使用豚草花粉诱导的小鼠过敏性结膜炎模型及造模方法与流程

1.本发明属于过敏性结膜炎动物模型构建技术领域，涉及使用豚草花粉诱导的小鼠过敏性结膜炎模型及造模方法。


背景技术：

2.过敏性结膜炎是一种常见眼表疾病，发病具有季节性和周期性，由于眼部组织接触到环境中的药物或其他过敏原而产生的超敏反应性炎症。常见的临床症状包括眼红，眼痒，流泪以及结膜水肿。过敏原与机体第一次接触后体内变应原特异性ige，与肥大细胞膜表面fcεri相结合，使机体处于致敏状态，当相同的过敏原再次与已处于致敏状态的机体接触时，变应原与已致敏的结膜肥大细胞膜表面fcεri上的ige相结合，受体交联会触发结膜肥大细胞脱颗粒，进而导致其他一些中间介质的释放这就导致了过敏性结膜炎前期相反应的形成，主要特征是血管扩张、血管壁通透性增高、瘙痒，此阶段持续20
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30min。肥大细胞释放的趋化因子通过诱导局部活化的血管内皮细胞表达新的黏附分子，启动晚期相反应，一般在接触过敏原后6
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8小时出现，期间各种炎细胞特别是嗜酸性粒细胞浸润是晚期相反应的主要组织学表现。抗原特异性t细胞启动嗜酸性粒细胞向结膜移动，进而导致组织损伤。
3.虽然临床已选用血管收缩剂，局部肥大细胞稳定剂，抗组胺剂，糖皮质激素及非糖皮质激素消炎药等多种药物治疗变应性结膜炎，但目前还没有一种药物令人完全满意。因此开发疗效更好，副作用更小的新型抗变应性结膜炎眼药十分必要。评估新药的疗效及研究变应性结膜炎的病理生理，均需要建立动物变应性结膜炎模型。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供使用豚草花粉诱导的小鼠过敏性结膜炎模型及造模方法，成模率高，致敏反应明显。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
6.使用豚草花粉诱导的小鼠过敏性结膜炎模型的造模方法，包括：
7.将豚草花粉跗关节注射液注射进小鼠跗关节皮下，注射体积为65
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85μl，注射后第10天开始，将豚草花粉滴眼液滴至小鼠右眼，每只10
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15μl，每天一次，共4次。
8.优选地，所述豚草花粉跗关节注射液采用以下方法配制：取豚草花粉2.0
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3.0mg加入650μl明矾佐剂，现配现用。
9.优选地，所述豚草花粉滴眼液采用以下方法配制：取15
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20mg豚草花粉，溶于100μl pbs缓冲溶液中，配制为150
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200mg/ml的工作液。
10.优选地，单侧跗关节皮下不能容纳65
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85μl注射液时，在两后肢都进行注射。
11.优选地，还包括在造模前将小鼠适应性喂养3d。
12.优选地，所述小鼠采用6w龄balb/c小鼠，雌雄不限。
13.优选地，还包括在末次激发后进行模型验证。
14.更优选地，所述模型验证包括：末次激发后20min内完成眼部显微镜照片拍照观
察。
15.更优选地，所述模型验证还包括：末次激发后30min内完成取样，动物麻醉后采血致死，连带眼睑将小鼠右眼取出，10％福尔马林固定后，常规石蜡包埋切片，he染色观察结膜形态和眼形细胞浸润情况。
16.本发明还提供了上述造模方法得到的小鼠过敏性结膜炎模型。
17.本发明的有益效果如下：
18.1、使用小鼠品系为普通balb/c小鼠，价格较低，且成模率为83％以上。
19.2、滴眼激发溶剂选择了接近中性的pbs缓冲溶液，减少了传统方法中氢氧化铝佐剂对眼部的额外影响，发病诱因更接近临床。
20.3、相比其他各种方法，跗关节皮下注射后10
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13天激发的方法(本法)可以通过病理切片和he染色观察到过敏性结膜炎的晚期相反应。
附图说明
21.图1显示本发明实施例的一般观察结果。
22.图2显示本发明实施例的he染色结果。
具体实施方式
23.为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
24.实施例
25.一、实验准备
26.动物：6w龄balb/c小鼠，雌雄不限。
27.试剂与耗材：豚草花粉(rw，greer，lot:314555)，明矾佐剂(imject alum，thermo科学，lot:wa313000)，磷酸盐缓冲溶液(ph7.4)。
28.主要试剂配制方法：
29.豚草花粉跗关节注射液：取豚草花粉2.0mg(2.0
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3.0mg均可)加入650μl明矾佐剂，现配现用。
30.豚草花粉滴眼液：取15mg(15
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20mg均可)豚草花粉，溶于100μl pbs缓冲溶液中，配制为150mg/ml的工作液。
31.二、造模操作方法
32.动物适应性喂养3d，开始进行造模，造模时，将配制好的豚草花粉跗关节注射液注射进小鼠跗关节皮下，注射体积为65μl(65
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85μl均可)，如果单侧跗关节皮下不能容纳65μl，可以在两后肢都进行注射。注射后第10天开始，将配制好的豚草花粉滴眼液滴至小鼠右眼，每只10μl(10
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15μl均可)，每天一次，共4次。
33.三、模型验证方法
34.一般观察：末次激发后20分钟内完成眼部显微镜照片拍照观察，如图1所示，可见模型组小鼠相对正常对照组小鼠眼部分泌物增加，眼部血管更充盈。
35.模型验证：末次激发后30min内完成取样，动物麻醉后采血致死，连带眼睑将小鼠
右眼取出，10％福尔马林固定后，常规石蜡包埋切片，he染色观察结膜形态和眼形细胞浸润情况，如图2所示。he染色结果表明83.3％小鼠结膜出现炎性细胞浸润情况，且结膜形态发生变化，其中30％小鼠结膜出现水肿增厚且伴有充血情况。
36.在实验室复制过程中亦发现，腹腔注射卵清蛋白后卵清蛋白激发法、腹腔注射豚草花粉与氢氧化铝佐剂后激发法以及豚草花粉干粉吹入鼻腔致敏后滴眼激发法都不能观察到明显的眼部现象和相关的病理特征。本发明采用对小鼠足下跗关节注射抗原的方法相比腹腔注射和雾化吸入法能达到更好的效果。
37.四、应用
38.过敏性结膜炎小鼠模型可以应用于治疗结膜炎药物的研发，如药物研发公司制备了某种药物，则可以通过设计不同分组，最后检测出该药物是否有效。
39.分组设计为：
40.1.正常对照组(纯同步饲养)
41.2.假手术组(和造模组有通用的基本操作，但不涉及到导致病症的操作)
42.3.模型组(过敏性结膜炎)
43.4.阳性药物组(参比药物，能有效治疗)
44.5.阴性药物组(通常认为无治疗效果的给药)
45.6.溶媒、赋型剂组(此组无治疗效果或有部分治疗效果)
46.7.待测药物的低剂量组
47.8.待测药物的中剂量组
48.9.待测药物的高剂量组
49.假手术组、阴性对照组和溶媒组可以根据客户的具体要求和模型的特性，有些组可以删减。
50.按本发明构建过敏性结膜炎动物模型后，即可根据分组对动物执行治疗方案，待治疗方案周期结束后，通过病理、生化和其他相关检测来确认治疗药物是否有效。
51.显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。