一种检测S100B蛋白的时间分辨免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法和应用与流程

一种检测s100b蛋白的时间分辨免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测s100b蛋白的时间分辨免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.中枢神经特异性蛋白（s100b）由于能够在饱和的硫酸铵溶液内进行100%溶解而得名，目前，已发现的该家族成员有20个，大部分以同源二聚体的形式存在。s100b是一种分子量为21kd的酸性钙结合蛋白，在结构上s100b含有2个ef手性钙结合区域以及辅助的zn
2
结合位点，通过zn
2
于结合位点内组氨酸残基的结合来改变s100b的结构，缩短钙结合位点之间的距离，来发挥作为钙传感器蛋白的作用。s100b在生物体内主要作为细胞内钙受体蛋白发挥作用，在其生理浓度的范围之内作为细胞因子对机体神经具有营养功能，能够有效促进神经的发育及再生。神经胶质细胞可以旁分泌和自分泌s100b，以促进神经的生长和修复，但是高浓度的s100b具有神经毒性，在体外通过no依赖途径诱导神经元死亡。其中心肌病、炎性反应、肿瘤及神经系统类疾病是与s100b蛋白表达水平相关的4种疾病类型，s100b在血清中含量的变化与血脑屏障、脑损伤等神经损伤及病变有着重要的联系，在临床上通常作为神经性疾病诊断和治疗的重要指标之一。
3.目前，主要从血清、羊水、脑脊液及尿液等体液中进行s100b蛋白的检测，当机体出现脑损伤的情况后，虽然s100b蛋白含量在脑脊液中升高的情况较血清中更为明显，但临床诊断中仍以进行血清样本的检测为主，原因是其诊断的敏感性相对较高，且操作方便。对s100b检测目前主要采用免疫法，分别为荧光免疫测定法、免疫放射测定法、酶联免疫吸附试验及放射免疫分析法等方法。在这些方法中，荧光免疫测定法的价格相对较高，难以推广，免疫放射测定法及放射免疫分析法均具有一定的放射性，且试剂盒稳定期及核素半衰期相对较短，在应用过程中因操作复杂受到了限制。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测s100b蛋白的时间分辨免疫层析试纸条，利用镧元素的时间分辨荧光微球标记抗体，结合免疫层析技术，采用双抗体夹心法，可检测出样本中s100b蛋白的浓度。
5.为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种检测s100b蛋白的时间分辨免疫层析试纸条，包括底衬和依次设在所述底衬上的样品垫、包被膜、吸水纸，所述样品垫上包被有荧光微球标记的s100b多克隆检测抗体和荧光微球标记的兔igg，所述包被膜包括平行设置的检测区和对照区，所述检测区域所述对照区之间设置后间隔区，所述检测区包被有识别单一抗原表位的s100b单克隆捕获抗体，所述对照区包被有山羊抗兔igg抗体；所述包被膜为结合有透光聚合物的硝酸纤维素膜，所述聚合物为在小于450nm波长具有10%以下透光率，在500nm波长以上具有87%以上的透光率
的材料。
6.作为进一步优选的方案，本发明所述的s100b单克隆捕获抗体和山羊抗兔igg抗体的浓度分别为1～2.0mg/ml和0.3～0.5mg/ml，在所述包被膜上的包被量喷速均为0.7～1.0μl/cm。
7.作为进一步优选的方案，本发明所述的所述样品垫为玻璃纤维素膜。
8.作为进一步优选的方案，本发明所述的荧光微球为eu
3
镧系元素荧光微球，荧光微球的直径为290nm
‑
350nm。
9.作为进一步优选的方案，本发明所述的检测区靠近所述吸水纸，所述对照区靠近所述样品垫，所述间隔区的宽度为0.3
‑
0.5cm。
10.作为进一步优选的方案，本发明所述的聚合物为聚苯乙烯丙烯腈、聚丙烯酸酯、聚丁酸酯、聚碳酸酯、乙二醇改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯中的一种或者两种以上。
11.本发明还提供了一种时间分辨免疫层析试纸条的制备方法，该制备方法包括包被膜处理步骤：在包被膜上分别固定识别单一抗原表位的s100b单克隆捕获抗体和山羊抗兔igg抗体，形成检测区和对照区；样品垫处理步骤：制备荧光微球标记的s100b多克隆检测抗体和荧光微球标记的兔igg，并喷涂在样品垫上；组装步骤：在底衬上依次搭接粘贴样品垫、包被膜以及吸水纸。
12.作为进一步优选的方案，本发明所述的样品垫处理步骤中，制备荧光微球标记的s100b多克隆检测抗体的方法如下：（1）将s100b多克隆检测抗体透析过夜，再将透析后的s100b多克隆检测抗体调整至浓度为2～4mg/ml；（2）采用活化缓冲液洗涤微球，加入碳二亚胺和n
‑
羟基琥珀酰亚胺，室温反应后，充分洗涤微球后得到荧光微球，再用活化缓冲液复溶荧光微球；（3）在复溶后的荧光微球中加入s100b多克隆检测抗体，室温反应，加入硼酸缓冲液反应后洗涤，再用tris缓冲液复溶至原体积，使用定量喷膜仪以喷涂于玻璃纤维素膜上，避光，烘干后即得。
13.进一步的，本发明还提供了一种检测s100b的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括塑料卡壳，还包括设置在所述塑料卡壳内的缓冲液袋和本发明所述的时间分辨免疫层析试纸条。
14.作为进一步优选的方案，本发明所述的缓冲液中含有na2hpo4、nah2po4·
2h2o、nacl、酪蛋白、brij
‑
35、proclin300以及还原剂。
15.相比现有技术，本发明的有益效果在于：1．本发明所述的试纸条，采用特殊的透光聚合物材料作为包被膜，既可以达到化学发光法的定量分析，又能达到金标法的快速检测，且保证了试验结果的准确可靠。
16.2．本发明的试纸条将时间分辨荧光免疫层析技术引入s100b的定量检测中，结合时间分辨荧光检测仪，可实现s100b的单人份定量检测，且灵敏度高，批内、批间差异小，为临床使用提供了极大便利。
17.3．本发明所述的试纸条用样品垫代替现有时间分辨荧光免疫层析试纸中所采用的结合垫，把荧光微球标记的s100b多克隆检测抗体和荧光微球标记的兔igg一并喷涂在样
品垫上，使样本与标记抗体的接触面更大，反应时间相对较长，反应会更充分，不仅能提高灵敏度，还减少了制备结合垫的工序，使整个制备工艺更为简便，从而降低了试纸条的成本。
18.4．本发明的试纸条的制备方法简单，可以快速定量检测，试验结果准确可靠，灵敏度高，制备方法简单，适合大规模生产，对于s100b的定量检测有着积极的意义。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1
‑
图12为本发明实施例12组实验的结果线性图；图13为ab3作为s100b单克隆捕获抗体和ab2作为s100b多克隆标记抗体的效果线性图；图14为本发明所述的检测s100b的时间分辨免疫层析试剂盒线性测定结果；图15为本发明所述的检测s100b的时间分辨免疫层析试剂盒与罗氏试剂盒的相关性检测结果；图16为本发明所述的检测s100b的荧光免疫层析试纸条检测样品的效果线形图。
具体实施方式
21.在本发明中，除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
“……
一种或多种”是指从所列组合中选取其中的一种或多种，并不是对数量的限制。
22.除非另有说明，本发明实施方案中所技术均属于采用本领域技术内现有的医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学等技术。
23.本发明所述的检测s100b蛋白的时间分辨免疫层析试纸条，包括底衬和依次设在所述底衬上的样品垫、包被膜、吸水纸，所述样品垫上包被有荧光微球标记的s100b多克隆检测抗体和荧光微球标记的兔igg，所述包被膜包括平行设置的检测区和对照区，所述检测区域所述对照区之间设置后间隔区，所述检测区包被有识别单一抗原表位的s100b单克隆捕获抗体，所述对照区包被有山羊抗兔igg抗体；所述包被膜为结合有透明聚合物的硝酸纤维素膜，采用该聚合物为透光聚合，可以实现化学发光法的定量分析，达到金标法的快速检测，同时保证检测结果的准确性。具体的，为了保证能够捕捉多层多孔膜表面和内部的荧光信号，并有效分离的目标，增强信嗓比的目的，所述聚合物为在小于450nm波长具有10%以下透光率，在500nm波长以上具有87%以上的透光率的材料。作为进一步优选的方案，本发明所述采用的透明聚合物优选为但不限于聚苯乙烯丙烯腈、聚丙烯酸酯、聚丁酸酯、聚碳酸酯、乙二醇改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯中的一种或者两种以上。
24.本发明所述的试纸条的工作原理如下：利用镧元素的时间分辨荧光微球标记抗体，结合免疫层析技术，采用双抗体夹心法原理进行检测。层析过程中，样本中s100b与荧光标记的兔抗人s100b单克隆抗体反应形成复合物，在层析作用下沿着硝酸纤维膜向前移动至检测区域，被硝酸纤维膜上包被的另一个兔抗人s100b单克隆抗体捕获并形成复合物沉积在t区，在激发光源的作用下，荧光物质发射特定波长的荧光信号，经干式荧光免疫分析仪俘获荧光信号，通过信号转化及定标曲线自动转化为定量数值，可检测出样本中s100b的浓度，实现s100b的单人份定量检测。
25.本发明中，所述s100b多克隆检测抗体和s100b单克隆捕获抗体选自ab1、ab2、ab3、ab4抗原蛋白中的一种，其中ab2的序列为seq id no:1，ab3的序列为seq id no:2，ab1为南京金斯瑞生物科技股份有限公司生产的货号为v01003的抗体，ab4为南京金斯瑞生物科技股份有限公司生产的货号为v01001的抗体；s100b多克隆检测抗体与s100b单克隆捕获抗体为不同抗原蛋白。优选的所述s100b多克隆检测抗体为seq id no:3序列，所述s100b单克隆捕获抗体为seq id no:2序列。
26.由于抗体浓度对试纸条的性能存在的影响，如果抗体浓度过低会影响信号值过低。作为进一步优选的方案，本发明所述的s100b单克隆捕获抗体和山羊抗兔igg抗体的浓度分别为1～2.0mg/ml和0.3～0.5mg/ml，在所述包被膜上的包被量均为0.7～1.0μl/cm。
27.在本发明中，用样品垫代替现有时间分辨荧光免疫层析试纸中所采用的结合垫，把荧光微球标记的s100b多克隆检测抗体和荧光微球标记的兔igg一并喷涂在样品垫上，使样本与标记抗体的接触面更大，反应时间相对较长，反应会更充分。优选的，所述的所述样品垫为玻璃纤维素膜。
28.镧系元素被用于时间分辨荧光检测，其中常用的有eu、tb和sm，而eu（铕元素）是在标记抗原抗体中应用最广的元素，镧系元素具有较宽的激发光谱带和较窄的发射光谱带，荧光持续时间长，且荧光光谱的stocks位移较大，利用光谱分辨技术和时间分辨技术可有效排除激发光和非特异性荧光的干扰。本发明所述的荧光微球优选但不限于采用eu
3
镧系元素荧光微球。荧光微球颗粒直径会影响检测信号值，直径太小，检测信号值太低；优选的，本发明所述的荧光微球的直径为290nm
‑
350nm。
29.作为进一步优选的方案，本发明所述的检测区靠近所述吸水纸，所述对照区靠近所述样品垫，所述间隔区的宽度为0.3
‑
0.5cm。
30.本发明还提供了一种时间分辨免疫层析试纸条的制备方法，该制备方法包括包被膜处理步骤：在包被膜上分别固定识别单一抗原表位的s100b单克隆捕获抗体和山羊抗兔igg抗体，形成检测区和对照区；样品垫处理步骤：制备荧光微球标记的s100b多克隆检测抗体和荧光微球标记的兔igg，并喷涂在样品垫上；组装步骤：在底衬上依次搭接粘贴样品垫、包被膜以及吸水纸。
31.作为进一步优选的方案，本发明所述的样品垫处理步骤中，制备荧光微球标记的s100b多克隆检测抗体的方法如下：（1）将s100b多克隆检测抗体透析过夜，再将透析后的s100b多克隆检测抗体调整至浓度为2～4mg/ml；（2）采用活化缓冲液洗涤微球，加入碳二亚胺和n
‑
羟基琥珀酰亚胺，室温反应后，
充分洗涤微球后得到荧光微球，再用活化缓冲液复溶荧光微球；（3）在复溶后的荧光微球中加入s100b多克隆检测抗体，室温反应，加入硼酸缓冲液反应后洗涤，再用tris缓冲液复溶至原体积，使用定量喷膜仪以喷涂于玻璃纤维素膜上，避光，烘干后即得。
32.在上述方法中，步骤（1）具体是在2～8℃下，采用50mm、ph6.0的mes溶液将s100b多克隆检测抗体透析过夜。步骤（2）中所述的活化缓冲液为50mm、ph6.0的mes、0.05% trition x100溶液。步骤（3）中，所述硼酸缓冲液含有5%bsa的0.02mol/l，其ph为8.0；所述tris缓冲液含有0.5%bsa、浓度为0.02mol/l的0.5%tween
‑
20，其ph8.0；使用定量喷膜仪喷涂的包被量喷速为4ul/cm，烘干的温度为50℃。在喷涂过程中，平衡喷涂三次（不重叠），这样操作的目的在于让样本与标记抗体的接触面更大，反应时间相对较长，反应会更充分，能提高灵敏度。
33.进一步的，本发明还提供了一种检测s100b的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括塑料卡壳，还包括设置在所述塑料卡壳内的和缓冲液袋和本发明所述的时间分辨免疫层析试纸条。
34.作为进一步优选的方案，本发明所述的缓冲液中含有na2hpo4、nah2po4·
2h2o、nacl、酪蛋白、brij
‑
35、proclin300以及还原剂。具体的，缓冲液含有80.94mmna2hpo4、16.63mmnah2po4·
2h2o、0.9%nacl 、0.2%酪蛋白、0.5%brij
‑
35、0.1%proclin300 、0.125%谷胱甘肽、ph 7.4。
35.以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中，如无特殊说明，所采用的试剂、实验方法均为本领域的现有技术。
36.实施例1：s100b抗体的筛选在该实施例中，利用常规的血清实验在抗原序列为seq id no:1
‑ꢀ
seqidno:4（对应编号为ab1抗体、ab2抗体、ab3抗体、ab4抗体）的s100b不同抗体选择单克隆捕获抗体和多克隆标记抗体进行配对实验，如下表1。在实验中，设置有12组配对实验，每组均进行10个s100b阴阳性血清样本的实验，12组配对实验的组成如下表2，配对结果参见图1
‑
12。
37.表1：抗体配对实验表其中ab2的序列为seq id no:1，ab3的序列为seq id no:2，ab1为南京金斯瑞生物科技股份有限公司生产的货号为v01003的抗体，ab4为南京金斯瑞生物科技股份有限公司生产的货号为v01001的抗体。
38.seq id no:1：mselekamvalidvfhqysgregdkhklkkselkelin nelshfleeikeqevvdkvmetseq id no:3：ldndgdgecdfqefmafvamvttacheffehe
表2：s100b抗体配对实验
通过上述实验结果及图1
‑
图12的结果可知，采用配对5：ab3作为s100b单克隆捕获抗体、ab2作为s100b多克隆标记抗体时，效果最好。
39.为了进一步验证ab3作为s100b单克隆捕获抗体和ab2作为s100b多克隆标记抗体的效果，进行了对50个样本进行实验，实验结果参见表3和图13。
40.表3：证实验结果
实施例2一种检测s100b的时间分辨免疫层析试纸条，包括底衬、以及依次设在所述底衬上的样品垫、包被膜和吸水纸，所述样品垫上包被有荧光微球标记的s100b多克隆标记抗体（seq id no:1，来源自raybiotech，cat#144
‑
00676）和荧光微球标记的兔igg（杭州博茵生物技术有限公司，货号:n160701），所述包被膜包括平行设置、且相互间隔0.5cm的检测区和对照区，所述检测区靠近所述吸水纸，所述对照区靠近所述样品垫，所述检测区包被有识别单一抗原表位的s100b多克隆捕获抗体（seq id no:2，来源于瑞博奥（广州）生物科技股份有限公司），所述对照区包被有山羊抗兔igg抗体（杭州博茵生物技术有限公司，货号：p200301）。
41.本实施例中，所述包被膜为化学交联聚苯乙烯丙烯腈的硝酸纤维素膜，所述聚苯乙烯丙烯腈在小于450nm波长具有10%以下透光率，在500nm波长以上具有87%以上的透光率。这种材料可以允许绝大多数的可见光透过，光检测器能够捕捉多层多孔膜表面和内部的荧光信号，使检测结果更准确。
42.本实施例中，所述样品垫为玻璃纤维素膜，其能够载有足量的荧光微球，且遇样本后又能迅速释放微球。
43.本实施例中，所述荧光微球选用本领域公知的用于标记抗体的eu
3
镧系元素荧光微球，微球表面带有羧基活性基团，可以连接蛋白、糖类等生物物质，内含荧光素。所述荧光微球的直径为290～350nm。
44.本实施例的检测s100b的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：（1）、在包被膜上分别固定识别单一抗原表位的s100b单克隆捕获抗体和山羊抗兔igg抗体，形成检测区和对照区；具体方法为：使用含有5%蔗糖的0.02mol/l的ph为7.2
‑
7.6的磷酸盐缓冲液，分别将识别单一抗原表位的s100b单克隆捕获抗体稀释到1.5mg/ml的浓度和山羊抗兔igg抗体稀释到0.3mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以喷速1ul/cm将二者以0.5cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上，50℃烘干48h，加入干燥剂封存备用；（2）、制备荧光微球标记的s100b单克隆标记抗体和荧光微球标记的兔igg，并喷涂在样品垫上；具体方法为：（a）、在2～8℃下，采用50mm的ph6.0的mes溶液将s100b多克隆标记抗体透析过夜，再将透析后的s100b多克隆标记抗体调整至浓度为2～4mg/ml；（b）、使用50mm的ph6.0的mes、0.05% trition x100活化缓冲液洗涤微球，加入碳二亚胺和n
‑
羟基琥珀酰亚胺，使微球终浓度为0.2mol/l，室温反应15
‑
30分钟，充分洗涤微球，再用50mm的ph6.0的mes、0.05% trition x100活化缓冲液复溶荧光微球；（c）、按s100b多克隆标记抗体与荧光微球的质量比为1:0.1～0.2的比例，在复溶后的荧光微球中加入s100b多克隆标记抗体，室温反应2小时，加入含有5%bsa的0.02mol/l的ph8.0的硼酸缓冲液，室温反应30分钟，洗涤，再用含有0.5%bsa，0.5%tween
‑
20的0.02mol/l的ph8.0的tris缓冲液复溶至原体积，使用定量喷膜仪以喷速4ul/cm喷涂于玻璃纤维膜上，避光，50℃烘干24小时即得，加入干燥剂封存备用；（3）、在底衬上搭接粘贴样品垫、包被膜和吸水纸，切割成宽度为0.40cm大小，即得。
45.实施例3
一种检测s100b的时间分辨免疫层析试剂盒，本实施例的检测s100b的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括：实施例2所述的试纸条、塑料卡壳、缓冲液袋；所述试纸条装于所述塑料卡壳内，所述缓冲液袋位于所述塑料卡壳的边角处，靠近所述试纸条的样品垫，所述缓冲液袋的表面留置圆孔用于针刺。
46.由于s100b蛋白以100%中性饱和硫酸铵溶液中溶解而得名，其n端和c端含在大量疏水基因，因此在体外实验中通过改良其环境中的疏水性能，筛选更易与抗体结合的样本缓冲液。
47.本实施例中对三种不同组成的缓冲液进行了实验，缓冲液的组成参见表4。
48.表4：缓冲液组成表5是不同缓冲液的效果对比，实验证明缓冲液2中的血液样品与缓冲液的混合液的爬行速度更均匀，荧光微球标记抗体释放最干净，重复性cv最小，而采用吐温20的缓冲液的样本爬行速度不均匀，荧光微球标记抗体释放不干净，重复性cv较大。
49.表5：缓冲液对比数据本发明的检测s100b的时间分辨荧光免疫层析试剂盒在使用时，将待测血液样品加到加样孔后，通过针刺缓冲袋，样本缓冲液与血液样本混合浸入到样品垫上，当样品垫上的样本达到饱和状态后，通过毛细管作用将样本输送到样品垫上含有荧光微球标记抗体的
一端。当血液样本中含有s100b时，s100b与荧光微球上的抗体形成抗原
‑
抗体复合物，随着层析作用，复合物向前移动，先到达对照区c时，山羊抗兔igg抗体与荧光微球标记的兔igg结合，在c线处出现稀土离子微球的聚集，形成抗体
‑
抗体复合物。未结合的复合物继续向前移动，到达包被识别单一抗原表位的s100b单克隆捕获抗体的检测区t处，形成抗体
‑
抗原
‑
抗体夹心复合物，聚集在检测区t处。残余的荧光微球标记抗体继续前行到达吸水纸，整个反应在15分钟内完成，并进行上机读卡。在激发光源下产生的荧光强度与试纸条上的结合物含量成正比，当光源照射到试纸条的检测区和对照区时，激发附着的荧光物质，发射光收集并转化为电信号，电信号的强弱和荧光分子数量相关，检测仪计算样品中待测物的含量。
50.试剂盒的性能测试实验对实施例3的检测s100b的时间分辨免疫层析试剂盒的性能进行测试，包括准确度、线性、最低检测限、重复性、批间差等进行实验。样本中胆红素≤6mg/ml，胆固醇≤75mg/ml，甘油三酯≤60mg/ml、rf因子≤1500ui/ml、hama≤1000mg/ml、血红蛋白≤100mg/ml对检测结果进行统计，计算样本检测结果的均值和相对偏差，其中相对偏差在
±
15%内。具体操作如下：1、准确度：分别检测三个水平浓度的s100b参考品，计算其相对偏差（b%）≤15%。结果参见表6。
51.表6：准确度检测结果2、线性：其测定范围[0.05，30]ng/ml，相关系数r≥0.9900。参见表7和图14。
[0052]
表7：准确度检测结果3、最低检测限：取20份，对配制参考品基质进行检测，计算样本测定结果平均值m
和标准差sd，其中（m 2sd）≤0.05ng/ml。参见表8表8：最低检测限结果4、重复性：随机抽取20份试剂盒，分别对三个水平浓度的s100b参考品进行检测，其变异系数cv≤15%。参见表9。
[0053]
表9：重复性检测结果
5、批间差：随机抽取连续三个批号的试剂，每个批号取20份对三个水平浓度的s100b参考品进行检测，其变异系数cv≤15%。参见表10。
[0054]
表10：批间差检测结果6、与罗氏试剂盒的相关性检测，结果参见图15。
[0055]
图15的结果显示，本发明所述的检测s100b的时间分辨免疫层析试剂盒与罗氏试剂盒具有高度相关性。
[0056]
应用实施例1利用实施例2的时间分辨免疫层析试剂盒检测s100b，具体步骤如下：
a、拟合标准曲线在实施例1的时间分辨免疫层析试纸条的加样区加入不同浓度的s100b标准品（取8个不同的浓度，分别为0ng/ml、0.05ngm/l、0.1ng/ml、0.3ng/ml、1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml，每个浓度做4个平行样），膜层析反应15分钟后，仪器读取质控线c、检测线t信号，以检测的样品的检测线荧光值与质控线的荧光值的比值的对数值为横坐标，s100b标准品浓度的对数值为纵坐标，建立方程并拟合成标准曲线y=1.2145x 0.4176。
[0057]
标准曲线r2=0.9935，线性较好，可以通过该标准曲线对样品中所含s100b浓度进行定量分析。
[0058]
b、样品检测在s100b的荧光免疫层析试纸条的加样区加入待测样品，膜层析反应15分钟。开启荧光检测设备，读取id卡里的标准曲线，并将检测条插入荧光检测设备的插卡口，运行仪器，仪器通过相应的分析软件自动计算出待测样本中的s100b浓度，根据定标卡上的信息将实际检测值带入预设的标准曲线中算出定量的结果，结果参见表11和图16。
[0059]
表11：样品检测结果
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。