药物递送组合物的制作方法

1.本发明涉及一种药物递送组合物；另外，还涉及一种可用于所述药物递送组合物的耐酸性细胞、药物载体以及所述耐酸性细胞的制造方法。本技术基于2019年3月29日向日本技术的特愿2019
‑
069029号而要求优先权，在此将它的内容援引到本技术中。


背景技术：

2.在以人为首的具有消化道的动物中，从口摄取的食物通过食道被送到胃中。例如，对于药物的口服给药，尤其在药物以肽、蛋白质为主要成分的情况下，药物在胃中被酶分解的可能性很高。另外，由于胃的内部为强酸性，所以即使是低分子化合物的药物，也存在有在胃中被非酶性地分解的可能性。另外，即使在想由肠吸收酸性化合物的情况下，有时也被胃吸收。因此，使用在胃中不溶解而在肠中溶解的胶囊的口服给药是有用的。
3.作为实现药物向肠递送的方法，已知有利用了在脂质中导入了蛋白b的物质在胃内稳定的性质的被称为bilosome的技术(非专利文献1)、利用了作为稻米的细胞器的蛋白质体对消化酶显示抗性的稻米疫苗(非专利文献2)或者利用了对消化酶、温度变化以及ph变化具有抗性的孢子的孢子疫苗(非专利文献3)等。
4.作为以工业口服疫苗为目标的疫苗，已知有利用了酵母的疫苗。例如，在专利文献1中记载了在酵母菌体内表达抗原性蛋白质的口服疫苗。在专利文献1中示出了通过对酵母菌体进行冷冻干燥，在胃以及空肠中不被消化而在回肠中被消化分解的情况，但是来自酵母的抗原性蛋白质的释放依赖于小肠的消化酶的功能。在专利文献2中暗示了将整合有外源基因的酵母株进行经粘膜/口服给药来诱导免疫，但是也记载了来自所用酵母的蛋白质也具有抗原性。现有技术文献专利文献
5.专利文献1：国际公开第2006/028214号专利文献2：日本特表2012
‑
508697号公报非专利文献
6.非专利文献1：mann jf et al.,lipid vesicle size of an oral influenza vaccine delivery vehicle influences the th1/th2 bias in the immune response and protection against infection.vaccine.2009jun 2；27(27)：3643
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9.非专利文献2：nochi t et al.,rice
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based mucosal vaccine as aglobal strategy for cold
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chain
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and needle
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free vaccination.proc natl acad sci u s a.2007jun 26；104(26)：10986
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91.非专利文献3：huang jm et al.,mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.vaccine.2010jan 22；28(4)：1021
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30.


技术实现要素：

发明要解决的问题
7.在畜牧业中，若发生传染病则抑制传染病的感染扩大是困难的，有时进行大量家畜的杀灭处理。在传染病中也有被认为通过肠道免疫能够预防的传染病，针对畜产动物开发在肠道中确立对病原菌的免疫的技术是紧迫的课题。另外，通过赋予肠道免疫，存在也能够赋予其它的粘膜免疫、全身免疫的可能性。因此，要求开发经口给予疫苗并能够直接递送至肠内的肠溶性组合物。但是，非专利文献1～3中记载的技术在畜牧业中使用时存在成本方面的问题。
8.因此，本发明的目的在于，提供一种能够将药物递送至肠的新型药物递送组合物、可用于所述药物递送组合物的耐酸性细胞及药物载体以及所述耐酸性细胞的制造方法。用于解决问题的手段
9.本发明包括以下的技术方案。(1)一种药物递送组合物，其包含内包药物的耐酸性细胞。(2)如(1)所述的药物递送组合物，所述药物局部存在于所述耐酸性细胞具有的袋状膜结构中。(3)如(2)所述的药物递送组合物，所述袋状膜结构是从由外源性脂质体以及细胞器构成的组中选择的至少一种。(4)如(3)所述的药物递送组合物，所述细胞器是从由线粒体、叶绿体、内质网、液泡、细胞核、过氧化物酶体以及高尔基体构成的组中选择的至少一种。(5)如(1)至(4)中任一项所述的药物递送组合物，所述药物是从由低分子化合物、肽、蛋白质以及核酸构成的组中选择的至少一种。(6)如(1)至(5)中任一项所述的药物递送组合物，所述药物是在肠中起作用的药物。(7)如(1)至(6)中任一项所述的药物递送组合物，所述药物是具有免疫原性的药物。(8)如(1)至(7)中任一项所述的药物递送组合物，所述耐酸性细胞是在ph7以上的条件下发生细胞破裂的细胞。(9)如(1)至(8)中任一项所述的药物递送组合物，所述耐酸性细胞是对ph1～3的酸性条件具有抗性的细胞。(10)如(1)至(9)中任一项所述的药物递送组合物，所述耐酸性细胞是属于温泉红藻纲(cyanidiophyceae)的藻类的细胞。(11)一种饲料，其含有(1)至(10)中任一项所述的药物递送组合物。(12)一种医药品，其含有(1)至(10)中任一项所述的药物递送组合物。(13)一种食品，其含有(1)至(10)中任一项所述的药物递送组合物。(14)一种耐酸性细胞，其内包药物。(15)如(14)所述的耐酸性细胞，所述药物局部存在于所述耐酸性细胞具有的袋状膜结构中。(16)如(14)所述的耐酸性细胞，所述药物局部存在于所述耐酸性细胞具有的袋状膜结构中外。
(17)如(14)至(16)中任一项所述的耐酸性细胞，所述药物是从由低分子化合物、肽、蛋白质以及核酸构成的组中选择的至少一种。(18)(15)所述的耐酸性细胞的制造方法，其包括将编码融合蛋白的基因导入耐酸性细胞的步骤，其中所述融合蛋白含有作为药物的肽或蛋白质以及相对于细胞膜或细胞器局部存在的肽或蛋白质。
10.另外，本发明还包括以下的技术方案。(19)一种药物载体，其包含耐酸性细胞。(20)如(19)所述的药物载体，所述耐酸性细胞是在ph7以上的条件下发生细胞破裂的细胞。(21)如(19)或(20)所述的药物载体，所述耐酸性细胞是对ph1～3的酸性条件具有抗性的细胞。(22)如(19)至(21)中任一项所述的药物载体，所述耐酸性细胞是属于温泉红藻纲(cyanidiophyceae)的藻类的细胞。(23)一种药物胶囊，其在(19)至(22)中任一项所述的药物载体中内包有药物。(24)如(23)所述的药物载体，所述药物局部存在于所述耐酸性细胞具有的袋状膜结构中。
11.另外，本发明还包括以下的技术方案。(25)一种耐酸性细胞，其包含外源性物质。(26)如(25)所述的耐酸性细胞，所述外源性物质局部存在于所述耐酸性细胞具有的袋状膜结构中。(27)如(25)或(26)所述的耐酸性细胞，所述外源性物质是从由低分子化合物、肽、蛋白质、核酸以及合成高分子化合物构成的组中选择的至少一种。(28)如(25)至(27)中任一项所述的耐酸性细胞，所述外源性物质是在肠中起作用的物质。(29)如(25)至(28)中任一项所述的耐酸性细胞，所述外源性物质是具有免疫原性的物质。(30)如(26)至(29)中任一项所述的耐酸性细胞，所述袋状膜结构是从由外源性脂质体、细胞膜以及细胞器构成的组中选择的至少一种。(31)如(30)所述的耐酸性细胞，所述细胞器是从由线粒体、叶绿体、内质网、液泡、细胞核、过氧化物酶体以及高尔基体构成的组中选择的至少一种。(32)如(25)至(31)中任一项所述的耐酸性细胞，所述耐酸性细胞是在ph7以上的条件下发生细胞破裂的细胞。(33)如(25)至(32)中任一项所述的耐酸性细胞，所述耐酸性细胞是对ph1～3的酸性条件具有抗性的细胞。(34)如(25)至(33)中任一项所述的耐酸性细胞，所述耐酸性细胞是属于温泉红藻纲(cyanidiophyceae)的藻类的细胞。(35)一种饲料，其含有(25)至(34)中任一项所述的耐酸性细胞。(36)一种医药品，其含有(25)至(34)中任一项所述的耐酸性细胞。(37)一种食品，其含有(25)至(34)中任一项所述的耐酸性细胞。
(38)一种所述外源性物质的给予方法，包括对对象经口给予(25)至(34)中任一项所述的耐酸性细胞。(39)一种动物的饲养方法，其包括使动物摄食(25)至(34)中任一项所述的耐酸性细胞。(40)一种肠道免疫的赋予方法，其包括经口给予(25)至(34)中任一项所述的耐酸性细胞。发明效果
12.基于本发明，能够提供能够将药物递送至肠的新的药物递送组合物、可用于所述药物递送组合物的耐酸性细胞及药物载体以及所述耐酸性细胞的制造方法。
附图说明
13.图1是示出针对在mg
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132的存在和不存在的条件下培养后的gapdh
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gp
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sfgfp表达株使用抗gfp抗体进行了免疫印迹的结果的图。图中，箭头示出gapdh
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gp
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sfgfp蛋白质的带。图2是gapdh
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gp
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sfgfp表达株的荧光显微镜图像。(a)pc：表示细胞的轮廓的相位差显微镜图像；(b)chl：叶绿体的自发荧光图像；(c)sfgfp：sfgfp的荧光图像。图3是示出在实施例2中用于制备chl
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tp
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3ha
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gp
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co1表达株的dna片段的结构的图。图4是示出针对在mg
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132的存在和不存在的条件下培养后的chl
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tp
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3ha
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gp
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co1表达株使用抗ha抗体进行了免疫印迹的结果的图。图中，箭头示出chl
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tp
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3ha
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gp
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co1蛋白质的带。图5是chl
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tp
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3ha
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gp
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co1表达株的荧光显微镜图像。(a)pc：表示细胞的轮廓的相位差显微镜图像；(b)chl：叶绿体的自发荧光图像；(c)sfgfp：利用抗ha抗体的免疫荧光染色图像。图6是示出通过免疫印迹法对给予了sfgfp表达株的悬浮液(对照悬浮液给予组)、chl
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tp
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3ha
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gp
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col表达株的悬浮液(悬浮液给予组)或chl
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tp
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3ha
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gp
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col表达株的海藻酸固化饲料(海藻酸固化饲料给予组)的小鼠评价了抗gp蛋白质抗体产生的结果的图。(a)：海藻酸固化饲料给予组；(b)悬浮液给予组；(c)对照悬浮液给予组。编号1～4表示小鼠的个体编号。图7示出了基于叶绿体核酮糖1,5
‑
二磷酸羧化酶/加氧酶大亚单位基因的属于温泉红藻纲的藻类的分子系统树。在各分支的附近示出了基于最大似然法的局域自举值(仅记载50以上，左侧)以及基于贝叶斯方法的后验概率(仅记载0.95以上，右侧)。用虚线包围了已知的cyanidioschyzon merolae(一种温泉红藻)，用实线包围了yfu3株以及hkn1株。
具体实施方式
14.[定义]在本说明书中，“肽”以及“蛋白质”这种用语彼此可互换使用，指通过酰胺键结合的氨基酸的聚合物。“肽”或“蛋白质”可以是天然氨基酸的聚合物，也可以是天然氨基酸与非天然氨基酸(天然氨基酸的化学类似物、修饰衍生物等)的聚合物，还可以是非天然氨基
酸的聚合物。除非特别说明，氨基酸序列从n末端侧向c末端侧记载。对于构成“肽”或“蛋白质”的氨基酸残基的数量没有特别的限定，具有两个以上的氨基酸残基的氨基酸聚合物也包含在“肽”或“蛋白质”中。在本说明书中，除非特别说明，将氨基酸残基数量多的聚合物(例如100个氨基酸残基以上)记载为“蛋白质”，将氨基酸残基数量少的聚合物(例如小于100个氨基酸)记载为“肽”。
[0015]
在本说明书中，“多核苷酸”以及“核酸”这种用语彼此可互换使用，指核苷酸通过磷酸二酯键结合的核苷酸聚合物。“多核苷酸”以及“核酸”可以是dna，也可以是rna，还可以由dna与rna的组合构成。另外，“多核苷酸”以及“核酸”可以是天然核苷酸的聚合物，也可以是天然核苷酸与非天然核苷酸(天然核苷酸的类似物、碱基部分、糖部分以及磷酸部分中的至少一个部分被修饰的核苷酸(例如硫代磷酸酯骨架)等)的聚合物，还可以是非天然核苷酸的聚合物。除非特别说明，碱基序列从5’侧向3’侧记载。
[0016]
在本说明书中，“基因”这种用语指包含编码特定的蛋白质的至少一个可读框(开放阅读框)的多核苷酸。基因可以包含外显子以及内含子双方。
[0017]
在本说明书中，与多核苷酸有关使用的“可操作地连接”这种用语的意思是指第一碱基序列与第二碱基序列充分地接近配置，第一碱基序列可以影响第二碱基序列或第二碱基序列的控制下的区域。例如，多核苷酸“与启动子可操作地连接”的意思是指该多核苷酸以在该启动子的控制下表达的方式连接。在本说明书中，“启动子能够发挥功能”的意思是指在对象的细胞内，启动子能够表达与该启动子可操作地连接的多核苷酸。在本说明书中，“可表达的状态”的意思是指在导入了多核苷酸的细胞内，该多核苷酸或基因处于可被转录的状态。在本说明书中，“表达载体”的意思是指包含对象多肽的载体，且是具备在导入了该载体的细胞内使对象多核苷酸成为可表达的状态的系统的载体。
[0018]
在本说明书中，“药物递送组合物”的意思是指用于向生物体内的任意的部位(脏器、器官、组织、疾病部位等)递送药物的组合物。
[0019]
在本说明书中，“药物载体”的意思是指用于药物的递送的载体。药物载体可以是有机物和无机物中的任一者。在药物载体由有机物构成的情况下，所述药物载体可以是细胞。
[0020]
在本说明书中，细胞“内包药物”的意思是指药物存在于细胞内和/或药物存在于细胞膜。在药物存在于细胞内的情况下，药物可以存在于细胞器的内部。
[0021]
在本说明书中，药物“局部存在于袋状膜结构”的意思是指药物的大部分存在于对象的袋状膜结构的内部(袋的内部)或形成袋状膜结构的膜(下称“袋状膜”)。在药物局部存在于细胞具有的袋状膜结构的情况下，内包于细胞中的全部药物无需存在于该袋状膜结构的内部或袋状膜，一部分的药物也可以存在于该袋状膜结构的外部。在药物“局部存在于袋状膜结构”的情况下，存在于该袋状结构的药物的比例可以是例如细胞内包的全部药物量的50％以上，优选为60％以上，更优选为70％以上，进一步优选为80％以上。
[0022]
在本说明书中，“低分子化合物”的意思是指分子量约2000以下的化合物。但是，分子量2000以下的肽以及核酸不包含在“低分子化合物”内。在本说明书中，“合成高分子化合物”的意思是指分子量为2000以上的非天然化合
物。“非天然化合物”的意思是指在自然界不存在的化合物。作为合成高分子化合物，可以举出各种合成聚合物(聚烯烃、聚酯、聚酰胺、聚乙二醇、聚(2
‑
噁唑啉)等)。人工化学合成的肽、蛋白质以及核酸不包含在“合成高分子化合物”内。
[0023]
在本说明书中，“外源性物质”的意思是指从细胞外导入的物质或基于从细胞外导入的物质在细胞内生成的物质。作为基于从细胞外导入的物质在细胞内生成的物质的具体例子，例如可以举出：导入了外来基因的细胞中的所述外来基因的转录产物(mrna)以及翻译产物(蛋白质)，导入了前药的细胞中的所述前药的活性代谢物(显示目标的药效的药剂)等。外源性物质是与细胞本来具有的物质(内源性物质)不同的物质。
[0024]
在本说明书中，“药物”的意思是指在生物体中显示有益活性的物质。药物显示的有益活性没有特别的限定，包括生理活性、药理活性、生物活性以及对诊断等有用的化学活性等。例如，所述活性可以包括：作为医药品的有效成分众所周知的化合物具有的药理活性，以及给予到体内使用的诊断药物具有的化学活性或生理活性。作为所述活性，例如可以举出免疫诱导活性、免疫增强活性、抗癌活性、信号传导抑制活性、信号传导促进活性、代谢拮抗活性、镇痛活性、抗炎活性、杀菌活性、抗病毒活性、抗过敏活性、酶抑制活性、造影作用、荧光活性等，但不限于这些活性。药物也可以是在生物体内释放出显示有益活性的化合物的那些化合物(所谓的前药)。
[0025]
在本说明书中，“医药品”包括医疗用医药品以及用于疾病的治疗、预防或增进健康而服用的广义的药物。“医药品”不论是否为公开注册的药、也不论是医疗用或医疗用以外的药物都可以。在本说明书中，“食品”以包括通常的食品、健康食品、营养辅助食品、健康辅助食品、功能性食品、美容辅助食品以及保健品等的概念使用。
[0026]
在本说明书中，“变异株”的意思是指在原始细胞株的基因组(包括核基因组、叶绿体基因组、线粒体基因组，下同)自然发生地或人为地产生了变异的细胞株。使基因组产生变异的人为方法没有特别的限定。作为所述人为的方法，例如可以举出：紫外线照射、放射线照射、利用亚硝酸等化学处理，基因导入、基因组编辑等基因工程的方法等。在本说明书中，“yfu3株的变异株”是指在yfu3株的基因组中产生了突变的藻类株且具有二倍体的细胞形态以及单倍体的细胞形态的藻类株。“hkn1株的变异株”是指在hkn1株的基因组中产生了突变的藻类株且具有二倍体的细胞形态以及单倍体的细胞形态的藻类株。
[0027]
在本说明书中，“近缘种”例如是rbcl基因、18srrna基因或16srna基因的碱基序列与原来的生物种的所述基因的碱基序列具有90％以上的同一性的细胞株。在生物种为藻类的情况下，所述比较对象的基因是rbcl基因或18srrna基因，优选为rbcl基因。原来的藻类具有的rbcl基因的碱基序列与近缘种的藻类具有的rbcl基因的碱基序列的同一性优选为95％以上，更优选为97％以上，进一步优选为98％以上，特别优选为99％以上。藻类具有的rbcl基因的碱基序列可以通过众所周知的方法得到。例如，通过众所周知的方法从作为对象的藻类的细胞提取dna，通过pcr法等将rbcl基因的dna片段扩增，利用dna序列分析仪对扩增后的dna片段的碱基序列进行分析，由此能够得到作为对象的藻类的rbcl基因的碱基序列。
[0028]
[药物递送组合物]
在一实施方式中，本发明提供一种药物递送组合物，其包含内包药物的耐酸性细胞。在优选的实施方式中，所述药物局部存在于所述耐酸性细胞具有的袋状膜结构中。
[0029]
＜耐酸性细胞＞在本说明书中，“耐酸性细胞”的意思是指对酸性条件具有抗性的细胞。作为所述酸性条件，具体而言，可以举出ph1～3的ph条件。耐酸性细胞优选为对ph1～4的ph条件具有抗性，更优选为对ph1～5的ph条件具有抗性。对酸性条件“具有抗性”的意思是指在酸性条件下不发生细胞破裂，不发生细胞内容物的溶出。
[0030]
耐酸性细胞可以是活细胞，也可以是死细胞，但是优选为维持细胞的形态的细胞。耐酸性细胞优选为细胞膜和/或其外膜未发生破损、没有发生细胞内容物的溶出的细胞。在耐酸性细胞为活细胞的情况下，该细胞能够在酸性条件下生长。
[0031]
耐酸性细胞的细胞种类没有特别的限定。作为耐酸性细胞，例如可以举出耐酸性的藻类细胞。作为这种藻类细胞，例如可以优选例示从酸性温泉等酸性环境分离出的微藻的细胞。作为这种微藻的具体例子，例如可以举出属于温泉红藻纲(cyanidiophyceae)的藻类。
[0032]
温泉红藻纲分类学上分类为红藻门(rhodophyta)、温泉红藻纲(cyanidiophyceae)。在温泉红藻纲中在当前分类有cyanidioschyzon属、cyanidium属以及galdieria属的三个属。耐酸性细胞可以是属于这些属中的任一个属。例如通过使用了18s rrna基因或叶绿体核酮糖1,5
‑
二磷酸羧化酶/加氧酶大亚单位(rbcl)基因的碱基序列的系统分析，能够判断某个藻类是否属于温泉红藻纲。系统分析只要通过众所周知的方法进行即可。图7中示出了基于属于温泉红藻纲的藻类的rbcl基因的碱基序列的分子系统树。
[0033]
在属于温泉红藻纲的藻类中，存在有具有二倍体的细胞形态以及单倍体的细胞形态双方的藻类。二倍体的细胞形态通过减数分裂而能够产生单倍体的细胞形态。而且，认为单倍体的细胞通过两个细胞的接合而产生二倍体的细胞。单倍体的细胞与二倍体的细胞相比，使用了基因重组技术的转化体的制备是容易的。因此，如后面所述地，在将编码作为药物的肽的基因导入耐酸性细胞的情况下，可以优选使用单倍体的细胞。另外，使用单倍体的细胞制备多个导入了任意药物编码基因的转化体，通过对这些转化体之间进行杂交，由此能够制备兼具多个药物编码基因、内包多个药物的二倍体。
[0034]
对于藻类是二倍体还是单倍体的判断可以通过确认相同基因座的拷贝数来进行。即，若相同基因座的拷贝数为1，则判断为单倍体。另外，也可以利用下一代序列分析仪等判断藻类是单倍体。例如，利用下一代序列分析仪等取得全部基因组的序列读段，将这些序列读段组装后，针对组装得到的序列，对序列读段进行作图定位(mapping)。在二倍体中，在基因组上的各个区域中能够找到各等位基因的碱基的不同，但是在单倍体中，由于只存在一个等位基因，所以无法找到这种区域。或者，也可以用dapi等核染色试剂对细胞进行染色，与已知是单倍体的细胞进行比较，将表示同等的荧光亮度的细胞判断为单倍体，将表示约2倍的荧光亮度的细胞判断为二倍体。或者，也可以用dapi等核染色试剂对细胞进行染色，与已知是二倍体的细胞进行比较，将表示同等的荧光亮度的细胞判断为二倍体，将表示约1/2倍的荧光亮度的细胞判断为
单倍体。
[0035]
为了在肠内快速地释放药物，耐酸性细胞优选为不具有坚固的细胞壁。在本说明书中，“不具有坚固的细胞壁”的意思是指在下述(a)～(c)的细胞破裂处理中的任一种处理中发生细胞破裂。
[0036]
(a)将细胞悬浮在ph7以上的等渗溶液中放置1周以上。(b)将细胞悬浮在蒸馏水中放置1分钟以上。(c)进行细胞的干燥处理并将细胞悬浮在ph7以上的等渗溶液中。在上述(a)～(c)中，在细胞是培养细胞的情况下，也可以在进行各处理之前，通过离心分离等除去培养基，用等渗溶液等对藻类细胞进行清洗。在上述(a)以及(c)中，作为等渗溶液，可以举出包含10％蔗糖以及20mm的hepes的ph7的缓冲液。在上述(c)中，作为干燥处理，可以举出在冰箱内(4℃)的干燥、冷冻干燥等。在干燥处理中使用通过离心分离回收的藻类细胞的沉淀。当在冰箱内干燥的情况下，干燥处理时间根据细胞量的不同而不同，可以例示3天以上。
[0037]
另外，将上述(a)～(c)的细胞破裂处理后的细胞悬浮液离心分离(1500
×
g，3分钟)，求出离心上清液中的蛋白质质量与细胞悬浮液中的总蛋白质质量的比率，由此能够判断是否产生了细胞破裂。具体而言，在通过下列算式求出的破裂率为20％以上的情况下，可以判断为产生了细胞破裂。
[0038][0039]
或者，也可以用光学显微镜(例如倍率600倍)观察细胞悬浮液中的细胞，在产生了细胞破裂的细胞的比率是细胞整体的10％程度以上且优选为20％程度以上的情况下，判断为产生了细胞破裂。
[0040]
在细胞不具有坚固的细胞壁的情况下，在利用光学显微镜的观察(例如倍率600倍)中，通常观察不到细胞壁。另外，通过在ph6以下的条件下的温和的低渗处理是否产生细胞破裂不影响是否为不具有坚固的细胞壁的藻类的判断。
[0041]
在上述(a)以及(c)的细胞破裂处理中，由于可以使用ph7以上的等渗溶液，所以在上述(a)以及(c)的任一种的细胞破裂处理中发生细胞破裂的细胞可以说是在ph7以上的条件下发生细胞破裂的细胞。为了在肠中快速地释放药物，耐酸性细胞优选为在ph7以上的条件下发生细胞破裂的细胞。
[0042]
另外，通过将细胞浸渍到ph7以上的缓冲液等中观察10～30分钟左右，确认藻类细胞是否破裂，由此能够判断该细胞是否为在ph7以上的条件下破裂的细胞。
[0043]
作为具有上述这种特征的耐酸性细胞，在属于温泉红藻纲的藻类中，例如可以举出属于cyanidioschyzon merolae、galdieria属的藻类的单倍体以及属于cyanidium属的藻类的单倍体等。这些藻类可以从酸性温泉等酸性环境下分离，也可以从菌种保藏机构等取得。作为这种菌种保藏，可以举出国立研究开发法人国立环境研究所微生物系统保存设施(日本茨城县筑波市小野川16
‑
2)、american type culture collection(atcc：美国菌种保藏中心；10801university boulevard manassas,va 20110，美国)等。
[0044]
作为属于galdieria属的藻类的单倍体，可以举出galdieria sulphuraria及
galdieria partita的单倍体以及它们的近缘种、变异株以及后代的单倍体等。例如，对从菌种保藏等取得的属于galdieria属的藻类的二倍体到成为静止期为止进行培养，其后也通过继续任意期间培养，在培养液中出现单倍体的细胞。可以回收该单倍体的细胞，作为耐酸性细胞使用。
[0045]
作为属于cyanidium属的藻类的单倍体，可以举出cyanidium sp.yfu3株(ferm bp
‑
22334)(下称“yfu3株”)的单倍体、以及cyanidium sp.hkn1株(ferm bp
‑
22333)(下称“hkn1株”)的单倍体以及它们的近缘种、变异株以及后代等。yfu3株(单倍体)是从日本大分县由布市的温泉的高温酸性水分离出的单细胞红藻。yfu3株在2017年5月30日作为保藏号ferm p
‑
22334保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(特许微生物保藏中心)(日本千叶县木更津市上总镰足2
‑5‑
8)，作为保藏号ferm bp
‑
22334在2018年4月20日移交为国际保藏。hkn1株是从日本神奈川县足柄下郡箱根町的温泉的高温酸性水分离出的单细胞红藻。hkn1株(单倍体)在2017年5月30日作为保藏号ferm p
‑
22333保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(特许微生物保藏中心)，作为保藏号ferm bp
‑
22333在2018年4月20日移交为国际保藏。
[0046]
属于温泉红藻纲的藻类，可以使用微藻培养用的培养基进行培养。作为培养基，没有特别的限定，可以例示包含氮源、磷源、微量元素(锌、硼、钴、铜、锰、钼、铁等)等的无机盐培养基。例如，作为氮源，可以举出铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、尿素、氨类等，作为磷源，可以举出磷酸盐等。作为这种培养基，例如可以举出2
×
allen培养基(allen mb.arch.microbiol.1959 32:270
‑
277.)、m
‑
allen培养基(minoda a et al.plant cell physiol.2004 45:667
‑
71.)、ma2培养基(ohnuma m et al.plant cell physiol.2008jan；49(1):117
‑
20.)等。
[0047]
属于温泉红藻纲的藻类也可以通过使用了酸性温泉排水的培养基进行培养。“酸性温泉排水”的意思是指从温泉设施排出的酸性的排水。作为酸性温泉排水，没有特别的限定，优选为ph1.0～4.0，更优选为ph1.0～3.0。“使用了酸性温泉排水的培养基”的意思是指向酸性温泉排水中添加氮源、磷源、微量元素等而制备出的培养基。作为使用了酸性温泉排水的培养基，优选为向酸性温泉排水添加氮源得到的培养基，更优选为添加了氮源以及磷源得到的培养基(例如参照hirooka s and miyagishima s.y.(2016)cultivation of acidophilic algae galdieria sulphuraria and pseudochlorella sp.ykt1 in media derived from acidic hot springs.front microbiol.dec 20；7:2022.)。作为氮源，可以举出铵盐(硫酸铵等)、尿素、硝酸盐(硝酸钠等)等，优选为铵盐、尿素，更优选为铵盐。作为氮源的添加量，例如，作为氮添加量可以举出1～50mm。对于氮源的添加量，以氮添加量计优选为5～40mm，更优选为10～30mm。作为磷源，可以举出磷酸盐(磷酸二氢钾等)。作为磷源的添加量，以磷添加量计可以举出0.1～10mm，对于磷源的添加量，以磷添加量计优选为0.5～5mm，更优选为1～3mm。作为属于温泉红藻纲的藻类，由于也可以通过使用了酸性温泉排水的培养基进行培养，所以能够有效利用酸性温泉排水，并且能够以低成本进行培养。在属于温泉红藻纲的藻类是属于galdieria属的藻类的情况下，作为上述的氮源，优选为铵盐、尿素，更优选为铵盐。在属于温泉红藻纲的藻类为属于cyanidium属的藻类的情况下，作为上述的氮源，优选为铵盐、硝酸盐，更优选为铵盐。
[0048]
如上所述地，属于温泉红藻纲的藻类，能够在比较宽松的培养条件下高密度地增殖。作为ph条件，可以例示ph1.0～6.0，优选为ph1.0～5.0。当在室外培养的情况下，为了防止其它生物的增殖，优选在酸度高的条件下进行培养，作为这种条件可以举出ph1.0～3.0。作为温度条件，可以例示15～50℃，优选为30～50℃。当在室外进行培养的情况下，为了防止其它生物的增殖，优选在高温下进行培养，作为这种条件可以举出35～50℃。作为光强度，可以例示5～2000μmol/m2s，优选为5～1500μmol/m2s。当在室外培养的情况下，只要在太阳光下培养即可。当在室内培养的情况下，可以在连续光下培养，也可以设置明暗周期(10l:14d等)。
[0049]
＜药物＞对于耐酸性细胞内包的药物没有特别的限定，可以是任意药物。作为药物，例如可以举出低分子化合物、肽、蛋白质、核酸、脂质、糖类、维生素类、激素类、合成高分子化合物等，但不限于这些。其中，优选药物是从由低分子化合物、肽、蛋白质以及核酸构成的组中选择的至少一种的药物。
[0050]
作为低分子化合物，可以没有特别限定地使用作为医药品的有效成分被公众所知的低分子化合物。低分子化合物可以是用于诊断药物的造影剂、荧光色素等。作为低分子化合物，例如可以举出免疫增强剂、抗癌剂、信号传导抑制剂、代谢拮抗剂、镇痛剂、抗炎剂、抗生物质、抗过敏剂、中枢神经系统疾病治疗药、循环器官疾病治疗药、呼吸器官系统疾病治疗药、消化器官系统疾病治疗药、泌尿生殖器官疾病治疗药等、造影剂、荧光色素等，但不限于这些。低分子化合物不限于医药品的有效成分，也可以是食品中的成分(例如氨基酸、维生素等营养成分等)以及食品添加物(香料等)。
[0051]
作为核酸，例如可以举出作为核酸医药使用的核酸分子等(sirna、mirna、反义rna、适配体、引诱物(decoy)、cpg低聚核酸等)。
[0052]
作为合成高分子化合物，可以举出聚烯烃、聚酯、聚酰胺等在工业上制造的高分子化合物且粒状或球状的高分子化合物。其中，也有能够期待免疫增强作用的高分子化合物。药物可以是包含低分子化合物的微胶囊，也可以是缓释性微胶囊或者依赖于温度、ph、压力等环境而释放药物的微胶囊。
[0053]
作为肽或蛋白质(下面也统称为“药物肽”)，可以没有特别限定地使用作为医药品的有效成分已为公知的肽以及蛋白质。作为药物肽，例如可以举出抗原、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体、抗体片段、配体、血液成分蛋白质等，但不限于这些。其中，作为药物肽，优选为具有免疫原性的药物肽。药物肽“具有免疫原性”的意思是指在给予了该药物肽的生物体内能够诱导针对该药物肽的免疫。由药物肽诱导的免疫可以是细胞性免疫，也可以是体液免疫，还可以是它们双方。
[0054]
药物肽更优选为有助于肠道免疫的药物肽。“肠道免疫”的意思是指用于阻止异物从肠道向体内侵入的生物体防御系统。肠道免疫系统由派尔斑(派伊尔氏淋巴集结)等淋巴组织、粘膜固有层的免疫活性细胞、肠道上皮细胞以及存在于其间的淋巴细胞等构成。有助于肠道免疫的药物肽可以是对这些肠道免疫系统中的任一种以上起作用并且强化肠道免疫系统的药物肽。
[0055]
作为有助于肠道免疫的药物肽，例如可以举出病原性微生物或病原性病毒(下面也统称为“病原菌”)的免疫原性肽或免疫原性蛋白质。可以根据本实施方式的药物递送组
合物的适用对象感染的感染病，适当选择免疫原性的药物肽。免疫原性肽或免疫原性蛋白质也称为抗原性肽或抗原性蛋白质。
[0056]
例如，在将本实施方式的药物递送组合物应用于人的情况下，作为药物肽可以使用人病原菌的免疫原性肽或免疫原性蛋白质。作为人的病原菌，例如可以举出狂犬病病毒、轮状病毒、流感病毒、艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒、a型肝炎病毒、b型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、霍乱弧菌、沙门菌、结核菌、肺炎链球菌、炭疽菌、伤寒杆菌等，但不限于这些。例如，在将本实施方式的药物递送组合物应用于家畜的情况下，作为药物肽可以使用家畜病原菌的免疫原性肽或免疫原性蛋白质。作为家畜病原菌，例如可以举出狂犬病病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、赤羽病病毒、牛腺病毒、牛副流感病毒、牛沙门菌、结核菌、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪霍乱病毒、猪链球菌等，但不限于这些。例如，可以使用构成病原性病毒的外膜或衣壳的蛋白质的全长蛋白质或它们的部分肽或者病原性细菌的细胞膜蛋白质的全长蛋白质或它们的部分肽来设计免疫原性肽或免疫原性蛋白质。例如，在病原菌为狂犬病病毒的情况下，作为免疫原性蛋白质，可以例示糖蛋白(碱基序列为序列号1，氨基酸序列为序列号2)的全长或其部分肽。
[0057]
(药物向袋状膜结构的局部存在化)在耐酸性细胞的细胞中，优选药物局部存在于耐酸性细胞所具有的袋状膜结构。在本说明书中，“袋状膜结构”的意思是指由生物体膜或生物膜模拟结构划分为袋状的结构，作为具体例子，可以举出细胞膜、细胞器以及外源性脂质体等。作为细胞器，例如可以举出线粒体、叶绿体、内质网、液泡、细胞核、过氧化物酶体以及高尔基体等，但不限于这些。“外源性脂质体”的意思是指从外部导入细胞的脂质体。药物通过局部存在于耐酸性细胞的袋状膜结构，能够抑制细胞质中的分解酶导致的药物分解。因此，一直到耐酸性细胞被递送至生物体内的规定部位(例如肠)且耐酸性细胞发生细胞破裂为止，能够将药物保护起来以避免由细胞内酶导致的分解。
[0058]
对于使药物局部存在于袋状膜结构的方法没有特别的限定，例如可以举出利用对于向任意袋状结构移动进行指示的信号肽(下称“移动信号”)或者向该袋状结构移动的蛋白质(下称“移动蛋白”)的方法。例如，使将任意袋状结构作为目标的移动信号或移动蛋白与药物结合，导入耐酸性细胞，由此能够使药物局部存在于该袋状结构。例如，在使药物局部存在于线粒体、液泡、过氧化物酶体、内质网、细胞膜、高尔基体以及细胞核中的任意部位的情况下，可以使药物与针对线粒体、液泡、过氧化物酶体、内质网、细胞膜、高尔基体或细胞核的移动信号(信号肽)或移动蛋白结合。对于这些移动信号以及移动蛋白，可以根据耐酸性细胞的种类，选择各种各样的众所周知的移动信号以及移动蛋白。或者，也可以通过利用密度梯度离心等的细胞分级分离法将想要局部存在药物的袋状膜结构从耐酸性细胞分离，分析该袋状膜结构中的蛋白质，由此取得针对该袋状膜结构的移动信号或移动蛋白。
[0059]
例如，在作为耐酸性细胞使用cyanidioschyzon merolae的情况下，作为移动信号或移动蛋白，例如可以使用如下的移动信号或移动蛋白。作为针对叶绿体的移动蛋白，可以使用由叶绿体前蛋白移位酶seca亚基(chloroplast preprotein translocase seca subunit)(cmq393c；碱基序列为序列号3，氨基酸序列为序列号4)的n末端侧130残基(碱基序列为序列号5，氨基酸序列为序列号6)构成的蛋白质等(sumiya et al 2016,proc natl acad sci u s a.113(47):e7629
‑
e7638；
pmid:27837024)。作为针对线粒体的基质的移动信号，可以使用由ef
‑
tu(cms502c)(碱基序列为序列号7，氨基酸序列为序列号8)的n末端侧78残基(碱基序列为序列号9，氨基酸序列为序列号10)构成的肽等(imoto et al 2013,bmj.300(6735):1316
‑
8；pmid:2369666)。作为针对液泡的移动蛋白，可以使用异戊二烯化rab受体pra1(prenylated rab acceptorpra1)(cmj260c)(碱基序列为序列号7，氨基酸序列为序列号8)、abc转运体(abc transporter)(cms401c)(碱基序列为序列号13，氨基酸序列为序列号14)或o
‑
甲基转移酶(o
‑
methyltransferase)(cmt369c)(碱基序列为序列号15，氨基酸序列为序列号16)等(yagisawa et al 2009,plant j.60(5):882
‑
93；pmid:19709388)。作为针对过氧化物酶体的移动蛋白，可以使用过氧化氢酶(catalase)(cmi050c)(碱基序列为序列号17，氨基酸序列为序列号18)(moriyama et al 2014,planta.240(3):585
‑
98；pmid:25009310)。作为针对内质网的移动蛋白，可以使用acc1(cmm188c)(碱基序列为序列号19，氨基酸序列为序列号20)、pap(cmt239c)(碱基序列为序列号21，氨基酸序列为序列号22)或ala1(cmr396c)(碱基序列为序列号23，氨基酸序列为序列号24)等(mori et al 2016,front plant sci.7:958；pmid:27446184)。作为针对细胞膜的移动蛋白，可以使用ala1(cmr396c)等(mori et al 2016,front plant sci.7:958；pmid:27446184)。由于ala1(cmr396c)也是针对内质网的移动蛋白，所以通过使用ala1(cmr396c)，能够使药物局部存在于细胞膜以及内质网双方。作为针对高尔基体的移动蛋白，可以使用got1(cmi302c)(碱基序列为序列号25，氨基酸序列：序列号286)等(yagisawa et al 2013,protoplasma.250(4)：943
‑
8；pmid：23197134)。作为针对细胞核的移动蛋白，可以使用拓扑异构酶i型ib(topoisomerase i type ib)(cmm263c)(碱基序列：序列号27，氨基酸序列：序列号28)等(moriyama et al 2014,genome biol evol.6(1)：228
‑
37；pmid：24407855)。
[0060]
在药物为药物肽的情况下，所述药物肽可以作为与移动信号或移动蛋白的融合蛋白而内包于耐酸性细胞中。通过使药物肽成为与移动信号或移动蛋白的融合蛋白，能够使药物局部存在于该移动信号或移动蛋白作为目标的袋状膜结构。例如，通过将编码药物肽与移动信号或移动蛋白的融合蛋白的基因(下面也称为“融合蛋白基因”)导入耐酸性细胞并且在该耐酸性细胞内表达融合蛋白，该融合蛋白移动至所述移动信号或移动蛋白作为目标的袋状膜结构。作为其结果，所述融合蛋白中包含的药物肽局部存在于所述袋状膜结构。因此，在优选的方式中，耐酸性细胞是以可表达的状态导入了包含移动信号或移动蛋白与药物肽的融合蛋白的融合蛋白基因的细胞，并且是具有所述融合蛋白基因的细胞。另外，在优选的方式中，耐酸性细胞是表达了所述融合蛋白基因的细胞。所述融合蛋白基因除了包含药物肽的编码序列以及移动信号或移动蛋白的编码序列以外，还可以包含编码提高肠道细胞的识别的肽的序列等。作为提高肠道细胞的识别的肽，例如可以举出co1肽(序列号43)等。
[0061]
药物肽与移动信号或移动蛋白的融合蛋白基因优选可操作地连接于耐酸性细胞
中能够发挥功能的启动子。启动子只要是在耐酸性细胞中能够发挥功能的启动子，则没有特别的限定，从维持细胞内的药物量的观点出发，优选表达量多的持家基因的启动子。例如，在耐酸性细胞是cyanidioschyzon merolae的情况下，作为启动子，例如可以适合使用apcc(cmo250c)的启动子(例，
‑
600～
‑
1；
“‑
1”表示紧靠起始密码子的前面的核苷酸)、cpcc(cmp166c)的启动子、过氧化氢酶(cmi050c)的启动子等。cyanidioschyzon merolae的apcc的启动子序列示于序列号29，cyanidioschyzon merolae的cpcc(cmp166c)的启动子序列示于序列号30，cyanidioschyzon merolae的过氧化氢酶(cmi050c)的启动子序列示于序列号31。这些cyanidioschyzon merolae的启动子也可以在其它的属于温泉红藻纲的藻类中使用。
[0062]
对于编码所述融合蛋白的基因而言，以可表达的状态导入耐酸性细胞，例如以表达载体的形态导入耐酸性细胞。表达载体除了包含所述融合蛋白以及启动子以外，还可以包含增强子、多聚a附加信号、终止子、3’utr等控制序列、药剂抗性基因等标记基因。作为终止子以及3’utr，例如可以例示β微管蛋白的3’utr。对于载体的种类没有特别的限定，可以根据耐酸性细胞的种类适当选择使用通常使用的表达载体。载体可以是直链状，也可以是环状，可以为质粒等非病毒载体，也可以为病毒载体(例如，慢病毒载体等逆转录病毒载体)，还可以是基于转座子的载体。
[0063]
在耐酸性细胞为cyanidioschyzon merolae的情况下，作为选择标记，可以使用ura5.3基因(cmk046c)。在cyanidioschyzon merolae中存在作为尿嘧啶营养缺陷型的变异株的cyanidioschyzon merolae m4株(minoda et al.,plant cell physiol.2004jun；45(6)：667
‑
71.)。cyanidioschyzon merolae m4株在ura5.3基因具有变异，无法合成尿嘧啶。因此，cyanidioschyzon merolae m4株在不含尿嘧啶的培养基中无法生长。因此，通过将cyanidioschyzon merolae m4株作为亲株并将野生株的ura5.3基因用于选择标记，由此能够选择导入了融合基因的转化体。更具体而言，将可操作地连接于启动子的所述融合蛋白基因与cyanidioschyzon merolae野生株(例如，10d株)的ura5.3基因集连接，导入cyanidioschyzon merolae m4株。其后，通过在不含尿嘧啶的培养基中进行培养，由此能够得到导入了所述融合蛋白基因的细胞。
[0064]
对于将任意的融合蛋白基因导入耐酸性细胞的方法没有特别的限定，可以使用众所周知的方法。作为基因导入法，例如可以举出聚乙二醇法、脂质体转染法、微注射法、deae葡聚糖法、基因枪法、电穿孔法、磷酸钙法等。
[0065]
融合蛋白基因在耐酸性细胞中可以作为质粒等存在，也可以插入核基因组、叶绿体基因组以及线粒体基因组中的任一方。在将融合蛋白基因插入基因组的情况下，可以插入基因组的特定位置，也可以随机地插入基因组。作为将融合蛋白基因插入基因组的特定的位置的方法，可以使用同源重组。例如，对于cyanidioschyzon merolae，由于已经完成了全基因组序列的解读(matsuzaki m et al.,nature.2004apr 8；428(6983)：653
‑
7.)，所以能够将融合蛋白基因插入基因组上的所希望的位置。对于cyanidioschyzon merolae的融合蛋白基因的插入位置没有特别的限定，例如可以例示cmd184c与cmd185c之间的区域。
[0066]
在融合蛋白基因中，配置药物肽以及移动信号或移动蛋白的顺序可以根据移动信号或移动蛋白的种类适当选择。通常，移动信号或移动蛋白的编码序列配置在比药物肽的
编码序列更靠5’侧。
[0067]
在将编码药物肽的基因(下称“药物肽基因”)插入叶绿体基因组或线粒体基因组的情况下，药物肽无需一定是与移动信号或移动蛋白的融合蛋白。例如，将药物肽基因与在叶绿体中能够发挥功能的启动子可操作地连接，以可表达的状态插入叶绿体基因组，在叶绿体内表达药物肽基因，由此能够使药物肽局部存在于叶绿体。同样地，将药物肽基因与在线粒体中能够发挥功能的启动子可操作地连接，以可表达的状态插入线粒体基因组，使药物肽基因在线粒体内表达，由此能够使药物肽局部存在于线粒体。
[0068]
在本实施方式的药物递送组合物中，药物优选为局部存在于细胞器，更优选为局部存在于叶绿体。另外，药物优选为药物肽，优选以与移动信号或移动蛋白的融合蛋白的形态局部存在于成为该移动信号或移动蛋白的目标的细胞器。所述移动信号或移动蛋白更优选为叶绿体移动信号或叶绿体移动蛋白。
[0069]
＜任意成分＞本实施方式的药物递送组合物除了包含所述耐酸性细胞以外，还可以包含其它成分。作为其它成分，没有特别的限定，例如可以举出药学上容许的载体等。“药学上容许的载体”的意思是指不妨碍耐酸性细胞内包药物的功能且对该给药对象不显示实质上的毒性的载体。“不显示实质上的毒性”的意思是指其成分在通常使用的给药量下对给药对象不显示毒性。作为药学上容许的载体，没有特别的限定，可以举出赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、乳化剂、稳定剂、稀释剂、油性基剂、增粘剂、抗氧化剂、还原剂、氧化剂、鳌和剂、溶剂等。药学上容许的载体可以单独使用一种，也可以并用两种以上。药学上容许的载体优选为对耐酸性细胞不造成损伤的载体。
[0070]
本实施方式的药物递送组合物可以适当地与其它成分混合，按照通用方法形成为颗粒剂、片剂、胶状剂、液体制剂、胶囊剂等的形态。在这些药剂形态中，优选为对耐酸性细胞不造成损伤的药剂形态，例如优选为胶状剂、液体制剂、胶囊剂等。例如，如后述的实施例所示，可以作为包含耐酸性细胞的海藻酸的固化体的形态。另外，除了海藻酸以外，也可以使用明胶、琼脂、卡拉胶、槐豆胶、瓜尔胶、黄原胶、果胶、结冷胶、罗望子胶、阿拉伯树胶等增粘剂或凝胶化剂，将包含耐酸性细胞的悬浮液固化，用作本实施方式的药物递送组合物。对用于所述耐酸性细胞的悬浮的介质没有特别的限定，优选为不使耐酸性细胞发生细胞破裂的介质，优选为ph1～6左右的等渗溶液。作为所述等渗溶液，例如可以举出用于耐酸性细胞的培养的培养基以及调整成ph1～6左右的葡萄糖等渗溶液、蔗糖等渗溶液以及各种缓冲液(磷酸缓冲生理盐水、hepes缓冲液、柠檬酸缓冲液、tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)等)等。在一实施方式中，药物递送组合物是利用增粘剂或凝胶化剂的耐酸性细胞的固化体。通过使药物递送组合物成为利用增粘剂和/或凝胶化剂的固化体，能够防止耐酸性细胞的干燥。“利用增粘剂或凝胶化剂的耐酸性细胞的固化体”是指用增粘剂或凝胶化剂将耐酸性细胞的悬浮液凝胶化、固化得到的固化体。换言之，“利用增粘剂或凝胶化剂的耐酸性细胞的固化体”是含有耐酸性细胞以及由增粘剂及凝胶化剂构成的组中选择的至少一种的凝胶组合物。
[0071]
对于本实施方式的药物递送组合物的给药路径没有特别的限定，可以口服给药也可以是非口服给药，优选为口服给药。在本实施方式的药物递送组合物中，由于药物内包于耐酸性细胞中，所以能够抑制胃酸导致的药物分解。因此，本实施方式的药物递送组合物适
合口服给药。本实施方式的药物递送组合物的药物递送目标优选为肠(肠道)，更优选为小肠。若口服给予本实施方式的药物递送组合物，则药物被保护在耐酸性细胞的细胞内并通过胃。接着，当到达肠时，由于肠道内的中性～弱碱性的ph条件(ph7以上)，耐酸性细胞发生细胞破裂，药物释放到肠道内。释放到肠道内的药物在肠道内起作用，有助于肠道免疫的强化等。此外，通过肠道免疫的强化，也能够期待激活其它的粘膜免疫以及全身免疫。
[0072]
如以上所述的，根据本实施方式的药物递送组合物，由于药物内包于耐酸性细胞中，所以能够抑制胃中的药物的分解，能够将药物递送至肠。另外，在耐酸性细胞中，由于药物局部存在于袋状膜结构，所以将药物保护起来以避免由细胞质中的分解酶导致的分解。此外，通过使用导入了药物肽基因或包含药物肽的编码序列的融合蛋白基因的耐酸性细胞，能够简易地使内包药物的耐酸性细胞增殖。尤其是，属于温泉红藻纲的藻类由于在酸度高且其它生物无法生存的条件下也能够增殖，所以也能够在室外大量培养。因此，能够期待降低制造成本。
[0073]
[饲料]在一实施方式中，本发明提供一种包含上述实施方式的药物递送组合物的饲料。
[0074]
对于给予本实施方式的饲料的动物种类没有特别的限定。例如可以举出家畜类(牛、猪、鸡、马、绵羊、山羊等)、宠物(狗、猫、仓鼠、兔、鹦鹉、热带鱼、爬行动物类、两栖类、昆虫等)、水产动物(鱼类、贝类等)、试验动物(小鼠、大鼠、豚鼠等)等，但不限于这些。
[0075]
本实施方式的饲料除了上述实施方式的药物递送组合物以外，还可以包含其它成分。作为其它成分，例如可以举出通常使用的饲料(包括家畜饲料、水产饲料、宠物食品)等。例如，上述实施方式的药物递送组合物可以作为饲料添加剂来添加到已有的饲料中。对于添加上述实施方式的药物递送组合物的饲料没有特别的限定，可以根据对象动物适当选择。通过将所述实施方式的药物递送组合物添加到通常饲料中来给予动物，能够使动物通过通常的摄食行动来摄取药物。
[0076]
用于本实施方式的饲料的所述药物递送组合物可以是任何形态，但为了防止药物从所述耐酸性细胞漏出，优选为不损伤所述耐酸性细胞的细胞的形态。例如可以举出上述例示过的胶状剂、胶囊剂以及通过凝胶化剂和/或增粘剂固化了的形态等。在将所述药物递送组合物作为饲料添加物添加到饲料中的情况下，例如只要将利用增粘剂和/或凝胶化剂的所述药物递送组合物的固化体调整成适当的大小并添加到饲料中进行混合即可。或者，也可以在将所述药物递送组合物添加到饲料中并进行混合后，使用凝胶化剂和/或增粘剂将混合物固化。可以根据动物的大小，将所述固化体酌情制备成适当的大小。通过形成为利用增粘剂和/或凝胶化剂的固化体，能够防止耐酸性细胞的干燥。
[0077]
对于本实施方式的饲料中的上述实施方式的药物递送组合物的含量没有特别的限定，可以根据饲料的种类适当地设定。例如，作为饲料中的药物递送组合物的含量，可以例示0.01～80质量％，优选为0.1～70质量％，进一步优选为0.1～60质量％，特别优选为0.1～50质量％。作为饲料中的耐酸性细胞的含量，例如可以例示0.1～100mg(湿重)/g、0.5～80mg(湿重)/g、1～60mg(湿重)/g等。
[0078]
根据本实施方式的饲料，由于包含上述实施方式的药物递送组合物，所以能够将任意药物作为饲料使动物摄取。如上所述地，所述药物递送组合物能够将任意药物保护起
来以避免胃中分解并且递送至肠。因此，通过将在肠中起作用的药物用于所述药物递送组合物，能够有效地使该药物作用于动物的肠。另外，在药物是具有免疫原性的药物肽的情况下，对于摄取了药物递送组合物的动物，能够有效地激活肠道免疫。此外，通过激活肠道免疫，也能够期待激活其它的粘膜免疫以及全身免疫。
[0079]
在另外的方式中，本发明提供一种动物的饲养方法，其包括使动物摄食包含上述实施方式的药物递送组合物的饲料。此外，在另外的方式中，本发明提供一种对动物赋予肠道免疫的方法，其包括使动物摄食包含上述实施方式的药物递送组合物的饲料。
[0080]
[医药品]在一实施方式中，本发明提供一种包含上述实施方式的药物递送组合物的医药品。
[0081]
本实施方式的医药品可以是人用医药品，也可以是动物用医药品。在动物用医药品的情况下，对适用的动物种类没有特别的限定。例如可以举出家畜类(牛、猪、鸡、马、绵羊、山羊等)、宠物(狗、猫、仓鼠、兔、鹦鹉、热带鱼、爬行动物类、两栖类、昆虫等)、水产动物(鱼类、贝类等)、试验动物(小鼠、大鼠、豚鼠等)等，但不限于这些。
[0082]
本实施方式的医药品除了上述实施方式的药物递送组合物以外，还可以包含其它成分。作为其它成分，没有特别的限定，可以举出药学上容许的载体。“药学上容许的载体”的意思是指不妨碍药物的功能且对其给药对象不显示实质上的毒性载体。另外，“不显示实质上的毒性”的意思是指其成分在通常使用的给药量内对给药对象不显示毒性。作为药学上容许的载体，没有特别的限定，可以举出赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、乳化剂、稳定剂、稀释剂、油性基剂、增粘剂、抗氧化剂、还原剂、氧化剂、鳌和剂、溶剂等。药学上容许的载体可以单独使用一种，也可以并用两种以上。其它成分可以是上述以外的成分，例如可以没有特别限制地使用通常用于医药品的医药品添加物。另外，其它成分也可以是除了上述药物递送组合物中包含的药物以外的活性成分。对于上述活性物质没有特别的限定，例如可以举出整肠剂、抗炎剂、抗生物质、抗菌性物质、生药、结构促进剂、退热剂、镇痛剂等。
[0083]
对于本实施方式的医药品的剂型没有特别的限定，但是为了防止药物从所述耐酸性细胞漏出，优选为所述耐酸性细胞不发生细胞损伤的形态。例如可以举出片剂、颗粒剂、胶状剂、胶囊剂、液体制剂及糖浆剂等。例如，本实施方式的医药品也可以包含利用增粘剂和/或凝胶化剂的耐酸性细胞的固化体。
[0084]
本实施方式的医药品中的上述实施方式的药物递送组合物的含量没有特别的限定，可以根据所述药物递送组合物包含的药剂的种类，适当地设定含量。例如，作为医药品中的药物递送组合物的含量，可以例示0.01～80质量％，优选为0.1～70质量％，进一步优选为0.1～60质量％，特别优选为0.1～50质量％。作为医药品中的耐酸性细胞的含量，例如可以例示0.1～100mg(湿重)/g、0.5～80mg(湿重)/g、1～60mg(湿重)/g等。
[0085]
本实施方式的医药品的给药路径没有特别的限定，可以是口服给药，也可以是非口服给药，优选为口服给药。对于本实施方式的医药品，由于药物内包于耐酸性细胞中，所以能够抑制胃酸导致的药物分解。本实施方式的医药品的药物递送目标优选为肠(肠道)，更优选为小肠。
[0086]
基于本实施方式的医药品，由于包含上述实施方式的药物递送组合物，所以能够
将任意药物保护起来以避免胃中分解，从而能够将药物递送至肠内。因此，通过将在肠中起作用的药物用于所述药物递送组合物，能够有效地使该药物作用于肠。另外，在药物是具有免疫原性的药物肽的情况下，对于摄取了药物递送组合物的动物，能够有效地激活肠道免疫。此外，通过激活肠道免疫，也能够期待激活其它的粘膜免疫以及全身免疫。因此，本实施方式的医药品能够用于人的疾病的预防、治疗、增进健康。尤其适合用于如下药物：希望不在胃中而在肠中吸收的药物，因胃酸而分解或变得不溶从而妨碍肠内吸收的药物，用于肠内一次吸收多种药物的医药品等。
[0087]
在另外的方式中，本发明提供一种药物的给药方法，其包括向对象口服给予包含上述实施方式的药物递送组合物的医药品。此外，在另外的方式中，本发明提供一种向对象赋予肠道免疫的方法，其包括向对象口服给予包含上述实施方式的药物递送组合物的医药品。
[0088]
[食品]在一实施方式中，本发明提供一种包含上述实施方式的药物递送组合物的食品。
[0089]
本实施方式的食品可以是通常食品也可以是营养辅助食品、功能性食品或保健品等。所述药物递送组合物可以作为食品添加剂添加到食品中。
[0090]
在本实施方式的食品中，食品的种类没有特别的限定，但是为了防止药物从所述耐酸性细胞漏出，优选为所述耐酸性细胞不发生细胞损伤的形态，优选不是干燥食品。作为食品，例如可以举出：青汁(green juice)、清凉饮料、碳酸饮料、营养饮料、水果饮料、蔬菜饮料、乳酸饮料、乳饮料、运动饮料、茶、咖啡等饮料；咖喱酱、炖菜汤、速溶汤等各种汤类；冰激凌、冰冻果子露、刨冰等冰制食品类；饴糖、果冻、果酱、奶油等糕点类；鱼糕、鱼肉山芋饼、火腿、香肠等水产
·
畜产加工食品；加工乳、发酵乳、黄油、芝士、酸奶等乳制品；沙司、色拉调料、味噌、酱油、调味汁等调味料；各种软罐头食品等其它加工食品等；但不限于这些。
[0091]
在本实施方式的食品中，所述药物递送组合物的含量没有特别的限定，可以根据食品种类进行适当设定。例如，考虑食品的味道等，作为食品中的药物递送组合物的含量，可以例示0.01～80质量％，优选为0.1～70质量％，进一步优选为0.1～60质量％，特别优选为0.1～50质量％。作为食品中的耐酸性细胞的含量，例如可以例示0.1～100mg(湿重)/g、0.5～80mg(湿重)/g、1～60mg(湿重)/g等。
[0092]
另外，在食品为功能性食品、营养辅助食品或保健品等的情况下，可以是上述这种通常食品的形态，也可以是颗粒剂、片剂、胶状剂、饮剂等形态。例如，本实施方式的食品可以包含利用增粘剂和/或凝胶化剂的耐酸性细胞的固化体。
[0093]
根据本实施方式的食品，由于包含上述实施方式的药物递送组合物，所以可以将任意药物作为食品摄取。如上所述地，所述药物递送组合物能够将任意药物保护起来以避免胃中分解从而能够递送至肠内。本实施方式的食品在想要不受胃酸的影响地在肠内吸收一个以上的特定营养成分的情况下是有用的。
[0094]
[药物载体]在一实施方式中，本发明提供一种包含耐酸性细胞的药物载体。本实施方式的药物载体包含的耐酸性细胞与上述“[药物递送组合物]”的“＜耐酸性细胞＞”中已说明过的耐酸性细胞相同，优选的例子也可以举出同样的例子。所述耐酸性细胞对酸具有抗性，即使在胃这种酸性环境下细胞也不破损。因此，通过将药物内包在细胞
中，可以作为耐酸性的药物载体使用。将药物内包在细胞中的方法可以举出与上述“[药物递送组合物]”中记载的方法相同的方法。本实施方式的药物载体优选由耐酸性细胞构成。本实施方式的药物载体可以适合用于将药物递送至肠内，可以适合用于口服给药的医药品或者口服摄取的饲料或食品。
[0095]
[药物胶囊]在一实施方式中，本发明提供一种在所述实施方式的药物载体中内包有药物的药物胶囊。所述耐酸性细胞在细胞中内包有药物，如在后述的实施例中所示，在胃这种酸性环境下，几乎不会发生药物的释放。因此，包含所述耐酸性细胞的药物载体通过在所述耐酸性细胞的细胞中内包药物，能够用作耐酸性的药物胶囊。本实施方式的药物胶囊将把药物递送至肠内作为目的，可以用作口服药物胶囊。
[0096]
[耐酸性细胞]在一实施方式中，本发明提供一种在细胞中内包药物的耐酸性细胞。在优选的实施方式中，所述药物局部存在于耐酸性细胞所具有的袋状膜结构。本实施方式的耐酸性细胞与上述实施方式的药物递送组合物包含的耐酸性细胞相同，优选的例子也可以举出相同的例子。或者，所述药物局部存在于耐酸性细胞所具有的袋状膜结构之外。在药物局部存在于袋状膜结构之外的情况下，药物存在于耐酸性细胞的细胞质。
[0097]
药物没有特别的限定，例如优选从由低分子化合物、肽、蛋白质以及核酸构成的组中选择的至少一种药物。例如，在会受到来自细胞质中分解酶等影响的药物的情况下，优选药物局部存在于袋状膜结构中。通过局部存在于袋状膜结构，能够将药物保护起来以避免来自细胞质中分解酶等的影响。因此，能够有效地将药物递送至生物体内的规定部位。例如，在药物为肽、蛋白质或核酸的情况下，容易受到细胞质中的蛋白酶或核酸酶的影响；因此，优选为局部存在于袋状膜结构中。另一方面，在作为难以受到细胞质中的分解酶等的影响的药物(例如低分子化合物)的情况下，药物也可以局部存在于袋状膜结构外。
[0098]
另外，在一实施方式中，本发明提供一种包含外源性物质的耐酸性细胞。本实施方式的耐酸性细胞与上述“[药物递送组合物]”的“＜耐酸性细胞＞”中已说明过的耐酸性细胞相同，优选的例子也是相同的。外源性物质没有特别的限定，可以举出药物、毒物、染料、香料、以及对生物体的作用不明的化合物等，但不限于这些。所述外源性物质导入耐酸性细胞的导入方法没有特别的限定，例如可以举出：与细胞透过性物质(细胞透过性肽等)结合的方法，以及内包在细胞透过型微团内的方法等。另外，在外源性物质为药物的情况下，可以举出与上述“[药物递送组合物]”所述的方法相同的方法。本实施方式的耐酸性细胞例如可以用于递送外源性物质。更具体而言，本实施方式的耐酸性细胞可以应用于口服用组合物，该口服用组合物用于将外源性物质递送至肠内。
[0099]
此外，在另外的方式中，本发明提供一种含有所述耐酸性细胞的饲料。此外，在另外的方式中，本发明提供一种含有所述耐酸性细胞的医药品。此外，在另外的方式中，本发明提供一种含有所述耐酸性细胞的食品。
此外，在另外的方式中，本发明提供一种所述外源性物质的给药方法，其包括向对象口服给予所述耐酸性细胞。此外，在另外的方式中，本发明提供一种动物的饲养方法，其包括使动物摄食所述耐酸性细胞。此外，在另外的方式中，本发明提供一种肠道免疫的赋予方法，其包括口服给予所述耐酸性细胞。
[0100]
[耐酸性细胞的制造方法]在一实施方式中，本发明提供一种内包有药物的耐酸性细胞的制造方法，其包括将编码融合蛋白的基因导入耐酸性细胞的步骤，所述融合蛋白包含：作为药物的肽或蛋白质，以及相对于细胞膜或细胞器局部存在的肽或蛋白质。本实施方式的制造方法可以通过在上述“[药物递送组合物]＜耐酸性细胞＞(药物向袋状膜结构的局部存在化)”中记载的方式来进行。实施例
[0101]
下面，通过实施例对本发明进行说明，但是本发明不限于下面的实施例。
[0102]
[实施例1](gapdh
‑
gp
‑
sfgfp表达株的制备)为了将gapdh
‑
gp
‑
sfgfp的dna片段插入cyanidioschyzon merolae 10d的染色体的cmd184c(基因编号)的下游，首先如以下所示地制备了质粒pd184
‑
hsp
‑
gapdh
‑
gp
‑
sfgfp。该质粒设计成在pqe80质粒(大肠杆菌内的维持、复制用；qiagen公司制)的多克隆位点依次排列下面的序列。序列从5’侧开始依次排列成cmd184c基因的后半部(基因可读框(orf)的773bp
‑
2773bp以及包括终止密码子的下游25bp)、热激(hs)启动子(接近hsp20/cmj101c基因起始密码子的上游的序列200bp；sumiya et al2014,plos one.22；9(10)：e111261；pmid：25337786)、gapdh(cmj042c基因的可读框1bp
‑
1209bp；gapdh记载于moriyama et al2014,planta.240(3)：585
‑
98；pmid：25009310)、狂犬病病毒糖蛋白基因gp(orf全长1
‑
1572bp，uniprotkb accession no.p19462)、β微管蛋白终止子(β
‑
tubulin/cmn263c基因的包括终止密码子的下游200bp)、ura筛选标记以及cmd185基因的下游(从终止密码子下游28bp到1880bp的碱基序列)。为了加热培养基诱导gapdh
‑
gp
‑
sfgfp的表达，hs启动子是必需的。ura筛选标记是gapdh
‑
gp
‑
sfgfp株的筛选所必需的。为了通过同源重组将dna片段插入cmd184c下游，cmd184c的后半部和下游的序列以及cmd185c基因的下游是必需的。
[0103]
首先，为了制备质粒pd184
‑
hsp
‑
gapdh
‑
gp
‑
sfgfp，准备了下面的(1)、(2)、(3)、(4)以及(5)的各dna片段。(1)将质粒pd184
‑
apccp
‑
egfp
‑
ura
cm
‑
cm
(包含pqe80(序列号32)、cmd184c的后半部(序列号33)、apcc启动子(序列号34)、egfp(序列号35)、β微管蛋白终止子(序列号36)、ura筛选标记(序列号37)以及cmd185c基因的下游的dna序列(序列号38)；fujiwara et al 2013,plos one.8(9)：e73608；pmid：24039997)作为模板，使用引物组[#1d184( 25)r/#2bt3’( 1)f]，通过pcr法，将除了apcc启动子以及egfp的部分的dna序列扩增。(1)的dna片段的碱基序列示于序列号31。(2)将c.merolae 10d的基因组dna作为模板，使用引物组[#3hs(
‑
200)fd184/#4hs
(
‑
1)r]，通过pcr法将hs启动子的dna序列(序列号39)扩增。(3)将c.merolae 10d的基因组dna作为模板，使用引物组[#5j042(1)fhs/#6j042(1209)r
‑
link3]，通过pcr法将gapdh基因可读框(序列号40)扩增。(4)根据c.merolae的密码子使用频率对gp的dna序列进行了化学合成(序列号41)，将其作为模板，使用引物组[#7gp(1)f
‑
linker3/#8gp(1572)r
‑
linker2]，通过pcr法进行了扩增。(5)将papcc
‑
promoter
‑
sfgfp
‑
pme2f
‑
ura(miyagishima et al 2014,nat commun.5：3807；pmid：24806410)作为模板，使用引物组[#9sfgfp(1)f
‑
linker2/#10sfgfp(714)rbt]，通过pcr法将sfgfp(序列号42)扩增。
[0104]
将上述(1)、(2)、(3)、(4)以及(5)的各dna片段混合，使用in
‑
fusion(注册商标)hd cloning kit(产品编号为639648，takara)，将它们融合，以置换pd184
‑
apccp
‑
egfp
‑
ura
cm
‑
gs
的apcc启动子以及egfp的部分的方式插入hs启动子、gapdh、gp以及sfgfp。infusion反应后，导入大肠杆菌感受态细胞，将质粒扩增，得到了pd184
‑
hsp
‑
gapdh
‑
gp
‑
sfgfp。接着，将其作为模板，使用引物组[#11d184(1200)f/#12d184( 1400)r]，通过pcr法，将连接有cmd184基因的后半部(基因orf的1200bp
‑
2773bp以及包括终止密码子的下游25bp)、hs启动子、gapdh、gp、sfgfp、β微管蛋白终止子、ura筛选标记以及cmd184c基因的下游(从终止密码子下游28bp到1440bp的碱基序列)的dna片段扩增。通过peg法(ohnuma et al 2008,plant cell physiol.49(1)：117
‑
20；pmid：18003671)将该dna片段导入c.merolae的尿嘧啶营养缺陷型株m4(minoda et al 2004,plant cell physiol.45(6)：667
‑
71.；pmid：15215501)，使用不含有尿嘧啶的ma2固体培养基进行筛选，得到了gapdh
‑
gp
‑
sfgfp表达株。
[0105]
(gapdh
‑
gp
‑
sfgfp蛋白质的蛋白酶体引起的分解的评价)对如上所述地制备出的c.merolae的gapdh
‑
gp
‑
sfgfp表达株(下称“gapdh
‑
gp
‑
sfgfp表达株”)在放入锥形瓶的ma2培养基60ml中以od750＝0.2的细胞浓度进行继代培养，在光照射下(50μmolm
‑2s
‑1)、40℃下进行了2天的旋转培养(表达前)。接着，将该培养液每次20ml地转移到两个锥形瓶中。为了通过热刺激诱导gapdh
‑
gp
‑
sfgfp基因表达，将所述两个锥形瓶转移到50℃的恒温箱内，在光照射下持续1小时进行了旋转培养。在就要转移到50℃下之前，为了阻碍蛋白酶体对蛋白质的分解，在所述两个锥形瓶的一方中以最终浓度成为100μm的方式添加了蛋白酶体抑制剂mg
‑
132(mg
‑
132( ))(nishida et al 2005；mol biol cell.16(5)：2493
‑
502；pmid：15772156)。在另一方的锥形瓶中作为对照仅添加了40μl的作为mg
‑
132的溶剂的dmso(mg
‑
132(
‑
))。通过免疫印迹法，确认gapdh
‑
gp
‑
sfgfp蛋白质的表达，通过带型的比较，验证了蛋白酶体抑制的效果。在gapdh
‑
gp
‑
sfgfp蛋白质的检测中使用了抗gfp抗体(clone jl
‑
8，产品编号为632381，takara)。
[0106]
图1中示出了免疫印迹的结果。在mg
‑
132(
‑
)中，与mg
‑
132( )相比较，gapdh
‑
gp
‑
sfgfp蛋白质的带变薄。根据该结果，显示出了gapdh
‑
gp
‑
sfgfp蛋白质在表达后有一部分被蛋白酶体分解。
[0107]
(gapdh
‑
gp
‑
sfgfp蛋白质的细胞内局部存在的分析)为了对gapdh
‑
gp
‑
sfgfp蛋白质的细胞内局部存在进行分析，在光照射下、50℃、mg
‑
132存在下对gapdh
‑
gp
‑
sfgfp表达株进行了1小时的培养后，用荧光显微镜观察了
gapdh
‑
gp
‑
sfgfp蛋白质的荧光。
[0108]
图2中示出了gapdh
‑
gp
‑
sfgfp表达株的荧光显微镜图像。根据sfgfp的荧光信号，显示了gapdh
‑
gp
‑
sfgfp蛋白质局部存在于细胞质。图2(a)的图像(pc)是表示细胞的轮廓的相位差显微镜图像，图2(b)的图像(chl)是叶绿体的自发荧光图像，图2(c)的图像(sfgfp)是sfgfp的荧光图像。
[0109]
[实施例2](chl
‑
tp
‑
3ha
‑
gp
‑
col表达株的制备)为了将用于表达chl
‑
tp
‑
3ha
‑
gp
‑
col(参照图3)的dna片段插入c.merolae 10d的染色体的cmd184c(基因编号)的下游，首先如以下所示地制备了质粒pd184
‑
apccp
‑
chl
‑
tp
‑
3ha
‑
gp
‑
col。该质粒设计成在pqe80质粒的多克隆位点从5’侧依次排列下面的序列。序列从5’侧开始依次排列成cmd184c基因的后半部(基因orf的773bp
‑
2773bp以及包括终止密码子的下游25bp)、apcc启动子(接近apcc/cmo250c基因起始密码子的上游的序列600bp)、叶绿体移动信号chl
‑
tp(seca/cmq393c基因orf的1bp
‑
390bp；sumiya et al2016,proc natl acad sci u s a.113(47):e7629
‑
e7638；pmid：27837024)、编码3xha标签的序列(用于利用ha抗体确认表达)、狂犬病病毒糖蛋白基因gp(1572bp，uniprotkb accession no.p19462)、编码col肽的序列(col肽：sfhqlparsplp(序列号43)、提高与肠道免疫有关的m细胞的抗原识别的肽；kim et al 2010,j immunol.185(10)：5787
‑
95；pmid：20952686)、β微管蛋白基因终止子(β
‑
tubulin/cmn263c基因的包括终止密码子的下游200bp)、ura
cm
‑
gs
筛选标记以及cmd185基因的下游(从终止密码子下游28bp到880bp的碱基序列)。为了通过同源重组将dna片段插入cmd184c下游，cmd184c的后半部和下游的序列以及cmd185基因的下游是必需的。为了不断地表达chl
‑
tp
‑
ha
‑
gp
‑
col，apcc启动子是必需的(watanabe et al 2011,j gen appl microbiol.57(1)：69
‑
72；pmid：21478650)。为了筛选插入了chl
‑
tp
‑
3ha
‑
gp
‑
col的转化体，ura
cm
‑
gs
筛选标记是必需的(imamura et al 2010,plant cell physiol.51(5)：707
‑
17；pmid：20375110)，此外能够提高使该基因多拷贝化的蛋白质表达量(fujiwara et al 2013,plos one 8(9)：e73608；pmid：24039997)。
[0110]
为了制备质粒pd184
‑
apccp
‑
chl
‑
tp
‑
ha
‑
gp
‑
col，准备了下面的(1)、(2)、(3)以及(4)的dna片段。(1)将质粒pd184
‑
apccp
‑
egfp
‑
ura
cm
‑
gs
(包括pqe80(序列号32)、cmd184c的后半部(序列号33)、apcc启动子(序列号34)、egfp(序列号35)、β微管蛋白终止子(序列号36)、ura
cm
‑
gs
筛选标记(序列号44)以及cmd185基因的下游的dna序列(序列号38)；fujiwara et al 2013,plos one.8(9)：e73608；pmid：24039997)作为模板，使用引物[#13apcc(
‑
1)r/#14bt3’( 1)]，通过pcr法，对除了egfp的部分的dna序列进行了扩增。(2)将c.merolae 10d的基因组dna作为模板，使用引物组[#15seca(1)fapcc/#16seca(390)r
‑
linker
‑
ha]，通过pcr法，对chl
‑
tp的dna序列(序列号45)进行了扩增。(3)将包含3xha(序列号46)的质粒dna：pbsb
‑
tha(ohnuma et al2008,plant cell physiol.49(1)：117
‑
20；pmid：18003671)作为模板，使用引物组[#17ha(1)f/#18ha(90)r]，通过pcr法对3xha(序列号46)进行了扩增。(4)根据c.merolae的密码子使用频率对gp的orf进行了化学合成(序列号40)，将
其作为模板，使用引物组[#19gp(1)fha/#20col
‑
gp(1680)rbt]，通过pcr法进行了扩增。
[0111]
将上述(1)、(2)、(3)以及(4)的各dna片段混合，使用in
‑
fusion(注册商标)hd cloning kit(产品编号为639648，takara)将它们融合，以替换pd184
‑
apccp
‑
egfp
‑
ura
cm
‑
gs
的egfp部分的方式插入了chl
‑
tp、3x ha以及狂犬病病毒糖蛋白orf。在infusion反应后，导入到大肠杆菌感受态细胞内对质粒进行了扩增，得到了pd184
‑
apccp
‑
chl
‑
tp
‑
3ha
‑
gp
‑
bt
‑
ura
cm
‑
gs
。接着，将其作为模板，使用引物[#11d184(1200)f/#12d 184( 1400)r]，通过pcr法，对连接有cmd184c基因的后半部(基因orf的1200bp
‑
2773bp以及包括终止密码子的下游25bp)、apcc启动子、chl
‑
tp、3xha、gp、col肽、β微管蛋白终止子、uracm
‑
gs筛选标记以及cmd185c基因的下游(从第28号到第1440bp号的碱基序列)的dna片段进行了扩增。通过peg法(ohnuma et al 2008,plant cell physiol.49(1)：117
‑
20；pmid：18003671)，将该dna片段导入c.merolae的尿嘧啶营养缺陷型株m4(minoda et al 2004,plant cell physiol.45(6)：667
‑
71；pmid：15215501)，用不含有尿嘧啶的ma2固体培养基进行筛选，得到了chl
‑
tp
‑
3ha
‑
gp
‑
col表达株。
[0112]
(chl
‑
tp
‑
3ha
‑
gp
‑
col蛋白质的蛋白酶体引起的分解的评价)在放入了锥形瓶的ma2培养基60ml中以od750＝0.2的细胞浓度分别对如上所述地制备出的c.merolae的chltp
‑
sfgfp
‑
ha
‑
gp
‑
col表达株(下称“chl
‑
tp
‑
3ha
‑
gp
‑
col表达株”)以及作为负对照的野生株(wt)进行继代培养，在光照射下(50μmol m
‑2s
‑1)、在40℃下进行了2天的旋转培养。接着，将各株的培养液每次20ml地分别转移到两个锥形瓶中。为了阻碍蛋白酶体引起的蛋白质分解，向所述两个锥形瓶的一方以最终浓度成为100μm添加了蛋白酶体抑制剂mg
‑
132(mg
‑
132( ))(nishida et al 2005；mol biol cell.16(5)：2493
‑
502；pmid：15772156)。作为对照，向另一方的锥形瓶中仅添加了作为mg
‑
132的溶剂的dmso 40μl(mg
‑
132(
‑
))。通过免疫印迹法，确认chltp
‑
sfgfp
‑
ha
‑
gp
‑
col蛋白质的表达，通过带型的比较验证了蛋白酶体抑制的效果。在chltp
‑
sfgfp
‑
ha
‑
gp
‑
col蛋白质的检测中使用了抗ha抗体(clone 16b12，产品编号为901503，biolegend)。
[0113]
图4中示出了免疫印迹的结果。在mg
‑
132(
‑
)以及mg
‑
132( )之间，未观察到chltp
‑
sfgfp
‑
ha
‑
gp
‑
col蛋白质的带型的不同。根据该结果，显示了chltp
‑
sfgfp
‑
ha
‑
gp
‑
col蛋白质没有被蛋白酶体分解。
[0114]
(chltp
‑
sfgfp
‑
ha
‑
gp
‑
co1蛋白质的细胞内局部存在的分析)为了对chltp
‑
sfgfp
‑
ha
‑
gp
‑
col蛋白质的细胞内局部存在进行分析，固定了在光照射下、在40℃且不存在mg
‑
132的条件下培养了2天后的chl
‑
tp
‑
3ha
‑
gp
‑
col表达株，使用抗ha抗体，进行免疫荧光染色。
[0115]
图5中示出了免疫荧光染色的结果。根据抗ha抗体的信号，显示了chltp
‑
sfgfp
‑
ha
‑
gp
‑
co1蛋白质局部存在于叶绿体(位于中央部分的类囊体与被膜之间)。图5(a)的图像(pc)是示出细胞的轮廓的相位差显微镜图像，图5(b)的图像(chl)是叶绿体的自发荧光图像，图5(c)的图像(anti
‑
ha)是利用抗ha抗体的免疫荧光染色图像。能够确认通过抗ha抗体检测到的chltp
‑
sfgfp
‑
ha
‑
gp
‑
col蛋白质局部存在于叶绿体。
[0116]
表1示出了在实施例1以及实施例2中使用的引物的序列。
[0117]
[表1]
[0118]
[实施例3](对小鼠给予gapdh
‑
gp
‑
sfgfp表达株)以成为1.3
×
108个细胞/ml(od750＝4)的方式将gapdh
‑
gp
‑
sfgfp表达株悬浮在300mm葡萄糖液(等渗溶液)中，使用探子将悬浮液250μl直接递送至小鼠(icr系)的胃中。其后，在0、0.5、1.0小时后，摘出胃、小肠上部以及小肠下部，使摘出的各脏器悬浮在300mm葡萄糖液1ml中。将所述悬浮液离心后，分取出其上清液，进行了针对sfgfp的酶联免疫吸附试验(elisa assay)，测定了450nm的吸光度。
[0119]
表2中示出了各脏器的sfgfp的相对浓度(利用酶联免疫吸附试验的450nm的吸光度)的测定结果。sfgfp在胃中几乎未检测到，从紧接着给药之后在小肠中检测到了。该结果显示了藻体的细胞在给药后立即从胃移动至肠内，在胃中未破裂，在肠中破裂了。
[0120]
[表2]
[0121]
[实施例4](对小鼠喂食包含sfgfp表达株的海藻酸固化饲料)将在细胞质中表达并标记了sfgfp后的c.merolae 10d(sumiya et al 2014,plos one.9(10)：e111261；pmid：25337786)的细胞(sfgfp表达株)与市售饲料(clea rodent diet ce
‑
2，clea japan,inc.)混合，如以下所示地用海藻酸使混合物固化，作为饲料试样。将悬浮有sfgfp表达株的300mm葡萄糖液(等渗溶液)(od750＝4)27ml以3000g离心10分钟，采集了沉淀的细胞。将所述sfgfp表达株的细胞以及1.12g的市售饲料(ce
‑
2)悬浮到包含1％海藻酸钠的2.5％蔗糖溶液10ml中。接着，将所述悬浮液向10％氯化钙溶液滴下，得到了包含sfgfp表达株以及市售饲料的海藻酸固化体的饲料试样。所述饲料试样中的sfgfp表达株的含量为4.6mg湿重/g(一粒80～110mg)。使小鼠(icr系)自由地摄取所述饲料试样4小时之后，进行了通常饲养。在摄取开始的4、8、24以及48小时后摘出了小鼠的胃肠、小肠上部、小肠下部。将摘出的各脏器悬浮在300mm葡萄糖溶液中，以1000g进行了离心后，回收上清液，作为sfgfp的细胞外浓度测定用试样。在上清液回收后，添加与回收到的上清液等量的蒸馏水(dw)将沉淀再次悬浮，以1000g进行了离心后，回收上清液，作为sfgfp的细胞内浓度测定用试样。用市售的elisa kit(gfp elisa kit；cat no.ab171581，abcam)对所述细胞外浓度测定用试样以及细胞内浓度测定用试样中的sfgfp量进行定量，分别作为细胞外浓度以及细胞内浓度。
[0122]
表3中示出了各脏器中的sfgfp的相对浓度(利用酶联免疫吸附试验的450nm的吸光度)的测定结果。对于sfgfp，细胞外浓度以及细胞内浓度都是小肠一方以更高于胃的浓度被检测到。另外，在小肠下部，与小肠上部相比较，sfgfp浓度高，细胞内浓度与细胞外浓度的比率也增加。该结果表示藻体的细胞在小肠内破裂，sfgfp被小肠细胞取入。
[0123]
[表3]
[0124]
[实施例5]
(给药试验以及血清的采集)作为“对照悬浮液给予组”，以成为1.3
×
108个细胞/ml(od750＝4)的方式将sfgfp表达株悬浮在300mm葡萄糖液(等渗溶液)中，使用探子将悬浮液300μl直接递送至小鼠(icr系个体三个)的胃内。每隔一周进行了相同量的经口给药，进行了6次，在最终给药2周后采集了血清。
[0125]
作为“悬浮液给予组”，以成为1.3
×
108个细胞/ml(od750＝4)的方式将chl
‑
tp
‑
3ha
‑
gp
‑
col表达株(c.merolae的chltp
‑
sfgfp
‑
ha
‑
gp
‑
col蛋白质表达株)悬浮到300mm葡萄糖液中，使用探子将悬浮液300μl直接递送至小鼠(icr系个体四个)的胃内。每隔一周进行了相同量的经口给药，进行了6次，在最终给药2周后采集了血清。
[0126]
作为“海藻酸固化饲料给予组”，对悬浮有chl
‑
tp
‑
3ha
‑
gp
‑
col表达株(c.merolae的chltp
‑
sfgfp
‑
ha
‑
gp
‑
col蛋白质表达株)的300mm葡萄糖液(od750＝4)27ml以3000g进行了10分钟离心，采集了沉淀的细胞。将chl
‑
tp
‑
3ha
‑
gp
‑
col表达株的细胞以及1.12g的市售饲料(ce
‑
2)悬浮到包含1％海藻酸钠的2.5％蔗糖溶液10ml中。接着，将该悬浮液向10％氯化钙溶液滴下，得到了包含chl
‑
tp
‑
3ha
‑
gp
‑
col表达株以及市售饲料的海藻酸固化体的饲料试样。chl
‑
tp
‑
3ha
‑
gp
‑
col株的含量为4.6mg湿重/g(一粒80～110mg)。使小鼠(icr系个体四个)自由摄取饲料试样后，进行了通常饲养。隔周进行饲料试样的摄食，进行了6次，在最终摄食2周后采集了血清。
[0127]
(抗gp蛋白质抗体产生的评价)通过免疫印迹法确认了抗gp蛋白质抗体的产生。首先，为了在狂犬病病毒的gp蛋白质的氨基末端融合6
×
组氨酸标签序列，将gp基因的orf克隆到pqe80载体(包含6
×
组氨酸标签序列，产品编号为32923，qiagen)中制备了质粒。将该质粒导入大肠杆菌，表达了6
×
组氨酸标签融合gp蛋白质(蛋白质大小为约50kda)。使用镍柱(产品编号为17531901，ge医疗)将该蛋白质浓缩。接着，利用sds
‑
page法通过电泳将6
×
组氨酸标签融合gp蛋白质浓缩液分离。将蛋白质从电泳后的凝胶转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)薄膜(产品编号为ipvh00010，默克公司)上。将转移后的薄膜浸渍到从各小鼠个体采集到的血清的稀释液中，在室温下进行了1小时的孵育。通过将血清在tris缓冲液(ph7.5，包含0.1％tween20)中稀释到五百分之一，由此制备了血清稀释液。将血清中包含的抗gp蛋白质抗体的有无作为与位于50kda附近的gp蛋白质的抗体反应的有无来进行判断。
[0128]
(结果)图6中示出了免疫印迹的结果。在作为负对照的“对照给予组(液)”的小鼠个体1、2、3的血清稀释液中，在作为狂犬病gp蛋白质的分子量大小的约50kda的位置未检测到带(图6(c))。与此相对，在“海藻酸固化饲料给予组”的小鼠个体2、3、4(图6(a))以及“悬浮液给予组”的小鼠个体3、4(图6(b))中，在约50kda的位置检测到带。根据该结果显示了，给予表达了狂犬病gp蛋白质的c.merolae的悬浮液或海藻酸固化饲料的小鼠产生了抗gp蛋白质抗体。
[0129]
(考察)在“对照悬浮液给予组”的小鼠个体2中，检测到大小比6
×
组氨酸标签融合gp蛋白质的预测大小更小的带，这被认为该小鼠个体具有的抗体相对于6
×
组氨酸标签融合gp蛋白质浓缩液中包含的来自大肠杆菌的蛋白质而言与gp蛋白质的给予无关系地发生了非特
异性反应的情况。
[0130]
根据一系列的实施例确认到，利用用于本发明的耐酸性细胞适当地导入的抗原性蛋白质能够被递送至小肠上部以后的部位。另外确认到，即使在将导入了本发明的抗原性蛋白质的耐酸性细胞作为能够在通常的畜产、养殖业中使用的形态混入至饲料中的情况下，也能够同样地将抗原性蛋白质递送至目标的部位。此外，还确认到，通过这样递送的抗原性蛋白质驱动肠道免疫系统，在血中产生了抗体。