个优点。剂量可通过食物或水以最小的约束和劳动力向大量动物施用。约束还使动物紧张，致使药物或疫苗接种不太有效且提高传染病的风险。对于产肉动物，经口施用的另一个优点在于其避免了注射部位反应。断针、注射部位污染或使用高反应性佐剂可诱导损害畜体和皮肤的脓肿。这些反应降低了动物在屠宰时的价值。在需要将鱼从其池中或开口的海水网箱中捕获出来并单独注射的鱼疫苗接种程序中，这也是问题。经口接种快速且有效，并消除了对动物进行多种处理以施用随后的加强接种的需要。经口施用之后的不良免疫反应也不太可能发生，因此更安全。
5.经口疫苗接种是鱼水产养殖系统中以最小的应激或劳动力同时给大量的鱼接种疫苗或治疗的特别节约成本的方式。当经口施用疫苗可通过喂食/饮用期间的摄入实现时尤其如此。另外，因为产生经口疫苗所需的纯化步骤较少，所以与可注射疫苗制剂相比，可以更经济有效地制造经口疫苗。经口疫苗接种还提供了副作用较少（例如对注射的应激或其它反应）的优点。
6.尽管经口施用药物特别是疫苗具有优点，但是该技术的发展由于缺乏适当的疫苗递送系统而延迟。在没有合适的递送系统的情况下，大多数经口疫苗在胃肠（gi）道中（特别是在低ph胃条件下）发生降解，导致吸收有限，这进而导致免疫应答不足。
7.从历史上看，免疫依赖于通过肠胃外施用疫苗诱导体液免疫。然而，通过肠胃外施用诱导的抗体不一定达到粘膜表面（大多数感染原的进入位点）。粘膜免疫是防御感染原的重要的第一道防线，由于抗原与粘膜组织的接触，所述粘膜免疫在粘膜表面（包括肠、肺、口、眼、乳腺和泌尿生殖道）以及鱼的皮肤和鳃上形成。
8.已开发了多种将药物或疫苗递送至肠粘膜组织的载体。可生物降解聚合物（例如聚(dl
‑
丙交酯)和聚(dl
‑
丙交酯
‑
共
‑
乙交酯））已用于生产用于经口施用抗原的组合物。然而，这些聚合物颗粒的生产需要使用可损害脆弱抗原的溶剂。此外，溶剂的使用阻止减毒的活生物体（例如病毒或细菌）并入到这些组合物中。
9.开发适当的经口递送系统的其它挑战包括需要仅选择食品级或饲料级和可生物降解的化合物和佐剂以及需要持久且稳健的免疫应答。
技术实现要素：
10.在一个方面，本发明提供了用于向水生或陆生物种经口施用生物活性剂的组合物，其包含这样的颗粒：每个颗粒包含分散在油滴中的生物活性剂，所述油滴分散在包含肠溶包衣聚合物的基质中，其中所述颗粒各自还包含粘膜粘附聚合物。
11.在另一个方面，本发明提供了向动物胃后（post gastric）递送生物活性剂的方法，其包括向动物经口施用如上所述组合物的步骤，其中所述生物活性剂是免疫原。
12.在另一个方面，本发明提供了给水生或陆生物种接种疫苗的方法，其包括向所述物种经口施用如上所述组合物的步骤，其中所述组合物为疫苗的递送载体。
13.在另一个方面，本发明提供了制备组合物的方法。所述方法依次包括：(a) 形成包含分散或溶解的生物活性剂的水性混合物；(b) 使步骤(a)的水性混合物在油中均质化以产生水性混合物在油中的乳液；(c) 使步骤(b)的产物在包含肠溶包衣聚合物的水溶液中形成浆液；以及(d1) 将步骤(c)的浆液喷射、滴入或注入到包含肠溶包衣聚合物的交联剂的水溶液中以形成颗粒，其中步骤(a)的水性混合物还包含粘膜粘附聚合物，或者(d2) 由步骤(c)的浆液形成颗粒，其中步骤(b)还包括形成所述乳液在水性粘膜粘附聚合物中的液滴，并使所述粘膜粘附聚合物交联以形成中间颗粒。
具体实施方式
14.除非本文另有定义，否则在本公开内容中使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员一般理解和使用的含义。此外，如本文和权利要求中使用的术语“至少一个/种”和“一个/种或更多个/种”具有相同的含义，并且包括一个/种、两个/种、三个/种或更多个/种。除非另外指出，否则组合物中组分的百分比或份数均以重量计。术语“分散”意指悬浮和/或溶解。
[0015]“经口疫苗接种”被定义为通过喂食免疫原性物质来经口施用以刺激动物的全身免疫系统从而形成对病原体的特异性免疫应答。
[0016]“交联”及其变体指两种或更多种原料和/或物质（包括任何本文中公开的那些）通过一个或更多个共价和/或非共价（例如，离子）缔合的连接。交联可自然（例如，胱氨酸残基的二硫键）或者通过合成或半合成路径来实现。带电聚合物的交联可通过与带相反电荷的多价抗衡离子的离子缔合来实现。可通过这样的交联制备牢固的固体结构（例如水凝胶）。
[0017]“胃保护”指保护生物活性剂不被胃破坏而失去活性。
[0018]
本发明的组合物包含含有生物活性剂和粘膜粘附聚合物的颗粒材料，其中所述生物活性剂分散在油中。所述油滴进而包埋在肠溶包衣聚合物的外部基质中或被其包覆。外部基质包围油滴，保护内容物不暴露于动物胃中的低ph条件，原因是聚合物在低ph下仍然是不溶解的并且作为保护涂层或层仍然是完整的。颗粒的平均几何尺寸（有时称为直径）通常为10
ꢀµ
m至5000
ꢀµ
m，并且颗粒可直接形成所述尺寸范围或者通过研磨、磨碎或其它手段减小到该尺寸。通常，颗粒的直径小于100
ꢀµ
m，优选小于50
ꢀµ
m。
[0019]
在一些实施方案中，将粘膜粘附聚合物和生物活性剂混合在一起并使其相互接触，在进而分散在油滴中的颗粒内缔合在一起。这些颗粒中的一个或更多个存在于单个油滴内，并且一个或更多个油滴存在于外部基质内。粘膜粘附聚合物和/或肠溶包衣聚合物可
以是交联或未交联的。
[0020]
在另一些实施方案中，生物活性剂如上分散在油滴内，然后将这些油滴包埋在粘膜粘附聚合物中。进而将所得颗粒包埋在肠溶包衣聚合物的外部基质中。粘膜粘附聚合物和/或肠溶包衣聚合物可以是交联或未交联的。
[0021]
在一些实施方案中，本发明提供了用于经口施用疫苗以刺激水生和陆生物种中针对特定疾病的免疫应答的组合物。所述组合物包含有效量的作为生物活性剂的抗原。本组合物被设计用于提供用于与动物的肠粘膜接触以刺激摄取和粘膜免疫的生物活性物质。根据本发明的组合物经口施用，通常与饲料或可药用载体（包括例如水（例如动物饮用水）、片剂、胶囊剂、大丸剂型（bolus dosage forms）、颗粒饲料）一起或作为食品添加剂以将所述组合物运送到靶物种的肠道中。
[0022]
本发明的组合物在向对象递送生物活性剂方面提供了多个优点。首先，制备递送系统的方法避免了通过其它方法制备颗粒通常所需的有机溶剂或高温和高ph的使用。在本组合物的整个制备期间通过将水环境维持在温和的ph条件和低温下，可经口递送敏感的生物活性物质，例如活的减毒细菌或病毒。第二，肠溶包衣聚合物的附加层保护生物活性剂在胃肠道中不被降解。在免疫原的情况下，这允许以更少量的抗原/疫苗刺激相同的免疫应答。第三，油分散体包围生物活性剂，防止在制备期间以及在胃暴露期间小的生物活性分子（例如蛋白质、肽和药物）浸出到水环境中。另外，粘膜粘附聚合物本身提供佐剂作用。最后，可容易地配制该递送系统用于有效递送至水生和陆生物种两者。
[0023]
通常，用于制备本发明组合物的所有组分是食品级、无毒且可生物降解的，并且通常是天然存在的。可用于制备所述组合物的物质的描述如下。
[0024]
生物活性剂生物活性剂可以是天然存在的、合成或半合成的物质（例如，化合物、发酵物、提取物、细胞结构），其能够直接或间接地引发一种或更多种物理、化学和/或生物学效应。生物活性剂可以预防、缓解、治疗和/或治愈活体的异常和/或病理状况，例如通过破坏寄生生物体或者通过限制疾病或异常的影响。根据效果和/或其应用，生物活性剂可以是药剂（例如预防剂或治疗剂）、诊断剂和/或美容剂，并且包括但不限于：疫苗、药物、前药、亲和分子、合成有机分子、激素、抗体、聚合物、酶、低分子量分子蛋白质化合物、肽、维生素、类固醇、类固醇类似物、脂质、核酸、碳水化合物、其前体及其衍生物。生物活性剂还可以是营养补充剂。非限制性的营养补充剂包括蛋白质、碳水化合物、水溶性维生素（例如，维生素c、维生素b复合物等）、脂溶性维生素（例如，维生素a、d、e、k等）、矿物质和草本提取物。生物活性剂可以商购和/或通过已知的技术制备。
[0025]
本发明中的生物活性剂包括但不限于疫苗（疫苗也可以作为免疫刺激复合物的一部分，抗原与霍乱毒素及其b亚单位、凝集素和佐剂的缀合物递送）、抗生素、亲和分子、合成有机分子、聚合物、低分子量蛋白质化合物、肽、维生素、类固醇、类固醇类似物、脂质、核酸、碳水化合物、其前体及其衍生物。生物活性剂还可以是农药，例如灭鼠剂。
[0026]
生物活性剂可以是免疫原，即，能够在动物中引起特异性免疫应答的物质。免疫原的实例包括抗原和疫苗。例如，免疫原可包括免疫原性肽、蛋白质或重组蛋白质（其包含含有免疫原性肽和/或蛋白质和细菌（例如，菌苗）的混合物）；完整无活性、减毒和传染性的病毒颗粒；完整杀伤、减毒和传染性的原核生物；包括其任何生命周期阶段的完整杀伤、减毒
和传染性的原生动物，及完整灭活、减毒和传染性的多细胞病原体、重组亚单位疫苗以及递送和表达编码免疫原性蛋白（例如dna疫苗）的基因的重组载体。
[0027]
一种或更多种生物活性剂通常占颗粒（不包括水）重量的至少0.1%、或至少1%、或至少5%。通常，其占至多40%、或至多20%、或至多10%。
[0028]
粘膜粘附聚合物粘膜粘附聚合物是这样的聚合物：其与粘膜组织特异性地结合，并帮助保持生物活性剂紧靠粘膜，从而改善施用。合适的实例包括合成的聚合物，例如聚(丙烯酸)、羟丙基甲基纤维素和聚(丙烯酸甲酯)、羧基官能化的聚合物、硫酸盐官能化的聚合物、胺官能化的聚合物，及其衍生物或修饰物；以及天然存在的聚合物，例如角叉菜胶（carrageenan）、透明质酸、壳聚糖（chitosan）、阳离子瓜尔胶和藻酸盐（alginate）。也可以使用天然存在的聚合物的衍生的或以其它方式修饰的版本，并且许多这样的聚合物是本领域中已知的。非限制性实例包括藻酸丙二醇酯和果胶、羧甲基壳聚糖、羧甲基甲壳素、甲基乙二醇壳聚糖、三甲基壳聚糖等。
[0029]
优选的粘膜粘附聚合物是壳聚糖和修饰的或衍生的壳聚糖，其可通过甲壳素（甲壳类动物中外骨骼的主要化合物）的脱乙酰作用获得。壳聚糖[α
‑
(1~4)
‑2‑
氨基
‑2‑
脱氧
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖]（与纤维素密切相关的粘多糖）表现出由分子量、脱乙酰度和粘度所决定的化学特性。壳聚糖可形成可通过与交联剂（例如磷酸盐离子、戊二醛或硫酸盐离子）的化学反应结合大量抗原的微粒和纳米颗粒。
[0030]
尽管在一些优选的实施方案中使用壳聚糖，但是可使用其它聚合物来实现类似的粘膜粘附功能。这些聚合物包括但不限于明胶、藻酸盐、葡聚糖、透明质酸、琼脂和抗性淀粉。
[0031]
一种或更多种粘膜粘附聚合物通常占颗粒（不包括水）重量的至少1%、或至少10%、或至少15%。通常，其占至多50%、或至多30%、或至多20%。
[0032]
油在典型的传统产物中，大量的生物活性剂在其制备期间和通过胃通道通过浸出颗粒而损失到水环境中，特别是小分子尺寸的生物活性剂，例如病毒、蛋白质、药物、抗生素、农药等。在本发明中，生物活性剂从颗粒中的浸出通过包含分散在油中或被油包覆的试剂的离散颗粒、区域或相大大地消除。任何类型的油（包括液体或固体形式的植物油、动物油或合成油和脂肪，或蜡）可用于包覆生物活性剂。用于本发明的植物来源的油包括但不限于：蓖麻油、椰子油、可可脂、玉米油、棉籽油、橄榄油、橄榄角鲨烷、棕榈油、花生油、菜籽油、红花油、芝麻油、大豆油、向日葵油、硬脂酸脂、巴西棕榈蜡及其混合物。用于本发明的动物来源的油包括但不限于：鱼油、鲨鱼角鲨烷、乳脂、蜂蜡、羊毛脂、猪油等。在某些情况下，分散油是橄榄或鲨鱼角鲨烷与任何其它类型的油、脂肪或蜡的混合物。通常，油的质量大于生物活性剂和粘膜粘附聚合物的组合质量。
[0033]
在典型的过程中，使包含生物活性剂和粘膜粘附聚合物的水溶液与油以按重量计1份溶液比1.1至5份油的比例均质化直至产生均匀的乳液。为了帮助形成均匀且稳定的乳液，可添加非离子表面活性剂。合适的非离子表面活性剂包括但不限于：乙氧基化脂肪醇、聚氧乙烯表面活性剂和羧酸酯等。一旦形成稳定的乳液，通过粘膜粘附聚合物的化学或物理反应使分散在油中的水滴固化。例如，通过降低温度或改变乳液的ph使明胶和琼脂聚合
物固化；而通过将乳液的ph提高到6.5以上和/或通过添加抗衡离子例如三聚磷酸钠（tripolyphosphate，tpp）使壳聚糖固化。
[0034]
一种或更多种油通常占颗粒（不包括水）重量的至少1.5%、或至少10%、或至少20%。通常，其占至多40%、或至多30%、或至多25%。
[0035]
肠溶包衣聚合物油分散体的液滴（包含粘膜粘附聚合物或被其包覆）分散在肠溶包衣聚合物的基质中，所述肠溶包衣聚合物提供胃保护和生物活性剂完整的胃后释放或递送，即，在肠中释放。
[0036]
示例性的肠溶包衣聚合物包括在足够高ph下可溶于水但在低ph下不溶解的聚合物。通常，其在大于5.0的ph下是可溶的，而在小于4.0的ph下是不溶解的。合适的聚合物在动物肠（生物活性物质待在此处释放）的相对温和的ph条件下为基本上可溶或可消化的，但在胃中不溶解且难消化，此处肠溶包衣聚合物的外部基质保护敏感的生物活性剂不被破坏。在某些情况下，肠溶包衣聚合物是交联的，例如与二价阳离子交联，以防止在胃中溶解或消化。
[0037]
合适的肠溶包衣聚合物可选自任何大量的亲水性聚合物，包括例如聚丙烯酸、聚(甲基)丙烯酸酯、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素和水溶性的天然或合成多糖胶。一个示例性的合成肠溶包衣聚合物是eudragit
®ꢀ
fs30d（evonik industries）。海藻酸钠和果胶由于其温和的交联条件是优选的水溶性胶。
[0038]
特别地，由于藻酸盐易于用于形成固体凝胶组合物，其提供了胃敏感的生物活性剂的优选的亲水性载体基质。当藻酸盐溶液与二价阳离子结合或混合时，藻酸盐溶液形成固体凝胶。但是，在某些实施方案中，藻酸盐是未交联的，但在胃环境中仍然难消化和不溶解，因此当在动物胃的低ph条件下时保护颗粒内容物。
[0039]
藻酸盐包含不同比例的1,4
‑
连接的β
‑
d
‑
甘露糖醛酸（m）、α
‑
l
‑
古洛糖醛酸（g）和交替（mg）嵌段。藻酸盐溶液的粘度主要由m/g嵌段的分子比决定。低粘度藻酸盐通常包含至少50%的甘露糖醛酸单元，并且其粘度为20
‑
200 mpa。中等和高粘度藻酸盐包含至少50%的古洛糖醛酸单元，并且其粘度通常大于200 mpas。
[0040]
在一些实施方案中，形成基质的聚合物是藻酸盐、果胶或其混合物。优选低粘度等级藻酸盐和低甲氧基果胶。典型的低甲氧基果胶的甲基化程度小于50%，并且这些低甲氧基果胶通常与二价阳离子（例如ba、ca、mg、sr或zn）交联。
[0041]
一种或更多种肠溶包衣聚合物通常占颗粒（不包括水）重量的至少10%、或至少20%、或至少30%。通常，其占至多70%、或至多50%、或至多40%。
[0042]
可选成分在一些实施方案中，除了主要的生物活性剂以外，组合物任选地包含营养物、营养食品、诱食剂和/或掩味化合物。还可包含渗透促进剂或佐剂以引起强烈的免疫应答并改善粘膜淋巴细胞对抗原的摄取。一个示例性的佐剂是β葡聚糖。
[0043]
制备组合物制备颗粒的第一种通用方法如下。使包含分散的生物活性剂和粘膜粘附聚合物的水性混合物与油均质化以产生水性混合物在油中的乳液。通常，使用按重量计1份水性混合物比1.1至5份油的比例来制备乳液。然后，使乳液在包含肠溶包衣聚合物的水溶液中浆化，
biopolymers inc.）溶解在100 ml 0.5n冰醋酸溶液中。用氢氧化钠将溶液的ph调节至5.8，并使该溶液冷却至室温。添加了吐温80（0.2%, sigma, st louis, mo）和消泡剂（antifoam）（0.5%, sigma, st louis, mo），并将壳聚糖溶液保持在4℃下直至使用。将30 ml包含300 mg卵清蛋白（“ova”，模型疫苗）的溶液添加到壳聚糖溶液中以产生混合物。将所得溶液添加到195 g包含5% span
‑
80（sigma）的橄榄油中，并在冰浴中以10,000 rpm匀化30分钟以形成油包水乳液。在搅拌下将20 ml水性三聚磷酸钠（5%）和0.5n naoh缓慢添加到连续油相中包含卵清蛋白和交联壳聚糖微粒的生物活性剂乳液中。使颗粒硬化至少2小时但不从油相中移除。
[0052]
将颗粒在油中的分散体搅拌进330 ml的9%低粘度等级藻酸钠（fmc biopolymers inc.）水溶液中，所述溶液还包含66 g寡糖（速溶菊粉，cargill, minneapolis，mn）、10 g卵磷脂和3 g吐温80。将所得水性分散体注入到包含5% cacl2的交联溶液中以形成藻酸盐基质珠，每个珠包含多个油滴，每个油滴进而包含卵清蛋白和交联壳聚糖的微粒。将珠冷冻干燥并研磨成尺寸小于150
ꢀµ
m的颗粒以获得本发明的干组合物。
[0053]
实施例1b形成本发明组合物的一种替代方法利用水性生物活性溶液在油中的乳液。将10 ml包含100 mg卵清蛋白的水溶液与15 g包含5% span
‑
80的芥花油合并并均质化以形成微细的油包水乳液。将该乳液与100 ml 3%水性壳聚糖溶液混合，并将分散体注入到包含5%三聚磷酸盐（tripolyphosphate）溶液（5% tpp）的交联溶液中。使颗粒硬化至少2小时。所得的固体交联的壳聚糖颗粒包含包埋的油滴，并且每个这些油滴进而包含分散的小于10 μm的水性卵清蛋白液滴。固体颗粒通过过滤分离并微细地分散在400 ml的9%低粘度等级藻酸盐水溶液中。将所得水性分散体注入到包含5% cacl2的交联溶液中以形成藻酸盐基质珠。将珠冷冻干燥并研磨成尺寸小于150
ꢀµ
m的颗粒以获得本发明的干组合物。
[0054]
实施例2免疫原性组合物的制备在50℃下将壳聚糖（3 g，fmc biopolymer）溶解在100 ml 0.5 n冰醋酸溶液中。用氢氧化钠将溶液的ph调节至5.8，并使该溶液冷却至室温。将10 ml包含100 mg作为模型疫苗的卵清蛋白（ova）的溶液与50 mg免疫刺激剂（β葡聚糖，ahd international, atlanta, ga）混合并添加到壳聚糖溶液中。以10,000 rpm将所得混合物在150 g包含5% w/w span
‑
80的鲨鱼角鲨烷油（jedwards international）中乳化30分钟以形成ova、壳聚糖和β葡聚糖的水滴在连续油相中的乳液。在搅拌下将该乳液添加到400 ml的9%低粘度等级藻酸钠在0.5 n naoh中的水溶液中，所述水溶液还包含寡糖（40 g，速溶菊粉）。将所得乳液注入到5% cacl2溶液中以交联藻酸盐，得到本发明的免疫原性组合物。将该组合物冷冻干燥并研磨成尺寸小于250
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m的颗粒。
[0055]
实施例3用于治疗/预防鱼寄生虫感染的组合物的制备制备了包含用于治疗鱼中寄生虫感染的蛋白质抗原或杀寄生虫化合物的组合物。将10 mg生物活性剂溶解在10 ml如上述实施例2中描述的3%水性壳聚糖溶液中，并在15 g包含75%橄榄油、20%角鲨烷油和5% span
‑
80的油混合物中乳化。
[0056]
使1 ml的水性5%三聚磷酸钠、0.5 n naoh溶液在1 g橄榄油中乳化并混合到生物
活性剂乳液中，得到包含生物活性剂和交联壳聚糖的颗粒在油中的分散体。使该分散体静置2小时以硬化交联的壳聚糖。在搅拌下将所得的颗粒在油中的分散体添加到20 ml包含9%低粘度等级藻酸钠、1%低甲氧基果胶、30% w/w速溶菊粉和1%吐温80的溶液中。将所得混合物注入到包含3% cacl2的交联溶液中以形成包含包埋的分散油滴的藻酸盐
‑
果胶基质珠，每个油滴进而包含生物活性剂和交联壳聚糖的微粒。将珠冷冻干燥并研磨至小于150
ꢀµ
m以获得本发明的干组合物。
[0057]
实施例4包含药物的组合物的制备制备了用于治疗结肠疾病的包含药物（糖皮质激素，例如地塞米松（dexamethasone）或甲基泼尼松龙（methyl prednisolone））的组合物。将药物添加到如上述实施例1或2中描述的壳聚糖溶液中，并在95%角鲨烷油和5% span
‑
80的混合物中乳化。制备了包含0.5 n naoh中5%三聚磷酸钠在角鲨烷油中的碱性乳液并将其缓慢混合（20% w/w）到生物活性乳液中以交联壳聚糖，并使混合物静置至少2小时以硬化交联的颗粒。以1:3乳液/eudragit液体的比例将壳聚糖微粒的油分散体混入到包含肠溶包衣聚合物（30% w/w eudragit
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fs30d, evonik industries）的液体中并喷雾干燥以形成本发明的干微粒组合物。
[0058]
实施例5本发明组合物中生物活性剂的包封效率使用卵清蛋白（ova）模拟典型的蛋白质药物或疫苗评估了本发明组合物中的附加油分散体和肠溶包衣聚合物基质的作用。制备了三种包含ova（sigma）的组合物。组合物1由结合ova的壳聚糖微粒构成，其如下制备：将100 mg ova溶解在10 ml 3%壳聚糖溶液中，并将该溶液注入到10%水性tpp中以形成交联的珠，随后保持2小时以使珠硬化，随后冷冻干燥并研磨。组合物2如下制备：使10 ml包含100 mg ova的水溶液在15 g包含3% span
‑
80的角鲨烷油中乳化，并使所得乳液在20 ml 3%壳聚糖溶液中混合。然后将所得浆液注入到10% tpp溶液中以形成珠，随后如上所述硬化、冷冻干燥并研磨。组合物3由根据本发明如实施例2中制备的结合ova的壳聚糖微粒构成。
[0059]
如下测定了三种类型的组合物中ova的包封效率。将500 mg的每种组合物分散在10 ml ripa缓冲液中并在室温下孵育30分钟。将悬浮液涡旋5分钟，然后在3000 rpm下离心15分钟。如下所述使用蛋白质印迹分析测定了上清液的ova含量。
[0060]
蛋白质印迹法：将组合物用如上所述的ripa缓冲液裂解，将相当于每种样品12 μg蛋白质的计算量上样到10% sds
‑
聚丙烯酰胺梯度凝胶（sds
‑
page, bio
‑
rad, hercules, ca）上。将蛋白质转移到pvdf膜（bio
‑
rad）上，并在包含0.5%吐温20的pbs（pbs
‑
t）中用5%脱脂乳封闭1小时。在室温下将印迹用以1:5000稀释度的合适的一抗孵育1小时。在用pbs
‑
t（3
×
10 ml，每次5分钟）洗涤后，将膜用以1:5000稀释度的合适的hrp缀合的二抗（emd millipore corporation, billerica, ma, usa）孵育1小时。用pbs
‑
t（3
×
10 ml，每次5分钟）洗涤后，用ecl底物（amsheram biosciences）使化学发光膜显影。ova（初始量的ova的保留%）的包封效率列于表1中。
[0061]
表1组合物包封效率（%）
170295395
[0062]
结果证明组合物2和3中的油分散体在防止生物活性剂浸出（损失）到简单的水环境中的保护作用。然而，当在胃条件下测试时发现对比组合物2和本发明组合物3之间的显著差异，如下实施例7中所述。
[0063]
实施例6未受保护的蛋白质抗原活性在模拟胃液中的降解为了评估在典型的胃暴露之后蛋白质抗原活性的损失，在37℃下在振动器上使未包封的ova（10 mg）在10 ml 包含0.08%胃蛋白酶的模拟胃液中（ph
‑
2）孵育2小时。在15分钟、30分钟、60分钟和120分钟的孵育时间处取出培养基，并如上所述使用蛋白质印迹分析分析了剩余ova的量。表2示出了暴露于模拟胃液2小时后ova的降解，表示为相对于暴露前活性的剩余活性%。
[0064]
表2时间（分钟）剩余活性（%）1561305560381202
[0065]
这些结果表明，未受保护的基于蛋白质的抗原或生物活性剂的活性在动物消化道中会完全降解。
[0066]
实施例7本发明组合物中生物活性剂的胃保护为了评估胃暴露后蛋白质抗原的剩余活性，如实施例5中所述制备了三种组合物。在37℃下在振动器上使每种500 mg的三种组合物各自在10 ml 包含0.08%胃蛋白酶的模拟胃液中（ph
‑
2）孵育2小时。在2小时的暴露结束时，取出胃液并如实施例5中所述测量了组合物中ova的剩余活性。表3示出了暴露于模拟胃液2小时后各组合物中ova的剩余活性。
[0067]
表3组合物剩余活性（%）110220390
[0068]
这些结果清楚地表明本发明组合物3相对于现有技术组合物1和2的优异的胃保护作用。
[0069]
实施例8组合物中藻酸盐的粘度等级对胃保护的影响根据上述实施例2制备了包含9%低等级粘度藻酸盐（50 cp）、6%中等等级粘度藻酸盐（300 cp）和1%高等级粘度藻酸盐（800 cp）的三种组合物。如实施例7中所述将三种组合物暴露于模拟胃液，并如实施例5中所述测量了组合物中ova的剩余活性。表4示出了暴露于
模拟胃液2小时后各组合物中ova的剩余活性。
[0070]
表4藻酸盐粘度等级剩余活性（%）高（800cp）25中等（300cp）40低（50cp）90
[0071]
这些结果表明，包含低粘度等级藻酸盐的组合物在模拟动物消化道中为基于蛋白质的抗原或生物活性剂提供更高的保护。
[0072]
实施例9本发明组合物的最佳粒径在本实施例中，对干燥且磨碎的本发明组合物的粒径在模拟胃环境中的保护作用进行了评估。如实施例5中所述制备了ova组合物，随后将干粉末分离成2种粒径：通过50
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m筛的小颗粒，和在50
ꢀµ
m筛上捕获但通过100
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m筛的大颗粒。 表5示出了暴露于模拟胃液2小时后各粒径组合物中ova的剩余活性。
[0073]
表5粒径剩余活性（%）50
‑
100
µ
m90<50
µ
m40
[0074]
这些结果表明，当将干组合物研磨成50
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m以上的粒径时提供最佳的胃保护。
[0075]
实施例10向小鼠经口施用ova组合物向小鼠经口施用了卵清蛋白以测试本发明组合物在诱导免疫应答中的效力。
[0076]
动物：使用十至十二周龄的雌性balb/c小鼠。小鼠随意进食。将每个实验组放在单独的笼子中。
[0077]
卵清蛋白组合物：将卵清蛋白（1 mg/g卵清蛋白，sigma, st. louis, mo.）并入如实施例5中描述的本发明组合物中。将三组小鼠，每组4只如下接种：1）组合物中的卵清蛋白（ova），经口施用，2）ova溶液，皮下（sc）施用，3）经口施用不含抗原的组合物。在第0周和第3周给小鼠接种。每个剂量施用总计100 mg以1:2 w/w的干组合物/油的比例与玉米油混合的涂覆在颗粒饲料上的干组合物。在第4周，使每只小鼠安乐死并收获血清和脾细胞。
[0078]
免疫学测定：通过elisa测定血清的igg和iga。使用吸附到聚苯乙烯板上的ova进行elisa。对于血清，将样品以1:25稀释度一式三份地置于孔中。使用与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠抗体，随后是邻苯二胺底物（sigma, st. louis, mo., u.s.a.）。每个孔的光密度通过将板置于微量滴定板分光光度计上并在490 nm处读取板来测定。使用前述技术，对脾细胞的ova特异性的抗体分泌细胞（antibody secreting cells，asc）进行测试。
[0079]
通过测定光密度随时间的增加对ova特异性igg和iga抗体进行定量。预计接种ova的每只小鼠的ova特异性血清和iga igg和asc分泌细胞在注射ova并经口喂食本发明组合物的那些小鼠中同样地增加。预计在喂食不含抗原的组合物的小鼠中不会检测到ova特异性igg或iga抗体。因此，预计所述组合物在经口施用后可有效地诱导免疫应答。
[0080]
实施例11
向鸡经口施用包含抗原的组合物肠炎沙门氏菌（salmonella enteritidis）是产蛋母鸡发病的主要原因。感染降低产量并提高成群死亡率。此外，肠炎沙门氏菌可通过卵传递给小鸡，感染后代或食用经感染鸡蛋的人类。因为感染以这种细菌附着并侵入肠粘膜开始，且长期感染涉及肠淋巴组织的感染，所以必须要刺激粘膜免疫来控制这种疾病。
[0081]
为了评估给鸡接种本发明的疫苗组合物的效力，将肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白（主要的免疫原）并入到根据实施例2的组合物之中，不同之处在于以1:2 w/w的比例将疫苗乳液混合到碱性藻酸钠相中并将浆液喷雾干燥。将干燥的组合物涂覆在饲料表面上并向鸡经口施用。十周龄的鸡以2周的时间间隔接受3次经口施用装载有300
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g肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白抗原或牛血清白蛋白的组合物。在抗原的最后一次经口施用后一周，收集血清和肠液并通过elisa测定鞭毛蛋白特异性抗体。预计结果表明经口接种疫苗的禽的血清中鞭毛蛋白特异性抗体显著增多。
[0082]
实施例12向牛犊经口施用包含抗原的组合物证明了经口施用根据本发明制备的包含卵清蛋白的组合物在牛犊肺中刺激免疫应答的效力。
[0083]
将卵清蛋白并入如实施例1a中描述的组合物中。对于向牛犊经口施用，将包含40
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g卵清蛋白/mg剂量的组合物施加到饲料中。每个实验组使用四只牛犊，并且每只牛犊接受5 mg卵清蛋白/剂，持续5天。
[0084]
使用两组牛犊来评估经口施用卵清蛋白诱导特异性免疫应答的效力。组1间隔3周通过皮下（sc）注射给予2个剂量的不完全弗氏佐剂（freund’s adjuvant）中的卵清蛋白。该组充当肠胃外对照，其为常规地用于任何疫苗的疫苗接种方法。组2间隔3周接受2次包含卵清蛋白的组合物的经口给药方案。评估血清同种型抗体对卵清蛋白的应答。预计结果表明，在经口喂食包含ova的组合物的牛犊中产生大量ova特异性igg和iga。所预计的很高水平的血清iga预测在刺激牛全身性免疫应答中具有高效力。
[0085]
实施例13向鱼经口施用包含弧菌抗原的组合物溶藻弧菌（vibrio alginolyticus）是水产养殖中严重的细菌感染，在虹鳟鱼中尤为严重。其现在在所有的鳟鱼生产国地方性流行，在这些国家中其可导致严重的经济损失。其也正在成为养殖鲑鱼（主要是在淡水生长阶段）的更显著的病原体但是已报道其在海洋中同样造成损失。疫苗接种可防止溶藻弧菌对鲑鱼养殖周期的任何阶段产生重大影响。典型的疫苗接种方案包括2至5 g鱼苗的初次接种和初次接种后4
‑
6个月经口加强接种。 然而，理想的疫苗接种方案将仅包括定期向鱼提供一种类型的接种疫苗以保持整个培养期间鱼血清中的有效抗体滴度。
[0086]
实验设计：证明了经口施用根据本发明制备的包含erm疫苗的组合物在鳟鱼血清中刺激免疫应答的效力。
[0087]
将减毒的溶藻弧菌并入到如实施例1b中描述的组合物中。对于向鱼经口施用，将包含2
ꢀµ
g溶藻弧菌疫苗/mg剂量的组合物施加到饲料中。每个实验组使用20条平均大小为5 g的鱼，并且每条鱼在饲料配给中接受1剂量的溶藻弧菌疫苗，持续5天。
[0088]
使用三组鱼来评估相对于通过注射的标准疫苗接种，经口施用溶藻弧菌疫苗诱导免疫应答的效力。使用通过注射方案的疫苗接种给组1接种疫苗。该组充当肠胃外对照，其为常规地用于任何疫苗的疫苗接种方法。组2接受1次包含溶藻弧菌疫苗的组合物的经口给药方案。组3接受1次不含疫苗的组合物的经口给药方案。疫苗接种后6周评估血清对溶藻弧菌的同种型抗体应答。预计结果表明，在经口喂食包含溶藻弧菌的组合物的鱼中产生大量的溶藻弧菌特异性iga。预计经口接种疫苗的鱼和注射接种疫苗的鱼二者血清中的免疫应答是相当的。所预计的很高水平的血清iga预测在刺激鱼全身性免疫应答中具有高效力。
[0089]
实施例14包含灭鼠剂的组合物杀鼠灵（warfarin）是用于控制大鼠和小鼠侵扰的最常见灭鼠剂。摄取包含杀鼠灵的诱饵的啮齿动物在15至30分钟内表现出明显的中毒症状，并且在1至2小时内失去意识。然而，由于其快速起效，啮齿动物通常摄取亚致死量的杀鼠灵并且在8小时内恢复过来。包封杀鼠灵可延迟症状的发作，允许消耗完全致死剂量。
[0090]
实验方法：使用10至12周龄的雌性balb/c小鼠。小鼠随意进食。将每个实验组放在单独的笼子中。
[0091]
本发明的杀鼠灵组合物：将杀鼠灵（400 mg/g组合物，sigma, st. louis, mo.）并入到如实施例3中一般描述的组合物中。三组小鼠，每组4只各自随意如下喂食：1）本发明的杀鼠灵组合物，以4%杀鼠灵活性混合到诱饵中，2）未包封的杀鼠灵，以4%活性混合到饵料中，3）包含如实施例3中的组合物但不包含杀鼠灵或其它生物活性剂的诱饵。监测摄食量和对小鼠的杀伤效果。
[0092]
结果表明，组1和组3的摄食量相似，而组2（未包封的杀鼠灵）中的摄食量小25%以上。预计组1中所有小鼠在喂食8小时后全部死去，而所有组2小鼠在喂食8小时后仍然存活。
再多了解一些
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