使用耳垢测定皮质醇和葡萄糖平均浓度的方法与流程

使用耳垢测定皮质醇和葡萄糖平均浓度的方法
1.本发明所处背景
2.a.所在领域
3.本专利涉及皮质醇和葡萄糖浓度的测量方法，即使用耳垢来测量皮质醇和葡萄糖的平均水平。
4.b.相关文献描述
5.第一个问题
6.缺乏可靠且无害的方法来测量葡萄糖的平均水平
7.慢性疾病在全球范围内是导致死亡的最高诱因(71％)，而糖尿病排位第四(who，2018)。此外，根据世界卫生组织的同一份报告，6.5亿成年人同时患有另一种慢性病，如肥胖症。更令人震惊的是，18岁以上的成年人超重比例高达39％。此外，这种附加的慢性疾病逐步显示出上升的趋势。在1975年至2016年期间，全球肥胖症患病率几乎增加了两倍(ncd
‑
risc等，2017)。
8.这两种流行的疾病密切相关。将近90％最常见类型的糖尿病或ii型糖尿病都与超重有关(wu等，2014)。此外，这些疾病通常具有相同的代谢变化，即葡萄糖的逐渐升高。所以，对糖尿病的诊断需要测试葡萄糖水平。另一方面，葡萄糖水平升高但不在糖尿病范围内的受试者患有肥胖的可能性也高出4.5％(meigs等，1998)。
9.目前，对
″
短期
″
的葡萄糖样本(如血清)的测量在评估平均葡萄糖水平方面存在很大的局限性。这是因为葡萄糖水平在白天变化很大，而且白天时发生的一些压力事件(dagogo
‑
jack，2010)、吸烟(frati等，1996)、高血压(modan等，1985)、体重指数(bmi)(hiller等，1988)和身体活动(allen等，2009年)也会影响葡萄糖水平。
10.为了获得准确的葡萄糖检测结果，现有一些标准化的葡萄糖测量方法，例如在测量前禁食或测试餐后葡萄糖浓度。但是，这类测量方法对患者提出了要求和限制，且往往不能准确反映葡萄糖的平均水平，而葡萄糖的平均水平又对糖尿病患者长期的葡萄糖控制很关键。实际上，用这些方法检测出的结果往往低于空腹血清葡萄糖(fsg)或餐后血清葡萄糖(psg)的均值(peter等，2006)。
11.糖化血红蛋白(hba1c)是血红蛋白的一种形式，它与空腹和餐后葡萄糖指数均呈正相关，所以通常被用作反映葡萄糖长期平均水平的指标(monnier等，2006；bonora等，2001；rohlfing等，2002)，也被认为是反映平均葡萄糖浓度的最标准方法。但是，与糖尿病患者相比，健康人的餐后葡萄糖或空腹葡萄糖水平与hba1c相关性较弱(van
′
t riet等，2010)。研究表明，在普通人群中，psg与hba1c相关性为0.33，fsg与hba1c之间的相关性为0.46，而这种相关性在糖尿病人中分别为0.71和0.79(van
′
t riet等，2010)。这些结果破坏了hba1c在筛查测试中的有效性(dagogo
‑
jack，2010)。另一方面，在健康人和葡萄糖控制较差的糖尿病患者中，空腹葡萄糖水平与hba1c的关联比餐后葡萄糖水平与其的关联强(monnier等，2006)。这种情况意味着饮食异常的糖尿病患者的hba1c检测指标可能处于合理范围内。这个缺点限制了使用hba1c指标来密切监测这些患者的葡萄糖平均水平的能力。因此，反映葡萄糖平均浓度的更准确方法应该均衡的综合餐后和空腹葡萄糖水平。hba1c可
以反映最近三个月的葡萄糖平均浓度，但其受最近一个月的血浆葡萄糖浓度的影响最大(75％)(leow，2016；mortensen&v
á
lund，1988；tahara&shima，1993)。此外，hbalc无法提供较短时间内的葡萄糖检测信息，例如，追踪血糖控制后的早期变化，而这一时期需要比较严格的代谢控制(goldstein等，2004；j.h.kim等，2012；koenig等，1976)。
12.此外，该方法还有其他局限性。一方面，它会受到一些变量的影响，例如衰老会改变hba1c的浓度(dagogo
‑
jack，2010年)。另一方面，一些常见的疾病，例如贫血(sundaram等，2007)和一些血红蛋白病(高达7％)(weatherall，2011)也可能影响其水平。甚至长时间的工作也会导致hba1c水平升高(azami等人，2018)。此外，对其的检测昂贵，且往往实验检测条件不允许(sacks，2011年)。最后，该方法实际上是间接地预估葡萄糖水平的均值，因为它只是一种相关的蛋白质而并非糖本身。所以，一些学者甚至怀疑其作为糖尿病和糖尿病前期诊断指标的有效性(dagogo
‑
jack，2010)。
13.近来，糖化白蛋白已被用作测量2至4周中期阶段的指标。但是，一些社会人口变量，例如年龄，体重指数(bmi)(miyashita等，2007)或影响白蛋白代谢的疾病，如甲状腺功能障碍，肾病综合征或肝硬化(kj kim&lee，2012)等，使糖化白蛋白的测定在临床实践中有些不稳定(huh等，2014)。此外，到目前为止，其作为诊断方法的有效性尚不明确。
14.同样要注意的是，所有这些样本，包括测量葡萄糖，hba1c或糖化白蛋白，都是从血液样本中获得的，这意味着它们的成本昂贵，因为其需要熟练的技术人员，如护士来操作。而且，它们可能有一些副作用，例如出血和感染，在患有代谢性疾病(例如糖尿病)的患者中，这种情况甚至更加常见和复杂。但是，尽管有上述缺点，葡萄糖水平测量仍然是一些国家/地区初级保健中心里最被需要的实验室测试(salinas等，2014；zunic，2012)，也在卫生系统的实验室检测成本里高居第三位(zunic，2012年)。hba1c也是需求最大的实验室测试之一，甚至人们甚至认为对hba1c的需求仍然被低估(salinas等，2012)。因此，我们需要开发一种更好的样本，其不仅能够直接反映不同时期的葡萄糖平均浓度，而且应更加经济、无害。
15.第二个问题
16.缺乏可靠和实用的测量皮质醇平均浓度的方法
17.抑郁症是另一种慢性流行疾病，然而其的临床诊断因其症状的异质性并不非常可靠(lieblich等，2015)。所以，相关研究一直致力于开发一种精确的生物标志物，以改善对其诊断的一致性。其中，皮质醇水平一直是最受欢迎的生物标志物，因为它是该综合症中最常见的神经生物学变化(pariante，2009)。然而，由于皮质醇分泌的反应性，这种激素的结果非常不同。它不仅具有非常明显的昼夜节律(bhagwagar，2003；bhagwagar等，2005)，而且还受几个典型变量影响，例如食物摄入(gibson&checkley，1999)，尼古丁(steptoe&ussher，2006)，体育锻炼(hill等，2008)和压力水平(kirschbaum等，1993；sharpley，2012)都可能会影响其短期水平。这种情况意味着当前大多数生物试样(例如血浆或血清)都不是反映皮质醇平均浓度的最合适试样，而其是描述不同类型的mde状态变化的关键指标。
18.不久前，头发样本被开始用作衡量皮质醇平均浓度水平的指标(dettenborn等，2012)。研究发现，头发可提供衡量皮质醇平均浓度的指标，因为它可以积累激素但不像短期试样那样受到复合因素的影响(short等，2016a)。但是，它也有一些限制。大多数对其有效性的研究都是通过将毛发皮质醇浓度(hcc)与单个或几个皮质醇试样进行比较而进行，
而没有考虑夜间的皮质醇水平。这种局限性可以解释为什么到目前为止，头发与一种或多种短期唾液试样之间的大多数相关系数都较为适中(d
′
anna
‑
hernandez等，2011；sauv
é
等，2007；van holland)等人，2012；xie等，2011)。事实上，很少有成功的研究证实头发的有效性。理想的研究应该将hcc与连续的皮质醇水平，或白天和晚上测量的皮质醇水平相关联。那些将hcc与24小时尿液收集相关联的研究则显示出多样的结果。sauv
é
等人(2007)发现hcc与24h尿皮质醇收集之间只有中等程度的相关性，而short等人(2016b)的研究则表明没有显著的相关性。
19.最终，头发对皮质醇浓度平均水平的反映可能并没有想象的那么好。例如，尚不清楚的是，汗腺是否也与一定量的皮质醇在头发的内部传递有关(sharpley，2012)。但可以确定的是，皮脂腺将皮质醇输送到头发中，因此为神经纤维网络所支配(okumura，1967)。此外，急性因素也会影响到头发的生长。有一系列证据表明，在应对压力期间释放的神经激素和神经递质可以显著影响头发的生长周期(paus等，2006，1997；botchkarev，2003)。此外，类固醇沉积在毛囊内，因此未来的无发部分也依赖于反映头发生长周期的局部代谢变量(terao&katayama，2016)。这些变量可能解释了为什么头发皮质醇治疗方案建议从头皮后部切除角质化组织，因为在该区域观察到的头发生长变异性较小(pragst&balikova，2006)。这可能意味着，尽管急性皮质醇混合变量可能不会影响hcc，但其局部协变量可能会影响hcc。所以有理由认为，头发并不能准确反映皮质醇的长期系统水平，而是提供了一个局部观察的指标。
20.头发标本还遇到了一些实际问题，这些问题阻碍了其在临床上的广泛使用。头发生长变异性较小的区域，也是人们开始脱发时，受影响最大的后顶点的区域。事实上，这种类型的脱发(iv型)影响40％40岁以上的男性和10％40岁以上的女性(hamilton，1951年)，这还不包括很大一部分因头发没有达到最低长度而无法提供试样的人(至少一个厘米以反映上个月的皮质醇浓度)。最近的一项研究表明，高达30％的参与者由于各种原因(包括美学原因)无法或不愿提供此样本(fischer等，2016)。更重要的是，准确地剪掉1毫米的头发似乎是无法完成的任务。但是，能够区分几周之间的皮质醇平均水平对医生而言非常重要。抗抑郁作用通常在治疗3周而不是4周后开始显示其效果(tanum&malt，1996)。这意味着就不能通过使用头发样本来准确描述与长期皮质醇水平相关的抗抑郁作用。实际上，与非角质化组织不同，对头发的分析时间相对较长。实际上，分析单个唾液样本可能需要4个小时零20分钟，但分析头发样本却需要30多个小时。这种差异意味着工作时间增加了八倍。因此，这是一个效率很低的过程。这种情况可以解释为什么其成本比分析唾液等短期皮质醇试样高44.3％(bristow，2017)。上述所有因素均阻碍了其广泛的临床应用。
21.一些变量也会影响头发中的皮质醇水平。例如，性别可能会改变hcc。多项研究表明，男性比女性更容易增加hcc(garcia
‑
leon等，2018；vanaelst等，2012)。此外，尽管已经排除了由外部因素(例如紫外线辐射或使用清洁产品)在靠近发根四厘米以下部分引起的
″
洗出
″
或皮质醇去除效果(dettenborn等，2010年)，其他的去除影响(换句话说，试样是刚刚从头皮中长出的部分)是否也会降低其水平尚不清楚。此外，尽管毛发水平的显著差异与毛细血管皮质醇分析的这一步骤有关，但头发研究与特定的皮质醇提取方法并不一致。当试样被粉碎而不是被切成小块时，提取的皮质醇最多可提取3.5倍(davenport等，2006)。最终，尚不清楚某些美容疗法(例如染发)是否也会影响hcc(manenschijn等，2011；sauv
é
等，
2007)。
22.第三个问题：
23.缺乏高效、安全的设备来清洁外耳道
24.不幸的是，到目前为止，还没有一种耳垢自洁装置能像外耳清洁的传统临床方法一样有效。这种局限性意味着，尽管耳垢试样在测量葡萄糖和皮质醇的长期水平方面有潜在用途，其广泛的临床应用似乎是不现实的。因为到目前为止，只有合格的医生才能安全地进行检测，所以使用临床方法提取试样十分昂贵。
25.此外，尽管清洁外耳不是医学意义上的适应症，数以百万计的人每天仍有这种危险的习惯。棉签是最常见的耳朵自洁方法(khan等，2017)，同时也是几种外耳疾病的主要危险因素，例如耳垢异常和出血(ahmed等，2014；nussinovitch等，2004)。
26.考虑到其潜在的严重副作用，棉签的流行可能不仅和其使用便捷有关。首先，这些设备可能会令人上瘾。围绕外耳道的纤维很敏感，对其的刺激会引发身体的愉悦感。但是，长期使用这些设备会引发恶性循环，即
″
痒
‑
抓痒循环
″
，这种恶性循环会一直持续。因此，棉签的流行不仅可以解释瘙痒感的普遍增加，而且还可以解释其被滥用的原因(mochizuki等，2014年；pata等，2003年)。因此，考虑到它们目前在全球的商业市场上取得了巨大的成功，对这种潜在副作用的简单警告可能不足以作为减少其巨大需求的措施。例如，2005年仅一个品牌在美国的销售额为1.893亿美元，在2014年增长至2.084亿美元。最近的一项市场研究发现，2011年至2017年期间，其销售额的增长率在美国为30％，中国为32％，欧洲为26％，预计未来五年的增长率分别为20％，24％和19％(hexa reports，2017)。因此，一种高效且安全的替代设备需要被研发出来以替代风险高的棉签。
27.遗憾的是，到目前为止，这还没有实现。当前，市售的几种耳朵清洁产品都没有效果或几乎没有效果。全面、系统的评价表明，尽管某些耳垢分解溶液(例如合有矿物油的溶液)可能具有一定的效用，但尚不清楚它们中的哪一种引起了这种分解作用。此外，到目前为止，没有任何一种设备(机械或电子)能够像由专家操作提取，或使用注射器(如reiner
‑
alexander注射器)进行的提取那样有效(clegg等，2010)
28.第一个解决方案
29.耳垢反映了葡萄糖和皮质醇的平均水平
30.很少有生物试样可以反映葡萄糖和皮质醇的平均水平。脂肪组织可能是其中之一，因为它具有可以累积物质的特性(szymczak&milewicz，1998)。但是，对患者的组织进行活检似乎是非常不现实的，因为这不仅危险，而且比采集血液样本昂贵。但是，另一个更容易获得的生物试样也可以反映这些水平：耳垢。耳垢是一种油性分泌物，主要由脂质组成(inaba等，1987)。它由耳道周围的高分泌腺和皮脂腺分泌(montagna，1955年)。这种分泌可以准确的反映葡萄糖和皮质醇的平均水平，因为它不受局部和急性效应的影响，而这是因为神经纤维或局部的代谢变量不会影响葡萄糖和皮质醇的浓度。实际上，与毛囊的皮脂腺不同，耳朵的顶分泌腺和皮脂腺并不被神经支配(bende，1981)。
31.蜜蜂也产生蜡状物，而蜂窝的角色也表明，耳垢可能比血样具有更多优势。一方面，蜜蜂可以将它们的糖(蜂蜜)存储(积累)在蜂窝中(fratini等，2016)，另一方面，由于蜂窝具有抑菌特性，因此不会被微生物消耗(ghanem，2011年)。人体产生的蜡状物也具有这种性质(stoeckelhuber等，2006)。因此，这表明耳垢不仅可以长时间积累葡萄糖和皮质醇，而
且还可以免受表皮菌群的影响。该特征可能意味着，如果有自采样耳垢设备，即可以从患者家中收集耳垢样本，而无需像血液样本那样在特殊的存储或运输条件下进行采集。
32.皮质醇和葡萄糖是两种高反应性物质。测量它们的长期水平至关重要，因为它们在流行病中被改变。但是，到目前为止，当前的生物试样只能测量其短期内的水平；即使有一些样本可以被积累起来以测量更长的一段时期的皮质醇和葡萄糖水平，它们的广泛临床应用不切实际且价格昂贵。耳垢可以长期测定这些物质，是可行且可靠的生物试样。但是，尚不清楚这种独特的试样是否能够长期积累这些反应性物质。
33.因此，申请人研发了一种在耳垢样本中检测葡萄糖和皮质醇的分析方法。
34.本发明所用的方法经过系统评估，初步的研究也证实了耳垢分析的效率和可靠性，并确定了在该新型样本中是否可以检测到葡萄糖和皮质醇。最后，还测试了各种类型的海绵从猪皮上去除人造蜡状物的效果。
35.结果：皮质醇水平以前未在耳垢中测量。在该油性分泌物中检测到了皮质醇和葡萄糖。分析耳垢中的皮质醇所需的时间比用分析头发中的皮质醇所需的时间少得多。具有特殊磨蚀性和吸收性的纤维素海绵是从猪皮上去除人造蜡状物最有效的方法。
36.结论：耳垢可能是测量长期皮质醇和葡萄糖水平最准确、最有效的样本。纤维素海绵是一种有效、经济和安全的提取材料。
37.第二种解决方案
38.设计一种安全、可靠的耳朵自洁设备
39.由于上述问题，申请人研发了一种医疗器械，其提供了有效、安全和卫生的耳垢自提取方法。
40.另外，本发明的耳垢自采样装置可以为使用该生物样本分析葡萄糖和皮质醇水平提供合适的样本。
发明总结
41.因此，本发明的主要目的是提供一种测量耳垢中的葡萄糖和皮质醇水平的方法。
42.本发明的另一个主要目的是研制一种新的医疗设备，用于可靠、有效、安全、卫生的耳垢自提取。
43.以下说明详细描述了本发明使用耳垢来测量葡萄糖和皮质醇水平的方法，以及所设计的医疗设备，它们的种种优点对本领域的技术人员来说是显而易见的。
44.示例图的简要说明
45.图1本发明医疗设备第一实施例的左侧视图，示出尖端横截面(有海绵)。
46.图2本发明医疗设备尖端的透视图(无海绵)
47.图3本发明医疗设备尖端的俯视图(无海绵)
48.图4本发明医疗装置第二实施例的左侧视图，示出尖端横截面(有海绵)
49.图5基线
‑
egc和fsg之间的关联结果图示。
50.图6基线
‑
hba1c和fsg之间的关联结果图示。
51.图7跟踪egc和psg之间的关联结果图示。
52.图8跟踪hba1c与psg之间的关联结果图示。
53.图9基线egc和血糖水平平均值之间的关联结果图示。
54.图10基线hba1c与血糖水平平均值之间的关联结果图示。
55.图11跟踪egc与血糖水平平均值之间的关联结果图示。
56.图12跟踪hba1c与血糖水平平均值之间的关联结果图示。
57.图13hcc和ecc之间的关联结果图示。
58.本发明的具体描述
59.本说明将根据优选的实施例来描述本发明在耳垢中测量长期葡萄糖和皮质醇水平的方法。在最一般的实施例中，本发明的方法包括：
60.通过任何合适的方法从耳朵中提取耳垢样本。测量皮质醇和葡萄糖平均水平所需的最小耳垢量为0.8毫克；
61.通过测量手段或方法准备耳垢样本以测量皮质醇和葡萄糖水平。
62.使用任何已知的手段或方法测定皮质醇和葡萄糖，其中将皮质醇和葡萄糖的水平解释为皮质醇和葡萄糖的平均水平。
63.耳垢样本的提取可以通过传统方式进行，例如使用reiner
‑
alexander注射器或通过使用任何合适的提取装置。
64.样本的制备可以以不同的方式进行，这取决于所使用的皮质醇和葡萄糖的测量方法。样本可以包含纯的和干的耳垢。它们的葡萄糖和皮质醇分析可以以不同的方式进行，例如使用免疫组织化学反应或elisa。
65.在本发明的第一特定实施例中，通过使用reiner
‑
alexander注射器从外耳获得耳垢。
66.在这样一个特定的实施方案中，样本的制备以及对皮质醇和葡萄糖水平的测量如下进行：
67.样本制备
68.皮质醇提取
69.a)在环境温度下用n2蒸汽干燥耳垢样本，直到所有水从样本中蒸发为止。该步骤也可以使用冻干手段来完成。
70.b)称量干燥的耳垢样本，以通过干重来标准化皮质醇的重量。标准化是指将测得的重量调整到标准比例，以便能够比较数据；
71.c)用1ml磷酸盐缓冲盐溶液(pbs)均质化干燥的样本，以获得耳垢在pbs中的溶液。磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液的量可以是耳垢重量的10倍，例如，100g的耳垢使用1000ul的磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液。此外，可以使用任何亲水性溶剂，例如生理盐水。
72.d)将步骤c)中获得的溶液分为第一溶液部分和第二溶液部分，并将每个溶液部分添加到各自的试管中；
73.e)向第一溶液部分中加入0.5ml乙醚，以得到与0.5mg乙醚混合的pbs耳垢溶液；两种物质之间的比例是1∶1。但也可以使用其他合适的同类物质。
74.f)在至少一分钟内搅拌装有步骤e)的溶液的试管，所得的溶液在重悬后向其加入0.5mg的乙醚，与pbs的比例为1∶1；
75.g)在至少两个小时内，将步骤g)中获得的混合溶液在
‑
18至
‑
21℃(最好是
‑
20℃)的温度下冷却至少两小时，以确保液体部分被冷冻，并且不会污染有机部分。该步骤可以提取那些明显溶解在乙醚中的化合物，例如皮质醇。这是因为尽管乙醚部分在
‑
20℃下保持液
态，但磷酸盐部分却冻结了；
76.h)从冷却的溶液中提取明显溶于乙醚的化合物；
77.i)用n2置换法干燥剩余的液体溶液。但是，也可以使用其他方法，例如蒸发。
78.j)在
‑
80℃下储存步骤i)中得到的干燥部分以备进一步使用；
79.k)在第二溶液部分中加入300pg的皮质醇，以获得与皮质醇混合的pbs耳垢溶液；
80.1)向步骤k)中获得的溶液中加入0.5ml的乙醚，以确定纯化的皮质醇的量，作为评估提取效率的手段；
81.m)在至少一分钟内搅拌装有步骤i)获得的溶液的试管，获得的溶液在重悬后向其加入0.5mg乙醚，与pbs的比例为1∶1；
82.n)在至少两个小时内，将步骤m)中获得的混合溶液在
‑
18至
‑
21℃(最好在
‑
20℃)的温度下冷却，以确保液体部分被冷冻，并且不会污染有机部分；
83.o)从冷却的溶液中萃取溶于乙醚的化合物；
84.p)再次用置换法用n2干燥剩余的液体溶液；
85.q)将步骤i)中获得的干燥部分储存在
‑
80℃下以进一步使用；
86.r)在第三个试管中(不加均质溶液)将0.5ml的300pg/ml纯化的皮质醇溶液在ph值为7的pbs中溶解。此步骤旨在获得在耳垢中提取皮质醇的效率。
87.s)进行与第一溶液部分和第二溶液部分相同的步骤，从中提取皮质醇。
88.皮质醇定量
89.根据制造商的说明(enzo life sciences，farmingdale，ny)，使用elisa技术来量化耳垢样本中皮质醇的浓度，其定量方法如下：
90.a)使用制造商提供的缓冲液对提取的样本进行重构，该方法使用比色竞争elisa技术对皮质醇进行定量分析。具体操作是：将缓冲液添加至提取的样本中，再将获得的溶液静置20分钟，也可以是其他的时间范围。20分钟的时间足以使溶液重新水化，使缓冲液更容易重悬。之后，在1分钟内搅拌溶液以使其均化。在这个过程中，缓冲液提供了一种稳定的溶液，因为无论是添加碱还是酸，其都能将ph值保持在一定范围内。
91.b)使用酶标仪(novostar)的标准曲线来测量样本中皮质醇的总量；
92.c)使用荧光技术将耳垢的干重归一化，其中荧光计在530
‑
570nm范围内激发，在590
‑
600nm的范围内读数。虽然年龄、性别、不同的医疗状况和压力水平等多个变量可能会影响耳垢中皮质醇的水平，但为避免协变量混淆皮质醇的检测结果，实验使用了胆固醇水平来做比照，因为胆固醇水平并不受上述变量的影响。
93.葡萄糖定量
94.使用一部分先前溶解在pbs中用以测量皮质醇水平的耳垢溶液来测量葡萄糖水平。葡萄糖的定量方法如下：
95.a)按照制造商的说明，使用kit sera
‑
pak plus(bayer healthcare)技术来测量溶解的耳垢溶液中葡萄糖的水平。在505nm处一式三份定量葡萄糖吸收量。使用其吸收的平均值获得葡萄糖浓度(mg/dl)，并根据归一化后样本的初始重量计算溶解在溶液中的葡萄糖总量。
96.在本发明的第二具体实施例中，使用本发明的提取装置获得耳垢，该提取装置包括：
97.手柄(1)，有第一端(2)和第二端(3)，所述第二端(3)有连接装置，在本发明的优选实施例中，该连接装置可包括螺纹(4)；
98.可拆卸的头部(尖端)，包括基座(5)和从基座的上部垂下、纵向延伸的细长海绵支架(6)，其中基座的下部包括有内螺纹的壳体(7)用于容纳手柄(1)的螺纹(4)，其中海绵支架(6)有星形横截面；
99.细长的海绵(8)，有位于中央的纵向壳体(未示出)，该纵向壳体具有星形横截面，用于容纳基座(5)的海绵保持架(6)。
100.手柄(1)和基座(5)可使用任何合适的联接装置，例如卡扣接头(9)。
101.海绵(8)最好由纤维素制成，并使用非过敏性胶粘剂粘合到海绵支架(6)上。
102.如前所述，海绵支架(6)的横截面为星形，当在耳朵内部摩擦海绵(8)时，这一设计可以提高耳垢的提取效率。但是，海绵保持架的横截面可以是任何合适的形状。
103.基座(5)比手柄(1)宽，其被用作为安全制动，阻止尖端插入耳道。
104.手柄(1)的特征在于具有旋转对称的形状，方便用户通过旋转手柄来摩擦海绵。
105.海绵(8)被包好并在湿润状态下密封以使其保持柔软。所用的润湿剂为氯化镁(mgcl2)，其可作为抗菌剂防止微生物在货架期内生长。氯化镁不仅可以防止海绵滋生微生物，还可以帮助提取耳垢。此外，它还被用于治疗皮炎(zhai等，1999)，皮炎是使用棉签最常见的副作用(ahmed等，2014)。也可以使用其他已知的抗微生物剂。
106.将带有海绵(8)的尖端插入耳朵并在耳道内旋转海绵(8)约30至60秒，即可获取耳垢。
107.在本发明的第二实施例中，通过将500μl的pbs缓冲溶液添加到5ml试管中来进行样本的制备。将海绵与塑料支架分离，然后放入管中。在海绵吸收了全部溶液后，将其重复挤压、吸收2分钟(或根据需要进行调整)，将海绵挤压至干燥后从试管中取出。随后，通过n2置换法干燥所得溶液，并将所得内容物重悬于500μl超纯水中。将试管中的所得溶液保存在4℃下直至进一步使用，也可以在其他合适的温度范围内冷却。对本领域技术人员显而易见的是，该过程也可以使用其他量值的pbs，其重量与体积之间的比例通常为1∶2，这也是本处使用500μl的原因。
108.在该第二具体实施例中，按照制造商的说明，通过elisa技术测量皮质醇水平，并通过使用kit sera
‑
pak plus(bayer healthcare)试剂盒测量溶解的耳垢溶液中葡萄糖的水平。也可以使用其他合适的已知方法，例如液相色谱
‑
串联质谱法(lc
‑
ms/ms)。
109.前导研究
110.清除耳垢
111.使用reiner
‑
alexander注射器清洁志愿者的耳朵，因为到目前为止，这是有效去除外耳耳垢的独特的安全方法(clegg等，2010)。该注射器是耳鼻喉医生清除异常耳垢的传统方法。在清洁两只耳朵之前，使用耳镜检查外耳道，以排除是否存在外耳病变，例如耳垢异常或鼓膜穿孔。简而言之，使用reiner
‑
alexander注射器在外耳道内缓慢注入37摄氏度的水。注射的过程会产生轻微的压迫感，因为温水会冲洗掉耳垢。将排出的水和提取的耳垢收集在肾形盆中。
112.使用耳垢样本分析皮质醇和葡萄糖
113.通过本发明的第一具体实施例提取皮质醇，并根据本发明的第一具体实施例进行
皮质醇和葡萄糖定量。
114.在一组健康参与者中进行了以下初步研究，以标准化耳垢样本的皮质醇和葡萄糖提取方案。
115.使用耳垢样本测定葡萄糖和皮质醇的结果(表ii.1)
116.表ii.1.初步研究
‑
对来自五名志愿者(志愿者0
‑
4)的样本进行皮质醇和葡萄糖分析
[0117][0118]
与血液样本相比，耳垢样本中皮质醇提取和定量方案的有效性
[0119]
如前所述，控制皮质醇的提取效率是将0.5ml 300pg/ml纯化的皮质醇溶液溶于ph为7的pbs中，并执行与耳垢样本相同的提取方案。结果显示，其平均皮质醇浓度为281.48
±
5.16pg./ml，对应三个试管的皮质醇浓度的平均值(289.2pg./ml、273.42pg./ml和281.6pg/ml)。该结果显示出了93.8
±
1.72％的提取效率，表明了使用耳垢样本提取皮质醇方案的高效性。
[0120]
提取过程的有效性还可以通过另一种方式评估，即在加入乙醚之前先在耳垢溶解的匀浆溶液中添加300pg纯化的皮质醇(参见方法)。进行此步骤是为了确定耳垢成分是否不干扰皮质醇的纯化。结果示于表2，其显示出从耳垢匀浆中获取的纯化皮质醇恢复率平均
为99.3％，这也证实了使用耳垢样本测量皮质醇水平的高效性。
[0121]
表ii.2：耳垢样本中皮质醇水平的恢复率
[0122][0123]
该过程还通过使用先前项目的三个血清样本作为对照组(参与者0
‑
2)来评估(表3)。可以肯定的是，使用耳垢测量皮质醇水平的方案确实是可靠的，因为当使用当前的耳垢方案对相同的血清样本进行皮质醇水平测量时，结果几乎相同(比较表3中的第3列和第4列)
[0124]
表ii.3：三名参与者(对照组)的血清皮质醇水平
[0125][0126]
最后，比较表ii.4和表ii.5后可以看出，使用reiner
‑
alexander注射器进行耳垢皮质醇分析比测量头发中的皮质醇要快。
[0127]
表ii.4：用reiner
‑
alexander注射器收集的耳垢样本分析皮质醇和葡萄糖所需的时间
[0128][0129]
表ii.5：分析头发中的皮质醇所需的时间和相关费用(相对于从唾液样本中获得
相同参数)
[0130][0131][0132]
然而，从表ii.4还可以看出，当使用reiner
‑
alexander注射器时，所收集的耳垢样本在被用于分析葡萄糖和皮质醇水平之前，需要对其进行干燥，这增加了分析这些样本所需的总时间。因此，本发明装置提供了可以收集耳垢而无需注射任何溶液的机制。
[0133]
结论
[0134]
前导研究表明，在耳垢样本中可以检测到葡萄糖和皮质醇的水平。分析耳垢中的皮质醇所需的时间明显少于分析头发中的皮质醇所需的时间。此外，研究还发现，去除人造耳垢最合适的海绵是由纤维素制成的。
[0135]
效度研究
[0136]
方法
[0137]
受试者主要是从智利科金博市北天主教大学(ucn)的工作人员和学生志愿者中招募的。所有受试者均由同一位临床研究人员进行评估。样本包括三十七名健康参与者，女性为20名，平均年龄为29.9岁，平均bmi为25.6kg/m2。
[0138]
所有受试者均在南半球冬季(2018年7月6日至8月3日之间)招募。以前的研究已经发现，季节会改变耳垢的甘油三酸酯组成(cipriani等，1990)。由于在成分和数量上不同的耳垢特征，亚洲人和智力低下的人被分别排除在外(cipriani等，1990；crandell&roeser，
1993)。受试者没有报告当前或上个月内的内科疾病史，包括耳部疾病(如耳垢异常，鼓膜穿孔或中耳炎)和代谢性疾病(如糖尿病，葡萄糖或乳糖不耐症)。参与者在至少一个月内没有使用任何药物。根据dms
‑
iii的定义(pichot，1986)，如果受试者报告在过去的一个月内使用了违禁药物，或处于严重的压力下，也将被排除。
[0139]
验证研究有两个访谈，每个访谈相隔一个月，基线(天＝1)和跟踪(天＝30)。在基线评估期间，研究者与受试者进行了全面的临床访谈，目的是排除受试者存在任何的医学疾病，例如耳部疾病，代谢性疾病或精神病。评估期间还记录了社会人口统计数据。一旦将受试者纳入研究，就可以使用reiner
‑
alexander注射器清洁耳朵，因为到目前为止，这是有效去除外耳耳垢的独特的安全方法(clegg等人，2010)，也是耳鼻喉医生清除异常的耳垢经常使用的传统方法。受试者被指示在跟踪期间避免使用棉签或任何耳朵清洁方法，这使得研究人员可以在三十天后(跟踪评估时)收集标准化的耳垢分泌物。3
‑
8mg的耳垢约为4周的分泌量。
[0140]
左右耳之间可被比较的耳垢分泌数量(cipriani等，1986)提供了案例对照，而不是横断研究的可能。因此，在跟踪评估中，使用reiner
‑
alexander注射器[对照组]清洁左耳，使用本发明的提取装置清洁右耳。使用hassles量表(kanner&coyne，1981)对一些环境因素进行自我评估，例如最常见的日常环境干扰(其频率和严重性)；使用《近期生活变化调查表》(rlcq；miller&rahe，1997)对一些受试者前一个月内生活中的突发因素(例如重大生活事件)进行评估。参与者还使用压力感知量表(pss；cohen，1994)评估了上个月的压力感知。所有心理测验工具均是经过核实的西班牙语版本。最终，进行标准化的满意度调查，以评估参与者使用本发明设备的体验。该评估基于态度量表构建技术(李克特量表)的5个刻度等级进行评分加总(spector，1985年)。该调查还记录了一些类型化和持续性的变量，例如参与者对棉签的了解或先前的使用情况。在访问期间还详细记录了一些人体测量数据，例如体重、身高、体重指数(bmi)和腰围。
[0141]
总体结果：社会人口统计数据，人体测量数据和自我管理的问卷调查结果
[0142]
结果：
[0143]
表iii.1：社会人口和人体测量数据
[0144]
[0145][0146]
[0147][0148]
表iii.3：自我管理的问卷调查结果
[0149]
[0150][0151]
总体而言，从表iii.1，iii.2和iii.3中可以看出，受试者包含相当同一的年轻样本，主要由女性构成(54.1％)。就人体测量变量而言，他们也是一群健康的人。但是，与其他智利对照组的样本相比，这组参与者面临着越来越多且更为严重的麻烦和生活事件(herane
‑
vives等，2018)。这也解释了为什么他们的压力感知比其他健康拉丁人种样本更高(cohen，1994)
[0152]
评价本发明的提取设备
[0153]
背景：到目前为止，还没有一种安全的自清洁装置可以像去除耳垢的传统临床方法一样有用。这样的自清洁装置可以代替危险的棉签。在这项研究中，我们评估了一种原创、安全的自采样耳垢设备(trears)，即它们的可靠性、有效性和用户体验。
[0154]
方法：将使用trears收集的37个右耳耳垢样本的重量与使用传统临床方法(reiner
‑
alexander注射器)收集的相同数量的左耳耳垢样本的重量进行比较。这些样本代表了过去一个月的耳垢分泌。还使用标准化的满意度调查评估了受试者使用该耳垢自洁设备的体验。
[0155]
结果：与reiner
‑
alexander注射器相比，使用trears清除耳垢的效果明显更好(p＜0.001)。两种方法的可靠性没有显著差异。湿度为50％(105.1μl)的trears尖端比湿度为12.5％(30μl)去除耳垢更有效(p＜0.05)。受试者认为，使用trears比使用棉签更安全、更舒适。
[0156]
结论：在健康人群中，使用trears是一种更方便、可靠和有效的外耳道自洁方法。其也可替代当下被广泛使用但风险很高的棉签。
[0157]
前导研究结果证实，一种特殊的具有研磨性和吸收性的海绵可以轻松的去除动物皮肤上的人造蜡状物(herane
‑
vives和benohr，2018年)。然而，其有效性尚未在耳垢中进行过测试。本案例对照研究在健康参与者中测试了使用该种海绵的耳垢提取装置(trears)的有效性和安全性。
[0158]
耳垢样本
[0159]
一名耳鼻喉专科医生于2018年5月30日对本研究的临床研究助理进行了reiner
‑
alexander注射器使用的培训。在清洁两只耳朵之前，使用耳镜检查外耳道以排除存在外部耳朵病变，例如耳垢异常或鼓膜穿孔。简而言之，使用reiner
‑
alexander注射器在外耳道内缓慢注入37摄氏度的水。注射过程会在产生温和的感觉，因为注射器的温水会冲洗掉耳垢。将排出的水和提取的耳垢收集在肾形盆中。在跟踪期间，参与者根据制造商的说明(图1)使用trears自行清洁了右耳。
[0160]
图1：trears使用说明。
[0161]
耳朵清洁设备
[0162]
警告
[0163][0164][0165]
警告
[0166]
请不要重复使用或清洗一次性吸头。清洁提示仅适用于一次性使用(每个耳道一个)。重复使用吸头可能会导致感染或损害耳朵。如果需要，可以在储存前用温肥皂水清洁trears
tm
设备并彻底干燥。
[0167]
·
耳垢在外耳道的入口附近产生。
[0168]
请勿将trears
tm
插入至超过安全制动器允许的深度。超出安全制动范围内使用trears
tm
可能会损坏鼓膜和听力构造，导致永久性听力损失和/或耳鸣/疼痛/头晕。
[0169]
·
异常的耳垢应由医疗专业人员清除。
[0170]
·
请按照说明逐步练习安全使用本产品。滥用trears
tm
可能会导致严重伤害。使用前请仔细阅读所有说明。
[0171]
使用trears
tm
之前，请仔细阅读本说明
[0172]
耳朵清洁装置
[0173]
使用说明
[0174]
请遵循以下说明，以安全有效地清洁耳朵。
[0175]
准备
[0176]
1.洗手。
[0177]
2.从外壳上取下trears
tm
设备和一个密封的一次性清洁头，然后将其放在干净的表面上。
[0178]
警告：如果清洁头密封不充分，请勿使用或重复使用。
[0179]
3.从包装中取出一个清洁头，将其插入trears
tm
设备，然后顺时针旋转直至发出喀哒声.
[0180]
清洁
[0181]
4.小心轻柔地将trears
tm
(连接了一次性清洁头)插入您的耳朵。请勿将清洁头强行插入耳道。
[0182]
注意：设备具有安全制动器，请勿将设备引入制动允许范围之外的耳道。
[0183]
5.清洁耳朵，在耳朵内侧的整个壁上擦拭清洁头约30至60秒钟。
[0184]
由于trears
tm
的安全制动，您可以安全地清洁耳朵。
[0185]
耳朵清洁装置
[0186]
使用说明
[0187]
请遵循以下说明，以安全有效地清洁耳朵。
[0188]
使用后处理
[0189]
6.从trears
tm
上取下清洁头，朝逆时针方向旋转。
[0190]
7.将使用过的清洁头丢弃到任何家庭垃圾箱中。清洁头可生物降解。
[0191]
警告：请勿使用马桶冲走。
[0192]
8.对另一只耳朵重复相同的步骤。
[0193]
9.将trears
tm
设备及密封的清洁头存放在干燥的地方。
[0194]
一次性清洁头上的海绵已预先使用氯化镁(mgcl2)润湿，所以具有不同的湿度水平。研究期间使用的镁油是31％的氯化镁水溶液，其也可用于按摩，皮肤再生和护理。由于镁含量高，该溶液具有光滑滋润的流体质地。它本身不包含任何油脂，但具有像油脂一样的柔滑感觉。每毫升镁油包含约103mg的镁元素。将四个耳垢样本贴标签，称重并低温保存。所有耳垢样本均贴有标签，称重并存储在4摄氏度下。
[0195]
统计分析
[0196]
使用kolmogorov
‑
smirnov统计测试和图解方法(包括直方图)检查数据的正态性。除了跟踪左耳样本外(p＝0.03)，所有样本均为正态分布(所有p＞0.05)。因此，我们使用重复t检验来比较基线左耳和右耳的耳垢提取量，以及基线和跟踪提取的耳垢提取量；使用wilcoxon配对符号秩检验来比较跟踪左耳和右耳的耳垢提取量；使用线性回归分析来确定tears提取的耳垢的数量与不同生物变量之间的关联，或相同数量与客户满意度调查问题之间的关联。显着性水平设置为p小于等于0.05(双尾)。
[0197]
结果
[0198]
表iii.1，iii.2和iii.3分别提供了详细的社会人口统计数据、人体测量数据和自我管理的问卷调查结果。大多数参与者认为trears的使用非常舒适，有效和安全。他们还描
述说，与棉签相比，使用trears更有效、更安全且更令人愉悦。尽管只有14.3％的人愿意购买该产品，大多数人仍然表示他们可能会考虑使用该产品(60.7％)(表v.1)。
[0199]
虽然提取的左右耳垢基线样本的量没有差异，但使用trears提取的耳垢比使用reiner
‑
alexander注射器要多得多(p＜0.001)(表iv.2)。经基线reiner
‑
alexander注射器清洗后，两只耳朵的耳垢产生量均显著增加(均p＜0.05)。跟踪左耳垢样本的提取量也明显高于基线右耳垢样本(p＜0.05)。
[0200]
尽管不同的顶销厚度在提取的耳垢数量上没有显示出任何差异，但是湿度为50％或105.1μl mgcl2(表iv.3)的海绵比12.5％(p＜0.05)的海绵提取了更多耳垢(表iv.4)。没有生物或心理变量改变耳垢的分泌量(所有p＞0.05)(表iv.5)。尽管trears的不同变体没有改变参与者对trears的使用体验的评价，当受试者面临更多的或更严重的麻烦时，他们认为其有效性平庸，且比棉签差(表iv.6)。
[0201]
图表：
[0202]
表iv.1：trears的满意度调查
[0203]
[0204][0205]
表iv.2：使用reiner
‑
alexander注射器和trears设备进行耳垢提取的比较。
[0206][0207]
表iv.3：trears湿度
[0208][0209][0210]
表iv.5：
[0211]
trears提取的耳垢与一些生物和心理变量之间的线性回归模型
[0212]
[0213]
[0214][0215]
讨论
[0216]
研究发现，在使用reiner
‑
alexander注射器对两只耳朵进行基线清洁后，产生的
耳垢数量显著增加。与临床方法(reiner
‑
alexander注射器)相比，trears清除了更多的耳垢。大多数参与者认为使用trears舒适，有效又安全。他们还报告说，使用它比使用棉签更有效、安全、舒适。尽管只有14.3％的人愿意购买该产品，但大多数参与者表示，他们可能会考虑使用该选择(60.7％)。
[0217]
值得注意的是，在跟踪期间，不管使用哪种提取方法，耳垢的数量均显著增加，而不是减少。这可能是由于使用reiner
‑
alexander注射器进行基线外耳清洁导致耳垢不足，从而使耳腺增加耳垢的分泌作为一种补偿机制。我们研究方案的设计也考虑到了这种差异。我们指示参与者避免在随后的阶段清洁耳朵，以提取标准化数量的耳垢来追溯当月生出的耳垢。在观察到有35.7％的参与者是棉签重度使用者，另外28.6％的参与者至少偶尔使用后，这种可能性也得到了加强。
[0218]
除温水外，reiner
‑
alexander注射器还可以被用来提取更多耳垢。cipriani等人(1986年)使用了一种提取方法，即注入一种酒精/乙醚3∶1v/v(2.02
±
0.22mg/周)的溶液。该方法比常规的提取方法提取了更多耳垢(2.25
±
0.18mg/周)。cipriani等人(1986)的结果也在本实验中被证实
‑
在比较了基线结果之后发现，没有耳垢的体积变化与耳侧有关。但是，耳垢的基线量并不代表一个月后耳垢的分泌量，因为在健康的混血人群中，trears提取的耳垢比注射器多出八倍。
[0219]
尽管极不建议，但棉签的使用将继续增加。因此，当前需要一种安全的替代方案。遗憾的是，与使用诸如reiner
‑
alexander注射器之类的临床方法相比，当前所有的自清洁产品或设备都没有效果或效果有限。然而，trears不仅与传统的耳垢清除方法一样有用，而且还能够提取出比临床方法更多的耳垢。trears的清洁头材料是一种特殊的磨蚀性和吸收性蜂窝状海绵，其先前已显示出清除人造液体蜡状物的效用。此外，trears的清洁头中还加入了一种矿物油，该矿物油对去除耳垢已经显示出一定的作用。我们发现，与使用相对干燥的清洁头(浓度为12.5％)相比，在其中添加一种浓度更高(50％)的矿物油(例如氯化镁)可增加trears的提取率。未来的trears设备将达到该湿度水平。此外，清洁头加矿物油所产生的累加效果可以解释这些重要的研究结果。
[0220]
使用耳垢测量平均葡萄糖浓度
[0221]
背景：平均血糖浓度的升高与很多流行病和慢性病有关。当前，没有任何一项测试即可以准确地反映其长期水平，又价格合理，方便无害。耳垢可能符合这些特征。本技术人将空腹和餐后血糖水平与耳垢和糖化血红蛋白(hba1c)的基线和跟踪样本相关联。
[0222]
方法：37名健康参与者提供了两个右耳耳垢样本和两个血清样本，这些样本的采集时间相距一个月。禁食8小时后采取基线测量，摄入一顿标准餐后采集跟踪样本。基线耳垢葡萄糖浓度(egc)代表一个之前未知时期的禁食和餐后葡萄糖水平的平均浓度，而后续的egc代表了本月的同一数据的平均值。两个hba1c样本均代表了一个月至三个月之间的回顾性平均葡萄糖浓度。使用其各自基线和跟踪数据的平均值计算血糖平均值。比较每个样本的基线水平和跟踪水平。在这些样本中研究了几个协变量的影响，包括空腹血清葡萄糖[fsg]与其各自的基线egc和hba1c样本的相关性，以及餐后血清葡萄糖[psg]与他们各自的跟踪egc和hba1c样本之间的相关性。平均血糖水平与上述所有hba1c和egc样本相关。使用基线和跟踪egc和hba1c样本预测了不同的血糖水平。
[0223]
结果：所有跟踪浓度均高于其各自的基线浓度。耳垢样本不受任何协变量的影响。
虽然egc与血糖水平之间的所有关联均显示出强正相关性(所有r＞0.60；p＜0.001)，但具有不同血糖水平的hba1c关联均显示出中度或弱相关性(所有r＜0.50；0.10＜p＜0.01)。基线egc预测了平均血糖水平的显著增加(所有p＜0.001)。
[0224]
结论：egc比hba1c更准确地反映了血糖水平。在测量葡萄糖浓度方面，耳垢比血糖和hba1c更稳定。egc结果表明，耳垢可以更好地代表长期的平均葡萄糖水平。
[0225]
尽管其他研究也在耳垢样本中测量了葡萄糖水平(masuda等，1978；shichjo&masuda，1979)，甚至是糖尿病患者的葡萄糖水平(khasanov和popova，1984年)，在先前的研究中发现的egc是否能准确地代表长期血糖水平仍旧未知。这也是为什么在本项研究中，我们测量了健康参与者样本中在禁食期间和一顿标准化就餐后摄入的egc，血糖和hba1c的水平，并比较每个样本的基线水平和跟踪水平。本项目还研究了几个协变量对葡萄糖水平的影响。空腹血清葡萄糖[fsg]与其基线egc和hba1c相关，且餐后血清葡萄糖[psg]与其跟踪egc和hba1c水平也相关。平均葡萄糖水平与上述所有hba1c和egc样本相关。使用基线和跟踪egc和hba1c样本预测了不同的血糖水平。
[0226]
研究假设：
[0227]
1)所有跟踪测试的浓度比其各自的基准浓度更重要；
[0228]
2)耳垢比血糖和hba1c在反映血糖浓度上更稳定；
[0229]
3)egc与不同血糖水平之间的所有关联强于hba1c与相同血糖测量之间的关联，且
[0230]
4)基线egc可以预测平均血糖水平的剧烈增加。
[0231]
方法：
[0232]
三十七名健康参与者提供了两个右耳耳垢和两个血清样本，这些样本的采集时间相距一个月。禁食8小时后采取基线措施，摄入一顿标准餐后采集跟踪样本。虽然耳垢葡萄糖累积的回顾周期尚不清楚，但跟踪的egc涵盖了当前测试月的葡萄糖累积。两个hba1c样本均代表了一个月至三个月之间的回顾性平均葡萄糖浓度。使用其基线和后跟踪血糖水平之间的平均值计算血糖水平的平均值。比较每个样本的基线水平和跟踪水平，并在这些样本中研究几个协变量的影响。空腹血清葡萄糖[fsg]与其基线egc和hba1c相关，餐后血清葡萄糖[psg]与其跟踪egc和hba1c也是如此。血糖水平的平均值与上述所有hba1c和egc指标相关。
[0233]
耳垢样本：
[0234]
在禁食8小时后收集右耳耳垢基线样本。在受试者用餐(标准的236毫升的液体餐)两小时后，收集右耳耳垢跟踪样本。所有样本都贴上标签并保存在4摄氏度下。
[0235]
使用reiner
‑
alexander注射器对耳垢进行采样。
[0236]
通过洗耳获得的耳垢样本通过使用n2置换法进行干燥处理。简而言之，将50毫升中分装在四个试管中，每个试管都插入一个与n2气罐连接的套管，并使用恒温槽保持25℃的恒定温度。当氮气流打开时，它将置换蒸发的h2o，从而使样本干燥。一旦将基础样本干燥(正如在第30天获得的左侧样本那样)，就通过减去空试管的重量(先前称重)来获得干燥的耳垢样本的重量。最后，将125plpbs添加到每个试管中，将每个试管中的内容物重悬，并将样本合并到一个5ml试管中，将所得样本重悬于500μlpbs中并保存在4℃下直到使用。
[0237]
使用trears采集的耳垢样本
[0238]
使用仪器获得的耳垢样本通过用500μl的pbs冲洗海绵清洁头2分钟来进行处理。由于trears的萃取机理是干燥的，因此用n2干燥的时间要少得多。实际上，与reiner
‑
alexander注射器相反，trears不会注入水。
[0239]
具体来说，将500μl的缓冲溶液pbs添加到5ml管中；然后将其置于5ml试管中。将海绵从其塑料支撑件上分离出来并引入管中。海绵吸收了全部溶液后，将海绵反复挤压并吸收2分钟，然后将海绵挤压干燥并从试管中取出。随后，用n2置换法干燥所得溶液，并将内容物重悬于500μl超纯水中。将试管中的溶液保存在4℃下直至使用。
[0240]
血清样本
[0241]
抽取空腹血样(肘前静脉，3
‑
cc注射器，并使用没有抗凝剂的采血管)。所有血清样本在早晨采集。在基线访视的早晨采集一份hba1c和血糖样本[fsg]。之前已指示参与者在评估前八小时避免进食或饮水。在跟踪期间还采集了另一份hba1c和血糖样本[psg]。这些跟踪样本是在摄入标准液体餐后采集的。236毫升的液体餐包含23.6％的蛋白质，44.8％的碳水化合物，28.8％的脂肪，28.8％的脂肪，1％的纤维和1.1毫升的236ml％的β
‑
羟基
‑
β
‑
丁酸丁酯。从空腹和餐后血糖水平之间的平均值估算血清中的平均葡萄糖浓度。
[0242]
血清葡萄糖分析：
[0243]
血清样本的制备。在空腹和餐后条件下获得的血液样本在4℃下保存24小时，以便于血清凝结和分离，然后在4℃下以1000xg离心20分钟。用1毫升注射器将沉淀物收集到2毫升贴好标签的塑料管中。一旦获得血清，将它们在
‑
20℃的环境下保存直到使用。
[0244]
定量从耳垢和血清中提取的葡萄糖：
[0245]
根据酶供应商(biovision inc.，milpitas，ca，usa)给出的说明，通过酶促氧化测定法和96孔板中氧化的葡萄糖标记定量葡萄糖，标准曲线为0，每孔2、4、6、8和10nmol葡萄糖标准液。将50μl标准品，含水部分和1∶25的血清稀释液与50μl含葡萄糖测定缓冲液的葡萄糖定量混合液，2μl葡萄糖探针和2μl酶促葡萄糖混合液一起添加到剩余的孔中。在微孔板读数器(novostar)中测量570nm的吸光度后，立即将混合物在37℃避光的条件下反应30分钟。将标准曲线的吸光度调整为直线方程式，并通过在调整后的曲线内进行插值来计算葡萄糖含量。
[0246]
血清样本中糖基化血红蛋白的定量：
[0247]
糖化血红蛋白(hba1c)的含量使用夹心elisa法进行定量，根据其供应商(abbexa ltd.，cambridge，uk)的说明，使用的标准曲线为0.30125、6.25、12.5、25、50，100和200ng/ml的hba1c标准品。将标准品和100μl标准品以及未稀释的血清添加到涂有涂有hba1c抗体的平板的孔中，让其在37℃温度下振荡反应60分钟。丢弃内容物并用洗涤液洗涤两次后，加入100μl与生物素偶联的hba1c检测抗体，然后在37℃振荡反应30分钟。丢弃内容物并用洗涤缓冲液洗涤五次后，将90μltmb培养基添加到每个孔中，并在黑暗中于37℃反应20分钟。最后，将50μl溶液添加到每个孔中，并在酶标仪(novostar)中定量在450nm处的吸光度。标准曲线的吸光度拟合直线，并且样本的吸光度被内插到所述曲线中。
[0248]
统计分析
[0249]
使用统计检验和图形方法检查数据的正态性。所有其他值均呈正态分布(所有p＞
0.05)。因此，使用重复的t检验比较不同样本的基线和跟踪血糖水平。使用线性回归分析来确定葡萄糖浓度与不同生物和心理变量之间的关联，并使用egc和hba1c标本预测不同的血糖水平。皮尔逊相关性用于确定基线和跟踪egc与不同血糖水平之间，或基线与跟踪hba1c与不同血糖水平之间的关联。使用cohen的相关标准：当r＝0.1
‑
0.3时为低，当r＝0.3
‑
0.5时为中，而当r＝0.5
‑
1.0时为高(j cohen，2013)。还记录了分析每个样本所需的时间。显著性水平设定为p≤0.05(两尾)。
[0250]
结果
[0251]
表iii.1，iii.2和iii.3分别提供了详细的社会人口统计和人体测量数据，以及自我管理的问卷调查结果。与使用reiner
‑
alexander注射器所需的时间相比，使用trears显著减少了分析耳垢所需的时间(比较表ii.4和v.1)。所有跟踪浓度均高于其各自的基线浓度(表v.2)。耳垢样本比hba1c或血糖水平更稳定，因为它们的葡萄糖浓度不受任何协变量的影响(表v.3)。年龄对基线hba1c样本有直接影响。此外，随着受教育年限的增加，跟踪hba1c和psg水平；吸烟降低了fsg和psg水平(表v.3)。egc与血糖水平之间的所有关联均显示出强正相关性(所有r＞0.60；p＜0.001)，而hba1c则呈现中度或弱相关性(所有r＜0.50；0.10＜p＜0.01)(图5，6、7和8)。与基线hba1c和fsg之间的关联性(r＝0.43，p＜0.001)相比，跟踪的hba1c与fsg的关联性更强(r＝0.48，p＜0.001)(图6和8)。这两个egc关联都比hba1c关联强。然而，与具有fsg水平的基线egc样本(r＝71p＜0.001)(图5)相比，跟踪的egc样本也显示出与psg的关联更强(r＝0.90，p＜0.001)(图7)。平均血糖水平也显示出与耳垢，而不是hba1c标本的关联更强(见图9、10和11、12)。其中，餐后耳垢样本也显示出与平均血糖水平的最强关联(r＝0.84，p＜0.001)(图11)。
[0252]
表v.1：分析不同样本的时间
[0253]
[0254]
[0255]
[0256]
[0257]
[0258]
[0259][0260]
讨论
[0261]
研究发现，使用血糖，hba1c和egc标本的所有跟踪浓度均明显高于其各自的基准
浓度，从而证实了该研究是适当进行的。耳垢比hba1c和血糖样本更稳定，因为它的葡萄糖水平不受任何协变量的影响。尽管egc与血糖水平之间的所有关联均显示出强正相关系数(所有r＞0.60；p＜0.001)，但两种血糖水平之间的hba1c关联仅表现出中等或弱相关性(所有r＜0.50；0.10＜p＜0.01)。跟踪egc和hba1c量度均显示与psg相关性最强，相关性在跟踪egc和psg之间(分别为r＝0.90，p＜0.001和r＝0.48，p＜0.01)。然而，通过基线egc和hba1c预测血糖水平的最大幅度增加(分别为β＝13.2，p＜0.001；β＝11.7，p＜0.01)。
[0262]
先前的研究已证实，在健康人群中，hba1c与禁食或餐后血糖水平之间的关联度非常小(van t riet等人，2010)。该结果可能是由于样本的中度原因所致，或者是因为hba1c通常在葡萄糖水平升高的人群(例如糖尿病患者)中显示出更强的关联性(van t riet等人，2010)。
[0263]
必须强调的是，基线egc不能与其跟踪样本完全媲美，因为它们代表着耳垢中葡萄糖累积的不同时期。确实，该研究设计仅允许我们在进行基线外耳清洁之后再标准化跟踪样本的耳垢分泌量。在这以前的剧烈体育活动或某些压力事件可能会暂时增加基线egc样本。从这个意义上讲，基线egc可能代表长期空腹和餐后血糖水平的几次累积。但是，不仅基线
‑
hba1c，基线
‑
egc也能预测血糖水平平均值的最大增加，这也表明，egc更好地代表了平均葡萄糖浓度，而不是空腹或餐后血糖浓度。众所周知，hba1c主要受fsg而非psg的影响，因为人们在白天禁食的时间比吃饭的时间长(monnier等，2006)。基线egc也可能主要受空腹血糖水平的影响，因为其葡萄糖浓度低于其跟踪耳垢样本的浓度(p＜0.01)。
[0264]
耳垢在反映葡萄糖水平方面无疑比hba1c好。不仅因为egc与血糖水平之间的所有相关性都强于所观察到的hba1c与血糖水平之间的相关系数，而且还因为跟踪egc与psg之间(r＝0.90；p＜0.001)比基线egc与fsg之间(r＝0.71；p＜0.001)显示出更强的相关性。因此，禁食期的基线egc可能比观察到的跟踪egc与不同血糖水平之间的相关性更显著。
[0265]
以前有研究表明hba1c水平受年龄的影响。hba1c也受教育程度的影响，其对应的工作类型很可能可以解释这一点。研究表明，这些需要较高学历的工作与工作时间的增加有关(uehata，1991)，而工作时间反过来也与hba1c的增加有关(azami等人，2018)。我们还验证了先前的结果，这些结果表明吸烟降低了fsg和psg。相比之下，耳垢也是一个更稳定的标本，因为它的皮质醇水平不受任何协变量的影响。我们的研究结果表明，下一步应该开始在糖尿病和肥胖症患者中测试egc。
[0266]
以前的一些研究使用曲线以下的部分，而不是空腹和餐后葡萄糖水平之间的平均值来估计平均葡萄糖浓度(avignon等，1997)。但是，空腹和餐后血糖水平之间的平均值也已显示为非常准确的指标。实际上，svendson及其团队发现，在18位1型糖尿病患者中，对每位进行大约2到300次测量得出的平均葡萄糖水平几乎与hba1c完全相关(r＝0.96)(aaby svendsen et al。，1982)。ozmen等研究发现，空腹和餐后血浆葡萄糖水平引起的平均血糖水平也与2型糖尿病患者的hba1c密切相关(ozmen等，2006)。最近，妊娠糖尿病妇女的餐后血糖水平和空腹血糖水平之间的平均值也被使用(koren等人，2016)。因此，该指数可能与健康人的平均血糖水平更相关，因为他们的24小时血糖水平变化幅度小于糖尿病患者(praet等人，2006)。
[0267]
受试者吸收不同膳食成分的能力的个体间差异也可能影响他们的血糖水平(freckmann等，2007)。这就是为什么有些研究在摄入75克葡萄糖后使用葡萄糖耐量测试，
而不是在标准餐后(ensure)进行餐后水平测试的原因。该餐含有多种营养物质，例如蛋白质，脂质和葡萄糖，其吸收率可能不同，这也最终影响psg的级别。但是，我们使用了一种被广泛使用的测试，以提供易于吸收的流质餐。此外，还排除了对某些食物过敏的参与者，例如乳糖不耐症。
[0268]
关于血浆和血清之间血糖水平的差异，一些研究报告说血浆葡萄糖高于血清葡萄糖，而其他研究则没有发现差异。但是，不建议通过测定血清中的葡萄糖来诊断糖尿病(美国糖尿病协会，2010)。然而，我们没有使用fsg或psg水平进行任何诊断，因为我们招募了健康受试者，并使用不同的样本调查他们的血糖水平。
[0269]
总而言之，耳垢比血糖和hba1c样本更能反映平均葡萄糖水平，因为它更稳定，并且其葡萄糖浓度能更好地预测平均葡萄糖浓度，而不是其禁食后或餐后的水平。
[0270]
使用耳垢样本测量皮质醇水平
[0271]
背景：对抑郁症的诊断被认为不完全可靠。这种情况可能是由于该综合症实质上的异质性。一种准确的生物标志物可以提高这一诊断的一致性。皮质醇水平通常是在抑郁症诊断中测量的，因为它是该综合征下常见的神经生物学改变。然而，由于反应性皮质醇的分泌特征，使用短期样本的皮质醇结果差异很大。这些样本不适合反映平均皮质醇浓度，因为一些急性因素会影响其皮质醇水平。已经发现，毛发皮质醇浓度(hcc)反映了长期的皮质醇系统水平，因为它会长期积累激素。但是，其广泛使用似乎是不现实的。此外，尚不清楚某些急性影响是否确实会改变hcc。耳垢皮质醇浓度(ecc)可能是反映平均皮质醇浓度更方便，更准确的样本。
[0272]
方法：在基线采样期间清洁了37名健康受试者的耳朵。一个月后，从受试者的右耳分析ecc。在跟踪期间，受试者还提供了1厘米的头发，回顾性的代表了头发皮质醇在过去一个月的蓄积。对ecc和hcc进行了比较并相互关联。
[0273]
结果：ecc显著大于hcc(p＜0.001)。ecc和hcc显示出显著的中度正相关(r＝0.39；p＝0.03)。尽管男性的hcc高于女性(p＜0.001)，但ecc不受性别的影响。
[0274]
结论：ecc可能是另一个能准确反映平均皮质醇浓度的样本。与头发相比，耳垢会累积的皮质醇浓度更高。耳垢也是一个更稳定的样本，因为其皮质醇水平不受任何协变量的影响。最终，分析ecc所需的时间远远少于分析hcc所需的时间。
[0275]
目标和假设：
[0276]
尽管我们最近发现该分泌物中可检测到这种激素，尚不清楚其含量是否代表平均皮质醇浓度。这就是为什么在本研究中，我们将37名健康受试者的耳垢样本中的皮质醇浓度(ecc)和hcc相关联的原因。我们假设：1)分析ecc所需的时间少于分析hcc所需的时间，2)ecc中的皮质醇含量比hcc的多，3)ecc与hcc之间呈正相关，以及4)常见的短期和头发皮质醇协变量不会影响ecc。
[0277]
方法：
[0278]
我们比较并关联了从跟踪耳垢样本中和在同一次访问中获得的1cm头发样本中获得的皮质醇水平。两个样本都代表了皮质醇在上个月的积累。在这些样本中研究了几个协变量的影响。还记录了分析ecc所需的时间。
[0279]
使用trears获取的耳垢样本：
[0280]
(请参见说明图1)
[0281]
耳垢皮质醇分析：
[0282]
纯化耳垢样本中的皮质醇：通过设备获得耳垢样本后，将重悬于500μlpbs中的样本用1ml注射器匀浆。然后，添加500μl的乙醚，并且使用涡旋将每个样本搅拌1分钟，然后在
‑
20℃下放置2小时。此后，将每个样本的液体部分(有机部分)转移到新的5ml试管中，并用上述n2置换法进行适当标记和干燥。干燥后，将样本重悬于500μlpbs中，并对皮质醇水平进行定量。另一方面，使用乙醚萃取后残留的水溶液来测定耳垢中的葡萄糖水平。
[0283]
测定耳垢样本中的皮质醇：根据其供应商提供的说明(美国纽约州法明代尔enzo生命科学公司)，使用elisa对皮质醇进行定量。皮质醇的含量通过竞争性比色elisa技术，使用皮质醇标准品的0、156、313、625、1250、2500、5000和10000pg/ml的标准曲线进行定量。将100μl标准溶液，有机样本部分和血清稀释液添加到涂有抗小鼠抗体的平板的孔中。除上述溶液外，将50μl含有共价结合至碱性磷酸酶的皮质醇蓝色偶联物和50μl抗皮质醇的小鼠单克隆抗体添加到所有孔中。加入抗体后，将其搅动孵育2小时，以使样本/标准品中存在的皮质醇与结合物的皮质醇与抗激素抗体竞争。因该抗体与抗体的相互作用，其将保持与孔的结合，粘附在孔壁上。2小时后，将孔彻底洗涤，并将200μl对硝基苯基磷酸酯(pnpp)加入每个孔中，并在不搅拌的情况下孵育1小时。该步骤使得对硝基苯基磷酸酯通过在对硝基苯酚中与皮质醇共价连接的碱性磷酸酶介导的酶促反应转化，并且其着色与存在的皮质醇的量成反比。最后，将50μl的用于终止酶促反应的溶液添加至每个孔。在酶标仪(novostar)中于405nm处读取板，将标准曲线的吸光度调整为4点对数曲线，并将样本的吸光度插值到该曲线中，从而获得样本的浓度(pg/毫升)。将浓度乘以样本的微升(500μl)，再除以干燥样本的重量，即可得出耳垢的浓度mg/mg。将浓度乘以稀释倍数以计算血清中的浓度。
[0284]
头发样本
[0285]
一位训练有素的临床医生收集了所有受试者的头发样本。测量是否存在可能影响头发皮质醇水平的生物混杂物或程序，以及其频率，包括美容处理(染色，漂白，永久性拉直或卷曲)和洗发的频率。从头后部的顶点采集头发样本，并用干净的剪刀将其剪至尽可能靠近头皮的位置。对于此研究，需要从后部顶点的不同位置获取四束头发，每束头发约为1厘米橡皮筋的厚度。在实验室中，从每个发束的发根处剪下1厘米长的头发，其大约代表过去一个月的头发生长，相当于对皮质醇进行1个月的回顾性评估。每个发束选取的1厘米部分的总重量大约等于25
‑
50毫克的头发。收集后，头发样本将在室温下、无光环境中保存于密封容器。
[0286]
头发皮质醇分析
[0287]
在分析之前，将头发样本在1ml的异丙醇中洗涤以除去外部污染物，然后从小瓶中除去异丙醇，并使头发在干净的空气环境中干燥48小时。完全干燥后，将五个陶瓷球添加到每个试管中，并使用mpbio fast prep(mp biomedicals，llc)将头发样本研磨成粉末。为了提取皮质醇，向每个样本中添加1.75ml的甲醇，并将样本孵育20小时，同时不断旋转样本。
[0288]
将头发，甲醇和陶瓷球倒入聚丙烯管(sarstedt ag&co，德国)中，该管将陶瓷球与其余混合物分开。将试管在3000 rcf下离心以分离出毛发和甲醇，然后将1.25ml的澄清的甲醇上层清液倒入2ml聚丙烯冷冻管中。然后使用真空离心机(scan speed 40，labgene)除去甲醇，并将试管冷冻在
‑
80℃直至需要进行皮质醇elisa。使用可商购的竞争性elisa
(salimetrics llc，美国)测定皮质醇水平。将样本解冻，并用0.125ml salimetrics皮质醇测定稀释剂复溶，然后按照制造商的方案测定样本。结果以每毫克头发皮质醇的皮克图来呈现。所有头发样本均在英国剑桥的安格利亚
·
鲁斯金大学生物标志物分析实验室进行了分析(www.anglia.ac.uk)(albermann&musshoff，2012)。
[0289]
统计分析
[0290]
使用统计检验和图形方法(例如直方图)检查数据的正态性；ecc和hcc值呈正态分布。因此，我们对相依样本使用(相依t检验)比较ecc和hcc。使用皮尔逊相关性来确定hcc和ecc之间的关联。使用cohen的相关标准：当r＝0.1
‑
0.3时为低，当r＝0.3
‑
0.5时为中，当r＝0.5
‑
1.0时为高(j cohen，2013)。使用线性回归分析来确定葡萄糖浓度与不同生物学和心理变量之间的关联。分析ecc所需的时间也被记录。显著性水平设定为p≤0.05(两尾)。
[0291]
结果
[0292]
表iii.1，iii.2和iii.3分别列出了详细的社会人口统计，人体测量和自我管理的问卷调查结果。使用trears分析ecc所需的时间是使用reiner
‑
alexander注射器分析ecc所需时间的一半(比较表ii.4和vi.1)。使用trears分析ecc所需的时间比分析hcc所需的时间少四倍(表vi.1)。ecc明显多于hcc(表vi.2)。尽管男性相比女性hcc升高(p＜0.001)(表vi.3)，但性别并未影响ecc。ecc与hcc呈中等正相关(r＝0.39，p＝0.003)(图13)
[0293]
表vi.1：分析ecc所需的时间
[0294]
[0295][0296]
[0297][0298]
请见表13.
[0299]
讨论：
[0300]
使用trears提取ecc比使用reiner
‑
alexander注射器的效率明显更高。如果和分析hcc所需的时间比较，其性能则表现更佳。耳垢浓缩的皮质醇浓度明显高于头发。且与头发相比，耳垢也是反映皮质醇水平更稳定的样本，因为它没有任何协变量。实际上，我们也
证实了先前研究的结论，即男性相比女性hcc升高(garcia
‑
leon等，2018；vanaelst等，2012)。
[0301]
头发是另一个能够累积皮质醇浓度的标本，其与已被证实可以反映皮质醇长期水平的试样有明显的正相关性。这种相关性在发现新样本不受任何急性影响后被加强。ecc与24小时尿液收集或持续皮质醇水平的相关性也可能增加，有些证据表明hcc受一些急性因素的影响，如汗水(sharpley，2012)和神经纤维(okumura，1967)。
[0302]
耳垢累积的皮质醇浓度高于头发。皮质醇是由一个不清楚的多隔室模型间接输送到毛干中的。然而，皮质醇通过一种简单的单室模型从皮质腺直接分泌到外耳道中。一个潜在的限制与ecc和hcc的比较有关。尽管本研究使用了相同受试的者样本，但他们的结果并非严格可比，因为对这些样本的分析是在两个不同的实验室中进行的。clark等人(1998年)显示，在接受标准促肾上腺皮质激素测试的对照组中，五种不同免疫测定之间的显著偏差比高达1.2。(jeremy cohen等人，2006)。但是，我们发现ecc/hcc比率高达14.3。除了偏大的偏差，两个实验室都使用elisa技术。因此，不可能是偶然发现这个差异。未来的研究可能会将ecc与指甲皮质醇水平相关联，这是另一个可能长期累积皮质醇水平的标本(izawa et al。，2015)。最终，应在抑郁症患者中测量ecc。
[0303]
结论：
[0304]
对健康人来说，耳垢可能是一种更经济，方便和有效的外耳自洁方法。该设备还可以代替使用起来有风险的棉签。耳垢样本可准确反映皮质醇和葡萄糖水平的平均值。常见的急性影响并不影响耳垢中葡萄糖和皮质醇的水平。