雄臭消除用重组蛋白及包含该重组蛋白的疫苗组合物的制作方法

1.本发明涉及一种雄臭消除用疫苗组合物。具体讲，就是涉及一种用于诱导促性腺激素释放激素(gonadotropin
‑
releasing hormone；gnrh)抗体的雄臭消除用重组蛋白、用于生产该重组蛋白的重组载体、包含所述重组蛋白为有效成分的雄臭消除用疫苗组合物以及利用该疫苗组合物的雄臭消除方法等。
2.本发明主张基于2020年3月24日提出的韩国专利申请第10
‑
2020
‑
0035897号的优先权，相关申请的说明书及附图中记载的所有内容均引用到本发明中。


背景技术：

[0003]“雄臭(公猪膻味；boar taint)”是指在烹饪或者食用猪肉或猪肉制品的过程中经常会产生的难闻气味或者味道，虽然这对于食肉的安全性来说完全没有问题，但是消费者在选择肉品的过程中最注重的是颜色，其次就是气味，因此消除雄臭的操作就非常重要。
[0004]
雄臭的主要致因物质是粪臭素(skatole)与雄烯酮(androsterone)，粪臭素是肠道细菌的蛋白质分解后生成的化学物质，也会存在于人的排泄物中。粪臭素在肝脏中分解，而雄烯酮会阻碍分解。即，未分解的粪臭素尤其容易堆积在脂肪部位，在将猪肉煮熟的过程中，所产生的气味就会散发到空气中而消失，这种气味就是雄臭。
[0005]
几个世纪以来，为了预防雄臭，一直都是采用对猪实施阉割(castration)。公猪的阉割在其出生后大约2～3周内实施，在一部分国家(荷兰、瑞士、挪威)，为了减轻阉割带来的疼痛与应激，也会针对全身或者局部使用麻醉剂。但是，最近，动物保护组织不论是否实施麻醉都对阉割提出了批判。
[0006]
随着针对公猪阉割的批判声音高涨，澳大利亚和新西兰开始接种1998年实现商用化的辉瑞(pfizer)公司生产的免疫性阉割疫苗“improvac”，并在美国、欧盟、日本、瑞士、澳大利亚、巴西等世界多个国家销售，国内于2006年获得药品注册。免疫性阉割疫苗可以成为旨在抑制雄臭而利用猪免疫系统的非常安全且有效的解决方案。所述疫苗通过刺激猪免疫系统生成针对促性腺激素释放激素(gonadotropin
‑
releasing hormone；gnrh)的特异性抗体，以此抑制睾丸的功能，从而防止雄臭致因物质的生成及积累。对此，从利用免疫系统实施外科手术获得与阉割相同效果的角度出发，使用了“免疫阉割”这一表述。
[0007]
但是，就国内的情况而言，仅根据采用免疫性阉割方法消除雄臭或者改善肉质并非100％符合阉割判定标准，与外科阉割法相比较，其费用支出非常高(如果外科阉割法每头需要100韩元，那么免疫性阉割法每头则需要5,000韩元)。因此，疫苗的上市最终以失败而告终。
[0008]
尽管如此，免疫性阉割方法不仅能够消除雄臭，而且还不会诱发实施外科阉割法后可能出现的生长能力下降、因应激及疼痛导致的免疫抑制。因此，最终有助于提高采用这一方法的农户生产效益。即使为了不与追求“动物福利”的世界趋势背道而驰，也越来越有必要用免疫性阉割法替代现有外科阉割法。因此，克服高昂接种费用、等级判定时的不确定性、安全性问题等现有免疫阉割疫苗的局限，利用纯粹国内技术研发可实际应用的雄臭消
除用疫苗的必要性正在不断提高。


技术实现要素：

[0009]
所要解决的技术问题
[0010]
本发明就是为解决上述现有技术存在的问题而研发，为了人为地提高促性腺激素释放激素(gonadotropin
‑
releasing hormone；gnrh)的抗原性，研发出含有与载体(carrier)蛋白质融合的雄臭消除用重组蛋白的疫苗，从而完成了本发明。
[0011]
因此，本发明的一个目的在于，提供一种雄臭消除用疫苗组合物，其以ctb(cholera toxin b subunit)及n个gnrh(gonadotropin
‑
releasing hormone)融合的重组蛋白为有效成分，所述n为1至20之间的整数。
[0012]
本发明的另一个目的在于，提供一种动物的雄臭消除方法，其包括：将本发明的疫苗组合物向除人之外的动物给药的步骤。
[0013]
本发明的另一个目的在于，提供一种雄臭消除用重组载体，其包含：由序列号3的碱基序列构成的gnrh基因及由序列号5的碱基序列构成的ctb基因。
[0014]
本发明的另一个目的在于，提供一种利用本发明的重组载体制造的雄臭消除用重组蛋白。
[0015]
本发明的另一个目的在于，提供一种利用本发明的重组载体进行转化的转基因生物。
[0016]
但是，本发明所要实现的技术课题并非仅仅局限于上面提到的课题，对于上面没有提到的其它课题，本领域技术人员通过以下介绍内容就能够有比较明确的了解。
[0017]
解决技术问题的方法
[0018]
为了实现上述本发明的目的，本发明提供一种雄臭消除用疫苗组合物，其含有融合ctb(霍乱毒素b亚基；cholera toxin b subunit)及n个gnrh(促性腺激素释放激素；gonadotropin
‑
releasing hormone)的重组蛋白为有效成分，所述n为1至20之间的整数。
[0019]
另外，本发明提供一种消除雄臭的方法，其将含有融合ctb及n个gnrh的重组蛋白为有效成分且所述n为1至20之间整数的疫苗组合物给药于除人之外的个体。
[0020]
另外，本发提供一种重组蛋白在消除雄臭中的应用，所述重组蛋白融合ctb及n个gnrh，所述n为1至20之间的整数。
[0021]
另外，本发明提供一种重组蛋白在生产消除雄臭疫苗中的应用，所述重组蛋白融合ctb及n个gnrh，所述n为1至20之间的整数。
[0022]
在本发明的一个实施例中，所述gnrh可以由序列号1的氨基酸序列构成，但并非仅限定于此。
[0023]
在本发明的另一实施例中，所述ctb可以由序列号4的氨基酸序列构成，但并非仅限定于此。
[0024]
在本发明的另一实施例中，所述n可以为6，但并非仅限定于此。
[0025]
在本发明的另一实施例中，当所述n为6时，gnrh可以由序列号2的氨基酸序列构成，但并非仅限定于此。
[0026]
在本发明的另一实施例中，当所述gnrh中的n大于2时，可以分别通过丙氨酸
‑
甘氨酸
‑
丙氨酸接头(alanine
‑
glycine
‑
alanine linker)进行连接，但并非仅限定于此。
[0027]
在本发明的一个实施例中，所述重组蛋白可以追加融合猪的免疫球蛋白fc片段(porcine fc fragment；pfc2)。
[0028]
在本发明的另一实施例中，所述pfc2可以由序列号6的氨基酸序列构成，但并非仅限定于此。
[0029]
在本发明的另一实施例中，所述ctb可以在gnrh的n
‑
末端方向融合，所述pfc2可以在gnrh的c
‑
末端方向融合，但并非仅限定于此。
[0030]
在本发明的一个实施例中，所述重组蛋白可以追加融合伴侣结合蛋白(bip，chaperone binding protein)。
[0031]
在本发明的另一实施例中，所述bip可以由序列号8的氨基酸序列构成，但并非仅限定于此。
[0032]
在本发明的另一实施例中，所述ctb可以在gnrh的n
‑
末端方向融合,所述bip可以在ctb的n
‑
末端方向融合，但并非仅限定于此。
[0033]
在本发明的一个实施例中，所述重组蛋白可以追加融合hdel(his
‑
asp
‑
glu
‑
leu)。
[0034]
在本发明的另一实施例中，所述hdel可以由序列号11的碱基序列编码，但并非仅限定于此。
[0035]
在本发明的另一实施例中，所述ctb可以在gnrh的n
‑
末端方向融合，所述hdel可以在gnrh的c
‑
末端方向融合，但并非仅限定于此。
[0036]
另外，在本发明的一个实施例中，所述重组蛋白可以依次融合bip、ctb、gnrh、pfc2及hdel，但并非仅限定于此。
[0037]
在本发明的另一实施例中，所述重组蛋白可以由序列号12的氨基酸序列构成，但并非仅限定于此。
[0038]
在本发明的一个实施例中，所述疫苗组合物可以追加包含佐剂(adjuvant)。
[0039]
在本发明的另一实施例中，所述佐剂可以是水包油乳剂(emulsigen)
‑
系列，但并非仅限定于此。
[0040]
另外，本发明提供一种动物的免疫阉割方法，其包括：将本发明的疫苗组合物向除人之外的动物给药的步骤。
[0041]
在本发明的一个实施例中，所述动物可以是狗、鲸鱼、猫、大猩猩、鹅、豚鼠、野鸡、骆驼、狍子、骡子、鸡、毛驴、海豚、猪、美洲驼、马、水牛、鹿、黄牛、驯鹿、羊驼、牦牛、绵羊、山羊、红毛猩猩、鸭子、猴子、雪貂、老鼠、火鸡、鸵鸟或兔子，但并非仅限定于此。
[0042]
另外，本发明提供一种雄臭消除用重组载体，其包含由序列号3的碱基序列构成的gnrh基因及由序列号5的碱基序列构成的ctb基因。
[0043]
在本发明的一个实施例中，所述重组载体，还包括：对由序列号6的氨基酸序列构成的pfc2进行编码的多核苷酸，但并非仅限定于此。
[0044]
在本发明的另一实施例中，所述重组载体，还包括：对由序列号8的氨基酸序列构成的bip进行编码的多核苷酸，但并非仅限定于此。
[0045]
在本发明的另一实施例中，所述重组载体，还包括：由序列号11的碱基序列构成的hdel基因，但并非仅限定于此。
[0046]
在本发明的另一实施例中，所述重组载体，还包括：对序列号12的氨基酸序列进行编码的多核苷酸或序列号13的碱基序列，但并非仅限定于此。
[0047]
另外，本发明提供一种利用本发明的重组载体制造的雄臭消除用重组蛋白。
[0048]
另外，本发明提供一种利用本发明的重组载体转化的转基因生物。
[0049]
发明的效果
[0050]
本发明涉及一种雄臭消除用疫苗组合物，其包含融合ctb(cholera toxin b subunit)及gnrh(gonadotropin
‑
releasing hormone)的重组蛋白。所述疫苗组合物利用包含gnrh的多肽序列的重组蛋白诱导给药该疫苗组合物的个体产生针对gnrh的抗体，从而可以确认睾丸的萎缩效果。因此，本发明能够以较低的费用、较高的安全性及最小的副作用对公猪实施免疫性阉割，从而能够有效消除雄臭。
附图说明
[0051]
图1是依据本发明一个实施例的用于制造重组gnrh蛋白的表达盒(expression cassette)示意图(bip,chaperone binding protein；ctb,cholera toxin b subunit；pfc2,porcine fc fragment；hdel,histidine
‑
aspartic acid
‑
glutamic acid
‑
leucine)；
[0052]
图2是依据本发明一个实施例的对重组gnrh蛋白进行分离、提炼结果的示意图；
[0053]
图3是依据本发明一个实施例的将含有重组gnrh蛋白的疫苗组合物对雄性大鼠注射日程的示意图；
[0054]
图4是依据本发明一个实施例的将含有重组gnrh蛋白的疫苗组合物对雄性大鼠注射3次后，摘除睾丸对其大小进行比较的示意图；
[0055]
图5是依据本发明一个实施例的将含有重组gnrh蛋白的疫苗组合物对雄性大鼠注射3次后，对血液中睾酮浓度进行测定结果的示意图，上图及中图是显示标准对照组的示意图，下图是显示各组测定结果的示意图。
具体实施方式
[0056]
本技术的发明人将重组促性腺激素释放激素(gnrh)蛋白对4周龄的实验大鼠接种之后，对由此导致的睾丸大小及重量变化、血液中睾酮浓度变化进行了分析。结果显示，将利用本发明的重组gnrh蛋白实施疫苗接种的组与对照组比较，睾丸的大小及重量减少了，血液中睾酮的浓度降低了。由此可以确认，包含本发明重组gnrh蛋白的疫苗组合物具有免疫阉割效果及由此产生的雄臭消除效果，从而完成了本发明。
[0057]
因此，本发明可以提供一种雄臭消除用疫苗组合物，其融合ctb(cholera toxin b subunit)及n个gnrh(gonadotropin
‑
releasing hormone)的重组蛋白为有效成分，所述n为1至20之间的整数。
[0058]
本说明书中使用的术语“ctb(cholera toxin b subunit)”或“霍乱毒素b亚单位”是指针对宿主细胞具有结合活性的多肽。优选地，可以由包含序列号5的碱基序列的多核苷酸编码。最优选地，可以由序列号5所示的多核苷酸编码，但可以由与序列号5的碱基序列具有80％以上，更加优选地具有90％以上，更更优选地具有95％以上序列同源性的碱基序列编码。例如：包含具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同源性的多核苷酸。多核苷酸的“序列同源性％”可以通过将两个最佳排列的序列与比较区域进行比较确认。与两个序列最佳排列的参考序列(不
包括添加或删除)相比，比较区域的多核苷酸序列一部分可以包含添加或删除(即，空位)。霍乱毒素是a1及a2亚单位与5个b亚单位结合形态的复合体，为了霍乱毒素的内载化及活化，ctb与粘膜免疫系统(mucosal immune system)的m细胞(microfold cell)结合。在这种情况下，ctb与细胞膜双层的gm1
‑
神经节苷脂(ganglioside)经过特异反应结合后，再使与ctb结合的a亚单位或抗原蛋白通过细胞膜。ctb通过穿透粘膜屏障的结合抗原的吸收增加及结合抗原的有效表达改善抗原的免疫原性，从而可用作旨在增强粘膜免疫的强力粘膜佐剂(adjuvant)及载体(carrier)分子。
[0059]
本说明书中使用的术语“多核苷酸”包括脱氧核糖核酸(dna)及核糖核酸(rna)。一般情况下，表现为包含通过磷酸二酯(phosphodiester)键彼此结合的2个以上连接核苷酸或核苷酸衍生物的低聚物或聚合物。多核苷酸还包括含有除了核苷酸类似物或磷酸二酯键之外的“骨架”键，例如，磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、硫酯键或肽键(肽核酸)的dna及rna衍生物。多核苷酸包括单链及/或双链多核苷酸，例如：不仅包括脱氧核糖核酸(dna)及核糖核酸(rna)，还包括rna或dna中任意一种类似物。
[0060]
本说明书中使用的术语“gnrh(gonadotropin
‑
releasing hormone)”是指促性腺激素释放激素。优选地，如果由序列号1的氨基酸序列构成的gnrh，或者能够诱导针对gnrh的免疫反应，就并非仅限定于此。另外，本发明的gnrh中序列号1的变异体包含在本发明的范围内。具体讲，所述肽包含与序列号1的氨基酸序列具有80％以上，更加优选地具有90％以上序列同源性的氨基酸序列。众所周知，gnrh由10个氨基酸构成，在所有动物中均由几乎相同的氨基酸构成。gnrh在下丘脑中生成，作用于脑垂体，从而促进性激素即fsh及lh的生成。因此，如果将gnrh用作抗原给动物接种，就会生成识别gnrh的抗体。所述抗体将体内存在的gnrh清除，以便阻断雄性及雌性动物的性成熟，由此就能够产生阉割效果，从而就可以获得消除雄臭的效果。
[0061]
本说明书中使用的术语“重组蛋白”或“重组融合蛋白”是指2种以上的蛋白质人为地连接形态的蛋白质。在本发明中是指连接了ctb与gnrh形态的蛋白质。如上所述，重组融合蛋白在确定各自的伙伴之后可以通过化学合成或者基因重组方法进行表达及提炼而获得。优选地，可以通过将对ctb进行编码的多核苷酸和对gnrh进行编码的多核苷酸连接起来的融合基因在细胞表达系统中进行表达而获取。
[0062]
关于用于本发明重组蛋白的gnrh，与具有一个拷贝(one copy)gnrh氨基酸序列的情况相比，具有两个或多个拷贝(two or more copies)的效果会更好。在具有多个拷贝(multiple copy)的情况下，就能够进一步增强针对gnrh的免疫原性。因此，关于gnrh的氨基酸序列，优选地，可以采用序列号1的氨基酸序列为2个以上的多聚体。如果gnrh的个数能够容纳于表达载体内，就没有特别的限制。但是，优选地，可以采用2个至20个，更加优选地为2个至10个连接的多聚体形态。更更优选地，可以采用6个连接的六聚体。在本发明的具体实施例中，将gnrh蛋白连续六次重复而制作。所述连接6个gnrh的多肽可以由序列号2的氨基酸序列构成，但并非仅限定于此。
[0063]
另外，所述重组融合蛋白的ctb与gnrh既可以直接连接，也可以通过接头等氨基酸连接子进行连接。另外，即使在包含多个拷贝gnrh的情况下，各个gnrh既可以直接连接，也可以通过接头等连接子进行连接。在通过接头进行连接的情况下，优选整体免疫原性(immunogenicity)并不因此而减少。
fragment；pfc2)。所述pfc2可以在gnrh的c
‑
末端方向融合，但并非仅限定于此。
[0071]
本说明书中使用的术语“fc片段(fc fragment)”是指，当免疫球蛋白通过木瓜蛋白酶(papain)消化时，只有重链(heavy chain；h chain)部分通过s
‑
s键连接，在这种情况下，将不具有抗原结合部位的部分称为fc片段。优选地，本发明的fc片段是指猪的fc片段。更加优选地，为由序列号6的氨基酸序列构成的猪fc片段，但与重组蛋白融合时，如果是使重组蛋白的表达量及溶解性增加的fc片段，则并非限定于此。另外，本发明的fc片段中序列号6的变异体包含在本发明的范围内。具体讲，所述肽包含与序列号6的氨基酸序列具有90％以上，更加优选地具有95％以上，最优选地具有98％以上序列同源性的氨基酸序列。
[0072]
另外，本发明的重组蛋白还可以追加融合bip(chaperone binding protein)。所述bip可以在gnrh或ctb的n
‑
末端方向融合，但并非仅限定于此。
[0073]
本说明书中使用的术语“bip(chaperone binding protein)”是一种用于使表达的重组蛋白向内质网移动的物质。优选地，为由序列号8的氨基酸序列构成的bip，但与重组蛋白融合时，如果是使重组蛋白向内质网移动的bip，则并非限定于此。另外，本发明的bip中序列号8的变异体包含在本发明的范围内。具体讲，所述肽包含与序列号8的氨基酸序列具有90％以上，更加优选地具有95％以上，最优选地具有98％以上序列同源性的氨基酸序列。当所述bip表达时或表达后，可以将肽的一部分切掉，只留下一部分肽。
[0074]
另外，本发明的重组蛋白还可以追加融合hdel(his
‑
asp
‑
glu
‑
leu)。所述hdel可以在gnrh或pfc2的c
‑
末端方向融合，但并非仅限定于此。
[0075]
本说明书中使用的术语“hdel”是指，由组氨酸
‑
天冬氨酸
‑
谷氨酸
‑
亮氨酸构成的目标肽序列，所述hdel可以防止重组蛋白从内质网(endoplasmic reticulum)分泌或者使其在内质网内保持稳定，所述hdel可以由序列号11的碱基序列编码，但并非仅限定于此。
[0076]
另外，本发明的重组蛋白可以是依次融合bip、ctb、gnrh、pfc2及hdel的，与之相关的所述重组蛋白可以由序列号12的氨基酸序列构成。但是，本发明并不受所述融合顺序或氨基酸序列限制。
[0077]
本发明的疫苗组合物对于消除雄臭(boar taint)具有非常良好的效果。
[0078]
另外，为了改善或增强免疫反应，本发明的疫苗组合物可以含有一种以上的佐剂(adjuvant)。
[0079]
本说明书中使用的术语“佐剂(adjuvant)”是指，添加到疫苗或具有药学活性的成分中增加免疫反应或者施加影响的物质或组合物，比较具有代表性的佐剂，通常是指免疫原(immunogen)用载体或辅助物质及/或其它具有药学活性的物质或组合物。比较典型的实例，术语“佐剂”应当从广义的概念去解释，它是指能够提高与所述佐剂融合或者与所述佐剂一起注射的抗原的免疫原性(immunogenicity)的广义物质或策略(stratagerm)。另外，所述佐剂可以分为免疫增强剂(immune potentiator)、抗原传递系统或其组合，并非仅限定于此。作为合适的佐剂实例，包括：氢氧化铝、弗朗德完全或不完全佐剂、deae葡聚糖、左旋咪唑、pcg及poly i:c或poly a:u。在本发明的一个实施例中，作为水包油乳剂(emulsigen)
‑
类佐剂，采用了含有双十八烷基二甲基溴化铵(dda，dimethyldioctadecyl ammonium bromide)的水包油乳剂
‑
d佐剂。
[0080]
本发明的重组蛋白不仅包含具有野生型(wild type)氨基酸序列的蛋白质，而且还包含重组融合蛋白的变异体。重组蛋白的变异体是指，与正常氨基酸序列相比，通过一个
以上氨基酸残基缺失、插入、非保全性或保全性取代或其组合而具有不同序列的蛋白质。从整体上不改变分子活性的蛋白质及肽水平下的氨基酸交换的方法属于本领域公知(h.neurath et al.,1979)。另外，所述重组蛋白也可以通过磷酸化(phosphorylation)、甲基化(methylation)、硫化(sulfation)、丙烯酸化(acrylation)、糖化(glycosylation)、法尼基化(farnesylation)等方法进行修饰(modification)。虽然所述变异体或修饰体是表现出与天然蛋白质相同生物学活性的功能性等价物，但是根据需要也可以是使其蛋白质特性发生改变的变异体或修饰体。优选为通过氨基酸序列上的变异和修饰增加蛋白质的热、ph等的结构稳定性或者增加蛋白质活性的。
[0081]
本发明的重组gnrh蛋白可以通过化学方法合成或者通过基因重组方法生产。优选地，可以利用重组载体使其转化到宿主细胞中，然后将由此表达的蛋白质通过分离、提炼进行生产。
[0082]
因此，作为本发明的另一形态，本发明提供一种雄臭消除用重组载体，其包含由序列号3的碱基序列构成的gnrh基因及由序列号5的碱基序列构成的ctb基因。
[0083]
重组载体通常是指插入外来dna片段的载体，一般情况下，是指双链的dna片段。本说明书中使用的术语“外来dna”是指源于外来品种的dna，或者是指在源于相同品种的情况下，从本来的形态发生实质性改变的形态。外来基因利用需要转录的特定目标核酸对多肽进行编码。对重组载体来说，为了提高在宿主细胞内转化的基因表达水平，所述基因必须与在被选择的表达宿主内发挥功能的转录及破译表达调节序列按照可发挥作用地方式连接。所述重组载体是指包含确保基因插入物能够在个体的细胞内表达而按照可发挥作用的方式连接的必需调节要素的基因构筑物(construct)，为了制造这种基因构筑物，可以采用标准重组dna技术。如果能够在原核细胞及真核细胞的各种宿主细胞内表达目标基因并发挥生成目标蛋白质的功能，重组载体的种类就没有特别的限定。但是，最好选择以下载体，即既拥有显示强大活性的启动子与较强的表达力，又能够大量生产与自然状态类似形态外来蛋白质的载体。优选地，重组载体至少包含启动子、起始密码子、对目标蛋白质编码的基因、终止密码子及终止子。除此之外，还可以适当包含对信号肽编码的dna、增强子序列、目标基因的5'末端及3'末端的非翻译区域(utr)、筛选标记区域或可复制单位等。
[0084]
在本发明的具体实施例中，将通过向含有6拷贝的gnrh基因片段的pcambia13000载体插入ctb基因片段制造的重组载体转化到烟草植物(nicotiana benthamiana)中。所述载体是一种带有35s启动子和hsp(heat shock protein)终止子系统，对烟草植物大量生产蛋白质非常有用的载体。
[0085]
本说明书中使用的术语“载体(vector)”是指，含有按照可发挥作用的方式与能够在适当的宿主内表达dna的合适调节序列连接的dna序列的dna构筑物。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或简单的潜在性基因组(genome)插入物。如果转化到合适的宿主中，则不论宿主的基因组如何，载体均可以进行复制并发挥功能，或者有时可以融合到基因组自身中。质粒是当前载体最常用的形态，因此术语“质粒(plasmid)”及“载体(vector)”有时候可以相互交换使用。但是，本发明包含具有与本领域公知或掌握情况同等功能的载体的其它形态。
[0086]
另外，在本发明中，所述重组载体，还包括：从对由序列号6的氨基酸序列构成的pfc2编码的多核苷酸、对由序列号8的氨基酸序列构成的bip编码的多核苷酸及由序列号11的碱基序列构成的hdel基因组成的组中选择的1种以上序列。
[0087]
作为本发明的另一形态，本发明提供一种利用本发明重组载体制造的雄臭消除用重组蛋白。
[0088]
另外，本为本发明的另一形态，本发明提供一种利用本发明重组载体转化的转基因生物。
[0089]
本说明书中使用的术语“转化(transformation)”是对通过注入的dna使生物的遗传性质发生改变的总称，“转化体(transgenic organism或transformant)”是指通过分子遗传学方法注入外部的基因制造的有机体。优选地，包含通过本发明的重组载体转化的有机体，只要是为了实现本发明的目的，所述有机体就没有限制。
[0090]
作为本发明的另一形态，本发明提供一种动物的雄臭消除方法，其包括：将本发明的疫苗组合物向除人之外的动物给药的步骤。
[0091]
如何动物的种类如何，利用本发明疫苗组合物的雄臭消除方法均可用于除人之外的所有动物。所述动物最好选用哺乳动物，例如：可以选用狗、鲸鱼、猫、大猩猩、鹅、豚鼠、野鸡、骆驼、狍子、骡子、鸡、毛驴、海豚、猪、美洲驼、马、水牛、鹿、黄牛、驯鹿、羊驼、牦牛、绵羊、山羊、红毛猩猩、鸭子、猴子、雪貂、老鼠、火鸡、鸵鸟或兔子，但并非仅限定于此。
[0092]
关于本发明的方法，给药最好实施2次以上。例如：第1次接种(initial vaccination)之后，可以1周至10周为间隔，实施1次到4次左右的加强接种(booster injections)。但是，这也可以根据相关动物的种类不同由本领域的技术人员适当变化实施。
[0093]
本说明书及权利要求书中使用的术语或者单词不应当仅限定于常用意义或者字典释义进行解释，而应当本着发明人为了通过最佳的方法介绍自己的发明而可以对术语的概念进行适当定义的原则按照符合本发明技术思想的涵义与概念进行解释。
[0094]
下面，为了有助于对本发明的理解，将列举理想的实施例。但是，下述实施例仅是为了能够更加容易对本发明进行理解而列举的，本发明的内容并不受以下实施例的限制。
[0095]
[实施例]
[0096]
实施例1:bip
‑
ctb
‑
gnrh
‑
pfc2
‑
hdel融合蛋白的表达及提炼
[0097]
为了诱导gnrh的免疫原性，如图1所示，制作出了用于表达将ctb、pfc2、bip及hdel融合到gnrh中的重组gnrh的载体。由10个氨基酸构成的gnrh有6个连续通过丙氨酸
‑
甘氨酸
‑
丙氨酸(aga)接头连接，6个连接的gnrh的氨基酸序列及碱基序列分别示于序列号2及序列号3中。另外，ctb的氨基酸序列及碱基序列分别示于序列号4及序列号5中，pfc2的氨基酸序列及碱基序列分别示于序列号6及序列号7中，bip的氨基酸序列及碱基序列分别示于序列号8及序列号9中，hdel的氨基酸序列及碱基序列分别示于序列号10及序列号11中。同时，表达盒(cassette)的全部氨基酸序列及碱基序列分别示于序列号12及序列号13中。
[0098]
将利用所述载体转化的根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)接种到烟草植物的叶子中完成了瞬时表达(transient expression)。从植物的叶子中提取总蛋白(total protein)并进行离心分离后，将溶液中含有的水溶性(soluble)形态的蛋白质利用安装有蛋白a琼脂糖凝胶柱(protein a
‑
sepharose column)的akta prime(ge healthcare,美国)分离出pfc2融合gnrh蛋白。
[0099]
实施例2:重组gnrh蛋白浓度确认
[0100]
为了确认及测定所述实施例1中分离、提炼的重组gnrh蛋白浓度，以已知浓度的牛
血清白蛋白(bsa，bovine serum albumin)为标准品(standard)，实施了sds
‑
page及布拉德福德定量分析(bradford assay)。将分离、提炼的重组gnrh蛋白按照1、2μl进行上样后，为了进行定量处理，使其中含有0.5、1、2μg的bsa。gel通过考马斯亮蓝染色(coomassie blue staining)最终确认了蛋白条带。布拉德福德定量分析将bsa用作标准品绘制标准曲线(standard curve)，并制定公式，然后代入gnrh的uv值计算出了浓度。
[0101]
其结果如图2所示，重组gnrh蛋白获得了充分表达，从而确认了分离、提炼过程。经确认，gnrh重组蛋白的浓度约为2μg/μl。同时，将上述确认的重组gnrh蛋白用于下述实施例3的动物实验中。
[0102]
实施例3:重组gnrh蛋白的注射效果确认
[0103]
3.1.实验动物、注射条件及日程
[0104]
为了确认重组gnrh蛋白的免疫阉割效果，对4周龄雄性斯泼累格多雷(sd，sprague dawley)大鼠按照表1中记载的注射条件和图3所示的日程注射了含有本发明重组gnrh蛋白的疫苗组合物，对照组注射相同量的pbs(p hosphate
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buffered saline)，实验组注射了所述疫苗组合物100μg/180μl及e
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d佐剂20μl(参照表1)。使入库的4周龄大鼠驯化4天左右。然后，按照14天到15天的注射间隔总共注射了3次，采血分别是在注射前及实验结束时实施。注射3次后，在经过4周的时刻摘除睾丸，测定其重量及大小，然后对血液中睾酮(testosterone)的浓度进行了测定。
[0105]
【表1】
[0106][0107]
3.2.睾丸的肉眼评估
[0108]
将本发明的疫苗组合物注射3次后，在经过4周的时刻摘除睾丸，对其进行了肉眼评估。其结果如表2及图4所示。
[0109]
【表2】
[0110][0111]
如上述表2及图4所示，与非接种对照组比较，包含重组gnrh蛋白的疫苗接种组睾丸的重量及长度明显减少。另外，正如通过重量比可以确认的那样，与个体的总体重对比，疫苗接种组睾丸的重量所占的比例明显更低。疫苗接种组的睾丸平均长度也一样，与非接种组对比，其表现出64％～86％的水平。
[0112]
通过上述结果可以确认，通过注射含有本发明重组gnrh蛋白的疫苗组合物成功实施了免疫性阉割。
[0113]
3.3.睾酮(testosterone)elisa结果
[0114]
将本发明的疫苗组合物注射3次以后，在经过4周的时刻进行采血，并对血液中睾酮的浓度进行了测定。测定是利用的elisa试剂盒按照制造商的指南进行操作的。具体讲，就是在涂布有睾酮的测试板上加入50μl的血清，然后再立即加入相同量的生物素化检测(biotinylated det ection)抗体，接着在37℃条件下使其反应45分钟。然后，再利用350μl的冲洗缓冲液(washing buffer)清洗了3次。接着，再加入100μl的hrp conjugate溶液，然后在37℃条件下培养了30分钟。按照与上述过程相同的方法清洗5次之后，再添加90μl的基质液，接着在37℃条件下培养了15分钟。然后，加入50μl的反应终止液，接着再通过elisa仪测定了450nm波长下的od值。为了对血液中睾酮的实际量进行定量处理，将睾酮标准蛋白质按照0.1、0.4、1.6、5、20ng/ml添加完成了反应。然后，利用通过这种
操作获得的od值绘制标准曲线，并将前面获得的样品od值代入其中，完成了睾酮的定量，其结果记载到了表3及图5中。
[0115]
【表3】
[0116][0117]
其结果如所述表3及图5所示，与非接种对照组比较，包含重组gnrh蛋白的疫苗接种组血液中睾酮的浓度明显减少。
[0118]
上述结果与所述实施例3.2.的结果一致，通过注射含有本发明重组gn rh蛋白的疫苗组合物成功实施了免疫性阉割。因此，可以确认消除了雄臭。
[0119]
上述本发明的说明是针对本发明实施例进行的介绍，具有本发明所属技术领域一般知识的技术人员在不改变本发明的技术思想或者必要特征的前提下，完全能够轻松按照其它具体形态进行改变。因此，以上列举的实施例是为了从各个方面对本发明进行说明，并非对本发明进行限定。
[0120]
【产业上的可利用性】
[0121]
本发明涉及一种雄臭消除用疫苗组合物，其包含融合ctb(cholera toxin b subunit)及gnrh(gonadotropin
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releasing hormone)的重组蛋白。所述疫苗组合物利用包含gnrh的多肽序列的重组蛋白诱导注射该疫苗组合物的个体产生针对gnrh的抗体，从而确认了睾丸的萎缩效果。因此，本发明可用于以较低的费用、较高的安全性及最小的副作用对公猪实施免疫性阉割，从而消除雄臭。所以，预计本发明在产业上的利用价值将非常大。