基于多维数据的鱼露滋味形成功能微生物胞外酶挖掘方法与流程

1.本发明涉及食品生物制造领域，具体涉及一种基于多维数据的鱼露滋味形成功能微生物胞外酶挖掘方法。


背景技术：

2.鱼露也称“鱼酱油”，是一种以低值鱼类或水产品加工副产物为原料，经过天然发酵制得的风味独特的水产调味品。鱼露色泽呈琥珀色，味道鲜美，富含牛磺酸、人体必需氨基酸、有机酸和微量元素，备受人们的青睐。我国传统鱼露的生产多分布在东南沿海地区，在山东、江苏、浙江、福建、广东等地均有生产。广东省鱼露年产量为2万吨左右，占全国年总产量的60％以上，其中以广东潮汕地区的鱼露较为有名，生产规模较大。在泰国、马来西亚、日本和韩国等亚洲国家，鱼露也是重要的餐饮调味品。
3.传统的鱼露发酵工艺通常采用高盐盐渍(加盐量一般25％
‑
30％)的自然发酵方式，在微生物和鱼体内源酶的协同作用下，对鱼体中的蛋白质、脂质等营养成分进行分解发酵，再经陈酿后熟酿造而成。传统鱼露产业具有历史悠久、风味独特等主要优势，但其发展远远滞后于其它传统发酵食品。传统鱼露生产周期长且产品品质不稳定导致其生产成本增加、规模化生产程度降低。究其原因主要是目前鱼露生产的研究水平较低，缺乏系统的理论体系支撑，不能很好的指导实际生产活动。鱼露的发酵工艺是其品质形成的关键工序，在其发酵过程中微生物、酶与代谢产物之间通过物质、能量等一系列交换形成复杂的发酵体系。鱼露快速发酵是传统鱼露产业的研究热点，但目前鱼露快速发酵研究工作主要停留在实验室初步研究和中试论证的阶段，且产品风味较差，无法进行工业化生产应用。现阶段急需攻关的环节是克服传统鱼露发酵周期长、盐度高等难题，力求定向挖掘出优良的微生物酶制剂，助推传统鱼露风味改良与快速发酵的发展。


技术实现要素：

4.针对目前大部分技术研究主要基于传统纯培养方式的微生物与胞外酶筛选，缺乏对鱼露发酵体系中种类、功能以及来源的精准识别，无法从整体上获知鱼露发酵体系中详细微生物胞外酶信息的问题，本发明提供一种基于多维数据的鱼露滋味形成功能微生物胞外酶挖掘方法。
5.本发明的目的采用以下技术方案来实现：
6.一种基于多维数据的鱼露滋味形成功能微生物胞外酶挖掘方法，包括如下步骤：
7.(1)对传统鱼露发酵过程中包括游离氨基酸与呈味核苷酸在内的滋味代谢物含量的动态变化进行测定，构建滋味物质变化数据集；
8.(2)对不同发酵阶段的传统鱼露微生物群落进行宏基因组测序；对原始序列进行包括去接头、质量剪切以及去除污染在内的优化处理，使用metagene对拼接基因组进行预测，构建传统发酵鱼露微生物功能基因数据库；
9.(3)对发酵液进行脱盐处理，收集蛋白组分流出液，对提取的蛋白进行定量分析；
10.(4)对提取合格的蛋白依次进行还原烷基化和trypsin酶解，根据定量结果取trypsin酶解后的产物采用液相色谱
‑
质谱联用进行鉴定并定量分析；
11.(5)使用第(2)步构建的不同发酵阶段传统鱼露样品的宏基因unigene翻译的蛋白数据集作为数据库比对，将raw文件通过proteome discoverer提交至mascot服务器，对unigene翻译的蛋白质进行物种注释分析，对鉴定到的蛋白质进行分类学物种注释分析；
12.(6)采用simca
‑
14.1软件导入传统微生物胞外酶数据库和滋味代谢物进行o2pls潜变量回归分析，定义变量的性质，将微生物胞外酶数据集定义为自变量x，滋味数据集定义为因变量y，通过对自变量投影重要性指标vip(variable importance in projection)进行定义计算，其计算公式如下：
[0013][0014]
公式中rd(y；t
i
)表示ti对因变量y的解释能力，w
i
k2表示代表xk对ti的分量边际贡献程度；
[0015]
以vip>1和p＜0.05为条件，利用构建的o2pls模型为基础挖掘传统鱼露发酵过程滋味形成微生物胞外酶，并对鉴定得到的蛋白质进行生物信息学分析。
[0016]
优选的，所述滋味代谢物的含量测定采用衍生化法，一级氨基酸与邻苯二甲醛(opa)、二级氨基酸与芴甲氧羰酰氯(fmoc)衍生后，通过zorbax eclipseaaa色谱柱(150mm
×
4.6mm)分离样品，柱流速在40℃下为1ml/min；脯氨酸使用荧光检测器在激发波长和发射波长分别为266nm和305nm的条件下进行检测，而其他氨基酸使用紫外检测器在338nm波长下进行检测，流动相a为ph值7.8、浓度0.04mol/l的磷酸二氢钠缓冲液，流动相b为乙腈：甲醇：水体积比为45：45：10的混合溶液。
[0017]
优选的，采用illuminahiseq技术对不同发酵阶段的传统鱼露微生物群落进行宏基因组测序，先使用核酸剪切仪把基因组dna打断成短的dna片断，truseq dna sample prep kit构建pe文库，再用cbot truseq pe cluster kit进行桥式pcr，随后用illumina hiseq 2500对不同发酵阶段的传统鱼露微生物群落进行宏基因组测序。
[0018]
优选的，步骤(3)所述脱盐处理采用pd
‑
10纯化脱盐柱进行纯化脱盐。
[0019]
优选的，步骤(4)所述还原烷基化包括以下步骤：
[0020]
s1、在所述蛋白组分流出液中加入4倍体积的tac/丙酮溶液对蛋白进行沉淀12h，离心收集蛋白沉淀，以丙酮洗涤，加入8mol/l的尿素裂解液重悬，重悬后超声破碎，得到蛋白溶液；
[0021]
s2、在所述蛋白溶液加入1mol/l的二硫苏糖醇溶液后混匀，37℃保温1h后加入1mol/l的碘代乙酰胺溶液，混匀后在室温条件下避光静止放置反应1h，得到还原烷基化产物；
[0022]
其中，所述蛋白溶液与所述二硫苏糖醇溶液、所述碘代乙酰胺溶液的体积比例为12：1：4。
[0023]
优选的，步骤(4)所述液相色谱
‑
质谱联用的分离流动a相为0.1wt.％的甲酸溶液，流动b相为80vol％的乙腈溶液与0.08wt.％的甲酸溶液，样品以600nl/min流速上样，依次
经过3μm
×
100μm
×
20mm c18质谱预柱、1.9μm
×
50μm
×
120mm c18色谱柱进行分离。
[0024]
本发明的有益效果为：
[0025]
本发明提供一种基于多维数据驱动的传统发酵鱼露滋味形成功能微生物胞外酶挖掘方法，通过反向遗传学推测氨基酸序列获得相应的编码基因信息，追踪复杂环境中微生物群体的功能，综合传统鱼露发酵过程中滋味组分动态变化定向挖掘滋味形成功能微生物胞外酶，基于多维数据驱动模型，建立了有效多维鱼露发酵味形成功能微生物胞外酶挖掘方法，相对于传统纯培养盲目筛选，具有通量高、目的性强和和预测性高等优势，为实现传统发酵海洋食品品质靶向调控提供技术支撑。
附图说明
[0026]
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
[0027]
图1是基于kegg数据库的不同发酵阶段传统鱼露样品的功能注释统计图；
[0028]
图2是bradford定量标准曲线；
[0029]
图3是鉴定的蛋白酶相对分子质量分布图；
[0030]
图4是传统鱼露微生物胞外酶物种注释信息。
具体实施方式
[0031]
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
[0032]
本发明的实施例涉及一种功能微生物胞外酶挖掘方法，应用于中国传统鱼露发酵体系，具体是一种基于多维数据驱动的传统发酵鱼露滋味形成功能微生物胞外酶挖掘方法，综合传统鱼露发酵过程中滋味组分动态变化定向挖掘滋味形成功能微生物胞外酶。
[0033]
本实施例所用的传统鱼露取自广东省潮汕地区，发酵时间分别为1、3、6、9、12个月，每个发酵阶段各取5个不同发酵点的样品进行混合，过滤，得到鱼露样品。
[0034]
1、称取过滤后的鱼露样品5.00g于50ml的离心管中，向离心管中加入5ml 0.02mol/l的盐酸溶液，在25℃的条件下进行超声波提取10min，随后在4℃条件下10000rpm离心10min，取上清液，用超纯水定容至10ml，经0.22μm滤膜过滤后，用agilent 1100hplc进行分析；采用安捷伦公司自动在线衍生化方法，一级氨基酸与邻苯二甲醛(opa)、二级氨基酸与芴甲氧羰酰氯(fmoc)衍生后，通过zorbax eclipseaaa色谱柱(150mm
×
4.6mm)分离样品，柱流速在40℃下为1ml/min；脯氨酸使用荧光检测器在激发波长和发射波长分别为266nm和305nm的条件下进行检测，而其他氨基酸使用紫外检测器在338nm波长下进行检测，流动相a为0.04mol/l磷酸二氢钠缓冲液(ph值为7.8)，流动相b为乙腈：甲醇：水＝45％：45％：10％；
[0035]
2、采用天根生化科技的宏基因组dna抽提试剂盒(dp326)提取鱼露样品中的微生物宏基因组dna；利用nanodrop2000检验dna样品的纯度以及浓度，将符合后续试验要求的微生物宏基因组dna置于
‑
20℃冰箱备用；
[0036]
3、利用covaris m220核酸剪切仪把基因组dna打断成长度约为300bp的短dna片断，用truseq
tm dna sample prep kit构建pe文库，再用cbot truseq pe cluster kit进行
桥式pcr，随后用illumina hiseq 2500对不同发酵阶段的传统鱼露微生物群落进行宏基因组测序，构建传统发酵鱼露微生物功能基因数据库；
[0037]
基于kegg数据库的不同发酵阶段传统鱼露样品的功能注释结果如图1所示；
[0038]
4、量取8ml过滤后的鱼露样品，在15000r/min条件下进行离心5min，取离心后的上清液，经pd
‑
10纯化脱盐柱手动纯化脱盐，纯化脱盐后收集蛋白组分流出液，加入4倍体积的tac/丙酮溶液静置过夜，对蛋白进行沉淀12h，随后再在10000r/min条件下对过夜蛋白溶液进行离心5min，收集蛋白沉淀，蛋白沉淀经丙酮洗涤后，加入8mol/l尿素裂解液重悬，重悬后的蛋白溶液进行超声破碎(功率900w*30％，每超声2s间歇4s，进行10个循环超声处理)；
[0039]
5、分别准确称取2μg、4μg、6μg、8μg和10μg标准品，进行bradford蛋白定量标准曲线制作；采用h4mfptad酶标仪对bradford蛋白进行定量；
[0040]
所述bradford蛋白定量标准曲线如图2所示，标准曲线的线性良好；
[0041]
6、分别量取60μl五个不同发酵阶段的鱼露蛋白溶液溶液于离心管中，向离心管中加入5μl 1mol/l的二硫苏糖醇溶液后用振荡器混匀，在37℃条件下水浴保温1h后加入20μl 1mol/l的碘代乙酰胺溶液，振荡混匀后在室温条件下避光静止放置反应1h，随后将处理后的蛋白样品转移至超滤管中，离心弃去收集液，随后在超滤管中加入100μl ua溶液(8mol/l urea，0.1mol/ltris
‑
hcl，ph8.0)，离心后去收集液，重复操作两次，再加入100μl 0.05mol/l的碳酸氢铵溶液，离心后去收集液，重复操作三次，更换新的收集管后，按照蛋白：trypsin酶＝50：1的重量比例加入trypsin酶，随后在37℃条件下酶解12
‑
16h；
[0042]
7、根据定量结果取trypsin酶解后的产物进行液相
‑
质谱联用分析，每个样品进行三个生物学重复，采用easy nlc/ultimate 3000液相进行分离，流动相缓冲液a为是0.1wt.％甲酸，缓冲液b由80vol％乙腈和0.08wt.％甲酸组成，样品通过自动进样器以600nl/min流速上样到3μm 100μm
×
20mm c18质谱预柱，再经过1.9μm 50μm
×
120mm c18色谱柱进行分离；
[0043]
8、质谱分析原始数据为raw文件，用软件mascot 2.1和proteome discoverer(thermo)进行查库鉴定及定量分析，鉴定到的微生物胞外酶的相对分子质量主要集中在10
‑
50kda之间，如图3所示；使用来源于第3步构建的鱼露微生物功能基因数据库，对unigene翻译的蛋白质进行物种注释分析，对过滤后鉴定到的571个蛋白质进行分类学物种注释分析，对鱼露发酵体系中生物胞外酶种类、功能以及来源进行精准识别；比对时将raw文件通过proteome discoverer提交至mascot服务器；
[0044]
传统鱼露微生物胞外酶物种注释信息如图4所示；
[0045]
9、采用simca
‑
p 14.1中的正交偏最小二乘(o2pls)法构建传统鱼露发酵过程中微生物胞外酶与滋味物质之间的相关性矩阵，通过每个自变量vip值的对比，以vip>1和p＜0.05为条件，挖掘影响滋味形成的微生物胞外酶，具体获得的关键微生物胞外酶信息如下表所示：
[0046]
[0047]
[0048]
[0049]
[0050]
[0051][0052]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。