产气荚膜梭菌β1毒素抗体的间接ELISA方法与流程

技术特征：
1.一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接elisa检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、产气荚膜梭菌β1毒素抗体的间接elisa方法的建立：(1)以包被液稀释包被抗原至10μg/ml，96孔酶标板中以100μl/孔进行包被，4℃过夜，所述包被抗原为可溶性重组产气荚膜梭菌β1毒素蛋白；(2)pbst溶液洗板3次，每次5分钟，加入封闭液，以200μl/孔进行封闭，37℃保温2小时；(3)pbst溶液洗板3次，每次5分钟，加入待检血清样品，阳性对照为产气荚膜梭菌β1毒素单克隆抗体1k19，阴性对照为产气荚膜梭菌β2毒素单克隆抗体，100μl/孔，37℃保温1小时；(4)pbst溶液洗板3次，每次5分钟，阳性对照孔和阴性对照孔加入hrp
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山羊抗小鼠igg为二抗，待测血清样品孔加入相应的hrp标记二抗，100μl/孔，室温1小时；(5)pbst溶液洗板3次，每次5分钟，加入底物显色液100μl/孔，室温下避光10分钟，加入终止液h2so4溶液终止反应，测定od450nm数值检测吸光度值；步骤二、结果判定标准的确定：当样品od450nm值>x 3sd时，判定为阳性；od450nm值<x 2sd时，判定为阴性；介于二者之间时，判为可疑。2.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接elisa检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中包被液为0.85m碳酸盐缓冲液，ph值为9.6，所述0.85m碳酸盐缓冲液的包被液制备方法为：称取nahco
3 2.93g以及na2co
3 1.59g，加蒸馏水定容至1l；所述pbst溶液为1l的pbs溶液中加入2
‰
tween
‑
20混匀制得；所述步骤(2)中封闭液为5％脱脂奶粉，所述5％脱脂奶粉的制备方法为称取脱脂奶粉5g,，加pbs溶液定容至100ml；所述步骤(3)中阳性对照为产气荚膜梭菌β1毒素单克隆抗体1k19，以pbs稀释28倍(0.25μg/μl)；所述步骤(4)中hrp
‑
山羊抗小鼠igg二抗为hrp
‑
山羊抗小鼠igg稀释2000倍，所述hrp标记相应二抗为hrp标记的山羊抗待检动物igg二抗稀释2000倍；所述步骤(5)中底物显色液为5％邻苯二胺溶液，所述5％邻苯二胺溶液的制备方法包括称取opd(邻苯二胺)5mg，量取10ml底物缓冲液进行溶解，加入3％h2o20.15ml，现配现用，其中，所述底物缓冲液为柠檬酸缓冲液，ph值为5.0，所述柠檬酸缓冲液的制备方法包括称取柠檬酸1.92g，na2hpo4称取2.84g，并加蒸馏水定容至100ml；所述步骤(5)中终止液为2mol/l的h2so4，所述终止液的制备方法包括量取蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓度为98％的浓硫酸21.7ml。3.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接elisa检测方法，其特征在于：所述可溶性重组产气荚膜梭菌β1毒素蛋白的包被抗原表达菌株的构建方法为：根据文献报道的产气荚膜梭菌β1毒素基因序列，设计引物：forward(5`
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3`)cggaattccatatggatataggcaaaactactactatreverse(5`
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3`)gaatgcggccgcaatagctgttactttatg从产气荚膜梭菌c型标准株中扩增cpb1基因，构建至ptig
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trx载体，转化至bl21(de3)菌株中，标记为bl21(de3)ptig
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cpb1。4.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接elisa检测方法，其特征在于：所述产气荚膜梭菌β1毒素蛋白地间接elisa检测方法，具体操作方法包括以下步骤：s1：取bl21(de3)ptig
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cpb1甘油冻存菌株，在含100μg/ml氨苄青霉素的lb固体平板上
划线，次日挑取单菌落接入10ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中培养至菌液od
600
达1.0以上；s2：再以1％的接种量接种于200ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中培养3小时，之后加入0.5mm iptg在20℃条件下诱导表达16h，离心收获菌体。5.根据权利要求4所述的一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接elisa检测方法，其特征在于：所述包被抗原为重组产气荚膜梭菌β1毒素蛋白，所述可溶性重组蛋白的制备方法包括以下步骤：步骤a：离心收集800ml诱导后重组表达菌体，用pbs清洗一次，菌体沉淀加入20mm tris
‑
hcl(ph8.0)缓冲液重悬10ml，加入100μg/ml溶菌酶，1
‰
tritonx
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100，0.01mm pmsf，超声破碎10min；步骤b：10000rmp离心10min，取沉淀使用10ml含0.2m尿素的20mm tris
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hcl(ph 8.0)缓冲液清洗沉淀一次；10000rmp离心10min，离心沉淀加入10ml含2m尿素的20mm tris
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hcl(ph 8.0)变性缓冲液，37℃孵育2h使沉淀完全溶解变性；步骤c：将溶解变性后蛋白液转移到透析袋中，并向其透析袋外部的液体依次加入150ml含尿素浓度梯度分别为1.5m、1m、0.5m、0m的20mm tris
‑
hcl(ph 8.0)复性缓冲液，每个浓度梯度处理6h。6.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接elisa检测方法，其特征在于：所述阳性对照为产气荚膜梭菌β1毒素单克隆抗体1k19，为根据ncbi所提供的β1毒素氨基酸序列，对蛋白序列进行分析和抗原预测，去除可能发生交叉识别的大肠杆菌和产气荚膜梭菌β2毒素、α毒素，ε毒素的位点，从目标蛋白中挑选出抗原表位指数最高的一段具有14个氨基酸的肽段，以此作为抗原注射至balb/c小鼠，三次免疫后，取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行融合，经限制性梯度稀释后获得阳性克隆细胞株，并经过筛选获得。7.根据权利要求6所述的一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接elisa检测方法，其特征在于：所述阳性对照为产气荚膜梭菌β1毒素单克隆抗体1k19，其纯化方法为：将冻存于液氮罐中的1k19杂交瘤细胞复苏，进行细胞传代培养，待细胞状态良好后按1:100的比例将细胞分传于75cm2的培养瓶中，并置于co2培养箱中直至细胞过度生长以富积抗体，4～5天后，待培养液变黄色后，收集1k19培养上清，用0.22μm的滤器进行过滤除菌，采用akta纯化系统使用protein g纯化，获得mcab1k19。8.根据权利要求7所述的一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接elisa检测方法，其特征在于：所述mcab1k19纯化所用结合缓冲液为20mm磷酸钠，ph 7.0，洗脱缓冲液为0.1m甘氨酸
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盐酸缓冲液，ph 2.7，中和缓冲液为1m tris
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cl，ph 9.0。9.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接elisa检测方法，其特征在于：所述完全培养基含有体积含量为10％的胎牛血清的rpmi medium 1640，所述完全培养基含有体积含量为1％的青链霉素以及1％的谷氨酰胺。10.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接elisa检测方法，其特征在于：阴性对照为产气荚膜梭菌β2毒素单克隆抗体。

技术总结
本发明公开了一种产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接ELISA检测方法，包括步骤一、产气荚膜梭菌β1毒素抗体的间接ELISA方法的建立，步骤二、结果判定标准的确定。本发明属于病原微生物检测技术领域，具体是提供了一种特异性好、灵敏度高、重复性好的检测产气荚膜梭菌β1毒素抗体的间接ELISA体系，为动物的产气荚膜梭菌感染情况提供了有效的检测手段，在临床血清流行病学调查和疫苗免疫效果评价方面具有广泛应用前景，可快速检测的产气荚膜梭菌β1毒素抗体间接ELISA检测方法。素抗体间接ELISA检测方法。素抗体间接ELISA检测方法。


技术研发人员：马臣杰 曾瑾 马玲玲 李勇 宋孚洋 刘晓明 马红梅 吴霜 马嘉琦 王东 李文
受保护的技术使用者：宁夏大学
技术研发日：2021.06.16
技术公布日：2021/11/26