一种检测非洲猪瘟病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡的制作方法

1.本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡。


背景技术：

2.非洲猪瘟（african swine fever，asf）是由非洲猪瘟病毒（african swine fever virus，asfv）感染引起猪的一种急性、烈性传染病，呈世界性分布，asfv是目前己知的虫媒病毒中唯一核酸为dna的病毒。该病属于世界卫生组织（oie）要求法定报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。该病以高热、精神沉郁、厌食、网状内皮系统出血、可视黏膜发红为特征，强毒株感染猪病程短，死亡率高达100%，给世界范围内养猪业造成巨大经济损失。
3.非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是一种有囊膜的双链dna病毒。在电镜下呈正六边形，正20面体结构，直径约200nm，由5层同心圆结构组成，由内到外依次为类核、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。非洲猪瘟病毒可编码200多种蛋白质，其中p72蛋白是非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白。目前已有报道基于p30和p54蛋白开发的elisa抗体检测试剂盒和胶体金免疫层析抗体检测试纸卡，由于p72全长三聚体蛋白的制备困难，针对p72蛋白的胶体金免疫层析抗体检测试纸卡目前还未有报道。此前，通过对非洲猪瘟病毒天然衣壳蛋白p72的蛋白结构进行分析，采用特殊位点氨基酸突变的方式设计p72蛋白序列并通过酿酒酵母表达系统，我们已成功获得与天然结构完全相同的p72三聚体蛋白（cn202110522777.4）。
4.非洲猪瘟病毒抗体的检测方法有多种，世界动物卫生组织（oie）推荐的诊断技术包括病原学检测和血清学试验。elisa是国际卫生组织（oie）规定的国际贸易检验方法。病毒分离与核酸检测，均是针对病原体本身进行的检测方法，能作为潜伏期、疾病初期以及症状明显期等多个时期的检测，主要包括病毒分离试验、红细胞吸附试验、pcr试验、实时荧光定量pcr试验等。血清学试验用于检测非洲猪瘟抗原或抗体，主要包括荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验、免疫印迹检测和免疫层析检测等。
5.目前病原学检测、荧光抗体技术、免疫印迹检测对于技术条件以及设备要求高，费时费力，酶联免疫吸附试验检测所需抗原需要病毒感染细胞进行制备，存在散毒的风险，且elisa试剂盒价格昂贵，限制在基层中推广使用。胶体金免疫层析技术是一种快速检测技术，操作简便，反应时间快，不需要任何仪器，结果清晰明辨，非常适于现场快速检测。由于目前没有针对非洲猪瘟的疫苗，所以检测出非洲猪瘟病毒抗体，则认为体内一定存在非洲猪瘟病毒。针对目前非洲猪瘟的流行状况和防控形势，对于非洲猪瘟病毒抗体检测要求特异性高、敏感性强、检测速度快、操作简便、结果简单清晰的检测方法，便于在基层推广使用。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测非洲猪瘟病毒抗体的胶体金免疫层析
试纸卡，使得所述试纸卡在检测非洲猪瘟病毒抗体时具有更高的灵敏度、特异性和准确度。
7.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测非洲猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸卡，包括背衬以及在背衬上的样品垫、标记物垫、层析膜和吸水垫；所述标记物垫上标记有非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体的标记物，所述硝酸纤维素膜上的t线为非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体。其中，层析膜可选用常规的nc膜。
8.本发明在前期p72全长三聚体蛋白已有成果基础上进行非洲猪瘟病毒抗体免疫层析产品的研制，经过本发明研究发现，在标记物垫和t线上采用p72全长三聚体蛋白作为检测抗原，其灵敏度只能够检测到5000倍稀释阳性血清，这并未达到本发明所期望的灵敏度；经过本发明系统性的研究，将标记物垫上替换为喷涂p72全长单体蛋白作为检测抗原，灵敏度能够检测到10000倍稀释阳性血清。
9.本发明所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72通过酿酒酵母重组表达的方式获得p72三聚体抗原，相关内容已经全部记载在cn202110522777.4中，其全部记载同样可以作为本发明所记载的内容。本发明按照cn202110522777.4的制备方法制备获得无需依靠辅助蛋白b602l即可正确组装形成三聚体构型的重组p72蛋白。所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72的序列如seq id no: 1所示或在seq id no: 1所示蛋白序列上添加蛋白标签序列。在本发明具体实施方式中，所述蛋白标签为twin
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strep
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tag，融合在在p72蛋白的n端或者c端。
10.所述p72三聚体抗原通过酸化的方法可以进一步获得p72单体，例如通过有机酸（如柠檬酸）酸化获得，在本发明具体实施方式中提供了如下制备方法：将柠檬酸缓冲液缓慢加入到p72三聚体蛋白溶液中至柠檬酸终浓度达到0.1m或其以上，然后低温反应1
‑
3h；将反应后蛋白溶液上样至分子筛中，通过分子筛纯化获得p72单体。
11.在本发明具体实施方式中，本发明通过制备胶体金免疫层析试纸卡来说明本发明的技术方案；其中，所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体的显色标记物为非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体的金标复合物。在本发明具体实施方式中，金标复合物在标记物垫上的喷涂量为8ul/cm。胶体金与所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体在胶体金标记过程中的标记比含量为：1ml胶体金∶10ug 非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体。
12.在所述胶体金免疫层析试纸卡上，所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体在检测线上的喷涂量为1ul/cm，所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体的工作浓度为4mg/ml。
13.作为优选，所述层析膜上划有包被抗非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72的多抗的质控线，所述多抗在质控线上的喷涂量为1ul/cm；所述多抗的工作浓度为2mg/ml。在本发明具体实施方式中，所述多抗为兔抗p72抗体，作为优选，所述标记物垫喷涂有标记胶体金颗粒的非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体的复合物，所述标记胶体金颗粒的非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体的复合物在本发明具体实施方式中采用静电吸附法标记金颗粒。
14.在本发明具体实施方式中，所述背衬为聚乙烯背衬。此外，所述试纸卡还可以装载卡壳。
15.在本发明具体实施方式，利用制备的胶体金免疫层析试纸卡检测相关血液样本，特异性试验结果显示，对已知的猪圆环病毒抗体阳性血清，猪蓝耳病毒抗体阳性血清，猪伪
狂犬病毒抗体阳性血清及猪瘟病毒（黄病毒科瘟病毒属）抗体阳性血清和非洲猪瘟病毒抗体阳性血清进行交叉试验，只有非洲猪瘟病毒抗体阳性血清样品，检测线显色，呈阳性反应，而与其他几种血清反应时，检测线均不显色，呈阴性反应，表明所述试纸卡用于检测非洲猪瘟病毒抗体时具有高度的特异性。
16.将已知非洲猪瘟病毒抗体阳性血清分别做1:10、1:100、1:1000、1:10000稀释，分别用p30胶体金免疫层析试纸卡，p72三聚体的双抗原夹心胶体金免疫层析试纸卡和基于p72三聚体 p72单体的双抗原夹心胶体金免疫层析试纸卡进行检测，结果显示基于p72三聚体 p72单体的双抗原夹心胶体金免疫层析试纸卡的灵敏性可达1:10000倍，而常用抗原p30的试纸卡灵敏性仅达到1:1000， p72三聚体的试纸卡灵敏性也仅达到1:5000。
17.同时，分别检测5份已验证的非洲猪瘟病毒抗体阳性血清和5份已验证的非洲猪瘟病毒抗体阴性血清，每份血清样品平行做5个重复，结果显示批内重复性和批间重复性试验的检测结果均一致，表明所述抗原用于检测非洲猪瘟病毒抗体时具有较好的重复性和准确性。
18.此外，取同一批号胶体金免疫层析试纸卡对89份临床待测血清样本分别进行检测，观察结果并与国际通用试剂盒id vet 间接elisa试剂盒检测数据比较。id vet 间接elisa试剂盒检测数据显示89份血清样品55份阳性，34份阴性；而本发明的阳性符合数54份，阴性符合数33份，阳性符合率98%（54/55），阴性符合率97%（33/34），总符合率97.8%（87/89）。表明所述抗原用于检测非洲猪瘟病毒抗体时具有良好的准确性。
19.基于上述试验结果，本发明提出了seq id no: 1所示蛋白序列的p72单体和p72三聚体在制备检测非洲猪瘟病毒抗体的免疫层析产品中的应用，其中p72单体金标记物喷涂在标记物垫上，或名称不同但是仍属于结合样本中非洲猪瘟抗体的免疫层析试纸卡组成部件上；作为优选，所述免疫层析产品为胶体金免疫层析试纸卡。
20.由以上技术方案可知，本发明提供了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸卡，将非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体金标记物喷涂在标记物垫上，t线喷涂p72三聚体，所制得的试纸卡具有极高的灵敏度，同时本发明所述试纸卡还具备极高的特异性和准确性，结果直观可肉眼判断，可快速、特异地检出血清中非洲猪瘟病毒抗体，具有较高的实用价值，便于基层推广使用。
附图说明
21.图1所示为胶体金免疫层析试纸卡示意图；其中，1表示背衬，2表示样品垫，3表示金标结合垫，4表示检测线（t线），5表示质控线（c线），6表示吸收垫，7、表示硝酸纤维膜（nc膜），8表示视窗，9表示加样孔；图2所示为胶体金免疫层析试纸卡特异性分析；其中，1表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清；2表示猪圆环病毒抗体阳性血清 ；3表示猪瘟病毒抗体阳性血清；4表示猪蓝耳病毒抗体阳性血清；5表示猪伪狂犬病毒抗体阳性血清；图3所示为本发明胶体金免疫层析试纸卡（p72单体 p72三聚体）灵敏性分析；其中，1表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清；2表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清1:10稀释 ；3表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清1:100稀释；4表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清1:1000稀释； 5表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清1:10000稀释；6表示非洲猪瘟病毒抗体阴性血清；
图4所示为对照胶体金免疫层析试纸卡（p72三聚体 p72三聚体）灵敏性分析；其中，1表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清；2表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清1:10稀释 ；3表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清1:100稀释；4表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清1:1000稀释； 5表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清1:5000稀释；6表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清1:10000稀释；7表示非洲猪瘟病毒抗体阴性血清；图5所示对照胶体金免疫层析试纸卡（p30 p30）灵敏性分析；其中，1表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清；2表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清1:10稀释 ；3表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清1:100稀释；4表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清1:1000稀释； 5表示非洲猪瘟病毒抗体阳性血清1:10000稀释；6表示非洲猪瘟病毒抗体阴性血清；图6所示为不同形式的蛋白过分子筛superdex s
‑
200的结果。
具体实施方式
22.本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸卡，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述试纸卡已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述试纸卡进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
23.本发明中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。在对比试验中，如无特别说明，除蛋白抗原差异外，其他实验条件保持一致。
24.利用本发明胶体金免疫层析试纸卡检测，当被检样品中含有非洲猪瘟病毒抗体时，胶体金标记的非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体与样品中非洲猪瘟病毒抗体形成复合物一起层析移动，被喷涂在硝酸纤维素膜上t线位置的非洲猪瘟病毒p72蛋白三聚体捕获，t线形成金标非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体
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非洲猪瘟病毒抗体
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非洲猪瘟病毒p72蛋白三聚体复合物，未结合的金标非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体继续运动到c线上，被兔抗p72抗体捕获，形成金标非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体
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兔抗p72抗体复合物，此时，t线和c线均显示出肉眼可见的红色。当被检样品中不含有非洲猪瘟病毒抗体时，金标非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体与t线上非洲猪瘟病毒p72蛋白三聚体不反应，金标非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体继续运动到c线上，被兔抗p72抗体捕获，形成金标非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体
‑
兔抗p72抗体复合物，t线不显色，而c线显示出肉眼可见的红色。结果判定：t线不显色，c线显红色，检测样品为阴性，t线和c线都显红色，检测样品为阳性，若c线和t线均不显色，则说明试纸卡失效。
25.以下就本发明所提供的一种检测非洲猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸卡做进一步说明。
26.实施例1 ：本发明所述重组抗原的制备1. 非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体重组表达菌株的制备本发明基于生物信息学和结构生物学方法分析，对非洲猪瘟衣壳蛋白p72进行重新设计，使用化学合成的方法合成非洲猪瘟病毒的p72（strep
‑
tag）基因序列。将p72基因与酵母gal1启动子和adh1终止子构建到质粒上形成p72蛋白基因表达盒。通过pcr扩增出带有同源重组臂的p72蛋白基因表达盒作为修复模板。利用crispr
‑
cas9技术，共表达识别
ggatttaggaatccataaaa的grna，将p72蛋白基因表达盒通过同源重组的方式插入到酿酒酵母多拷贝的ty2逆转录转座子中，实现基因多拷贝表达。将修复模板和pcas
‑
ty2质粒共转化酿酒酵母by4743中，利用缺ura的平板进行克隆筛选。筛选出单克隆，通过qpcr方法鉴定拷贝数，挑取高拷贝菌株进行表达检测。
27.2. p72三聚体重组蛋白表达挑选高拷贝阳性单克隆酿酒酵母菌落接种于ypd液体培养基中，30℃过夜培养。取过夜培养的菌液于ypd 2%葡萄糖液体培养基中100倍扩大培养，30℃培养60h至od
600
达3.0，即得到所需蛋白。
28.3. p72三聚体重组蛋白纯化取1l酿酒酵母培养物，6000 rpm，离心10 min，收集沉淀。沉淀用50ml buffer w（iba）重悬，然后用高压匀浆机破碎酵母细胞，17000rpm 4℃离心60分钟，取上清用0.45 μm滤膜过滤，进行纯化。应用strep
‑
tactin xt gravity
‑
flow 柱（iba）进行融合蛋白亲和纯化，主要操作步骤如下：a.用10ml buffer w（iba）平衡层析柱，取过滤后上清加到层析柱中。然后通过重力流缓慢流出，重复操作两次。
29.b.用20 ml buffer w（iba）洗涤，洗除杂蛋白。
30.c.用洗脱buffer bxt (iba) 洗脱所需目的蛋白，收集洗脱液，1ml/管。
31.d.将目的蛋白收集，并用merck
‑
millipore 30kd浓缩管浓缩蛋白。
32.e.在4℃条件下用fplc平衡分子筛（superdex s
‑
200，ge），流速为1ml/min。将蛋白分批上样至上样环，用分子筛进一步纯化p72蛋白。
33.f.收集的样品进行sds
‑
page分析，结果如图1所示，纯化后胶图中出现单一条带，大小约为73kd。将目的蛋白用merck
‑
millipore 30kd浓缩管浓缩，然后通过bca方法测蛋白浓度。
34.4. 非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体的制备 取适量1m柠檬酸缓冲液加入到p72三聚体蛋白溶液中混匀至柠檬酸终浓度分别为0.05m和0.1m，4℃反应1h。将反应后p72蛋白溶液通过分子筛(superdex s
‑
200）纯化，通过结果可得加柠檬酸至终浓度0.1m时p72三聚体解聚成单体，而在0.05m时p72三聚体解聚形式介于单体和三聚体之间，结果见图6；此外，本发明又尝试使用终浓度更高的柠檬酸酸化，结果显示p72三聚体仍能解聚成单体，但考虑到蛋白变性问题，酸的终浓度优选为0.1
‑
0.3m。
35.实施例2：制备非洲猪瘟病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸卡1、静电吸附法制备标记有金颗粒的非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体的金标结合物取40nm胶体金颗粒用0.1 mol/lnaoh溶液调节ph至7.5，加入10ug非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体，快速混匀并在3d旋转仪上室温混匀30min，然后加入终浓度1% bsa并在3d旋转混合仪上混匀30min，将金标液于4 ℃ 12000 r/min离心10 min，小心弃去上清液，沉淀物用0.01mol/l pbs缓冲液洗涤2次，再离心所得沉淀即为纯化的金标复合物，制备的胶体金标记非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体用0.01mol/l pbs重悬，4 ℃保存备用。
[0036] 2、硝酸纤维素膜检测线和质控线喷洒及胶体金结合垫制备将重组表达的非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体用0.01mol/l pbs稀释成4mg/ml，
以1ul/cm均匀划在硝酸纤维素膜的t线位置。将兔抗p72抗体用0.01mol/l pbs稀释成2mg/ml，以1ul/cm均匀划在硝酸纤维素膜的c线位置，然后放于37℃过夜烘干备用。将非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体
‑
胶体金复合物以8ul/cm均匀喷涂在标记物垫上，37℃过夜烘干备用。
[0037]
3、试纸卡的组装将样品垫、喷涂有非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72单体金标结合物的标记垫、喷涂有非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体作为检测线和喷涂有兔抗p72抗体作为质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫按顺序依次粘附在聚乙烯背衬上。其组装结构为硝酸纤维素膜置于聚乙烯背衬的上面，样品垫平贴于硝酸纤维素膜左侧，吸收垫平贴于硝酸纤维素膜右侧，胶体金结合垫平贴于样品垫与硝酸纤维素膜之间，使其一端压于样品垫之下，另一端覆于硝酸纤维素膜之上。将组装好的大板用切条机切成4mm胶体金试纸条，然后将试纸条与卡壳组装，真空封装，常温保存；示意图见图1。
[0038]
4、检测非洲猪瘟病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡的应用取100ul待测样品液滴在本发明试纸卡加样孔上，10min后观察结果，同时分别取已知阳性血清样品和阴性血清样品分别作为阳性和阴性对照。结果判定：在样品垫上加入检测样品时，若检测线和质控线均显红色，为非洲猪瘟病毒抗体阳性，即样品中含有非洲猪瘟病毒p72蛋白抗体；若检测线不显色而质控线显红色，为非洲猪瘟病毒抗体阴性，即样品中不含非洲猪瘟病毒p72蛋白抗体；若质控线不显色，则试纸无效。
[0039]
实施例3：胶体金免疫层析试纸卡特异性试验对己知的猪圆环病毒抗体阳性血清，猪蓝耳病毒抗体阳性血清，猪伪狂犬病毒抗体阳性血清及猪瘟病毒抗体阳性血清和非洲猪瘟病毒抗体阳性血清进行交叉试验，结果见图2。
[0040]
图2结果显示，只有非洲猪瘟病毒抗体阳性血清样品，检测线显色，呈阳性反应，而与其他几种血清反应时，检测线均不显色，呈阴性反应，表明所述抗原用于检测非洲猪瘟病毒抗体时具有高度的特异性。
[0041]
实施例4：胶体金免疫层析试纸卡灵敏性试验参照实施例1制备方法制备两种对照胶体金免疫层析试纸卡，蛋白抗原为p72三聚体（标记物垫） p72三聚体（t线），以及p30（标记物垫） p30三聚体（t线），其他保持和实施例1相同，p72蛋白序列全部采用seq id no.1所示，p30蛋白序列如seq id no.2所示；将已知非洲猪瘟病毒抗体阳性血清分别做1:10、1:100、1:1000、1:5000、1:10000稀释，分别用p30胶体金免疫层析试纸卡、p72三聚体双抗原夹心胶体金免疫层析试纸卡和制备的基于p72三聚体 p72单体的胶体金免疫层析试纸卡进行检测，结果见图3
‑
5，结果显示基于p72三聚体和p72单体制备的双抗原夹心胶体金免疫层析试纸卡的灵敏性可达1:10000倍，基于p30的试纸卡灵敏性仅达到1:1000， 基于p72三聚体的试纸卡灵敏性也仅达到1:5000。
[0042]
实施例5：胶体金免疫层析试纸卡重复性和准确性试验将不同批次的所述免疫层析胶体金试纸分别检测5份已验证的非洲猪瘟病毒抗体阳性血清和5份已验证的非洲猪瘟病毒抗体阴性血清，每份血清样品平行做5个重复，结果显示批内重复性和批间重复性试验的检测结果均一致且与病毒中和试验结果保持一致，表
明所述胶体金免疫层析试纸卡具有良好的重复性和准确性。
[0043]
实施例6：胶体金免疫层析试纸卡的符合性试验取同一批号免疫层析胶体金试纸卡对89份临床待测血清样本分别进行检测，观察结果并与国际通用试剂盒id vet 间接elisa试剂盒检测数据比较。id vet 间接elisa试剂盒检测数据显示89份血清样品55份阳性，34份阴性；而本发明制备的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡阳性符合数54份，阴性符合数33份，阳性符合率98%（54/55），阴性符合率97%（33/34），总符合率97.8%（87/89），结果见表1。表明所述抗原用于检测非洲猪瘟病毒抗体时具有良好的准确性。
[0044]
表1以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。