原位促内皮化涂层及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种原位促内皮化涂层的制备方法，和由所述原位促内皮化涂层的制备方法所制得的原位促内皮化涂层。


背景技术：

2.心血管疾病(cvd)每年会导致数百万人死亡，约占全球总死亡人数的三分之一。目前，可通过手术，使用移植物替代病变血管来治疗心血管疾病。然而，现有的移植物的制备方法具有操作过程复杂、条件激烈、及可重复性差的缺点。而且，通过现有的移植物的制备方法所制得的移植物的原位促内皮化涂层具有附着力差、促内皮细胞粘附和增殖性能较弱的缺点。


技术实现要素：

3.有鉴于此，有必要提供一种原位促内皮化涂层的制备方法，以解决现有的移植物的制备方法具有操作过程复杂、条件激烈、及可重复性差的问题。
4.本发明提供一种原位促内皮化涂层的制备方法，包括以下步骤：
5.提供基材、第一聚合物溶液、羧基活化剂、第二聚合物溶液、交联剂溶液、及抗体溶液，其中，所述第一聚合物溶液中的第一聚合物具有氨基，所述第二聚合物溶液中的第二聚合物具有氨基和羧基；
6.将所述基材浸入第一聚合物溶液中，得到表面氨基化的基材；
7.混合所述羧基活化剂和第二聚合物溶液，所述羧基活化剂活化第二聚合物的羧基，得到混合液；
8.将所述表面氨基化的基材浸入混合液中，所述第二聚合物的被羧基活化剂活化的羧基与基材表面的氨基发生缩合反应，从而于所述基材的表面接枝第二聚合物；
9.将所述表面接枝有第二聚合物的基材浸入交联剂溶液中，在所述交联剂溶液中的交联剂的作用下，所述第二聚合物交联，于所述基材的表面形成第二聚合物的交联物；及
10.将所述表面形成有第二聚合物的交联物的基材浸入抗体溶液中，所述抗体溶液中的抗体与第二聚合物的交联物的氨基结合，得到所述原位促内皮化涂层，其中，所述原位促内皮化涂层包括基材和形成于所述基材表面的原位促内皮化膜。
11.进一步地，所述基材为聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、聚氨酯、聚醚醚酮、聚乳酸、聚己内酯、不锈钢、钴镍合金、或钴铬合金。
12.进一步地，所述基材为不锈钢、钴镍合金、或钴铬合金时，所原位促内皮化涂层的制备方法还包括以下步骤：
13.对所述基材进行羟基化处理，得到表面羟基化的基材；及
14.将所述表面羟基化的基材浸入第一聚合物溶液中，得到所述表面氨基化的基材。
15.进一步地，所述第一聚合物为聚乙烯亚胺、3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷、3
‑
[2
‑
(2
‑
氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基
‑
三甲氧基硅烷、及乙二胺中的至少一种；和/或
[0016]
所述第一聚合物溶液的溶剂为醋酸、透明质酸、及水中的至少一种；和/或
[0017]
所述第一聚合物溶液中，所述第一聚合物的浓度为0.5～100mg/ml。
[0018]
进一步地，所述第二聚合物为胶原、胶原衍生物、明胶、明胶衍生物、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、丝胶蛋白、丝胶蛋白衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、海藻酸、海藻酸衍生物、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、透明质酸、透明质酸衍生物、硫酸软骨素、硫酸软骨素衍生物、聚赖氨酸、聚赖氨酸衍生物、及多肽中的至少一种；和/或
[0019]
所述第二聚合物溶液的溶剂为醋酸、醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、透明质酸、及水中的至少一种；和/或
[0020]
所述第二聚合物溶液中，所述第二聚合物的浓度为1～10mg/ml。
[0021]
进一步地，所述羧基活化剂为1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐、n
‑
羟基琥珀酰亚胺、及2
‑
吗啉乙磺酸中的至少一种；和/或
[0022]
所述羧基活化剂和第二聚合物的摩尔比为2～3：1。
[0023]
进一步地，所述交联剂为戊二醛、京尼平、及三聚磷酸钠中的至少一种；和/或
[0024]
所述交联剂溶液中，所述交联剂的质量百分比含量为0.1～10％；和/或
[0025]
所述交联剂溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液。
[0026]
进一步地，所述抗体为cd34抗体、cd31抗体、及血管内皮生长因子中的至少一种；和/或
[0027]
所述抗体溶液中，所述抗体的浓度为1～5μg/ml。
[0028]
进一步地，所述原位促内皮化膜的厚度不大于20μm。
[0029]
一种由所述原位促内皮化涂层的制备方法所制得的原位促内皮化涂层。
[0030]
本发明技术方案中，将所述基材浸入第一聚合物溶液中，得到表面氨基化的基材，混合所述羧基活化剂和第二聚合物溶液，所述羧基活化剂活化第二聚合物的羧基，得到混合液。将所述表面氨基化的基材浸入混合液中，所述第二聚合物的被羧基活化剂活化的羧基与基材表面的氨基发生缩合反应，从而于所述基材的表面接枝第二聚合物，且所述第二聚合物通过化学键牢固地接枝于所述基材的表面。将所述表面接枝有第二聚合物的基材浸入交联剂溶液中，在所述交联剂溶液中的交联剂的作用下，所述第二聚合物交联，于所述基材的表面形成第二聚合物的交联物，且所述第二聚合物的交联物通过化学键牢固地接枝于所述基材的表面。将所述表面形成有第二聚合物的交联物的基材浸入抗体溶液中，所述抗体溶液中的抗体与第二聚合物的交联物的氨基结合，得到所述原位促内皮化涂层。由于所述第二聚合物的交联物通过化学键牢固地接枝于所述基材的表面，与所述第二聚合物的氨基相结合的抗体也可牢固地粘附于所述基材的表面。所述抗体可参与细胞的运输和定植，使得所述原位促内皮化涂层具有良好的促内皮细胞粘附和增殖的性能。即使所述原位促内皮化涂层的因子或蛋白失活或快速释放后，仍具有促内皮细胞粘附和增殖的性能。而且，本发明的原位促内皮化涂层的制备方法具有操作简单、条件温和、及可重复性的优点。
附图说明
[0031]
图1为本发明实施例提供的原位促内皮化涂层的sem图。
[0032]
图2为本发明实施例一的原位促内皮化涂层的cd34抗体的荧光显微镜照片。
[0033]
图3为本发明对比例一的原位促内皮化涂层上的内皮细胞在增殖1天后的增殖细
胞骨架的染色荧光照片。
[0034]
图4为本发明对比例一的原位促内皮化涂层上的内皮细胞在增殖3天后的增殖细胞骨架的染色荧光照片。
[0035]
图5为本发明对比例一的原位促内皮化涂层上的内皮细胞在增殖5天后的增殖细胞骨架的染色荧光照片。
[0036]
图6为本发明实施例一的原位促内皮化涂层上的内皮细胞在增殖1天后的增殖细胞骨架的染色荧光照片。
[0037]
图7为本发明实施例一的原位促内皮化涂层上的内皮细胞在增殖3天后的增殖细胞骨架的染色荧光照片。
[0038]
图8为本发明实施例一的原位促内皮化涂层上的内皮细胞在增殖5天后的增殖细胞骨架的染色荧光照片。
具体实施方式
[0039]
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面的具体实施方式对本发明进行详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
[0040]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的所有的和任意的组合。
[0041]
在本发明的各实施例中，为了便于描述而非限制本发明，本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的术语"连接"并非限定于物理的或者机械的连接，不管是直接的还是间接的。"上"、"下"、"下方"、"左"、"右"等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也相应地改变。
[0042]
本发明实施例提供一种原位促内皮化涂层的制备方法。
[0043]
所述原位促内皮化涂层的制备方法包括以下步骤：
[0044]
步骤s1：提供基材、第一聚合物溶液、羧基活化剂、第二聚合物溶液、交联剂溶液、及抗体溶液，其中，所述第一聚合物溶液中的第一聚合物具有氨基，所述第二聚合物溶液中的第二聚合物具有氨基和羧基；
[0045]
步骤s2：将所述基材浸入第一聚合物溶液中，得到表面氨基化的基材；
[0046]
步骤s3：混合所述羧基活化剂和第二聚合物溶液，所述羧基活化剂活化第二聚合物的羧基，得到混合液；
[0047]
步骤s4：将所述表面氨基化的基材浸入混合液中，所述第二聚合物的被羧基活化剂活化的羧基与基材表面的氨基发生缩合反应，从而于所述基材的表面接枝第二聚合物；
[0048]
步骤s5：将所述表面接枝有第二聚合物的基材浸入交联剂溶液中，在所述交联剂溶液中的交联剂的作用下，所述第二聚合物交联，于所述基材的表面形成第二聚合物的交
联物；
[0049]
步骤s6：将所述表面形成有第二聚合物的交联物的基材浸入抗体溶液中，孵育过夜，所述抗体溶液中的抗体与第二聚合物的交联物的氨基结合，得到所述原位促内皮化涂层(参图1)，其中，所述原位促内皮化涂层包括基材和形成于所述基材表面的原位促内皮化膜。
[0050]
在至少一实施例中，所述基材为聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、聚氨酯、聚醚醚酮、聚乳酸、聚己内酯、不锈钢、钴镍合金、或钴铬合金。
[0051]
在至少一实施例中，所述第一聚合物为聚乙烯亚胺、3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷、3
‑
[2
‑
(2
‑
氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基
‑
三甲氧基硅烷、及乙二胺中的至少一种。
[0052]
在至少一实施例中，所述第一聚合物溶液的溶剂为醋酸、透明质酸、及水中的至少一种。
[0053]
在至少一实施例中，所述第一聚合物溶液中，所述第一聚合物的浓度为0.5～100mg/ml。例如为，0.5mg/ml、1mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、或100mg/ml。具体的，所述聚乙烯亚胺溶液中，聚乙烯亚胺的浓度为0.5～100mg/ml；所述3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷溶液中，3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷的浓度为1～100mg/ml；所述3
‑
[2
‑
(2
‑
氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基
‑
三甲氧基硅烷溶液中，3
‑
[2
‑
(2
‑
氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基
‑
三甲氧基硅烷的浓度为1～100mg/ml；所述乙二胺溶液中，乙二胺的浓度为10～80％(v/v)。
[0054]
在至少一实施例中，所述第二聚合物为胶原、胶原衍生物、明胶、明胶衍生物、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、丝胶蛋白、丝胶蛋白衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、海藻酸、海藻酸衍生物、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、透明质酸、透明质酸衍生物、硫酸软骨素、硫酸软骨素衍生物、聚赖氨酸、聚赖氨酸衍生物、及多肽中的至少一种。
[0055]
在至少一实施例中，所述第二聚合物溶液的溶剂为醋酸、ph值为2～6的醋酸缓冲液、ph值为6.5～8的磷酸盐缓冲液、透明质酸、及水中的至少一种。具体的，所述醋酸缓冲液包括浓度为0.018m的醋酸钠、浓度为0.082m的醋酸、及浓度为0.14m的氯化钠。
[0056]
在至少一实施例中，所述第二聚合物溶液中，所述第二聚合物的浓度为1～10mg/ml。例如为，1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、或10mg/ml。
[0057]
在至少一实施例中，所述羧基活化剂为1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐、n
‑
羟基琥珀酰亚胺、及2
‑
吗啉乙磺酸中的至少一种。
[0058]
在至少一实施例中，所述羧基活化剂和第二聚合物的摩尔比为2～3：1。例如为2：1或3：1。
[0059]
在至少一实施例中，所述交联剂为戊二醛、京尼平、及三聚磷酸钠中的至少一种。
[0060]
在至少一实施例中，所述交联剂溶液中，所述交联剂的质量百分比含量为0.1～10％。具体的，所述戊二醛的质量百分比含量为0.1～2.5％；所述京尼平的质量百分比含量为0.1～10wt％；所述三聚磷酸钠的质量百分比含量为0.1～10％。
[0061]
在至少一实施例中，所述交联剂溶液的溶剂为ph值为6.5～8的磷酸盐缓冲液。
[0062]
在至少一实施例中，所述抗体为cd34抗体、cd31抗体、及血管内皮生长因子中的至少一种。
[0063]
在至少一实施例中，所述抗体溶液中，所述抗体的浓度为1～50μg/ml。例如为，1μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、25μg/ml、或50μg/ml。
[0064]
在至少一实施例中，所述混合液中，所述羧基活化剂和第二聚合物的反应产物的浓度为1～4mg/ml。例如为，1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、或4mg/ml。
[0065]
在至少一实施例中，将所述基材浸入温度为25～45℃的第一聚合物溶液中1～24h，得到表面氨基化的基材。
[0066]
在至少一实施例中，混合所述羧基活化剂和第二聚合物溶液5min～6h，得到混合液。
[0067]
在至少一实施例中，将所述表面接枝有第二聚合物的基材浸入交联剂溶液中0.5～6h，在所述交联剂溶液中的交联剂的作用下，所述第二聚合物交联，于所述基材的表面形成第二聚合物的交联物。
[0068]
在至少一实施例中，所述原位促内皮化膜的厚度不大于20μm。例如为，1μm、5μm、10μm、15μm、或20μm。
[0069]
本发明技术方案中，将所述基材浸入第一聚合物溶液中，得到表面氨基化的基材，混合所述羧基活化剂和第二聚合物溶液，所述羧基活化剂活化第二聚合物的羧基，得到混合液。将所述表面氨基化的基材浸入混合液中，所述第二聚合物的被羧基活化剂活化的羧基与基材表面的氨基发生缩合反应，从而于所述基材的表面接枝第二聚合物，且所述第二聚合物通过化学键牢固地接枝于所述基材的表面。将所述表面接枝有第二聚合物的基材浸入交联剂溶液中，在所述交联剂溶液中的交联剂的作用下，所述第二聚合物交联，于所述基材的表面形成第二聚合物的交联物，且所述第二聚合物的交联物通过化学键牢固地接枝于所述基材的表面。将所述表面形成有第二聚合物的交联物的基材浸入抗体溶液中，所述抗体溶液中的抗体与第二聚合物的交联物的氨基结合，得到所述原位促内皮化涂层。由于所述第二聚合物的交联物通过化学键牢固地接枝于所述基材的表面，与所述第二聚合物的氨基相结合的抗体也可牢固地粘附于所述基材的表面。所述抗体可参与细胞的运输和定植，使得所述原位促内皮化涂层具有良好的促内皮细胞粘附和增殖的性能。即使所述原位促内皮化涂层的因子或蛋白失活或快速释放后，仍具有促内皮细胞粘附和增殖的性能。进一步地，所述第一聚合物和第二聚合物具有良好的生物相容性和降解性，使得所述原位促内皮化涂层还具有生物相容性和降解性佳的优点。而且，本发明的原位促内皮化涂层的制备方法具有操作简单、条件温和、及可重复性的优点。
[0070]
所述基材为不锈钢、钴镍合金、或钴铬合金时，所原位促内皮化涂层的制备方法还包括以下步骤：
[0071]
对所述基材进行羟基化处理，得到表面羟基化的基材；及
[0072]
将所述表面羟基化的基材浸入第一聚合物溶液中，得到所述表面氨基化的基材。
[0073]
在至少一实施例中，可将所述基材进入氢氟酸和双氧水的混合溶液中，以使所述基材的表面羟基化。
[0074]
本发明技术方案中，当所述基材为不锈钢、钴镍合金、或钴铬合金时，可先对所述基材羟基化，以便于对所述基材进行氨基化处理。
[0075]
所述步骤s2之后，所述步骤s3之前，所述原位促内皮化涂层的制备方法包括以下步骤：
[0076]
采用超纯水或ph值为6.5～8的磷酸盐缓冲液清洗所述表面氨基化的基材至少一次；及
[0077]
氮气吹干所述表面氨基化的基材。
[0078]
在至少一实施例中，可采用超纯水或ph值为6.5～8的磷酸盐缓冲液清洗所述表面氨基化的基材3次，每次3min。
[0079]
本发明技术方案中，可采用超纯水或者磷酸盐缓冲液清洗所述表面氨基化的基材，再采用氮气吹干所述表面氨基化的基材，以获得清洁的表面氨基化的基材。
[0080]
所述步骤s5之后，所述步骤s6之前，所述原位促内皮化涂层的制备方法包括以下步骤：
[0081]
采用超纯水清洗所述表面形成有第二聚合物的交联物的基材；及
[0082]
冷冻干燥所述表面形成有第二聚合物的交联物的基材10～24h。
[0083]
本发明技术方案中，可采用超纯水清洗所述表面形成有第二聚合物的交联物的基材，再冷冻干燥所述表面形成有第二聚合物的交联物的基材，以获得清洁的表面形成有第二聚合物的交联物的基材。
[0084]
所述原位促内皮化涂层的制备方法还包括以下步骤：
[0085]
采用ph值为6.5～8的磷酸盐缓冲液清洗所述表面形成有原位促内皮化涂膜的基材至少一次；及
[0086]
冷冻干燥所述表面形成有原位促内皮化涂膜的基材10～24h。
[0087]
在至少一实施例中，可采用ph值为6.5～8的磷酸盐缓冲液清洗所述表面形成有原位促内皮化涂膜的基材3次，每次3min。
[0088]
本发明技术方案中，可采用ph值为6.5～8的磷酸盐缓冲液清洗所述表面形成有原位促内皮化涂膜的基材至少一次，再冷冻干燥所述表面形成有原位促内皮化涂膜的基材，以获得清洁的原位促内皮化涂层。
[0089]
本发明实施例还提供一种由上述原位促内皮化涂层的制备方法所制得的原位促内皮化涂层。
[0090]
由于该原位促内皮化涂层采用了上述所有实施例的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
[0091]
下面通过具体的实施例来对本发明进行具体说明。
[0092]
实施例一
[0093]
提供表面羟基化的316l不锈钢、聚乙烯亚胺溶液、磷酸盐缓冲液、胶原溶液、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐、交联剂溶液、及cd34抗体溶液，其中，所述聚乙烯亚胺溶液中的聚乙烯亚胺的浓度为3mg/ml，分子量为25000，所述胶原溶液的溶剂为醋酸水溶液，所述醋酸水溶液中的醋酸的浓度为0.5m，所述胶原溶液中的胶原的浓度为1mg/ml，所述交联剂溶液含有ph值为7.4的磷酸盐缓冲液和质量百分比含量为0.25％的戊二醛，所述cd34抗体溶液含有ph值为7.4的磷酸盐缓冲液和浓度为2μg/ml的cd34抗体；
[0094]
将表面羟基化的316l不锈钢浸入聚乙烯亚胺溶液中1h，得到表面氨基化的316l不锈钢，采用磷酸盐缓冲液清洗所述表面氨基化的316l不锈钢3次，每次3min，再氮气吹干所述表面氨基化的316l不锈钢，其中，所述表面氨基化的316l不锈钢带正电；
[0095]
混合所述胶原溶液和1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐，反应1h，所述1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐活化胶原的羧基，得到最终浓度为3mg/ml的混合液；
[0096]
将所述表面氨基化的316l不锈钢浸入混合液中3h后，所述胶原的被活化的羧基与表面氨基化的316l不锈钢表面的氨基发生缩合反应，从而于所述表面氨基化的316l不锈钢的表面接枝胶原，采用超纯水清洗所述表面接枝有胶原的316l不锈钢，氮气吹干所述表面接枝有胶原的316l不锈钢；
[0097]
将所述表面接枝有胶原的316l不锈钢浸入交联剂溶液中2h，所述胶原交联，于所述316l不锈钢的表面形成胶原交联物，采用大量的超纯水清洗所述表面形成有胶原交联物的316l不锈钢，再冷冻干燥所述表面形成有胶原交联物的316l不锈钢24h；及
[0098]
将所述表面形成有胶原交联物的316l不锈钢浸入cd34抗体溶液中，孵育过夜，然后用磷酸盐缓冲液进行清洗，真空干燥后，得到实施例一的原位促内皮化涂层。
[0099]
请参阅图2，所述实施例一的原位促内皮化涂层的基材表面具有cd34抗体。
[0100]
实施例二
[0101]
提供表面羟基化的316l不锈钢、聚乙烯亚胺溶液、磷酸盐缓冲液、壳聚糖溶液、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐、交联剂溶液、及cd34抗体溶液，其中，所述聚乙烯亚胺溶液中的聚乙烯亚胺的浓度为3mg/ml，分子量为25000，所述壳聚糖溶液的溶剂为2
‑
(n
‑
吗啡啉)乙磺酸醋酸溶液，所述2
‑
(n
‑
吗啡啉)乙磺酸醋酸溶液中的2
‑
(n
‑
吗啡啉)乙磺酸的浓度为0.1m，所述壳聚糖溶液中的壳聚糖的浓度为3mg/ml，所述交联剂溶液含有ph值为7.4的磷酸盐缓冲液和质量百分比含量为0.3％的戊二醛，所述cd34抗体溶液含有ph值为7.4的磷酸盐缓冲液和浓度为2μg/ml的cd34抗体；
[0102]
将表面羟基化的316l不锈钢浸入聚乙烯亚胺溶液中1h，得到表面氨基化的316l不锈钢，采用磷酸盐缓冲液清洗所述表面氨基化的316l不锈钢3次，每次3min，再氮气吹干所述表面氨基化的316l不锈钢，其中，所述表面氨基化的316l不锈钢带正电；
[0103]
混合所述壳聚糖溶液和1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐，反应30min，所述1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐活化壳聚糖的羧基，得到最终浓度为3mg/ml的混合液；
[0104]
将所述表面氨基化的316l不锈钢浸入混合液中3h后，所述壳聚糖的被活化的羧基与表面氨基化的316l不锈钢表面的氨基发生缩合反应，从而于所述表面氨基化的316l不锈钢的表面接枝壳聚糖，采用超纯水清洗所述表面接枝有壳聚糖的316l不锈钢，氮气吹干所述表面接枝有壳聚糖的316l不锈钢；
[0105]
将所述表面接枝有壳聚糖的316l不锈钢浸入交联剂溶液中1.5h，所述壳聚糖交联，于所述316l不锈钢的表面形成壳聚糖交联物，采用大量的超纯水清洗所述表面形成有壳聚糖交联物的316l不锈钢，再冷冻干燥所述表面形成有壳聚糖交联物的316l不锈钢24h；及
[0106]
将所述表面形成有壳聚糖交联物的316l不锈钢浸入cd34抗体溶液中，孵育过夜，然后用磷酸盐缓冲液进行清洗，真空干燥后，得到实施例二的原位促内皮化涂层。
[0107]
实施例三
[0108]
提供聚乳酸无纺布、3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷溶液、超纯水、磷酸盐缓冲液、丝胶蛋白溶液、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐、交联剂溶液、及cd34抗体溶液，其中，所述3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷溶液中的3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷的浓度为2mg/ml，所述3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷溶液中的溶剂为无水酒精，所述丝胶蛋白溶液的溶剂为ph值为8的磷
酸盐缓冲液，所述丝胶蛋白溶液中的丝胶蛋白的浓度为5mg/ml，所述交联剂溶液含有ph值为7.4的磷酸盐缓冲液和质量百分比含量为0.25％的戊二醛，所述cd34抗体溶液含有ph值为7.4的磷酸盐缓冲液和浓度为2μg/ml的cd34抗体；
[0109]
将所述聚乳酸无纺布浸入温度为37℃的3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷溶液中4h，得到表面氨基化的聚乳酸无纺布，采用超纯水清洗所述表面氨基化的聚乳酸无纺布，再氮气吹干所述表面氨基化的聚乳酸无纺布；
[0110]
混合所述丝胶蛋白溶液和1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐，反应30min，所述1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐活化丝胶蛋白的羧基，得到最终浓度为3mg/ml的混合液；
[0111]
将所述表面氨基化的聚乳酸无纺布浸入混合液中3h后，所述丝胶蛋白的被活化的羧基与表面氨基化的聚乳酸无纺布表面的氨基发生缩合反应，从而于所述表面氨基化的聚乳酸无纺布的表面接枝丝胶蛋白，采用超纯水清洗所述表面接枝有丝胶蛋白的聚乳酸无纺布，氮气吹干所述表面接枝有丝胶蛋白的聚乳酸无纺布；
[0112]
将所述表面接枝有丝胶蛋白的聚乳酸无纺布浸入交联剂溶液中2h，所述丝胶蛋白交联，于所述聚乳酸无纺布表面形成丝胶蛋白交联物，采用大量的超纯水清洗所述表面形成有丝胶蛋白交联物的聚乳酸无纺布，再冷冻干燥所述表面形成有丝胶蛋白交联物的聚乳酸无纺布24h；及
[0113]
将所述表面形成有丝胶蛋白交联物的聚乳酸无纺布浸入cd34抗体溶液中，孵育过夜，然后用磷酸盐缓冲液进行清洗，真空干燥后，得到实施例一的原位促内皮化涂层。
[0114]
实施例四
[0115]
提供表面羟基化的镍钛合金、乙二胺溶液、超纯水、海藻酸钠溶液、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐、京尼平溶液、及血管内皮生长因子溶液，其中，所述乙二胺溶液中的乙二胺的浓度为50％(v/v)，所述海藻酸钠溶液的溶剂为ph值为7.4的磷酸盐缓冲液，所述海藻酸钠溶液中的海藻酸钠的浓度为3mg/ml，所述京尼平溶液含有ph值为7.4的磷酸盐缓冲液和质量百分比含量为1％的京尼平，所述血管内皮生长因子溶液含有ph值为7.4的磷酸盐缓冲液和浓度为1μg/ml的血管内皮生长因子；
[0116]
于40℃的温度下，将表面羟基化的镍钛合金浸入乙二胺溶液中24h，得到表面氨基化的镍钛合金，采用超纯水清洗所述表面氨基化的镍钛合金，再氮气吹干所述表面氨基化的镍钛合金；
[0117]
混合所述海藻酸钠溶液和1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐，反应1.5h，所述1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐活化海藻酸的羧基，得到最终浓度为3mg/ml的混合液；
[0118]
将所述表面氨基化的镍钛合金浸入混合液中5h后，所述海藻酸的被活化的羧基与表面氨基化的镍钛合金表面的氨基发生缩合反应，从而于所述表面氨基化的镍钛合金的表面接枝海藻酸，采用超纯水清洗所述表面接枝有海藻酸的镍钛合金，氮气吹干所述表面接枝有海藻酸的镍钛合金；
[0119]
将所述表面接枝有海藻酸的镍钛合金浸入京尼平溶液中3h，所述海藻酸交联，于所述镍钛合金的表面形成海藻酸交联物，采用大量的超纯水清洗所述表面形成有海藻酸交联物的镍钛合金，再冷冻干燥所述表面形成有海藻酸交联物的镍钛合金24h；及
[0120]
将所述表面形成有海藻酸交联物的镍钛合金浸入血管内皮生长因子溶液中，孵育过夜，然后用磷酸盐缓冲液进行清洗，真空干燥后，得到实施例一的原位促内皮化涂层。
[0121]
对比例一
[0122]
于316l不锈钢作为对比例一的原位促内皮化涂层。
[0123]
请参阅图3至图8，本发明实施例一的原位促内皮化涂层上的内皮细胞的增殖速度远大于对比例一的原位促内皮化涂层上的内皮细胞的增殖速度。
[0124]
以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照以上较佳实施方式对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换都不应脱离本发明技术方案的精神和范围。