一种将胶质瘤细胞诱导为神经元的化合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及胶质瘤技术领域，尤其涉及一种将胶质瘤细胞诱导为神经元的化合物及其应用。


背景技术：

2.胶质瘤(glioma)是中枢神经系统常见恶性肿瘤，是最常见的成人颅内原发性肿瘤，超过50％的胶质瘤为高度恶性的胶质母细胞瘤，经最大范围安全切除及放疗、化疗等标准治疗后，患者中位生存期仍然仅14～16个月，预后极差。
3.目前临床治疗方案以stupp标准化治疗方案为主，即最大安全切除后，辅助放疗联合替莫唑胺(temozolomide，tmz)化疗；而其它治疗方案包括免疫疗法等，虽可改善一些患者的生存质量，但对于延长整体胶质瘤患者生存时间无实质性重大进展。其主要原因在于tmz无法针对性地抑制胶质瘤生长；而胶质瘤的异质性和复杂的分子特征又决定了单一靶点的治疗往往不甚理想。因此，寻找胶质瘤治疗的新策略显得十分迫切而重要。
4.恶性胶质瘤的危害主要源于它的快速增殖和侵袭，因此，从理论上分析，将其诱导成为未分化的细胞是阻止胶质瘤生长和侵袭的一种潜在方法。目前国内外的一些临床和基础研究发现，从转录因子角度出发，在胶质瘤细胞中通过表达神经元分化的转录因子，可以将部分胶质瘤细胞诱变为神经元样细胞(neuron
‑
like cells)。但是，通过上述方式诱导胶质瘤向神经元转化，存在效率不高和临床应用困难等问题。
5.随后，科学家们将目光集中在小分子化合物诱导胶质瘤细胞重新编程上。通过化合物库筛选等手段，有研究发现，由多种化合物配伍形成的组合物具有将胶质瘤细胞重编程为神经元样细胞的潜力。例如，现有技术中利用三种常用药物fasudil、tranilast和temo组合的配伍，可以将原代胶质瘤细胞重新编程为神经元样细胞，这些神经元样细胞表达神经元特殊的分子标志物和特征，同时肿瘤的生长也显著减缓。随后，现有技术中利用两个抑制剂的组合，即rho相关蛋白激酶(rock)和哺乳动物雷帕霉素目标(mtor)的组合，可以替代神经元转录因子，将胶质瘤细胞转化为神经元样细胞。现有技术中也发现，采用由forskolin、isx9、chir99021 i
‑
bet 151和dapt等小分子化合物组成的配伍，也可以将胶质瘤细胞重编程为神经元样细胞。
6.现已报道的化学小分子配伍组合虽然具有诱导胶质瘤细胞成为神经元的潜力，但这些化合物配伍过于复杂，涉及到多个分子的协同作用，且诱导效果不甚理想。因此，寻找新的能够快速诱导胶质瘤细胞向正常细胞“命运转变”的单个小分子，具有十分重要的应用价值。


技术实现要素：

7.本发明的其中一个目的是提出一种将胶质瘤细胞诱导为神经元的化合物及其应用，解决了现有技术中将胶质瘤细胞诱导为神经元需多个分子协同作用，配伍过于复杂，且诱导效果不甚理想的技术问题。本发明优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐
述。
8.为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
9.本发明将胶质瘤细胞诱导为神经元的化合物，为单一化合物，并且所述化合物为法舒地尔或法舒地尔衍生物中的一种。
10.根据一个优选实施方式，法舒地尔衍生物为法舒地尔盐的形式。
11.根据一个优选实施方式，法舒地尔衍生物为盐酸法舒地尔，盐酸法舒地尔的化学结构式如下：
[0012][0013]
本发明还公开了本发明中任一项技术方案所述的将胶质瘤细胞诱导为神经元的化合物在制备治疗胶质瘤药物中的应用。
[0014]
根据一个优选实施方式，所述的治疗胶质瘤药物包括具有治疗胶质瘤及其并发症功效的药物。
[0015]
根据一个优选实施方式，所述化合物的诱导浓度为：5～15μmol/l。
[0016]
根据一个优选实施方式，所述化合物的诱导浓度为：10μmol/l。
[0017]
根据一个优选实施方式，所述化合物的诱导时间为100天以上。
[0018]
本发明提供的将胶质瘤细胞诱导为神经元的化合物及其应用至少具有如下有益技术效果：
[0019]
本发明将胶质瘤细胞诱导为神经元的化合物，为单一化合物，并且所述化合物为法舒地尔或法舒地尔衍生物中的一种，结果显示，单用fasudil(法舒地尔)处理胶质瘤细胞后，会显著诱导胶质瘤细胞表达神经元特异性生物标记物；提示fasudil(法舒地尔)具有诱导胶质瘤向神经元转化的能力。即本发明提供了一种新的单化合物诱导胶质瘤命运重编程的可能有效方法，也为日后开展进一步临床相关研究提供了基础。即本发明将胶质瘤细胞诱导为神经元的化合物及其应用，克服了现有技术中化学小分子配伍复杂和诱导效果不理想的缺点，通过单一药物处理，即可实现胶质瘤细胞向神经元的稳定转变。
附图说明
[0020]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]
图1是法舒地尔处理后的胶质瘤细胞表达神经元轴突分子标记物tuj1的示意图；
[0022]
图2是法舒地尔处理后的胶质瘤细胞表达神经元细胞核分子标记物neun的示意图；
[0023]
图3是法舒地尔处理后的胶质瘤细胞表达神经元树突分子标记物map2的示意图。
具体实施方式
[0024]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
[0025]
下面结合说明书附图1～3对本发明将胶质瘤细胞诱导为神经元的化合物及其应用进行详细说明。
[0026]
利用法舒地尔将胶质瘤细胞诱导为神经元具体包括如下步骤：
[0027]
(1)体外培养胶质瘤细胞系：本发明采用胶质瘤细胞系kns89作为诱导对象。该胶质瘤细胞系购自于中国科学院典型培养物保藏委员会的上海细胞库购买，保存于液氮中。细胞复苏时，迅速从液氮中取出冻存细胞管，置入37℃恒温水浴锅中，不停晃动冻存管加速冻存细胞溶解，待冻存液完全融化后，于无菌条件下迅速将其转移至含10％胎牛血清(fbs)的高糖dmem培养基中，吹打均匀后离心(800rpm/4min)，弃上清，取dmem完全培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至培养皿，摇匀，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养。根据生长情况每隔1/2天更换培养基，每日观察并记录细胞的生长状况，如状态、密度、形态等。
[0028]
(2)fasudil(法舒地尔)处理：在胶质瘤细胞达到90％以上的密度后，将细胞传代到新的培养皿进行神经元诱导，细胞铺板密度大约为3.3
×
104个细胞/cm2。培养基仍使用含10％胎牛血清(fbs)的高糖dmem培养基，每1
‑
2天更换一次培养基。加入的fasudil(法舒地尔)为其盐酸盐形式，即盐酸法舒地尔，化学式为c
14
h
17
n3o2s
·
hcl，化学结构式如下：
[0029][0030]
fasudil(法舒地尔)处理胶质瘤细胞时，直接与dmem完全培养基混匀，终浓度为10μmol/l，连续处理胶质瘤细胞100天。
[0031]
(3)鉴定胶质瘤细胞向神经元转化：在fasudil(法舒地尔)处理细胞100天后，采用免疫荧光染色进行胶质瘤细胞向神经元转化的鉴定。具体方案如下，将细胞爬片放入24孔细胞培养板孔中，取对数生长期kns89细胞，按1
×
104/孔接种至孔中，当细胞汇合度至50％
‑
60％时进行染色。染色时，弃去细胞培养基，每孔加入400μl pbs缓冲液清洗2次，再加入400μl预冷的4％多聚甲醛室温下固定20分钟；随后弃去固定液，每孔加入400μl pbs清洗3次，加入400μl含0.25％tritonx
‑
100，室温下通透10分钟，弃去通透液，每孔加入400μl pbs清洗3次；随后利用pbs配制含10％小牛血清白蛋白(bsa)溶液，每孔中加入400μl，室温封闭1小时；染色时，用2％bsa溶液配制免疫荧光染色一抗，每孔中加入400μl，4℃摇床孵育过夜；翌日，每孔加入400μl pbs清洗3次，每次5分钟，随后加入相应荧光二抗400μl，室温避光孵育1小时；弃去荧光二抗，室温避光下，每孔加入400μl pbs清洗3次，取出爬片，稍晾干，使用含抗荧光淬灭的封片剂封片，待风干后在荧光显微镜下观察细胞爬片并拍照。
[0032]
(4)实验数据描述：通过前述方案，可以将胶质瘤细胞系kns89诱导成为神经元样(neuron
‑
like)细胞。具体如下：
[0033]
神经元轴突特异标志物(tuj1，也称beta
‑
iii tubulin)是神经元特异性的微管结合蛋白，可以特异地指示神经元突起，尤其是轴突的存在。在fasudil(法舒地尔)诱导后，kns89胶质瘤细胞中呈现广泛地tuj1免疫荧光染色阳性信号，表明胶质瘤细胞出现神经元轴突，如图1所示。具体地，如图1所示，对照组中仅显示细胞核，在fasudil(法舒地尔)诱导后，不仅显示细胞核，还广泛地呈现神经元轴突特异标志物(fasudil处理组中的长条状物质)。
[0034]
神经元细胞核特异标志物(neun)是成熟神经元的细胞核特异标记物，同样地可以发现，在fasudil(法舒地尔)诱导后，kns89胶质瘤细胞中呈现广泛地细胞核neun免疫荧光染色阳性信号，表明胶质瘤细胞核呈现神经元核特征，如图2所示。具体的，如图2所示，对照组中仅显示细胞核，在fasudil(法舒地尔)诱导后，不仅显示细胞核，还广泛地呈现神经元细胞核特异标志物(fasudil处理组中类似于蝌蚪状的物质，信号主要集中在细胞核)。
[0035]
神经元树突特异标志物(map2)是成熟神经元的树突标记物，而在fasudil(法舒地尔)诱导后，kns89胶质瘤细胞中呈现广泛地map2免疫荧光染色阳性信号，表明胶质瘤细胞出现神经元树突结构，如图3所示。具体的，如图3所示，对照组中仅显示细胞核，在fasudil(法舒地尔)诱导后，不仅显示细胞核，还广泛地呈现神经元树突核特异标志物(fasudil处理组神经元胞体中的分散状物质)。
[0036]
以上结果联合提示，利用fasudil(法舒地尔)处理胶质瘤细胞，可以将胶质瘤细胞诱导成为神经元样细胞。
[0037]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。