双光子显微镜装置的制作方法

1.本实用新型涉及一种双光子显微镜装置，特别涉及光学显微成像领域。


背景技术：

2.双光子显微镜是一种荧光显微成像装置，其借助于强聚焦激光束，产生非线性双光子吸收效应，激发染料释放出荧光信号，进而显微成像。不同于传统的荧光显微镜，双光子显微镜由于采取双光子吸收技术，因此所用激发光波长要长于发射的荧光波长。双光子显微镜常用红外波段光源作为激发光，可以最大限度地减少样品组织内部的光散射；同时，由于多光吸收，可以有效抑制背景信号，因此双光子显微镜具有很强的深组织穿透能力。例如，普通的共聚焦显微镜具有大约50
‑
80um的穿透能力，而双光子显微镜可以达到200um以上的穿透，因此，在活体深组织成像领域，双光子显微镜具有独一无二的技术优越性，是最常用的光学显微成像设备之一。
3.一般情况下，在设计和使用双光子显微镜装置的时候，我们通常通过调节激发光的光功率、光斑尺寸大小和物镜，来调整焦点处的光密度，以此来控制产生的荧光信号强度。然而，这些调整方式调整精度不高，微调不方便。因此我们需要一种能够方便且高精度的调整双光子显微镜的双光吸收效率和荧光信号强度的装置。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本实用新型的目的是提供一种双光子显微镜装置。
5.本实用新型采取以下技术方案：
6.一种双光子显微镜装置，其包括：色散光栅（1）、柱透镜（2）、反射镜（3）、挡光板（4）、二向色镜（5）、物镜（6）、聚焦透镜（8）和信号探测器（9），所述色散光栅（1）和反射镜（3）分别设于柱透镜（2）的两侧且距离为柱透镜（2）焦距处，所述挡光板（4）设于反射镜（3）表面处，所述二向色镜（5）设于色散光栅（1）的出射激发光（11）光线上，所述物镜设于二向色镜（5）的反射激发光（12）光线上，所述聚焦透镜（8）设于二向色镜（5）的透射的荧光（14）光线上，所述信号探测器（9）设于聚焦透镜（8）的透射的荧光（14）光线上且距离为聚焦透镜（8）焦距处。所述的入射激发光（10）经所述的色散光栅（1）色散后，从时间域傅里叶变换到空间域，不同频率组分占据不同的空间分布，所述挡光板（4）在傅里叶面上对某些光学频率进行遮挡，因此只有未被遮挡的光频率可被所述的反射镜（3）反射，再次经由所述的色散光栅（1）从空间域反傅里叶转换回时间域，所述的出射激发光（11）和入射激发光（10）具有不一样的光谱带宽，也因此具有不同的脉冲长度和峰值功率，以此来影响双光子吸收效率，进而调控显微镜的荧光信号强度。所述的出射激发光（11）被所述的二向色镜（5）反射进物镜（6），物镜（6）把激发光聚焦到样品（7）上激发出荧光，该荧光信号（13）再次穿过物镜（6）和二向色镜（5），然后被聚焦透镜（8）聚焦到信号探测器（9）上。
7.所述激发光为脉冲输出的激光。
8.所述的柱透镜（2）的焦距可以是100mm、200mm、300mm或500mm。
9.所述的二向色镜（5）可以反射激发光（11），且透射荧光信号（13）。
10.所述的物镜（6）可以有不同的数值孔径。
11.所述的聚焦透镜（8）的焦距可以是50mm、100mm、200mm或300mm。
12.所述的信号探测器（9）可以为apd、pmt、ccd、emccd、cmos或scmos。
13.本实用新型由于采取了以上技术方案，其具有以下优点：本实用新型通过挡光板在傅里叶面上对激发光频率带宽进行控制，进而调控激发光脉冲长度和峰值功率，从而达到对双光吸收效率和激发荧光信号强度的调控，整个装置构造简单，且可以很方便容易的对荧光激发效率和荧光信号强度进行高精度调整，既能够避免荧光信号太强超出探测器探测范围的问题，也可避免样品的过度光漂白现象。
附图说明
14.图1为本实用新型实施例1的装置结构图。
15.图2为本实用新型实施例2的装置结构图。
具体实施方式
16.实施例1
17.请参阅图1，本实用新型所述的一种双光子显微镜装置，其包括：色散光栅（1）、柱透镜（2）、反射镜（3）、挡光板（4）、二向色镜（5）、物镜（6）、聚焦透镜（8）和信号探测器（9），所述色散光栅（1）和反射镜（3）分别设于柱透镜（2）的两侧且距离为柱透镜（2）焦距处，所述挡光板（4）设于反射镜（3）表面处，所述二向色镜（5）设于色散光栅（1）的出射激发光（11）光线上，所述物镜（6）设于二向色镜（5）的反射激发光（12）光线上，所述聚焦透镜（8）设于二向色镜（5）的透射的荧光（14）光线上，所述信号探测器（9）设于聚焦透镜（8）的透射的荧光（14）光线上且距离为聚焦透镜（8）焦距处。
18.在室温下，用商用飞秒脉冲激光器输出波长为1030
±
4 nm，脉冲长度为200fs的脉冲激光，作为本实用新型所述的一种双光子显微镜装置的入射激发光（10），该入射激发光（10）经所述的色散光栅（1）色散后，透过柱透镜（2）从时间域傅里叶变换到空间域，在所述的反射镜（3）表面处，不同频率组分占据不同的空间分布。
19.另，根据傅里叶转换极限可知脉冲长度与波谱带宽的关系可由以下公式表示：
20.，
21.其中
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是脉冲长度,
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是激发光中心波长， 是光在真空中的传播速度，
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是激发光的波谱带宽，tbp是时间
‑
带宽积为一常数。从该公式我们可知，脉冲长度与波谱带宽成反比例关系，越窄的波谱带宽导致越长的脉冲长度，因此我们可以通过调节激发光的波谱带宽来调整其脉冲长度。
22.在图1所示的装置中，用所述挡光板（4）在傅里叶面上对某些光学频率进行遮挡，只允许中心的某些波谱范围的激发光可被所述的反射镜（3）反射，并再次由所述的色散光栅（1）从空间域反傅里叶转换回时间域；此时，所述的色散光栅（1）的出射激发光（11）具有与入射激发光（10）不同的波谱带宽，因此出射激发光（11）和入射激发光（10）有不同的脉冲长度。例如，调整所述的挡光板（4）在傅里叶面上对某些光学频率进行遮挡，只允许中心的
1030
±
1nm基频光可被所述的反射镜（3）反射时，根据上述傅里叶转换极限公式可知：
23.。
24.进一步地，激发光脉冲长度影响双光子吸收，进而影响所产生的荧光（13）的信号强度。
25.进一步地，所述的出射激发光（11）被所述的二向色镜（5）反射进物镜（6），物镜（6）把激发光聚焦到样品（7）上激发出荧光，该荧光信号（13）再次穿过物镜（6）和二向色镜（5），然后被聚焦透镜（8）聚焦到信号探测器（9）上。
26.实施例2
27.请参阅图2，本实用新型所述的一种双光子显微镜装置，其包括：第一色散光栅（1
‑
1）、第二色散光栅（1
‑
2）、第一柱透镜（2
‑
1）、第二柱透镜（2
‑
2）、挡光板（3）、二向色镜（4）、物镜（5）、聚焦透镜（7）和信号探测器（8）。所述的第一色散光栅（1
‑
1）与第二色散光栅（1
‑
2）参数相同，所述的第一柱透镜（2
‑
1）与第二柱透镜（2
‑
2）参数相同。所述的第一色散光栅（1
‑
1）、第一柱透镜（2
‑
1）、挡光板（3）、第二柱透镜（2
‑
2）和第二色散光栅（1
‑
2）依次序排列设置且相邻两部件间距均等于柱透镜的焦距。所述二向色镜（4）设于第二色散光栅（1
‑
2）的出射激发光（10）光线上，所述物镜（5）设于二向色镜（4）的反射激发光（11）光线上，所述聚焦透镜（7）设于二向色镜（4）的透射的荧光（13）光线上，所述信号探测器（8）设于聚焦透镜（7）的透射的荧光（13）光线上且距离为聚焦透镜（7）焦距处。
28.在室温下，用商用飞秒脉冲激光器输出波长为1030
±
4 nm，脉冲长度为200fs的脉冲激光，作为本实用新型所述的一种双光子显微镜装置的入射激发光（9），该入射激发光（9）经所述的第一色散光栅（1
‑
1）色散后，透过第一柱透镜（2
‑
1），从时间域傅里叶变换到空间域，在所述的挡光板（3）处，不同频率组分占据不同的空间分布。
29.用所述挡光板（3）在傅里叶面上对某些光学频率进行遮挡，只允许中心的某些波谱范围的激发光通过，该激发光再次通过透过第二柱透镜（2
‑
2）和第二色散光栅（1
‑
2），从空间域反傅里叶转换回时间域；此时，所述的出射激发光（11）波谱带宽与第一色散光栅（1
‑
1）的入射激发光（9）的波谱带宽不同，因此出射激发光（10）和入射激发光（9）具有不同的脉冲长度。
30.进一步地，激发光脉冲长度影响双光子吸收效率，进而影响所产生的荧光信号（13）的强度。
31.进一步地，所述的出射激发光（10）被所述的二向色镜（5）反射进物镜（6），物镜（6）把激发光聚焦到样品（7）上激发出荧光信号（13），该荧光信号（13）再次穿过物镜（6）和二向色镜（5），然后被聚焦透镜（8）聚焦到信号探测器（9）上。
32.此外，以上实施方式仅用于说明本实用新型，而并非是本实用新型的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本实用新型的精神和范围的情况下，还可以做出其他变化和变形，因此所有等同的技术方案也属于本实用新型的范畴，本实用新型的保护范围应由权利要求限定。此外，若本说明书中使用了一些特定的术语，仅是为了方便说明，并不对本实用新型构成限制。