一种南极磷虾降血脂肽及其治疗高脂血症的用途的制作方法

1.本发明涉及功能肽领域，尤其是涉及一种南极磷虾降血脂肽及其治疗高脂血症的用途。


背景技术：

2.高脂血症(hyperlipidemia，hlp)，也称血脂异常或者脂蛋白异常血症，是指由各种致病因素所导致的血浆中脂质代谢水平异常升高同时伴有脂蛋白胆固醇水平异常改变的一种全身性脂质代谢紊乱综合症。其中，血浆脂质主要包括：胆固醇(tc)和甘油三酯(tg)；而异常的血浆脂蛋白胆固醇主要包括：低密度脂蛋白胆固醇(ldl
‑
c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl
‑
c)、极低密度脂蛋白胆固醇(vldl
‑
c)和乳糜微粒(cm)。高脂血症(hlp)是动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病的重要危险因素。另外，高血脂症还可以导致脂肪肝、肝硬化、胰腺炎、高尿酸血症等。因此，研究高效无毒副作用的降血脂药物尤为重要。
3.降血脂药物可以通过调整血清中tc、tg、ldl
‑
c和hdl
‑
c等指标，改善高脂血症。目前，降血脂西药，如hmg
‑
coa还原酶抑制剂(他汀类药物)，应用广泛、疗效显著。但由于毒副作用等因素，他汀类药物的使用也面临困境。例如：德国拜耳药厂生产的西立伐他汀(商品名：拜斯亭)，因与美国境内出现的31例因横纹肌溶解症而死亡的病例有关，不得不退出市场。因此，研发新的治疗高脂血症的药物仍然具有重要意义。
4.现有研究证明以数个氨基酸结合生成的寡肽比氨基酸更易于消化吸收，已逐渐取代氨基酸成为营养不良或消化吸收有问题的特定人群配方食品的氮源。更为重要的是，相对于氨基酸和蛋白质，寡肽显示出了独特且显著的生物活性，陆续发现的抗肿瘤肽、抗氧化肽、降血压肽等显示出巨大的市场开发前景。
5.基于此，申请人以资源丰富的南极磷虾蛋白为原料，以降低油酸(oa)诱导的hepg2细胞脂质堆积模型中的脂质含量为指标，设计新的制备工艺，并发现降血脂功能显著且安全无毒性的降血脂肽，该降血脂肽可应用于治疗或者辅助治疗高脂血症的特医食品、保健品和药物。
6.上述背景技术旨在辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日前已公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本技术技术方案的新创性。


技术实现要素：

7.为解决上述背景技术中提及的至少一种技术问题，本发明的目的之一旨在提供一种南极磷虾降血脂肽，该降血脂肽在细胞和大鼠高脂血模型中均显示出显著的降血脂活性。
8.本发明的目的之二在于提供一种南极磷虾降血脂肽的应用，该降血脂肽可作为降血脂功能分子应用于治疗或者辅助治疗高脂血症的特医食品、保健品和药物。
9.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案。
10.一种南极磷虾降血脂肽，其包含seq id no:1所示的氨基酸序列或其变体。
11.优选地，所述南极磷虾降血脂肽由seq id no:1所示的氨基酸序列组成。
12.申请人以南极磷虾蛋白为原料，分离制备得到一种南极磷虾降血脂肽，该降血脂肽为九肽化合物，其氨基酸序列为：ile
‑
pro
‑
ala
‑
phe
‑
ser
‑
gly
‑
arg
‑
gly
‑
trp(ipafsgrgw)，esi
‑
ms测定分子量为990.15da，氨基酸序列如seq id no:1所示。经诱导模型试验与动物造模试验验证发现，ipafsgrgw能显著降低油酸(oa)诱导的hepg2细胞堆积模型中的脂质、胆固醇(tc)和甘油三酯(tg)含量，还具有显著降低高脂血症大鼠血清中的胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl
‑
c)含量的作用，此外，ipafsgrgw能显著提高高脂血症大鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇(hdl
‑
c)含量，因此降血脂肽ipafsgrgw可应用于治疗或者辅助治疗高脂血症的特医食品、保健品和药物。
13.前述所述南极磷虾降血脂肽的应用，所述应用包括以所述降血脂肽作为效用成分制备改善高脂血症的特医食品和/或保健品和/或药物。
14.优选地，所述改善高脂血症包括预防、治疗及辅助治疗高脂血症的至少一种。
15.优选地，所述改善包括降低油酸诱导的hepg2细胞堆积模型中的脂质、胆固醇和甘油三酯的含量。
16.优选地，所述改善包括降低高脂血症大鼠血清中的胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇的含量。
17.优选地，所述改善包括提高高脂血症大鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇的含量。
18.优选地，所述特医食品和/或保健品是固体食品或液体饮料的至少一种。
19.优选地，所述药物是液体剂型或冻干粉剂的至少一种。
20.一种治疗高脂血症的药物，包括有效量的前述所述南极磷虾降血脂肽及药学上可接受的载体。
21.所述药物中南极磷虾降血脂肽的重量百分比是0.01～99.99％。
22.所述药物中南极磷虾降血脂肽的重量百分比是1.0～55％。
23.所述药物中南极磷虾降血脂肽是所述药物中唯一或主要的效用成分。
24.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
25.本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
26.与现有技术相比，本发明所提供的南极磷虾降血脂肽ile
‑
pro
‑
ala
‑
phe
‑
ser
‑
gly
‑
arg
‑
gly
‑
trp(ipafsgrgw)可显著降低油酸(oa)诱导的hepg2细胞脂质堆积模型内脂质、总胆固醇(tc)和甘油三酯(tg)含量，以及显著降低实验性高脂血症大鼠血清中tc、tg和ldl
‑
c，升高hdl
‑
c。ipafsgrgw具有安全无毒副作用、降血脂活性显著等优点，可应用于治疗或者辅助治疗高脂血症的特医食品、保健品和药物。
27.本发明为实现上述目的而采用了上述技术方案，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
28.为让本发明的上述和/或其他目的、特征、优点与实例能更明显易懂，所附附图的
说明如下：
29.图1是nph
‑
i
‑
1的sephadex lh
‑
20层析图；
30.图2是nph
‑
i
‑
1c的rp
‑
hplc分析；
31.图3是南极鳞虾降血脂肽的结构式；
32.图4是南极鳞虾降血脂肽的质谱图；
33.图5是南极鳞虾降血脂肽对油酸(oa)诱导的hepg2细胞脂质堆积模型中甘油三酯(tg)含量的影响示意图；
34.图6是南极鳞虾降血脂肽对油酸(oa)诱导的hepg2细胞脂质堆积模型中胆固醇(tc)含量的影响作用示意图；
35.图7是南极鳞虾降血脂肽对实验性高脂血症大鼠血清甘油三酯(tg)含量的影响作用示意图；
36.图8是南极鳞虾降血脂肽对实验性高脂血症大鼠血清胆固醇(tc)含量的影响作用示意图；
37.图9是南极鳞虾降血脂肽对实验性高脂血症大鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(ldl
‑
c)含量的影响作用示意图；
38.图10是南极鳞虾降血脂肽对实验性高脂血症大鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(hdl
‑
c)含量的影响作用示意图。
具体实施方式
39.本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当替换和/或改动工艺参数实现，然而特别需要指出的是，所有类似的替换和/或改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品和制备方法已经通过较佳实例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
40.除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本发明使用本文中所描述的方法和材料；但本领域中已知的其他合适的方法和材料也可以被使用。本文中所描述的材料、方法和实例仅是说明性的，并不是用来作为限制。所有出版物、专利申请案、专利案、临时申请案、数据库条目及本文中提及的其它参考文献等，其整体被并入本文中作为参考。若有冲突，以本说明书包括定义为准。
41.除非另外说明，所有的百分数、份数、比例等都以重量计；另有说明包括但不限于“wt％”意指重量百分比、“mol％”意指摩尔百分比、“vol％”意指体积百分比。
42.当以范围、优选范围或一系列上限优选值和下限优选值给出数量、浓度或者其它数值或参数时，应理解其具体公开了由任何较大的范围限值或优选值和任何较小的范围限值或优选值的任何一对数值所形成的所有范围，而无论范围是否分别被公开。例如，当描述“1至5(1～5)”的范围时，所描述的范围应理解为包括“1至4(1～4)”、“1至3(1～3)”、“1至2(1～2)”、“1至2(1～2)和4至5(4～5)”、“1至3(1～3)和5”等的范围。除非另外说明，在本文描述数值范围之处，所述范围均包括范围端值以及该范围内的所有整数和分数。
43.除非具体说明，本文所描述的材料、方法和实例仅是示例性的，而非限制性的。尽
管与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或测试，但本文仍描述了合适的方法和材料。
44.本领域应当知晓的是，本发明所提供的南极磷虾降血脂肽的氨基酸序列是ile
‑
pro
‑
ala
‑
phe
‑
ser
‑
gly
‑
arg
‑
gly
‑
trp，简写ipafsgrgw，其中ile对应i，即异亮氨酸；pro对应p，即脯氨酸；ala对应a，及丙氨酸；phe对应f，即苯丙氨酸；ser对应s，即丝氨酸；gly对应g，即苷酸铵；arg对应r，即精氨酸；trp对应w，即色氨酸。
45.本领域应当知晓的是，oa即油酸，tc即总胆固醇，tg即甘油三酯，ldl
‑
c即低密度脂蛋白胆固醇，hdl
‑
c即高密度脂蛋白胆固醇。
46.本发明提供一种南极磷虾降血脂肽，该降血脂肽为九肽化合物，其氨基酸序列为：ile
‑
pro
‑
ala
‑
phe
‑
ser
‑
gly
‑
arg
‑
gly
‑
trp(ipafsgrgw)，氨基酸序列表如seq id no:1所示，esi
‑
ms测定分子量为990.15da。
47.本发明还提供南极磷虾降血脂肽的制备方法，包括：预处理、酶解、分离提取，具体包括：
48.1)预处理：南极磷虾去头、壳，经清洗、匀浆至糊状后，按照料液比1g:5～8ml加入无水乙醇，500w超声脱脂30～60min，过滤，重复2次上述操作，彻底除去南极磷虾中的脂质；干燥过滤所得固体物，得脱脂南极磷虾虾粉；
49.2)酶解：取脱脂南极磷虾虾粉，按料液比1g:5～8ml加入缓冲液，调节ph值至1.5～2.5，加入虾粉重量2～3％胃蛋白酶(酶活力≥3.0
×
104u/g)，35～40℃酶解3～4h，于90～100℃灭酶10～15min，冷却至45～50℃，调节ph值至6.5～8.0，加入虾粉重量1.5～2.5％中性蛋白酶(酶活力≥1.0
×
105u/g)，酶解3～4h，于90～100℃灭酶10～15min，后于6000～9000rmp离心25～30min，收集上清液，得南极磷虾酶解液；使用双酶复合酶解技术获取南极磷虾多肽，无毒副有机溶剂加入，安全性高，制备成本较低，反应条件温和；胃蛋白酶 中性蛋白酶能够快速将脱脂南极磷虾虾粉降解为小分子的高活性寡肽，得率高；
50.3)分离提取：将上述南极磷虾蛋白酶解液经截留分子量为3kda的超滤膜进行分级，收集分级组分，测定各组分对油酸(oa)诱导的hepg2细胞脂质堆积模型中脂质降低能力(用％空白组表示)，选择降脂能力最强的超滤组分依次经大孔树脂富集、凝胶色谱和反相高效液相色谱纯化(rp
‑
hplc纯化)，得到南极磷虾降血脂肽。
51.所述3)分离提取步骤中经大孔树脂富集、凝胶色谱和rp
‑
hplc纯化的具体过程为：
52.大孔树脂富集：将降脂能力最强的超滤组分溶于双蒸水配成浓度为90～100mg/ml的溶液，按照样品与d101大孔树脂1g:10～20g比例将样品溶液缓慢加入到树脂柱中，用2～3倍柱体积双蒸馏洗涤树脂柱，除去未吸附样品；用2～3倍柱体积60％乙醇洗涤树脂柱，收集洗脱溶液，冻干，得富集样品；
53.凝胶柱层析：将d101大孔树脂富集样品溶于双蒸水配成浓度为40～50mg/ml的溶液，经过sephadex lh
‑
20柱层析(2.5cm
×
160cm)分离，用双蒸水进行洗脱，流速0.5～0.8ml/min，根据214nm色谱图收集各色谱峰，测定各个色谱峰的降脂能力，活性最高色谱峰为凝胶层析酶解物；
54.rp
‑
hplc纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成25～30μg/ml的溶液，利用rp
‑
hplc进行纯化，根据制备寡肽的降血脂活性得1个高活性降血脂肽ile
‑
pro
‑
ala
‑
phe
‑
ser
‑
gly
‑
arg
‑
gly
‑
trp(ipafsgrgw)，esi
‑
ms测定分子量为990.15da。
55.所述rp
‑
hplc纯化的条件为：进样量15～20μl；色谱柱kromasil c
‑
18(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相：在0～30min内乙腈浓度从0匀速升至100％；洗脱速度0.6～0.8ml/min；紫外检测波长214nm。
56.以下详细描述本发明。
57.实施例1：
58.本实施例提供一种南极磷虾降血脂肽，该降血脂肽为九肽化合物，其氨基酸序列为：ile
‑
pro
‑
ala
‑
phe
‑
ser
‑
gly
‑
arg
‑
gly
‑
trp(ipafsgrgw)，esi
‑
ms测定分子量为990.15da，氨基酸序列如seq id no:1所示。
59.本实施例提供的南极磷虾降血脂肽的制备方法包括下述步骤：
60.1)预处理：南极磷虾去头、壳，经清洗、匀浆至糊状后，按照料液比1g:6ml加入无水乙醇，500w超声脱脂45min，过滤，重复2次上述操作，除去南极磷虾中的脂质；干燥过滤所得固体物，得脱脂南极磷虾虾粉；
61.2)酶解：取脱脂南极磷虾虾粉，按料液比1g:8ml加入缓冲液，调节ph值至2.5，加入虾粉重量3％胃蛋白酶(酶活力3.0
×
104u/g)，37℃酶解4h，于95℃灭酶10min，冷却至50℃，调节ph值至7.0，加入虾粉重量2.0％中性蛋白酶(酶活力1.0
×
105u/g)，酶解4h，于95℃灭酶15min，后于9000rmp离心25min，收集上清液，得南极磷虾酶解液(nph)；
62.3)分离提取：将上述南极磷虾蛋白酶解液(nph)经截留分子量为3kda的超滤膜进行分级，收集分级组分nph
‑
i(mw≤3kda)和nph
‑
ii(mw＞3kda)，测定nph
‑
i和nph
‑
ii对油酸(oa)诱导的hepg2细胞脂质堆积模型(模型建立方法参照[潘欣.鮸鱼鱼肉和鱼鳔功能多肽的制备及抗氧化和降脂活性研究[d].浙江海洋大学，2017])中脂质降低能力(表1)，降脂能力最强超滤组分nph
‑
i依次经大孔树脂富集、凝胶色谱和反相高效液相色谱(rp
‑
hplc)纯化，得到南极磷虾降血脂肽，利用氨基酸序列分析仪和质谱测定其结构，具体过程为：
[0063]
①
大孔树脂富集：将nph
‑
i溶于双蒸水配成浓度为100mg/ml的溶液，按nph
‑
i与d101大孔树脂1g:15g比例将nph
‑
i溶液缓慢加入到树脂柱中，用3倍柱体积双蒸馏洗涤树脂柱，除去为吸附样品；用3倍柱体积60％乙醇洗涤树脂柱，收集洗脱溶液，冻干，得富集样品(nph
‑
i
‑
1)，测定nph
‑
i
‑
1降脂能力(见表1)；
[0064]
②
凝胶色谱层析：将nph
‑
i
‑
1溶于双蒸水配成浓度为50mg/ml的溶液，经过sephadex lh
‑
20柱层析(2.5cm
×
160cm)分离，用双蒸水进行洗脱，流速0.5ml/min，根据214nm色谱图收集各色谱峰nph
‑
i
‑
1a～nph
‑
i
‑
1c，见图1，测定各个色谱峰的降血脂能力(见表1)，活性最高色谱峰为凝胶层析酶解物nph
‑
i
‑
1c；
[0065]
③
rp
‑
hplc精制与结构检测：将上述凝胶层析酶解物nph
‑
i
‑
1c用双蒸水配成30μg/ml的溶液，利用rp
‑
hplc进行纯化，进样量20μl，色谱柱kromasil c
‑
18(250mm
×
4.6mm，5μm；流动相在0
‑
30min内乙腈浓度从0匀速升至100％)，洗脱速度0.8ml/min；根据214nm色谱峰收集活性肽njp
‑
1～njp
‑
7，见图2，根据制备寡肽njp
‑
1～njp
‑
7的降血脂活性(见表1)得1个高活性降脂肽njp
‑
3；利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为ile
‑
pro
‑
ala
‑
phe
‑
ser
‑
gly
‑
arg
‑
gly
‑
trp(ipafsgrgw)，结构式见图3，esi
‑
ms测定分子量为990.15da，见图4。表1南极磷虾蛋白酶解物、分离组分和制备活性肽对油酸(oa)诱导的hepg2细胞脂质堆积模型中脂质含量的影响(n＝3)
[0066][0067][0068]
实施例2：
[0069]
在前述实施例的基础上，本实施例验证南极磷虾降血脂肽对油酸(oa)诱导的hepg2细胞脂质堆积模型甘油三脂(tg)和胆固醇(tc)的含量的影响作用，具体包括：
[0070]
模型的构建：参照现有技术[潘欣.鮸鱼鱼肉和鱼鳔功能多肽的制备及抗氧化和降脂活性研究[d].浙江海洋大学，2017]建立油酸(oa)诱导的hepg2细胞脂质堆积模型；
[0071]
结果分析：ipafsgrgw对油酸(oa)诱导的hepg2细胞脂质堆积模型中的甘油三酯和胆固醇的影响作用分别如图5和图6所示，从图5和图6可知，本技术所述南极磷虾降血脂肽均ipafsgrgw对油酸(oa)诱导的hepg2细胞脂质堆积模型中的tg和tc均具有显著的抑制作用，抑制作用接近于阳性药物辛伐他汀。
[0072]
实施例3：
[0073]
在前述实施例的基础上，本实施例进行高脂血症大鼠体内实验，验证南极磷虾降血脂肽对其的影响作用，具体包括：
[0074]
模型的构建：参照现有技术[陈蓓.罗勒提取物对高血脂症大鼠的调脂作用及其机制研究[d].新疆医科大学，2009]建立实验性高脂血症大鼠模型；
[0075]
结果分析：ipafsgrgw对高脂血症大鼠血清中的tg、tc、ldl
‑
c和hdl
‑
c的影响作用分别如图7～10所示，可知，lpgtripa能显著降低实验性高脂血症大鼠血清tg、tc和ldl
‑
c含量并升高hdl
‑
c含量。
[0076]
综上，ile
‑
pro
‑
ala
‑
phe
‑
ser
‑
gly
‑
arg
‑
gly
‑
trp(ipafsgrgw)显著降低细胞和动物模型中的血脂水平，且安全无毒副作用，可应用于治疗或者辅助治疗高脂血症的特医食品、保健品和药物。
[0077]
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
[0078]
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
[0079]
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
[0080]
本发明未尽事宜均为公知技术。