用于治疗激酶依赖性病症的化合物的制作方法

用于治疗激酶依赖性病症的化合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年1月25日提交的美国临时申请序列号62/797,130和2019年7月24日提交的美国临时申请序列号62/878,173的优先权，两者的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
3.本发明涉及通过调节蛋白激酶酶活性来调节细胞活性诸如增殖、分化、程序性细胞死亡、迁移和化学侵袭的化合物，及其组合物，以及使用此类化合物的方法。


背景技术：

4.人axl属于包括mer的受体酪氨酸激酶的tam亚家族。tam激酶的特征在于由两个免疫球蛋白样结构域和两个纤连蛋白iii型结构域组成的胞外配体结合结构域。axl在多种肿瘤细胞类型中过表达，并且最初是从患有慢性粒细胞白血病的患者中克隆而来。当过表达时，ax1表现出转化潜力。ax1信号传导被认为通过激活增殖和抗凋亡信号传导通路而引起肿瘤生长。ax1已与诸如肺癌、髓系白血病、子宫癌、卵巢癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、肾细胞癌、骨肉瘤、胃癌、前列腺癌和乳腺癌的癌症相关。ax1的过表达导致患有指定癌症的患者预后不良。
5.mer的激活，像ax1一样，传递引起肿瘤生长和激活的下游信号传导通路。mer结合诸如可溶性蛋白gas
‑
6的配体。gas
‑
6与mer的结合诱导mer在其胞内结构域上的自磷酸化，导致下游信号激活。mer在癌细胞中的过表达导致转移增加，最有可能是通过产生可溶性mer胞外结构域蛋白作为诱骗受体而发生。肿瘤细胞分泌可溶性形式的胞外mer受体，这降低可溶性gas
‑
6配体激活内皮细胞上mer的能力，从而导致癌症进展。
6.因此，需要抑制tam受体酪氨酸激酶诸如axl和mer的化合物来治疗所选的癌症。


技术实现要素：

7.在一个方面，本发明提供了式i’化合物：
[0008][0009]
或其药学上可接受的盐，其中
[0010]
a是c1‑6烷氧基，或c(o)nr7r8；
[0011]
r1是c1‑6烷基或杂环烷基
‑
c1‑6亚烷基
‑
；
[0012]
r2是卤基；
[0013]
r3是卤基、oh、c1‑4烷氧基或cf3；
[0014]
r4是卤基；
[0015]
r5和r6中的一个是
‑
chr'r"，而r5和r6中的另一个是h或
‑
chr'r"；
[0016]
r7和r8各自独立地是h或c1‑6烷基；
[0017]
r
′
和r”中的每一个独立地选自由h、oh和c1‑6烷氧基组成的组；
[0018]
q1、q2和q3各自独立地是ch或n；
[0019]
x是0、1、2、3或4；
[0020]
y是0、1、2、3或4；并且
[0021]
z是0、1、2、3、4或5。
[0022]
在另一方面，本发明提供了式i化合物：
[0023][0024]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0025]
r1是c1‑6烷基或杂环烷基
‑
c1‑6亚烷基
‑
；
[0026]
r2是卤基；
[0027]
r3是卤基、oh、c1‑4烷氧基或cf3；
[0028]
r4是卤基；
[0029]
r5和r6中的一个是
‑
chr'r"，而r5和r6中的另一个是h或
‑
chr'r"；
[0030]
r
′
和r
″
中的每一个独立地选自由h、oh和c1‑6烷氧基组成的组；
[0031]
q1和q2各自独立地是ch或n；
[0032]
x是0、1、2、3或4；
[0033]
y是0、1、2、3或4；并且
[0034]
z是0、1、2、3、4或5。
[0035]
另一方面提供了式ii化合物：
[0036][0037]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0038]
r1是c1‑6烷基或杂环烷基
‑
c1‑6亚烷基
‑
；
[0039]
r
2a
是h或卤基；
[0040]
r5和r6中的一个是
‑
chr'r"，而r5和r6中的另一个是h或
‑
chr'r"；并且
[0041]
r
′
和r
″
中的每一个独立地选自由h、oh和c1‑6烷氧基组成的组。
[0042]
另一方面提供了使用式i’、式i或式ii化合物或其药学上可接受的盐来治疗至少部分通过调节蛋白激酶的体内活性而介导的疾病、病症或综合征的方法。
[0043]
另一方面提供了用于制备式i’、式i和式ii化合物的方法。
[0044]
下面描述了这些和其他方面和实施方案。
具体实施方式
[0045]
缩写和定义
[0046]
以下缩写和术语在全文中具有指定含义：
[0047]
[0048][0049]
符号
“‑”
表示单键，并且“＝”表示双键。
[0050]
除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，“一个(种)”和“所述”包括复数指代物。
[0051]
当一般性地定义变量时，在许多可能的取代基的情况下，可在具有或不具有键的情况下定义每个单独的基团。例如，如果r
z
可以是氢，则在r
z
的定义中，这可表示为
“‑
h”或“h”。
[0052]
当描绘或描述化学结构时，除非另外明确陈述，否则假定所有碳均具有氢取代以符合四价。例如，在以下示意图的左手侧的结构中，暗示存在九个氢。九个氢被描绘在右手的结构中。有时结构中的具体原子在本文式中描述成具有一个或多个氢作为取代(明确定义的氢)，例如
‑
ch2ch2‑
。本领域普通技术人员应理解，上述描述性技术在化学领域中是常见的，以便使原本复杂结构的描述简洁和简单。
[0053][0054]
如本文所用，波浪线可表示化学部分的连接点。例如，在结构中，苯基在甲基的对位位置连接到分子的其余部分。
[0055]
如果将基团“r”描绘成在环系统上“浮动”，例如在下式中：
[0056][0057]
那么除非另外定义，否则取代基“r”可存在于环系统的任何原子上，假定替换来自一个环原子的所描绘、所暗示或明确定义的氢，只要形成稳定结构即可。
[0058]
当将基团“r”描绘成存在于含有饱和碳的环系统上时，例如在下式中：
[0059][0060]
其中在这个实例中，“y”可大于1，假定各自替换环上的当前所描绘、所暗示或明确
定义的氢；那么除非另外定义，否则当所得到的结构稳定时，两个“r”可存在于同一碳上。简单的实例是当r是甲基时，在所描绘的环的碳(“环状”碳)上可存在偕二甲基。在另一个实例中，在同一碳(包括所述碳)上的两个r可形成环，从而产生具有所描绘的环的螺环(“螺环基”基团)结构，例如在下式中：
[0061][0062]“卤素”或“卤基”是指氟、氯、溴或碘。
[0063]
术语“c
n
‑
m”或“c
n
‑
c
m”表示包括端点的范围，其中n和m是整数并且表示碳的数量。实例包括c1‑4、c1‑
c4、c1‑6、c1‑
c6等。
[0064]“烷基”是指具有一至八个碳原子的支链或直链烃链，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基和庚基。术语“c
n
‑
m
烷基”或(c
n
‑
c
m
)烷基是指具有n至m个碳原子的烷基。
[0065]“亚烷基”是指具有1至10个碳原子、1至8个碳原子、1至6个碳原子、1至4个碳原子或1至2个碳原子的任选取代的二价饱和脂族基团。术语“cn
‑
m亚烷基”是指具有n至m个碳原子的亚烷基。亚烷基的实例包括，但不限于亚甲基、乙
‑
1，2
‑
二基、丙
‑
1，3
‑
二基、丙
‑
1，2
‑
二基、丁
‑
1，4
‑
二基、丁
‑
1，3
‑
二基、丁
‑
1，2
‑
二基、2
‑
甲基
‑
丙
‑
1，3
‑
二基等。
[0066]
如本文所用，“烷氧基”是指烷基
‑
o
‑
基团，其中“烷基”先前已定义。
[0067]
如本文所用，“杂环烷基”或“杂环”是指非芳族环或环系统，其可任选含有一个或多个亚烯基作为环结构的一部分，其具有至少一个独立地选自硼、氮、硫、氧和磷的杂原子环成员，并且其具有4
‑
14个环成员、4
‑
10个环成员、4
‑
7个环成员或4
‑
6个环成员。术语“杂环烷基”包括单环4元、5元、6元和7元杂环烷基。杂环烷基可包括单环或双环或多环(例如，具有两个或三个稠合或桥联环)环系统或螺环。在一些实施方案中，杂环烷基是具有1、2或3个独立地选自氮、硫和氧的杂原子的单环基团。杂环烷基的成环碳原子和杂原子可任选被氧化以形成氧代或硫代基团或其他氧化键(例如，c(o)、s(o)、c(s)、s(o)2、n
‑
氧化物等)或者氮原子可被季铵化。杂环烷基可通过成环碳原子或成环杂原子连接。在一些实施方案中，杂环烷基含有0至3个双键。在一些实施方案中，杂环烷基含有0至2个双键。杂环烷基的定义中还包括具有一个或多个与杂环烷基环稠合(即具有共同键)的芳环的部分，例如哌啶、吗啉、氮杂(azepine)等的苯并(benzo)或噻吩基(thienyl)衍生物。含有稠合芳环的杂环烷基可通过任何成环原子连接，包括稠合芳环的成环原子。杂环烷基的实例包括氮杂环丁烷基(azetidinyl)、氮杂环庚烷基(azepanyl)、二氢苯并呋喃基、二氢呋喃基、二氢吡喃基、吗啉代、3
‑
氧杂
‑9‑
氮杂螺[5.5]十一烷基、1
‑
氧杂
‑8‑
氮杂螺[4.5]癸基、哌啶基、哌嗪基、氧代哌嗪基、吡喃基、吡咯烷基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、1，2，3，4
‑
四氢喹啉基、托品烷基(tropanyl)、4，5，6，7
‑
四氢噻唑并[5，4
‑
c]吡啶基和硫吗啉代(thiomorpholino)。
[0068]
如本文所用，“离去基团”(lg)为本领域理解的术语，其是指在异裂键裂解中以一对电子离去的分子片段，其中分子片段为阴离子或中性分子。如本文所用，离去基团可为能够被亲核试剂置换的原子或基团。参见，例如smith，march advanced organic chemistry，第6版(501
‑
502)。示例性离去基团包括但不限于卤基(例如氯、溴、碘)、
‑
or
lg
(当o原子连接到羰基时)、
‑
o(c＝o)r
lg
或
‑
o(so)2r
lg
(例如，甲苯磺酰基、甲磺酰基、苯磺酰基)，其中r
lg
是
任选取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。在某些实施方案中，离去基团是卤素。
[0069]
本文所描述的各反应的“产率”表示为理论产率的百分比。
[0070]
出于本发明的目的，“患者”包括人和任何其他动物，特别是哺乳动物，以及其他生物体。因此，所述方法适用于人类疗法和兽医应用。在优选的实施方案中，患者是哺乳动物，并且在最优选的实施方案中，患者是人类。优选的哺乳动物的实例包括小鼠、大鼠、其他啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、羊、马和灵长类动物。
[0071]“激酶依赖性疾病或病状”是指依赖于一种或多种激酶的活性的病理状况。激酶直接或间接参与多种细胞活动的信号转导通路，包括增殖、粘附、迁移、分化和侵袭。与激酶活性相关的疾病包括肿瘤生长、支持实体瘤生长的病理性新血管形成，以及与其他涉及过度局部血管形成的疾病诸如眼部疾病(糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等)和炎症(银屑病、类风湿性关节炎等)相关。
[0072]“治疗有效量”是当向患者施用时改善疾病症状的本发明化合物的量。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量将根据化合物、疾病状态及其严重性、待治疗患者的年龄等因素而变化。治疗有效量可由本领域普通技术人员根据他自己的知识和本公开按常规确定。
[0073]“癌症”是指细胞增殖性疾病状态，包括但不限于：心脏：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；头颈部：头颈部鳞状细胞癌、喉及下咽癌、鼻腔及鼻旁窦癌、鼻咽癌、唾液腺癌、口腔及口咽癌；肺：支气管癌(鳞状细胞癌、未分化小细胞癌、未分化大细胞癌、腺癌、非小细胞肺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤性错构瘤、间皮瘤；结肠：结直肠癌、腺癌、胃肠道间质瘤、淋巴瘤、类癌、透克氏综合征(turcot syndrome)；胃肠道：胃癌、胃食管交界处腺癌、食管(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠肽瘤(vipoma))、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西氏肉瘤(karposi's sarcoma)、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；乳腺：转移性乳腺癌、导管原位癌、浸润性导管癌、管状癌、髓样癌、粘液癌、小叶原位癌、三阴性乳腺癌；泌尿生殖道：肾脏(腺癌、维尔姆斯氏瘤(wilm's tumor)[肾母细胞瘤]、淋巴瘤、白血病、肾细胞癌)、膀胱和尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌、尿路上皮癌)、前列腺(腺癌、肉瘤、去势抵抗性前列腺癌)、睾丸(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)、透明细胞癌、乳头状癌；肝脏：肝细胞瘤(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤；骨：骨源性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤(ewing's sarcoma)、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨性外生骨疣)、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液纤维瘤(chondromyxofibroma)、骨样骨瘤和巨细胞瘤；甲状腺：甲状腺髓样癌、分化型甲状腺癌、乳头状甲状腺癌、滤泡状甲状腺癌、许特尔细胞癌(hurthle cell cancer)和未分化甲状腺癌；神经系统：颅骨(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、胶质瘤病)、脑(星形细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性胶质母细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科：子宫(子宫内膜癌)、宫颈
(宫颈癌、肿瘤前宫颈发育不良)、卵巢(卵巢癌[浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类癌]、颗粒
‑
卵泡膜细胞瘤(granulosa
‑
thecal cell tumors)、支持
‑
间质细胞瘤(sertoli
‑
leydig cell tumor)、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤)、阴道(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎性横纹肌肉瘤)、输卵管(癌瘤)；血液学：血液(髓系白血病[急性和慢性]、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病(hodgkin's disease)、非霍奇金淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；皮肤：恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西氏肉瘤、发育不良痣(moles dysplastic nevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕疙瘩(keloids)、银屑病；和肾上腺：神经母细胞瘤。因此，如本文所提供的术语“癌细胞”包括受以上确定的任一种病状折磨的细胞。
[0074]“药学上可接受的盐”包括“药学上可接受的酸加成盐”和“药学上可接受的碱加成盐”。“药学上可接受的酸加成盐”是指保留游离碱的生物有效性并且不是在生物学或其他方面不合需要的那些盐，这些盐是与无机酸以及有机酸形成的，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，而所述有机酸诸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、丁二酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
[0075]“药学上可接受的碱加成盐”包括衍生自无机碱的那些盐，诸如钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。示例性盐是铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺、仲胺及叔胺；取代的胺，包括天然存在的取代的胺、环胺以及碱性离子交换树脂，诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2
‑
二甲基氨基乙醇、2
‑
二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因(procaine)、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、n
‑
乙基哌啶、多胺树脂等。示例性有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱以及咖啡因。(参见，例如，s.m.berge等人，“pharmaceutical salts，”j.pharm.sci.，1977；66：1
‑
19，其以引用方式并入本文。)
[0076]
如本文所用，术语“化合物”意在包括所描绘结构的所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素体。所述术语还意在指本发明的化合物，无论它们是如何制备的，例如以合成方法制备、通过生物过程(例如代谢或酶转化)制备或其组合。
[0077]
本发明化合物还可包括中间体或最终化合物中存在的原子的所有同位素。同位素包括原子序数相同但质量数不同的那些原子。例如，氢的同位素包括氚和氘。
[0078]
本文公开和/或要求保护的任何一个方法步骤或工序可在惰性气体气氛下，更具体地在氩气或氮气下进行。此外，本发明的方法可作为半连续或连续过程，更优选作为连续过程进行。
[0079]
而且，可将本文所述的许多方法步骤和工序缩减。
[0080]
一般而言，本技术中使用的命名法基于国际纯粹与应用化学联合会(iupac)所采用的命名约定。本文所示的化学结构是使用制备的。在本文结构中的碳、氧或氮原子上出现的任何开放价表示存在氢原子。
[0081]
本发明的实施方案
[0082]
一方面提供了式i’化合物：
[0083][0084][0085]
或其药学上可接受的盐，其中
[0086]
a是c1‑6烷氧基，或c(o)nr7r8；
[0087]
r1是c1‑6烷基或杂环烷基
‑
c1‑6亚烷基
‑
；
[0088]
r2是卤基；
[0089]
r3是卤基、oh、c1‑4烷氧基或cf3；
[0090]
r4是卤基；
[0091]
r5和r6中的一个是
‑
chr'r"，而r5和r6中的另一个是h或
‑
chr'r"；
[0092]
r7和r8各自独立地是h或c1‑6烷基；
[0093]
r
′
和r
″
中的每一个独立地选自由h、oh和c1‑6烷氧基组成的组；
[0094]
q1、q2和q3各自独立地是ch或n；
[0095]
x是0、1、2、3或4；
[0096]
y是0、1、2、3或4；并且
[0097]
z是0、1、2、3、4或5。
[0098]
在这个方面的一些实施方案中，r1是c1‑6烷基或在一些实施方案中，r1是c1‑6烷基。在一些实施方案中，r1是甲基。在其他实施方案中，r1是在其他实施方案中，r1是
[0099]
在这个方面的一些实施方案中，r2是f。在一些实施方案中，r3是卤基。在一些实施方案中，r3是f。在一些实施方案中，r4是f。在一些实施方案中，r2、r3和r4各自独立地是f。
[0100]
在这个方面的一些实施方案中，x是0或1。在一些实施方案中，y是0或1。并且在一些实施方案中，z是0或1。在一些实施方案中，x、y和z各自独立地是0或1。在一些实施方案中，y是0。在一些实施方案中，z是1。在一些实施方案中，y是0且z是1。
[0101]
在这个方面的一些实施方案中，r5和r6中的一个是
‑
chr
′
r
″
而另一个是h。在这个方面的一些实施方案中，r5是
‑
chr
′
r
″
且r6是h。在这个方面的其他实施方案中，r6是
‑
chr
′
r
″
且r5是h。在这个方面的其他实施方案中，r5和r6各自独立地是
‑
chr
′
r
″
。在一些实施方案中，r5是甲基。在一些实施方案中，r5是甲基且r6是h。在一些实施方案中，r6是甲基。在一些实施方案中，r6是甲基且r5是h。在一些实施方案中，r5和r6各自是甲基。在一些实施方案中，r5是
‑
ch2oh。在一些实施方案中，r6是
‑
ch2oh。在一些实施方案中，r5是
‑
ch2o
‑
(c1‑
c6烷基)。在一些实施方案中，r6是s
‑
ch2o
‑
(c1‑
c6烷基)。在一些实施方案中，r5是
‑
ch2och3。在一些实施方案
中，r6是
‑
ch2och3。
[0102]
在这个方面的一些实施方案中，q1是ch。在这个方面的一些实施方案中，q2是ch。在一些实施方案中，q1和q2各自为ch。在这个方面的一些实施方案中，q1是ch并且q2是n。在其他实施方案中，q1是n并且q2是ch。在其他实施方案中，q1和q2各自是n。
[0103]
在这个方面的一些实施方案中，a是c1‑6烷基。在另一个实施方案中，a是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、丁氧基或叔丁氧基。在另一个实施方案中，a是甲氧基。
[0104]
在这个方面的一些实施方案中，a是c(o)nr7r8，其中r7和r8各自独立地是h或c1‑6烷基。
[0105]
在一个实施方案中，r7和r
8中的一个
是h，而另一个是c1‑6烷基。在另一个实施方案中，r7和r8都是h。在另一个实施方案中，r7和r8都是c1‑6烷基。
[0106]
在一些实施方案中，每个c1‑4烷基独立地是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或叔丁基。在另一个实施方案中，每个c1‑4烷基是甲基。
[0107]
在一些实施方案中，q3是ch。在一些实施方案中，q3是n。
[0108]
一方面提供了式i化合物：
[0109][0110]
或其药学上可接受的盐，其中
[0111]
r1是c1‑6烷基或杂环烷基
‑
c1‑6亚烷基
‑
；
[0112]
r2是卤基；
[0113]
r3是卤基、oh、c1‑4烷氧基或cf3；
[0114]
r4是卤基；
[0115]
r5和r6中的一个是
‑
chr'r"，而r5和r6中的另一个是h或
‑
chr'r"；
[0116]
r
′
和r"中的每一个独立地选自由h、oh和c1‑6烷氧基组成的组；
[0117]
q1和q2各自独立地是ch或n；
[0118]
x是0、1、2、3或4；
[0119]
y是0、1、2、3或4；并且
[0120]
z是0、1、2、3、4或5。
[0121]
在这个方面的一些实施方案中，r1是c1‑6烷基或在一些实施方案中，r1是c1‑6烷基。在一些实施方案中，r1是甲基。在其他实施方案中，r1是
在其他实施方案中，r1是
[0122]
在这个方面的一些实施方案中，r2是f。在一些实施方案中，r3是卤基。在一些实施方案中，r3是f。在一些实施方案中，r4是f。在一些实施方案中，r2、r3和r4各自独立地是f。
[0123]
在这个方面的一些实施方案中，x是0或1。在一些实施方案中，y是0或1。并且在一些实施方案中，z是0或1。在一些实施方案中，x、y和z各自独立地是0或1。在一些实施方案中，y是0。在一些实施方案中，z是1。在一些实施方案中，y是0且z是1。
[0124]
在这个方面的一些实施方案中，r5和r6中的一个是
‑
chr'r"而另一个是h。在这个方面的一些实施方案中，r5是
‑
chr'r"且r6是h。在这个方面的其他实施方案中，r6是
‑
chr'r"且r5是h。在这个方面的其他实施方案中，r5和r6各自独立地是
‑
chr'r"。在一些实施方案中，r5是甲基。在一些实施方案中，r5是甲基且r6是h。在一些实施方案中，r6是甲基。在一些实施方案中，r6是甲基且r5是h。在一些实施方案中，r5和r6各自是甲基。在一些实施方案中，r5是
‑
ch2oh。在一些实施方案中，r6是
‑
ch2oh。在一些实施方案中，r5是
‑
ch2o
‑
(c1‑
c6烷基)。在一些实施方案中，r6是s
‑
ch2o
‑
(c1‑
c6烷基)。在一些实施方案中，r5是
‑
ch2och3。在一些实施方案中，r6是
‑
ch2och3。
[0125]
在这个方面的一些实施方案中，q1是ch。在这个方面的一些实施方案中，q2是ch。在一些实施方案中，q1和q2各自是ch。在这个方面的一些实施方案中，q1是ch且q2是n。在其他实施方案中，q1是n且q2是ch。在其他实施方案中，q1和q2各自是n。
[0126]
在这个方面的一些实施方案中，式i化合物是式ia化合物：
[0127][0128]
或其药学上可接受的盐，其中r1、r2、r3、r4、q1、q2、x、y和z如式i的任何实施方案中所定义；并且r6是
‑
chr
′
r”(其中r
′
和r”如式i的任何实施方案中所定义)。在这个实施方案的一些实施方案中，r6是甲基。在这个实施方案的其他实施方案中，r6是
‑
ch2oh。在这个实施方案的其他实施方案中，r6是
‑
ch2och3。
[0129]
在这个方面的一些实施方案中，式i化合物是式ia
‑
1化合物：
[0130][0131]
或其药学上可接受的盐，其中r1、r2、r5、r4、q1、q2、x、y和z如式i的任何实施方案中所定义并且r
″′
是h或甲基。在这个实施方案的一些实施方案中，r
″′
是h。
[0132]
在这个方面的一些实施方案中，式i化合物是式ib化合物：
[0133][0134]
或其药学上可接受的盐，其中r1、r2、r3、r4、q1、q2、x、y和z如式i的任何实施方案中所定义；并且r5是
‑
chr
′
r”(其中r
′
和r”如式i的任何实施方案中所定义)。在这个实施方案的一些实施方案中，r5是甲基。在这个实施方案的其他实施方案中，r5是
‑
ch2oh。在这个实施方案的其他实施方案中，r5是
‑
ch2och3。
[0135]
在这个方面的一些实施方案中，式i化合物是式ib
‑
1化合物：
[0136][0137]
或其药学上可接受的盐，其中r1、r2、r3、r4、q1、q2、x、y和z如式i的任何实施方案中所定义且r
″
"是h或甲基。在这个实施方案的一些实施方案中，r
″″
是h。
[0138]
另一方面提供了式ii化合物：
[0139][0140]
或其药学上可接受的盐，其中
[0141]
r1是c1‑6烷基或杂环烷基
‑
c1‑6亚烷基
‑
；
[0142]
r
2a
是h或卤基；
[0143]
r5和r6中的一个是
‑
chr
′
r
″
，而r5和r6中的另一个是h或
‑
chr
′
r
″
；并且
[0144]
r
′
和r
″
中的每一个独立地选自由h、oh和c1‑6烷氧基组成的组。
[0145]
在这个方面的一些实施方案中，r1是c1‑6烷基或在一些实施方案中，r1是c1‑6烷基。在一些实施方案中，r1是甲基。在其他实施方案中，r1是在其他实施方案中，r1是
[0146]
在这个方面的一些实施方案中，r
2a
是h或f。在一些实施方案中，r
2a
是h。在其他实施方案中，r
2a
是f。
[0147]
在这个方面的一些实施方案中，r5和r6中的一个是
‑
chr
′
r
″
而另一个是h。在这个方面的一些实施方案中，r5是
‑
chr
′
r
″
且r6是h。在这个方面的其他实施方案中，r6是
‑
chr'r
″
且r5是h。在这个方面的其他实施方案中，r5和r6各自独立地是
‑
chr'r
″
。在一些实施方案中，r5是甲基。在一些实施方案中，r5是甲基且r6是h。在一些实施方案中，r6是甲基。在一些实施方案中，r6是甲基且r5是h。在一些实施方案中，r5和r6各自是甲基。在一些实施方案中，r5是
‑
ch2oh。在一些实施方案中，r6是
‑
ch2oh。在一些实施方案中，r5是
‑
ch2och3。在一些实施方案中，r6是
‑
ch2och3。
[0148]
在这个方面的一些实施方案中，式ii化合物是式iia化合物：
[0149][0150]
或其药学上可接受的盐，其中r1和r
2a
如式ii的任何实施方案中所定义，并且r6是
‑
chr'r
″
(其中r
″
和r
″
如式ii的任何实施方案中所定义)在这个实施方案的一些实施方案中，
r6是甲基。在这个实施方案的其他实施方案中，r6是
‑
ch2oh。在这个实施方案的其他实施方案中，r6是
‑
ch2och3。在这个方面的一些实施方案中，式ii化合物是式iia
‑
1化合物：
[0151][0152]
或其药学上可接受的盐，其中r1和r
2a
如式i或ii的任何实施方案中所定义并且r
″′
是h或甲基。在这个实施方案的一些实施方案中，r
″′
是h。在这个实施方案的一些实施方案中，r
″′
是甲基。
[0153]
在这个方面的一些实施方案中，式ii化合物是式iib化合物：
[0154][0155]
或其药学上可接受的盐，其中r1和r
2a
如式ii的任何实施方案中所定义，并且r5是
‑
chr'r"(其中r
″
和r
″
如式ii的任何实施方案中所定义)在这个实施方案的一些实施方案中，r5是甲基。在这个实施方案的其他实施方案中，r5是
‑
ch2oh。在这个实施方案的其他实施方案中，r5是
‑
ch2och3。
[0156]
在这个方面的一些实施方案中，式ii化合物是式iib
‑
1化合物：
[0157][0158]
或其药学上可接受的盐，其中r1和r
2a
如式i或ii的任何实施方案中所定义并且r
″″
是h或甲基。在这个实施方案的一些实施方案中，r
″″
是h。
[0159]
在一些实施方案中，式i’化合物是式iiia化合物：
[0160][0161]
或其药学上可接受的盐，其中r1、r2、r4、r6、q1、q2、x和z如式i’的任何实施方案中所定义。
[0162]
在一些实施方案中，式i’化合物是式iiib化合物：
[0163][0164]
或其药学上可接受的盐，其中r1、r2、r4、r6、r7、r8、q1、q2、x和z如式i’的任何实施方案中所定义。
[0165]
在一些实施方案中，a是c1‑6烷氧基。在另一个实施方案中，a是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、丁氧基或叔丁氧基。在又一个实施方案中，a是甲氧基。
[0166]
在一些其他实施方案中，a是c(o)nr7r8。
[0167]
在另一个实施方案中，r7和r8中的一个是h，而另一个是c1‑6烷基。在另一个实施方案中，r7和r8中的一个是h，而另一个是甲基。
[0168]
在一些其他实施方案中，r7和r8都是h。
[0169]
在一些实施方案中，r2是卤基。在另一个实施方案中，r2是f。
[0170]
在一些实施方案中，r4是f。
[0171]
在一个实施方案中，所述部分是
[0172]
在一些实施方案中，q1、q2和q3各自是ch。
[0173]
在一些其他实施方案中，q1和q3各自是ch，并且q2是n。
[0174]
在一些其他实施方案中，q1和q2各自是ch，并且q3是n。
[0175]
在另一方面，本发明提供了式i’、i或ii化合物或其药学上可接受的盐，如表1中所提供。
[0176]
表1.式i’、i或ii化合物
[0177]
[0178]
[0179]
[0180][0181]
一般施用
[0182]
以纯形式或以适当的药物组合物的形式施用本发明的化合物或其药学上可接受的盐可通过任何可接受的施用模式或用于提供相似效用的剂来进行。因此，可例如以呈固体、半固体、冻干粉末或液体剂型的形式，诸如例如片剂、栓剂、丸剂、软弹性和硬明胶胶囊、粉剂、溶液、混悬液、气雾剂等，优选以适于简单施用精确剂量的单位剂型，经口、经鼻、胃肠外(静脉内、肌内或皮下)、局部、经皮、阴道内、膀胱内、脑池内或经直肠施用。
[0183]
组合物将包括常规药物载剂或赋形剂和作为活性剂的本发明化合物，并且此外，可包括其他医疗剂(medicinal agents)、药剂(pharmaceutical agents)、载剂、佐剂等。本发明的组合物可与抗癌剂或通常施用于接受癌症治疗的患者的其他剂组合使用。佐剂包括防腐剂、湿润剂、助悬剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、乳化剂和分散剂。对微生物作用的防止可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保，所述抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚和山梨酸等。包括例如糖、氯化钠等的等渗剂也可以是合乎需要的。可通过使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，使可注射药物形式的吸收延长。
[0184]
如果需要，本发明的药物组合物还可包含少量辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、ph缓冲剂、抗氧化剂等，诸如，例如柠檬酸、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、丁基化羟基甲苯等。
[0185]
适用于胃肠外注射的组合物可包含生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、混悬液或乳剂、以及用于重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油
等)、其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯，诸如油酸乙酯。适当的流动性例如可通过使用诸如卵磷脂的包衣来维持，就分散液来说通过保持所需粒径来维持，以及通过使用表面活性剂来维持。
[0186]
一种优选的施用途径是口服，其使用可根据待治疗的疾病状态的严重程度调节的方便的日剂量方案。
[0187]
用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性惯用赋形剂(或载剂)诸如柠檬酸钠或磷酸二钙或以下物质混合：(a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(b)粘合剂，例如纤维素衍生物、淀粉、藻酸盐(alignate)、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(c)保湿剂，例如甘油，(d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、交联羧甲基纤维素钠、复合硅酸盐和碳酸钠，(e)溶解阻滞剂，例如石蜡，(f)吸收促进剂，例如季铵化合物，(g)湿润剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯、硬脂酸镁等，(h)吸附剂，例如高岭土和膨润土，以及(i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，或它们的混合物。就胶囊、片剂和丸剂而言，剂型还可包含缓冲剂。
[0188]
如上所述的固体剂型可制备有包衣和外壳，诸如肠溶衣和本领域众所周知的其他包衣。它们可含有缓和剂(pacifying agent)并且还可具有这样的组成，所述组成使得它们以延迟的方式在肠道的某个部分释放一种或多种活性化合物。可使用的包埋组合物的实例是聚合物质和蜡。如果适当，活性化合物还可以是具有一种或多种上述赋形剂的微囊化形式。
[0189]
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液、混悬液、糖浆剂和酏剂。此类剂型是例如通过将本发明的化合物或其药学上可接受的盐和任选的药物佐剂在以下各项中溶解、分散等，从而形成溶液或混悬液来制备：载剂，诸如例如水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等；增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3
‑
丁二醇和二甲基甲酰胺；油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯；或这些物质的混合物等。
[0190]
除活性化合物之外，混悬液还可含有助悬剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨糖醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶，或这些物质的混合物等。
[0191]
用于经直肠施用的组合物是例如栓剂，其可通过使本发明的化合物与例如合适的非刺激性赋形剂或载剂(诸如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，所述赋形剂或载剂在常温下是固体但在体温下是液体，并且因此当在合适的体腔中时熔融并在其中释放活性组分。
[0192]
本发明化合物用于局部施用的剂型包括软膏剂、粉剂、喷雾剂和吸入剂。活性组分在无菌条件下与生理学上可接受的载剂以及可能要求的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。眼科制剂、眼膏、粉剂和溶液也涵盖在本发明的范围之内。
[0193]
一般来说，根据预期施用模式，药学上可接受的组合物将含有按重量计约1％至约99％的本发明化合物或其药学上可接受的盐，和按重量计99％至1％的合适的药物赋形剂。在一个实例中，组合物将是介于按重量计约5％与约75％之间的本发明化合物或其药学上
可接受的盐，其余是合适的药物赋形剂。
[0194]
制备此类剂型的实际方法对本领域技术人员是已知的，或将是显而易见的；例如，参见remington's pharmaceutical sciences，第18版，(mack publishing co.，easton，pa.，1990)。在任何情况下，待施用的组合物都将含有治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐，用于根据本公开的教义治疗疾病状态。
[0195]
本发明的化合物或其药学上可接受的盐是以将根据各种因素而变化的治疗有效量施用，所述因素包括所采用的具体化合物的活性、化合物的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用模式和时间、排泄率、药物组合、具体疾病状态的严重性以及接受疗法的宿主。本发明化合物可以每天约0.1至约1,000mg范围内的剂量水平对患者施用。对于体重为约70千克的正常成人而言，在每天每千克体重约0.01mg至约100mg范围内的剂量是一个实例。然而，所使用的具体剂量可改变。例如，剂量可取决于多个因素，包括患者的需求、所治疗的病状的严重性以及所使用的化合物的药理活性。针对特定患者的最佳剂量的确定是本领域普通技术人员所熟知的。
[0196]
组合疗法
[0197]
本文公开的化合物可以作为单一疗法或与一种或多种另外的用于治疗疾病或病症，例如与过度增殖相关的疾病或病症诸如癌症的疗法组合施用(“共同施用”)。可与本文公开的化合物组合使用的疗法包括：(i)手术；(ii)放射疗法(例如γ辐射、中子束放射疗法、电子束放射疗法、质子疗法、近距离放射疗法和全身放射性同位素)；(iii)内分泌疗法；(iv)辅助疗法、免疫疗法、car t细胞疗法；和(v)其他化学治疗剂。
[0198]
术语“共同施用(co
‑
administered)”(“共同施用(co
‑
administering)”)是指本发明的化合物或其盐和与包括细胞毒性剂和放射治疗的一种或多种其他活性药物成分的同时施用或任何方式的单独依序施用。如果施用不是同时的，那么化合物应在彼此接近的时间内施用。此外，化合物是否以相同剂型施用并不重要，例如，一种化合物可局部施用而另一种化合物可口服施用。
[0199]
通常，可共同施用具有针对所治疗的疾病或病状的活性的任何剂。可在例如https：//www.cancer.gov/about
‑
cancer/treatment/drugs(上次访问时间为2019年1月22日)和公开可用的资源中找到此类用于癌症治疗的剂的实例，所述资源诸如vt devita和s.hellman(编辑)的cancer principles and practice of oncology，第11版(2018)，lippincott williams&wilkins出版社。本领域普通技术人员将能够基于药物的特定特性和所涉及的疾病来辨别哪种剂的组合是有用的。
[0200]
在一个实施方案中，治疗方法包括共同施用本文公开的化合物或其药学上可接受的盐与至少一种免疫疗法。免疫疗法(也称为生物反应调节剂疗法、生物疗法(biologic therapy)、生物疗法(biotherapy)、免疫疗法(immune therapy)或生物疗法(biological therapy))是一种利用免疫系统的一部分对抗疾病的治疗。免疫疗法可帮助免疫系统识别癌细胞，或增强针对癌细胞的反应。免疫疗法包括主动和被动免疫疗法。主动免疫疗法刺激身体自身的免疫系统，而被动免疫疗法通常使用在身体外部产生的免疫系统组分。
[0201]
主动免疫疗法的实例包括但不限于疫苗，包括癌症疫苗、肿瘤细胞疫苗(自体或同种异体)、树突状细胞疫苗、抗原疫苗、抗独特型疫苗、dna疫苗、病毒疫苗或利用白细胞介素2(il
‑
2)或淋巴因子激活的杀伤(lak)细胞疗法的肿瘤浸润淋巴细胞(til)疫苗。
[0202]
被动免疫疗法的实例包括但不限于单克隆抗体和含有毒素的靶向疗法。单克隆抗体包括裸抗体和缀合单克隆抗体(也称为带标签抗体、标记抗体或负载抗体)。裸单克隆抗体不具有附着的药物或放射性物质，而缀合单克隆抗体则与例如化疗药物(化学标记)、放射性粒子(放射性标记)或毒素(免疫毒素)接合。这些裸单克隆抗体药物的实例包括但不限于利妥昔单抗(美罗华(rituxan))，针对cd20抗原的抗体，用于治疗例如b细胞非霍奇金淋巴瘤；曲妥珠单抗(赫赛汀(herceptin))，针对her2蛋白的抗体，用于治疗例如晚期乳腺癌；阿仑单抗(坎帕斯(campath))，针对cd52抗原的抗体，用于治疗例如b细胞慢性淋巴细胞性白血病(b
‑
cll)；西妥昔单抗(爱必妥(erbitux))，针对egfr蛋白的抗体，例如与伊立替康(irinotecan)组合使用以治疗例如晚期结直肠癌和头颈癌；和贝伐珠单抗(安维汀(avastin))，是一种针对vegf蛋白起作用的抗血管生成疗法，并且例如与化学疗法组合使用以治疗例如转移性结直肠癌。缀合单克隆抗体的实例包括但不限于放射性标记抗体替伊莫单抗(泽娃灵(zevalin))，其将放射性直接递送至癌性b淋巴细胞并用于治疗例如b细胞非霍奇金淋巴瘤；放射性标记抗体托西莫单抗(百克沙(bexxar))，其用于治疗例如某些类型的非霍奇金淋巴瘤；和免疫毒素吉妥单抗(麦罗塔(mylotarg))，其含有加利车霉素(calicheamicin)并用于治疗例如急性髓性白血病(aml)。bl22是用于治疗例如毛细胞白血病的缀合单克隆抗体，免疫毒素，用于治疗例如白血病、淋巴瘤和脑肿瘤，以及放射性标记抗体诸如oncoscint，例如用于结直肠癌和卵巢癌，和prostascint，例如用于前列腺癌。
[0203]
可以使用的治疗性抗体的其他实例包括但不限于：herceptin
tm
(曲妥珠单抗)(genentech，ca)，它是用于治疗转移性乳腺癌患者的人源化抗her2单克隆抗体；reopro.rtm.(阿昔单抗)(centocor)，它是血小板上的一种抗糖蛋白iib/iiia受体，用于防止血块形成；zenapax
tm
(达利珠单抗(daclizumab))(roche pharmaceuticals，switzerland)，它是一种免疫抑制性人源化抗cd25单克隆抗体，用于预防急性肾同种异体移植排斥反应；panorex
tm
，它是一种鼠抗17
‑
ia细胞表面抗原igg2a抗体(glaxowellcome/centocor)；bec2，它是一种鼠抗独特型(gd3表位)igg抗体(imclone system)；imc
‑
c225，它是一种嵌合抗egfr igg抗体(imclone system)；vitaxin
tm
，它是一种人源化抗αvβ3整合素抗体(applied molecular evolution/medlmmune)；campath 1h/ldp
‑
03，它是一种人源化抗cd52 igg1抗体(leukosite)；smart m195，它是一种人源化抗cd33igg抗体(protein design lab/kanebo)；rituxan
tm
，它是一种嵌合抗cd20 igg1抗体(idec pharm/genentech、roche/zettyaku)；lymphocide
tm
，它是一种人源化抗cd22 igg抗体(immunomedics)；lymphocide
tm
y
‑
90(immunomedics)；lymphoscan(tc
‑
99m标记；放射成像；immunomedics)；nuvion(针对cd3；protein design labs)；cm3是一种人源化抗icam3抗体(icos pharm)；idec
‑
114是一种灵长类化抗cd80抗体(idec pharm/mitsubishi)；zevalin
tm
是一种放射性标记的鼠抗cd20抗体(idec/schering ag)；idec
‑
131是一种人源化抗cd40l抗体(idec/eisai)；idec
‑
151是一种灵长类化抗cd4抗体(idec)；idec
‑
152是一种灵长类化抗cd23抗体(idec/seikagaku)；smart抗cd3是一种人源化抗cd3 igg(protein design lab)；5g1.1是一种人源化抗补体因子5(c5)抗体(alexion pharm)；d2e7是一种人源化抗tnf
‑
α抗体(cat/basf)；cdp870是一种人源化抗tnf
‑
αfab片段(celltech)；idec
‑
151，是一种灵长类化抗cd4 igg1抗体(idec pharm/smithkline beecham)；mdx
‑
cd4，是一种人抗cd4 igg抗体(medarex/eisai/genmab)；cd20链霉亲和素( 生物素
‑
钇90；neorx)；cdp571，是一种人源化
抗tnf
‑
αigg4抗体(celltech)；ldp
‑
02，是一种人源化抗α4β7抗体(leukosite/genentech)；orthoclone okt4a，是一种人源化抗cd4 igg抗体(ortho biotech)；antova
tm
，是一种人源化抗cd40l igg抗体(biogen)；antegren
tm
，是一种人源化抗vla
‑
4 igg抗体(elan)；以及cat
‑
152，是一种人抗tgf
‑
β2抗体(cambridge ab tech)。其他抗体在后面的段落中提供。
[0204]
可与本文公开的化合物组合使用的免疫疗法包括辅助免疫疗法。实例包括细胞因子，例如粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)、粒细胞
‑
集落刺激因子(g
‑
csf)、巨噬细胞炎性蛋白(mip)
‑1‑
α、白细胞介素(包括il
‑
1、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
6、il
‑
7、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21和il
‑
27)、肿瘤坏死因子(包括tnf
‑
α)和干扰素(包括ifn
‑
α、ifn
‑
β和ifn
‑
γ)；氢氧化铝(alum)；卡介苗(bacille calmette
‑
guerin，bcg)；匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，klh)；不完全弗氏佐剂(incomplete freund's adjuvant，ifa)；qs
‑
21；detox；左旋咪唑(levamisole)；以及二硝基苯基(dnp)，和它们的组合，诸如例如白细胞介素(例如il
‑
2)与其他细胞因子(诸如ifn
‑
α)的组合。
[0205]
在各种实施方案中，本发明的化合物可与免疫学疗法和/或免疫学治疗剂组合。在各种实施方案中，免疫学疗法和/或免疫学治疗剂可包括以下一种或多种：过继细胞转移、血管生成抑制剂、卡介苗疗法、生物化学疗法、癌症疫苗、嵌合抗原受体(car)t细胞疗法、细胞因子疗法、基因疗法、免疫检查点调节剂、免疫缀合物、放射性缀合物、溶瘤病毒疗法或靶向药物疗法。免疫学疗法或免疫学治疗剂在本文中统称为“免疫治疗剂”。
[0206]
本公开提供了一种预防、治疗、减少、抑制或控制有需要的受试者的瘤形成(neoplasia)、肿瘤或癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含本发明化合物和免疫治疗剂的组合。在一个非限制性实施方案中，所述方法包括施用治疗有效量的组合，所述组合包含与免疫治疗剂组合的本发明化合物。在各种实施方案中，与单独的每种治疗相比，当用所述组合治疗时，所述组合在减少癌细胞数目方面提供了合作效应、累加效应或协同效应。在一些实施方案中，施用治疗有效量的包含本发明化合物和免疫治疗剂的组合产生的协同抗肿瘤活性和/或抗肿瘤活性比单独施用本发明化合物或免疫治疗剂的累加效应更强。
[0207]
人类癌症具有许多遗传和表观遗传学改变，产生了免疫系统可能能够识别的新抗原(sjoblom等人(2006)science 314：268
‑
74)。由t和b淋巴细胞组成的适应性免疫系统具有强大的抗癌潜力，以及对多种肿瘤抗原作出反应的广泛的能力和精细的特异性。此外，免疫系统表现出相当大的可塑性和记忆组分。成功利用适应性免疫系统的所有这些属性将使免疫疗法在所有癌症治疗方式中独树一帜。
[0208]
本公开提供了本发明化合物和免疫治疗剂的组合。这些例示的组合可以用于治疗患有癌症的受试者。在各种实施方案中，适用于本发明的组合物、制剂和方法中的免疫治疗剂可包括一种或多种包括以下的剂或疗法：过继细胞转移、血管生成抑制剂、卡介苗疗法、生物化学疗法、癌症疫苗、嵌合抗原受体(car)t细胞疗法、细胞因子疗法、基因疗法、免疫检查点调节剂(例如免疫检查点抑制剂)、免疫缀合物、放射性缀合物、溶瘤病毒疗法或靶向药物疗法。
[0209]
在本公开的某些实施方案中，治疗有效组合包含本发明的化合物和免疫治疗剂。在各种相关实施方案中，本发明的化合物增强了免疫治疗剂的活性。
[0210]
在上述各个方面的某些实施方案以及本文别处描述的其他方面和实施方案中，免
疫治疗剂增强了本发明化合物的活性。
[0211]
在上述各个方面的某些实施方案以及本文别处描述的其他方面和实施方案中，本发明化合物和免疫治疗剂协同作用。在本文所述的各种实施方案中，示例性的免疫治疗剂是选自共刺激分子的激动剂或激活剂的免疫细胞(例如t细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等)调节剂，其中所述调节剂是本领域已知的单克隆抗体、包含一个或多个免疫检查点抗原结合部分的双特异性抗体、三特异性抗体或与免疫细胞衔接的多价抗体/融合蛋白/构建体。在一些实施方案中，免疫治疗剂可以是调节共刺激分子、结合免疫细胞或癌细胞表面上的抗原的抗体。在这些不同的实施方案的每一个中，抗体调节剂可以是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、三特异性或多特异性形式抗体、融合蛋白或它们的片段，例如双抗体、单链(sc)
‑
双抗体(scfv)2、微型抗体、微抗体、barnase
‑
barstar、scfv
‑
fc、sc(fab)2、三聚体抗体构建体、三体抗体构建体、三聚体抗体(trimerbody)抗体构建体、三体抗体构建体、collabody抗体构建体、(scfv
‑
tnfa)3或f(ab)3/dnl抗体构建体。
[0212]
在每个前述方面的某些实施方案以及本文其他各处描述的其他方面和实施方案中，免疫治疗剂是调节免疫反应的剂，例如检查点抑制剂或检查点激动剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是增强抗肿瘤免疫反应的剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是增加细胞介导的免疫的剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是增加t细胞活性的剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是增加溶细胞性t细胞(ctl)活性的剂。
[0213]
在一些实施方案中，本发明的治疗方法可以包括将本发明的化合物与例如结合剂，例如调节(激活或抑制)检查点蛋白的抗体或其功能片段的分子组合使用。检查点抑制剂可以是抑制免疫检查点和/或促进免疫检查点抑制剂的任何分子、剂、治疗和/或方法，例如通过促进内在免疫检查点抑制剂；抑制参与免疫检查点表达的转录因子；和/或通过与一些另外的外在因素共同作用。例如，检查点抑制剂可包括抑制参与免疫检查点基因表达的转录因子或促进肿瘤抑制基因如bach2的转录因子表达的治疗(luan等人，(2016)。transcription factors and checkpoint inhibitor expression with age：markers of immunosenescence.blood，128(22)，5983)。此外，检查点抑制剂可以抑制免疫检查点基因的转录；免疫检查点mrna的修饰和/或加工；免疫检查点蛋白的翻译；和/或参与免疫或免疫检查点通路的分子，例如pd
‑
1转录因子(诸如hif
‑
1、stat3、nf
‑
κb和ap
‑
1)，或常见致癌通路(诸如jak/stat、ras/erk或p13k/akt/mtor)的激活(zerdes等人，genetic，transcriptional and post
‑
translational regulation of the programmed death protein ligand 1in cancer：biology and clinical correlations，oncogene第37卷，第4639
‑
4661页(2018)，其公开内容以引用方式整体并入本文)。
[0214]
检查点抑制剂可以包括在转录水平上调控免疫检查点的治疗、分子、剂和/或方法，例如使用rna干扰通路共抑制和/或转录后基因沉默(ptgs)(例如，微rna、mirna；沉默rna、小干扰rna或短干扰rna(sirna)。检查点分子的转录调控已被证明涉及mir
‑
16，其已被证明靶向检查点mrna cd80、cd274(pd
‑
l1)和cd40的3'utr(leibowitz等人，post
‑
transcriptional regulation of immune checkpoint genes by mir
‑
16in melanoma，annals of oncology(2017)28；v428
‑
v448)。mir
‑
33a也已被证明参与调控肺腺癌病例中pd
‑
1的表达(boldini等人，role of microrna
‑
33a in regulating the expression of pd
‑
1in lung adenocarcinoma，cancer cell int.2017；17：105，其公开内容以引用方式整
体并入本文)。
[0215]
t细胞特异性适体
‑
sirna嵌合体被认为是抑制免疫检查点通路中分子的高度特异性方法(hossain等人，the aptamer
‑
sirna conjugates：reprogramming t cells for cancer therapy，ther.deliv.2015jan；6(1)：1
‑
4，其公开内容以引用方式整体并入本文)。
[0216]
或者，可以使用影响相关通路，例如代谢的治疗来抑制免疫检查点通路的成员。例如，从cad巨噬细胞在线粒体中过量供应糖酵解中间体丙酮酸通过诱导骨形态发生蛋白4/磷酸化smad1/5/ifn调节因子1(bmp4/p
‑
smad1/5/irf1)信号传导通路来促进pd
‑
l1的表达。因此，实施调节代谢通路的治疗可导致免疫抑制性pd
‑
1/pd
‑
l1检查点通路的后续调节(watanabe等人，pyruvate controls the checkpoint inhibitor pd
‑
l1 and suppresses t cell immunity，j clin invest.2017jun 30；127(7)：2725
‑
2738)。
[0217]
检查点免疫可以通过溶瘤病毒进行调控，所述溶瘤病毒在肿瘤细胞内选择性复制并在肿瘤微环境中诱导急性免疫反应，即通过充当遗传载体，携带特定剂(例如，抗体、mirna、sirna等)至癌细胞并影响它们的溶瘤以及细胞因子和趋化因子的分泌，以与免疫检查点抑制协同作用(shi等人，cancer immunotherapy：a focus on the regulation of immune checkpoints，int j mol sci.2018年5月；19(5)：1389)。目前，正在进行利用以下病毒作为检查点抑制剂的临床试验：脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒(hsv)、柯萨奇病毒(coxsackieviruses)、呼肠孤病毒、新城疫病毒(ndv)、t
‑
vec(一种由gm
‑
csf(粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子)编码的疱疹病毒)和h101(shi等人，同上)。
[0218]
检查点抑制剂可在检查点免疫的翻译水平上发挥作用。从mrna到蛋白质的翻译代表了基因表达调控中的关键事件，因此抑制免疫检查点翻译是一种可以抑制免疫检查点通路的方法。
[0219]
免疫检查点通路的抑制可发生在免疫检查点翻译过程的任何阶段。例如，药物、分子、剂、治疗和/或方法可抑制起始过程(由此将40s核糖体亚单位募集到mrna的5
′
端并朝其3
′
端扫描mrna的5'utr。抑制可通过靶向引发剂甲硫氨酰转移rna(trna)(met
‑
trnai)的反密码子、其与起始密码子的碱基配对或募集60s亚单位以在免疫检查点特异性基因的翻译中开始氨基酸的延伸和依序添加来发生。或者，检查点抑制剂可通过阻止三元复合物(tc)(即真核起始因子(eif)2(或其α、β和γ亚单位中的一个或多个)、gtp和met
‑
trnai)的形成，在翻译水平上抑制检查点。
[0220]
检查点抑制可通过eif2α的失稳来实现，所述方法是通过用蛋白激酶r(pkr)、perk、gcn2或hri阻止eif2α的磷酸化，或通过阻止tc与40s核糖体和/或其他起始因子相关联，从而防止起始前复合物(pic)的形成；抑制eif4f复合物和/或其帽结合蛋白eif4e、支架蛋白eif4g或eif4a解旋酶。讨论癌症翻译控制的方法在truitt等人，new frontiers in translational control of the cancer genome，nat rev cancer.2016apr 26；16(5)：288
‑
304中进行了讨论，其公开内容以引用方式整体并入本文。
[0221]
检查点抑制剂还可包括在细胞和/或蛋白质水平上调控免疫检查点的治疗、分子、剂和/或方法，例如通过抑制免疫检查点受体。检查点的抑制可通过使用抗体、抗体片段、抗原结合片段、小分子和/或其他药物、剂、治疗和/或方法发生。
[0222]
免疫检查点是指免疫系统中的抑制通路，其负责维持自身耐受性并调节免疫系统反应的程度，以最大程度地减少对周围组织的损害。然而，肿瘤细胞也可激活免疫系统检查
点，以降低免疫反应针对肿瘤组织的有效性(`阻断`免疫反应)。与大多数抗癌剂相比，检查点抑制剂不直接靶向肿瘤细胞，而是靶向淋巴细胞受体或其配体，以增强免疫系统的内源性抗肿瘤活性。(pardoll，2012，nature reviews cancer 12：252
‑
264)。
[0223]
在一些实施方案中，免疫治疗剂是pd
‑
1活性调节剂、pd
‑
l1活性调节剂、pd
‑
l2活性调节剂、ctla
‑
4活性调节剂、cd28活性调节剂、cd80调节剂cd86活性调节剂、4
‑
1bb活性调节剂、ox40活性调节剂、kir活性调节剂、tim
‑
3活性调节剂、lag3活性调节剂、cd27活性调节剂、调节剂cd40活性调节剂、gitr活性调节剂、tigit活性调节剂、cd20活性调节剂、cd96活性调节剂、ido1活性调节剂、细胞因子、趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子(tnf)家族的成员，或免疫刺激性寡核苷酸。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂，即为抑制剂或拮抗剂，或为激活剂或激动剂，例如cd28调节剂、4
‑
1bb调节剂、ox40调节剂、cd27调节剂、cd80调节剂、cd86调节剂、cd40调节剂或gitr调节剂、lag
‑
3调节剂、41bb调节剂、light调节剂、cd40调节剂、gitr调节剂、tgf
‑
β调节剂、tim
‑
3调节剂、sirp
‑
α调节剂、tigit调节剂、vsig8调节剂、btla调节剂、siglec7调节剂、siglec9调节剂、icos调节剂、b7h3调节剂、b7h4调节剂、fas调节剂和/或btnl2调节剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是如上所述的免疫检查点调节剂(例如，免疫检查点调节剂抗体，其可以是本领域已知的单克隆抗体、包含一个或多个免疫检查点抗原结合部分的双特异性抗体、三特异性抗体，或与免疫细胞衔接的多价抗体/融合蛋白/构建体的形式)。
[0224]
在一些实施方案中，免疫治疗剂是抑制pd
‑
1活性的剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是抑制pd
‑
l1和/或pd
‑
l2活性的剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是抑制ctla
‑
4活性的剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是抑制cd80和/或cd86活性的剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是抑制tigit活性的剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是抑制kir活性的剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是增强或刺激激活免疫检查点受体活性的剂。
[0225]
pd
‑
1(也称为程序性死亡1、cd279、pdcd1)是一种细胞表面受体，在调控免疫系统中刺激性和抑制性信号之间的平衡以及维持外周耐受方面具有关键作用(ishida，y等人，1992embo j.11 3887；kier，mary e等人，2008annu rev immunol 26 677
‑
704；okazaki，taku等人，2007international immunology 19 813
‑
824)。pd
‑
1是免疫球蛋白超家族的抑制成员，与cd28同源。pd
‑
1的结构是一种单体1型跨膜蛋白，其由一个免疫球蛋白可变样胞外结构域和一个含有免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)和免疫受体酪氨酸基开关基序(itsm)的胞质结构域组成。pd
‑
1的表达可在t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞和单核细胞上诱导，例如在通过t细胞受体(tcr)或b细胞受体(bcr)信号传导激活淋巴细胞后(kier，mary e等人2008annu rev immunol 26 677
‑
704；agata，y等人1996int immunol 8765
‑
72)。pd
‑
1是配体cd80、cd86、pd
‑
l1(b7
‑
h1、cd274)和pd
‑
l2(b7
‑
dc、cd273)的受体，这些配体是细胞表面表达的b7家族的成员(freeman，gordon等人2000j exp med 192 1027；latchman，y等人2001nat immunol 2 261)。在配体衔接后，pd
‑
1将磷酸酶诸如shp
‑
1和shp
‑
2募集到其胞内酪氨酸基序，其随后使被tcr或bcr信号传导激活的效应分子去磷酸化(chemnitz，j等人2004j immunol 173 945
‑
954；riley，james l 2009immunological reviews 229114
‑
125)。以此方式，pd
‑
1仅当与tcr或bcr同时衔接时才将抑制性信号转导至t细胞和b细胞中。
[0226]
已经证明pd
‑
1通过细胞内在和细胞外在功能机制下调效应t细胞反应。通过pd
‑
1的抑制性信号传导会在t细胞中诱导无反应状态，导致细胞无法克隆扩增或产生最佳水平
的效应细胞因子。pd
‑
1还可通过其抑制存活信号共刺激的能力来诱导t细胞凋亡，从而降低关键抗细胞凋亡分子诸如bcl
‑
xl的表达(kier，mary e等人2008annu rev immunol 26 677
‑
704)。除了这些直接影响外，最近的出版物还暗示pd
‑
1通过促进调节性t细胞(treg)的诱导和维持而参与效应细胞的抑制。例如，已经证明在树突状细胞上表达的pd
‑
l1与tgf
‑
β协同作用，从而以增强的抑制功能促进cd4 foxp3 treg的诱导(francisco，loise m等人2009j exp med 206 3015
‑
3029)。
[0227]
tim
‑
3(也称为t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3、tim
‑
3、甲型肝炎病毒细胞受体2、havcr2、havcr
‑
2、kim
‑
3、timd
‑
3、timd3、tim
‑
3和cd366)是一种～33.4
‑
kda的单程i型膜蛋白，参与免疫反应(sanchez
‑
fueyo等人，tim
‑
3 inhibits t helper type 1
‑
mediated auto
‑
and alloimmune responses and promotes immunological tolerance，nat.immunol.4：1093
‑
1101(2003))。
[0228]
tim
‑
3在th1细胞和吞噬细胞(例如巨噬细胞和树突状细胞)上选择性表达。使用sirna或阻断抗体降低人的表达导致了cd4阳性t细胞的干扰素γ(ifn
‑
γ)分泌增加，暗示了tim
‑
3在人t细胞中的抑制作用。对来自自身免疫性疾病患者的临床样品的分析显示，在cd4阳性细胞中没有tim
‑
3的表达。具体地说，与来源于正常健康人的克隆相比，来源于多发性硬化症患者的脑脊液的t细胞克隆中tim
‑
3的表达水平较低，而ifn
‑
γ的分泌较高(koguchi k等人，j exp med.203：1413
‑
8.(2006))。
[0229]
tim
‑
3是以下配体的受体：半乳糖凝集素9(galectin
‑
9)，它是半乳糖凝集素家族的成员，在各种细胞类型上普遍表达的分子并且结合β
‑
半乳糖苷；磷脂酰丝氨酸(ptdser)(dekryff等人，t cell/transmembrane，ig，and mucin
‑
3allelic variants differentially recognize phosphatidylserine and mediate phagocytosis of apoptotic cells，j immunol.2010年2月15日；184(4)：1918
‑
30)；高迁移率族蛋白1(也称为hmgb1、hmg1、hmg3、sbp
‑
1、hmg
‑
1和高迁移率族盒1(chiba等人，tumor
‑
infiltrating dcs suppress nucleic acid
‑
mediated innate immune responses through interactions between the receptor tim
‑
3and the alarmin hmgb1，nat immunol.2012年9月；13(9)：832
‑
42)；以及癌胚抗原相关细胞粘附分子1(也称为ceacam1、bgp、bgp1、bgpi、癌胚抗原相关细胞粘附分子1)(huang等人，ceacam1 regulates tim
‑3‑
mediated tolerance and exhaustion，nature.2015年1月15日；517(7534)：386
‑
90)。
[0230]
btla(也称为b和t淋巴细胞衰减子、btla1、cd272以及b和t淋巴细胞相关)是一种～27.3
‑
kda的单程i型膜蛋白，参与免疫反应过程中的淋巴细胞抑制。btla在b和t细胞中均组成型表达。btla与肿瘤坏死因子受体(tnfr)家族成员hvem(疱疹病毒进入介体)相互作用(gonzalez等人，proc.natl.acad.sci.usa，2005，102：1116
‑
21)。btla，属于免疫球蛋白超家族的cd28家族，与hvem，一种共刺激肿瘤坏死因子(tnf)受体(tnfr)之间的相互作用是独一无二的，因为它定义了这两个受体家族之间的串扰。btla含有膜近端免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)和膜远端免疫受体酪氨酸开关基序(itsm)。itim或itsm的破坏消除了btla募集shp1或shp2的能力，这表明btla以不同于pd
‑
1的方式募集shp1和shp2，并且需要两种酪氨酸基序来阻断t细胞激活。btla胞质尾部还在胞质结构域内含有第三保守的含酪氨酸基序，其序列类似于grb
‑
2募集位点(yxn)。另外，含有这种btla n
‑
末端酪氨酸基序的磷酸化肽可在体外与grb2和pi3k的p85亚单位相互作用，尽管这种相互作用的功能影响在体内尚
未得到探讨(gavrieli等人，bioochem.biophysi res commun，2003，312，1236
‑
43)。btla是配体ptpn6/shp
‑
1、ptpn11/shp
‑
2、tnfrsf14/hvem和b7h4的受体。
[0231]
vista(也称为t细胞激活v结构域ig抑制子、vsir、b7
‑
h5、b7h5、gi24、pp2135、sisp1、dd1α、vista、c10orf54、10号染色体开放阅读框54、pd
‑
1h以及v
‑
set免疫调节受体)是一种～33.9
‑
kda的单程i型膜蛋白，它参与t细胞抑制反应，通过bmp4信号传导抑制引起的胚胎干细胞分化以及mmp14介导的mmp2激活(yoon等人，control of signaling
‑
mediated clearance of apoptotic cells by the tumor suppressor p53，science.2015年7月31；349(6247)：1261669)。vista与配体vsig
‑
3相互作用(wang等人，vsig
‑
3as a ligand of vista inhibits human t
‑
cell function，immunology.2019jan；156(1)：74
‑
85)
[0232]
lag
‑
3(也称为淋巴细胞激活基因3、lag3、cd223和淋巴细胞激活3)是一种～57.4
‑
kda的单程i型膜蛋白，它参与淋巴细胞激活，还与hla ii类抗原结合。lag
‑
3是免疫球蛋白超基因家族的成员，并且在以下细胞上表达：激活的t细胞(huard等人，1994，immunogenetics 39：213)、nk细胞(triebel等人，1990，j.exp.med.171：1393
‑
1405)、调节性t细胞(huang等人，2004，immunity 21：503
‑
513；camisaschi等人，2010，j immunol.184：6545
‑
6551；gagliani等人，2013，nated 19：739
‑
746)和浆细胞样树突状细胞(dc)(workman等人，2009，j immunol 182：1885
‑
1891)。lag
‑
3是一种由位于12号染色体上的基因编码的膜蛋白，并且在结构和遗传上与cd4相关。与cd4相似，lag
‑
3可与细胞表面的mhc ii类分子相互作用(baixeras等人，1992，j.exp.med.176：327
‑
337；huard等人，1996，eur.j.immunol.26：1180
‑
1186)。已经提出lag
‑
3与mhc ii类的直接结合在下调cd4 t淋巴细胞的抗原依赖性刺激中起作用(huard等人，1994，eur.j.immunol.24：3216
‑
3221)并且也已经证明lag
‑
3阻断可以使肿瘤或自身抗原(gross等人，2007，j clin invest.117：3383
‑
3392)和病毒模型(blackburn等人，2009，nat.immunol.10：29
‑
37)中的cd8 淋巴细胞恢复。此外，lag
‑
3的胞质内区域可与lap(lag
‑
3相关蛋白)相互作用，后者是一种参与cd3/tcr激活通路下调的信号转导分子(iouzalen等人，2001，eur.j.immunol.31：2885
‑
2891)。此外，已经证明cd4 cd25 调节性t细胞(treg)在激活后表达lag
‑
3，这有助于treg细胞的抑制活性(huang，c.等人，2004，immunity 21：503
‑
513)。lag
‑
3还可通过treg细胞以t细胞依赖性和非依赖性机制负调控t细胞稳态(workman，c.j.和vignali，d.a.，2005，j.immunol.174：688
‑
695)。
[0233]
已经证明lag
‑
3与mhc ii类分子相互作用(huard等人，cd4/major histocompatibility complex class ii interaction analyzed with cd4
‑
and lymphocyte activation gene
‑
3(lag
‑
3)
‑
ig fusion proteins，eur j immunol.1995年9月；25(9)：2718
‑
21)。
[0234]
另外，已知几种激酶是检查点抑制剂。例如，chek
‑
1、chek
‑
2和a2ar。
[0235]
chek
‑
1(也称为chk 1激酶、chk1和检查点激酶1)是一种～54.4
‑
kda的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它参与检查点介导的细胞周期停滞和对dna损伤和/或未复制的dna作出反应的dna修复的激活。
[0236]
chek
‑
2(也称为chk2激酶、cds1、chk2、hucds1、lfs2、pp1425、rad53、hcds1和检查点激酶2)是一种～60.9
‑
kda的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它参与检查点介导的细胞周期停
滞、dna修复激活和双链断裂介导的细胞凋亡。
[0237]
a2ar(也称为腺苷a2a受体、adora2a、腺苷a2a受体、a2ar、adora2和rdc8)是～44.7
‑
kda的对于腺苷和其他配体的多程膜受体。
[0238]
在一些实施方案中，例示性免疫治疗剂可包括一种或多种靶向pd
‑
1、pd
‑
l1、pd
‑
l2、ceacam(例如，ceacam
‑
1、
‑
3和/或
‑
5)、ctla
‑
4、tim
‑
3、lag
‑
3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4、tgfβ、ox40、41bb、light、cd40、gitr、tgf
‑
β、tim
‑
3、sirp
‑
α、vsig8、btla、siglec7、siglec9、icos、b7h3、b7h4、fas和/或btnl2等本领域已知的抗体调节剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是增加自然杀伤(nk)细胞活性的剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是抑制免疫反应抑制的剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是抑制抑制细胞或抑制细胞活性的剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是抑制treg活性的剂或疗法。在一些实施方案中，免疫治疗剂是抑制抑制性免疫检查点受体活性的剂。
[0239]
在一些实施方案中，本公开的组合包含本发明的化合物和免疫治疗剂，其中免疫治疗剂包括选自共刺激分子的激动剂或激活剂的t细胞调节剂。在一个实施方案中，共刺激分子的激动剂选自gitr、ox40、slam(例如，slamf7)、hvem、light、cd2、cd27、cd28、cds、icam
‑
1、lfa
‑
1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4
‑
1bb(cd137)、cd30、cd40、baffr、cd7、nkg2c、nkp80、cd160、b7
‑
h3或cd83配体的激动剂(例如，激动剂抗体或其抗原结合片段，或可溶性融合物)。在其他实施方案中，效应细胞组合包括双特异性t细胞衔接子(例如，结合cd3和肿瘤抗原(例如，egfr、psca、psma、epcam、her2等)的双特异性抗体分子)。
[0240]
在一些实施方案中，免疫治疗剂是pd
‑
1活性调节剂、pd
‑
l1活性调节剂、pd
‑
l2活性调节剂、ctla
‑
4活性调节剂、cd28活性调节剂、cd80活性调节剂、cd86活性调节剂、4
‑
1bb活性调节剂、ox40活性调节剂、kir活性调节剂、tim
‑
3活性调节剂、lag3活性调节剂、cd27活性调节剂、cd40活性调节剂、gitr活性调节剂、tigit活性调节剂、cd20活性调节剂、cd96活性调节剂、ido1活性调节剂、sirp
‑
α活性调节剂、tigit活性调节剂、vsig8活性调节剂、btla活性调节剂、siglec7活性调节剂、siglec9活性调节剂、icos活性调节剂、b7h3活性调节剂、b7h4活性调节剂、fas活性调节剂、btnl2活性调节剂、细胞因子、趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子(tnf)家族成员或免疫刺激性寡核苷酸。
[0241]
在一些实施方案中，免疫治疗剂是免疫检查点调节剂(例如免疫检查点抑制剂，例如pd
‑
1活性抑制剂、pd
‑
l1活性调节剂、pd
‑
l2活性调节剂、ctla
‑
4调节剂，或cd40激动剂(例如，抗cd40抗体分子)、(xi)ox40激动剂(例如，抗ox40抗体分子)或(xii)cd27激动剂(例如，抗cd27抗体分子)。在一个实施方案中，免疫治疗剂是以下的抑制剂：pd
‑
1、pd
‑
l1、pd
‑
l2、ctla
‑
4、tim
‑
3、lag
‑
3、ceacam(例如，ceacam
‑
1、
‑
3和/或
‑
5)、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和/或tgfβ、半乳糖凝集素9、cd69、半乳糖凝集素1、cd113、gpr56、cd48、garp、pd1h、lair1、tim
‑
1和tim
‑
4。在一个实施方案中，免疫检查点分子的抑制剂抑制pd
‑
1、pd
‑
l1、lag
‑
3、tim
‑
3、ceacam(例如，ceacam
‑
1、
‑
3和/或
‑
5)、ctla
‑
4，或它们的任何组合。
[0242]
在一个实施方案中，免疫治疗剂是刺激t细胞激活的蛋白质诸如b7
‑
1、b7
‑
2、cd28、4
‑
1bb(cd137)、4
‑
1bbl、icos、icos
‑
l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd70、cd27、cd40、dr3和cd28h的激动剂。
[0243]
在一些实施方案中，在本文公开的组合(例如，在与本发明化合物的组合)中使用的免疫治疗剂是共刺激分子的激活剂或激动剂。在一个实施方案中，共刺激分子的激动剂
选自cd2、cd28、cds、icam
‑
1、lfa
‑
1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4
‑
1bb(cd137)、gitr、cd30、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7
‑
h3或cd83配体的激动剂(例如，激动剂抗体或其抗原结合片段或可溶性融合物)。
[0244]
抑制性分子的抑制可以在dna、rna或蛋白质水平上进行。在实施方案中，抑制性核酸(例如，dsrna、sirna或shrna)可用于抑制抑制性分子的表达。在其他实施方案中，抑制性信号的抑制剂是多肽，例如可溶性配体(例如pd
‑1‑
ig或ctla
‑
4ig)，或抗体或其抗原结合片段，例如本领域已知的与抑制性分子结合的单克隆抗体、包含一个或多个免疫检查点抗原结合部分的双特异性抗体、三特异性抗体或与免疫细胞衔接的多价抗体/融合蛋白/构建体；例如与pd
‑
1、pd
‑
l1、pd
‑
l2、ctla
‑
4、tim
‑
3、lag
‑
3、ceacam(例如，ceacam
‑
1、
‑
3和/或
‑
5)、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和/或tgfβ、半乳糖凝集素9、cd69、半乳糖凝集素1、cd113、gpr56、cd48、garp、pd1h、lair1、tim
‑
1、tim
‑
4或它们的组合结合的抗体或其片段(在本文中也称为“抗体分子”)。
[0245]
在一些实施方案中，其中组合包含本发明的化合物和免疫治疗剂，其中免疫治疗剂是单克隆抗体或双特异性抗体。例如，单克隆或双特异性抗体可以特异性结合c
‑
met通路的成员和/或免疫检查点调节剂(例如，双特异性抗体结合肝细胞生长因子受体(hgfr)和本文所述的免疫检查点调节剂两者，诸如一种抗体，其结合pd
‑
1、pd
‑
l1、pd
‑
l2或ctla
‑
4、lag
‑
3、ox40、41bb、light、cd40、gitr、tgf
‑
β、tim
‑
3、sirp
‑
α、tigit、vsig8、btla、siglec7、siglec9、icos、b7h3、b7h4、fas、btnl2或cd27)。在特定实施方案中，双特异性抗体特异性结合人hgfr蛋白以及pd
‑
1、pd
‑
l1和ctla
‑
4之一。
[0246]
在本文所述方法的一些实施方案中，免疫治疗剂是pd
‑
1拮抗剂、pd
‑
l1拮抗剂、pd
‑
l2拮抗剂、ctla
‑
4拮抗剂、cd80拮抗剂、cd86拮抗剂、kir拮抗剂、tim
‑
3拮抗剂、lag3拮抗剂、tigit拮抗剂、cd20拮抗剂、cd96拮抗剂或ido1拮抗剂。
[0247]
在一些实施方案中，pd
‑
1拮抗剂是特异性结合pd
‑
1的抗体。在一些实施方案中，结合pd
‑
1的抗体是派姆单抗(pembrolizumab)(mk
‑
3475；merck)、匹利珠单抗(pidilizumab)(ct
‑
011；curetech ltd.)、纳武单抗(nivolumab)(bms
‑
936558，mdx
‑
1106；bristol myer squibb)、medi0680(amp
‑
514；astrazenenca/medimmune)、regn2810(regeneron pharmaceuticals)、bgb
‑
a317(beigene ltd.)、pdr
‑
001(novartis)或sti
‑
a1110(sorrento therapeutics)。在一些实施方案中，结合pd
‑
1的抗体在pct公开wo 2014/179664中有所描述，例如鉴定为ape2058、ape1922、ape1923、ape1924、ape1950或ape1963(anaptysbio)的抗体，或含有这些抗体中任一种的cdr区域的抗体。在其他实施方案中，pd
‑
1拮抗剂是包括pd
‑
l1或pd
‑
l2胞外结构域的融合蛋白，例如，amp
‑
224(astrazeneca/medimmune)。在其他实施方案中，pd
‑
1拮抗剂是肽抑制剂，例如，aunp
‑
12(aurigene)。
[0248]
在一些实施方案中，pd
‑
l1拮抗剂是特异性结合pd
‑
l1的抗体。在一些实施方案中，结合pd
‑
l1的抗体是阿特珠单抗(atezolizumab)(rg7446，mpdl3280a；genentech)、medi4736(astrazeneca/medimmune)、bms
‑
936559(mdx
‑
1105；bristol myers squibb)、阿维鲁单抗(avelumab)(msb0010718c；merckkgaa)、kd033(kadmon)、kd033的抗体部分或sti
‑
a1014(sorrentotherapeutics)。在一些实施方案中，结合pd
‑
l1的抗体在pct公开wo 2014/
055897中有所描述，例如ab
‑
14、ab
‑
16、ab
‑
30、ab
‑
31、ab
‑
42、ab
‑
50、ab
‑
52或ab
‑
55，或含有这些抗体中任一种的cdr区的抗体，其公开内容以引用方式整体并入本文。
[0249]
在一些实施方案中，ctla
‑
4拮抗剂是特异性结合ctla
‑
4的抗体。在一些实施方案中，结合ctla
‑
4的抗体是伊匹单抗(ipilimumab)(bristol myer squibb)或替西木单抗(tremelimumab)(cp
‑
675，206；pfizer)。在一些实施方案中，ctla
‑
4拮抗剂是ctla
‑
4融合蛋白或可溶性ctla
‑
4受体，例如，karr
‑
102(kahr medical ltd.)。
[0250]
在一些实施方案中，lag3拮抗剂是特异性结合lag3的抗体。在一些实施方案中，结合lag3的抗体是imp701(prima biomed)、imp731(prima biomed/glaxosmithkline)、bms
‑
986016(bristol myer squibb)、lag525(novartis)和gsk2831781(glaxosmithkline)。在一些实施方案中，lag3拮抗剂包括可溶性lag3受体，例如，imp321(prima biomed)。
[0251]
在一些实施方案中，kir拮抗剂是特异性结合kir的抗体。在一些实施方案中，结合kir的抗体是利利鲁单抗(lirilumab)(bristol myer squibb/innate pharma)。
[0252]
在一些实施方案中，免疫治疗剂是细胞因子，例如趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子或肿瘤坏死因子家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子是il
‑
2、il15或干扰素
‑
γ。
[0253]
在任何上述方面或本文别处描述的那些方面的一些实施方案中，癌症选自由以下项组成的组：肺癌(例如，非小细胞肺癌(nsclc))、肾癌(例如，肾尿路上皮癌)、膀胱癌(例如膀胱尿路上皮(移行细胞)癌)、乳腺癌、结直肠癌(例如结肠腺癌)、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、间皮瘤、黑色素瘤(例如皮肤黑色素瘤)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌(hnscc))、甲状腺癌、肉瘤(例如软组织肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、骨源性肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、平滑肌肉瘤或横纹肌肉瘤)、前列腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌、白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病(all)、急性粒细胞白血病(aml)、慢性粒细胞白血病(cml)、慢性嗜酸性粒细胞白血病或慢性淋巴细胞性白血病(cll))、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(nhl))、骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤(mm))、蕈样真菌病、默克尔细胞癌、血液系统恶性肿瘤、血液组织癌、b细胞癌、支气管癌、胃癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、子宫癌或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、睾丸癌、胆道癌、小肠癌或阑尾癌、唾液腺癌、肾上腺癌、腺癌、炎性肌纤维母细胞瘤、胃肠道间质瘤(gist)、结肠癌、骨髓增生异常综合征(mds)、骨髓增生性病症(mpd)、真性红细胞增多症、脊索瘤、滑膜瘤、尤文氏瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肝细胞癌、甲状腺癌、小细胞癌、原发性血小板增多症、不明原因的髓系化生、嗜酸性粒细胞增多综合征、系统性肥大细胞增多症、熟悉的嗜酸性粒细胞增多症、神经内分泌癌或类癌瘤。
[0254]
在任何上述方面或本文别处描述的那些方面的一些实施方案中，受试者的癌症或肿瘤对免疫检查点抑制(例如，对本文所述的任何免疫检查点抑制剂，诸如pd
‑
1拮抗剂或pd
‑
l1拮抗剂)没有反应或受试者的癌症或肿瘤在对免疫检查点抑制(例如，对本文所述的任何免疫检查点抑制剂，诸如pd
‑
1拮抗剂或pd
‑
l1拮抗剂)的初始反应后进展。
[0255]
在各种实施方案中，免疫治疗剂可包含抗体或其抗原结合片段。在这个定义中，免疫检查点抑制剂包括本领域已知的双特异性抗体和与免疫细胞衔接的多价抗体/融合蛋白/构建体。在一些实施方案中，包含双特异性抗体的免疫治疗剂可以包括二价的并且结合免疫检查点分子的相同表位、相同免疫检查点分子的两个不同表位或两个不同免疫检查点的不同表位的双特异性抗体。
[0256]
本领域普通技术人员可实施本领域已知的靶向以下中的一种或多种的几种双特异性抗体形式以用于本文所述的组合：ctla4、pd1、pd
‑
l1、tim
‑
3、lag
‑
3、各种b
‑
7配体、b7h3、b7h4、chk1和chk2激酶、btla、a2ar、ox40、41bb、light、cd40、gitr、tgf
‑
β、sirp
‑
α、tigit、vsig8、siglec7、siglec9、icos、fas、btnl2和其他。
[0257]
在各种实施方案中，免疫治疗剂可包括与免疫细胞衔接的多价抗体/融合蛋白/构建体。
[0258]
在本公开的一个实施方案中，检查点抑制剂与本发明的化合物组合用于减少或抑制原发肿瘤或癌症向其他部位的转移，或在远离原发肿瘤或癌症的其他部位形成或建立转移性肿瘤或癌症，从而抑制或减少肿瘤或癌症复发或肿瘤或癌症进展。
[0259]
在本公开的另一个实施方案中，本文提供了用于治疗癌症的组合疗法，组合疗法包含本发明的化合物和检查点抑制剂，其具有引发强效和持久免疫反应的潜力以及增强的治疗益处和更易于控制的毒性。
[0260]
在本公开的另一个实施方案中，本文提供了一种用于治疗癌症的组合疗法，组合疗法包含本发明的化合物和免疫检查点抑制剂。在本公开的一个实施方案中，本文提供了通过采用与检查点抑制剂协同作用的本发明的化合物来治疗癌症和/或预防转移建立的方法。
[0261]
在其他实施方案中，本公开提供了用于以下一项或多项的方法：1)减少或抑制可能或确实发展出转移的肿瘤或癌细胞的生长、增殖、迁移或侵袭，2)减少或抑制由原发性肿瘤或癌症引起的向与原发性肿瘤或癌症不同的一个或多个其他部位、位置或区域的转移的形成或建立，3)在转移已经形成或已经建立之后，减少或抑制在与原发性肿瘤或癌症不同的一个或多个其他部位、位置或区域的转移的生长或增殖，4)在转移已经形成或已经建立之后，减少或抑制额外转移的形成或建立，5)总体生存期延长，6)无进展生存期延长，或7)疾病稳定。所述方法包括向有需要的受试者施用本发明的化合物与如本文所述的检查点抑制剂的组合。
[0262]
在本公开的一个实施方案中，本发明的化合物与免疫治疗剂的施用提供了给定受试者的病状的可检测或可测量的改善，诸如减轻或改善与细胞增殖性或细胞过度增殖性病症、瘤形成、肿瘤或癌症、或转移的存在相关的一种或多种不良(身体)症状或后果，即，治疗益处或有益作用。
[0263]
治疗益处或有益作用是指病状或病变的任何客观或主观的、短暂的、暂时的或长期的改善，或与细胞增殖或细胞过度增殖性病症诸如瘤形成、肿瘤或癌症或转移相关或由其引起的不良症状的发作、严重性、持续时间或频率的降低。这可能会改善生存期。达到了根据本公开的治疗方法的令人满意的临床终点，例如，当一种或多种相关病理、不良症状或并发症的严重性、持续时间或频率逐渐或部分降低，或抑制或逆转细胞增殖或细胞过度增殖性病症诸如瘤形成、肿瘤或癌症或转移的一种或多种生理、生化或细胞表现或特征时。因
此，治疗益处或改善可以是但不限于靶增殖细胞(例如，瘤形成、肿瘤或癌症或转移)的破坏，或消除一种或多种、大部分或全部与细胞增殖或细胞过度增殖性病症诸如瘤形成、肿瘤或癌症或转移相关或由其引起的病理、不良症状或并发症。然而，治疗益处或改善不必是治愈或完全破坏所有靶增殖细胞(例如，瘤形成、肿瘤或癌症或转移)，或消除与细胞增殖或细胞过度增殖性病症诸如瘤形成、肿瘤或癌症或转移相关或由其引起的所有病理、不良症状或并发症。例如，通过抑制肿瘤或癌症的进展或恶化达成的肿瘤或癌细胞块的部分破坏或肿瘤或癌细胞团、大小或细胞数目的稳定可以降低死亡率并延长寿命，即使只是延长几天、几周或几个月，即使一部分或大部分肿瘤或癌块、大小或细胞仍然存在。
[0264]
治疗益处的特定的非限制性实例包括瘤形成、肿瘤或癌症或转移体积(大小或细胞块)或细胞数目减少，抑制或预防瘤形成、肿瘤或癌症体积的增加(例如，稳定化)，减慢或抑制瘤形成、肿瘤或癌症的进展、恶化或转移，或抑制瘤形成、肿瘤或癌症的增殖、生长或转移。
[0265]
在本公开的一个实施方案中，呈与本发明化合物的组合疗法施用免疫治疗剂可提供根据irrc(如源自时间点反应评估并基于肿瘤负荷)可检测或可测量的改善或总体反应，包括以下一项或多项：(i)ircr
‑
所有病变完全消失，无论是否可测量，并且无新病变(通过从首次记录日期起不少于4周的反复连续评估确认)；(ii)irpr
‑
相对于基线，肿瘤负荷降低≥50％(通过首次记录后至少4周的连续评估确认)。
[0266]
任选地，本文所述的任何方法可能不会立即见效。例如，治疗后瘤形成、肿瘤或癌症的细胞数目或块可能增加，但随着时间的推移，随后会出现给定受试者中的肿瘤细胞块、大小或细胞数目的最终稳定或减少。
[0267]
可以被抑制、减少、降低、延迟或预防的与瘤形成、肿瘤、癌症和转移有关的其他不良症状和并发症包括例如恶心、食欲不振、嗜睡、疼痛和不适。因此，与细胞过度增殖性病症相关或由其引起的不良症状或并发症的严重性、持续时间或频率的部分或完全降低或减少、受试者的生活质量和/或幸福感的改善，例如活力、食欲、心理健康增加，都是治疗益处的特定非限制性实例。
[0268]
因此，治疗益处或改善还可包括所治疗受试者的生活质量的主观改善。在另外的实施方案中，一种方法延长或延伸受试者的寿命(生存期)。在另一个实施方案中，一种方法改善了受试者的生活质量。
[0269]
在一个实施方案中，呈与本发明化合物的组合疗法施用免疫治疗剂可引起选自以下一种或多种的疾病状态和进展的一种或多种标志物的临床相关改善：(i)：总体生存期，(ii)：无进展生存期，(iii)：总体反应率，(iv)：转移性疾病的减少，(v)：肿瘤抗原(诸如碳水化合物抗原19.9(ca19.9)和癌胚抗原(cea))或其他取决于肿瘤的物质的循环水平，(vii)营养状况(体重、食欲、血清白蛋白)，(viii)：疼痛控制或镇痛剂使用，(ix)：crp/白蛋白比。
[0270]
用本发明化合物与免疫治疗剂组合治疗产生更复杂的免疫，不仅包括先天免疫和1型免疫的发展，还包括更有效地恢复适当免疫功能的免疫调节。
[0271]
在各种示例性方法中，可以对针对所关注的检查点分子(例如，pd
‑
1)的检查点抑制剂抗体(单克隆或多克隆、双特异性、三特异性或与免疫细胞衔接的多价抗体/融合蛋白/构建体)进行测序，然后可以将多核苷酸序列克隆到用于表达或繁殖的载体中。编码所关注
的抗体或其抗原结合片段的序列可维持在宿主细胞内的载体中，然后可将宿主细胞扩增和冷冻以备将来使用。在细胞培养物中产生重组单克隆抗体可通过用本领域已知的方法从b细胞中克隆抗体基因来进行。参见例如tiller等人，2008，j.immunol.methods 329，112；美国专利号：7,314,622。
[0272]
含有根据本公开的本发明化合物的药物组合物将包含有效量的本发明化合物、免疫治疗剂和/或两者，通常分散在药学上可接受的载剂中。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当适当时施用于动物诸如人时不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开，本领域技术人员将知道含有本发明化合物的药物组合物的制备，如remington's pharmaceutical sciences，第18版mack printing company，1990所例示。此外，对于动物(例如，人)施用，应当理解制剂应满足无菌、致热性、一般安全性和纯度标准。含有与本文所述的免疫治疗剂混合的本发明化合物的组合组合物的药理学上可接受的载剂的具体实例是硼酸盐缓冲液或无菌盐水溶液(0.9％nacl)。
[0273]
如在remington's pharmaceutical sciences第16版，osol，a.ed.[1980]中充分描述和阐明的，可以通过将具有所期望的纯度的抗体与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合来制备根据本公开使用的免疫治疗剂，例如免疫检查点调节剂抗体的制剂，以冻干制剂或水溶液和/或混悬液的形式储存。可接受的载剂、赋形剂、缓冲剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括可在本公开的药物组合物中采用的合适的水性和/或非水性赋形剂，例如水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣材料，在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂、缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸来维持适当的流动性。可包括抗氧化剂，例如，(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(bha)、丁基化羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α
‑
生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3
‑
戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)。其他示例性的药学上可接受的赋形剂可包括多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，诸如钠；金属配合物(例如锌
‑
蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
[0274]
在一个例示性实施方案中，药物组合物任选可含有根据需要以接近生理条件的药学上可接受的助剂物质，诸如ph调节和缓冲剂以及毒性调节剂，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠。在一些实施方案中，根据本领域已知的冻干和重构技术，本公开的检查点抑制剂抗体或其抗原结合片段被配制用于并且可被冻干用于储存并在使用前在合适的赋形剂中重构。在含有一种或多种检查点抑制剂抗体或其抗原结合片段的一种示例性药物组合物中，将所述组合物配制成一种或多种检查点抑制剂抗体或其抗原结合片段的无
菌、无防腐剂溶液，用于静脉内或皮下施用。所述制剂可作为一次性使用的预填充笔、作为一次性使用，例如含有约1ml的预填充玻璃注射器，或作为一次性使用机构用小瓶提供。优选地，含有检查点抑制剂抗体或其抗原结合片段的药物组合物澄清且无色，ph为约6.9
‑
5.0，优选ph为6.5
‑
5.0，甚至更优选ph为约6.0至约5.0。在各种实施方案中，当重构并施用于受试者时，包含药物组合物的制剂每ml溶液可含有约500mg至约10mg、或约400mg至约20mg、或约300mg至约30mg或约200mg至约50mg检查点抑制剂抗体或其抗原结合片段。示例性的注射或输注赋形剂可包括甘露醇、一水合柠檬酸、二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、聚山梨醇酯80、氯化钠、柠檬酸钠和用于胃肠外施用的水，例如静脉内、肌内、腹膜内或皮下施用。
[0275]
在另一个示例性实施方案中，将一种或多种免疫治疗剂或其抗原结合片段配制成用于静脉内或皮下施用的无菌水溶液，其含有1
‑
75mg/ml，或更优选地，约5
‑
60mg/ml，或更优选地，约10
‑
50mg/ml，或甚至更优选地，约10
‑
40mg/ml的抗体，与ph为约5至6的乙酸钠、聚山梨醇酯80和氯化钠。优选地，静脉内或皮下制剂是含有5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/ml免疫治疗剂，例如免疫检查点抑制剂抗体或其抗原结合片段的无菌水溶液，与ph为5.5的20mm乙酸钠、0.2mg/ml聚山梨醇酯80和140mm氯化钠。此外，包含检查点抑制剂抗体或其抗原结合片段的溶液在许多其他化合物当中可包含组氨酸、甘露醇、蔗糖、海藻糖、甘氨酸、聚乙二醇、edta、甲硫氨酸及其任何组合，以及相关领域已知的许多其他化合物。
[0276]
在一个实施方案中，本公开的药物组合物包含以下组分：5
‑
500mg本公开的免疫治疗剂或其抗原结合片段、10mm组氨酸、5％蔗糖和ph为5.8的0.01％聚山梨醇酯80，和本发明的化合物。这个组合物可作为冻干粉末提供。当粉末以全体积重构时，组合物保持相同的配方。或者，粉末可以半体积重构，在这种情况下，组合物包含10
‑
500mg本公开的免疫治疗剂或其抗原结合片段、20mm组氨酸、10％蔗糖和ph为5.8的0.02％聚山梨醇酯80。
[0277]
在一个实施方案中，部分剂量通过静脉推注施用，并且其余通过免疫治疗剂制剂的输注施用。例如，免疫治疗剂或其抗原结合片段的约0.001至约200mg/kg，例如约0.001mg/kg至约100mg/kg，或约0.001mg/kg至约50mg/kg，或约0.001mg/kg至约10mg/kg的静脉注射可作为推注给予，并且其余抗体剂量可通过静脉注射施用。预定剂量的免疫治疗剂或其抗原结合片段可以在例如一小时至两小时至五小时的时间段内施用。
[0278]
在另一个实施方案中，部分剂量通过皮下注射和/或以推注形式输注施用，并且其余通过免疫治疗剂制剂的输注施用。在一些示例性剂量中，免疫治疗剂制剂可以免疫治疗剂或其抗原结合片段的约0.001至约200mg/kg，例如，约0.001mg/kg至约100mg/kg，或约0.001mg/kg至约50mg/kg，或约0.001mg/kg至约10mg/kg的静脉内注射的剂量皮下施用。在一些实施方案中，剂量可作为推注给予，并且免疫治疗剂剂量的其余部分可通过皮下或静脉内注射施用。预定剂量的免疫治疗剂或其抗原结合片段可以在例如一小时至两小时至五小时的时间段内施用。
[0279]
本文中的制剂还可含有对于所治疗的特定适应症所必要的多于一种活性化合物，优选为具有互补活性并且不会对彼此有不利影响的那些化合物。例如，可能期望提供一种或多种具有其他特异性的免疫治疗剂。另选地，或此外，组合物可包含抗炎剂、化学治疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和/或小分子拮抗剂。此类分子适当地以对预期的目的有效的量组合存在。
[0280]
要用于体内施用的制剂应当无菌或几乎无菌。这可通过无菌过滤膜过滤来轻易实现。
[0281]
在各种实施方案中，本文所述的药物组合物的例示性制剂可使用药物制剂领域中众所周知的方法来制备。一般来说，此类制备方法可包括以下步骤：将活性成分与载剂或一种或多种其他辅助成分结合，然后如需要，将产品包装成所期望的单剂量或多剂量单位。
[0282]
在一些实施方案中，包含本发明化合物的组合物还可在囊泡中递送，并且免疫治疗剂可在同一脂质体制剂中递送，或在与含有本发明化合物的脂质体制剂相容的单独制剂中递送。在一些例示性实例中，脂质体含有一个或多个脂质体表面部分，例如聚乙二醇、靶向所期望的肿瘤表面抗原、受体、生长因子、糖蛋白、糖脂或新抗原的抗体及其抗体片段，它们被选择性转运至特定细胞或器官，从而增强靶向药物递送。
[0283]
在另一个实施方案中，本发明的化合物可在囊泡，具体地脂质体中递送(参见langer，science 249：1527
‑
1533(1990)；treat等人，在liposomes in therapious disease and cancer中，lopez
‑
berestein and fidler(编辑)，liss，ny，第353
‑
365页(1989)；lopez
‑
berestein，同上，第317
‑
327页；参见总体同上)。
[0284]
在又一个实施方案中，本发明的化合物，或含有所述组合的组合物，或含有免疫治疗剂的组合物可在控释系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵(参见langer，同上；sefton，crc crit.ref.biomed.eng.14：201(1987)；buchwald等人，surgery 88：507(1980)；saudek等人，n.engl.j.med.321：574(1989))。在另一个实施方案中，本发明化合物的控释可包含聚合物材料以提供持续、中间、脉冲或交替释放(参见medical applications of controlled release，langer和wise(编辑)，crc pres.，boca raton，fla.(1974)；controlled drug bioavailability，drug product design and performance，smolen和ball(编辑)，wiley,new york(1984)；ranger和peppas，j.macromol.sci.rev.macromol.chem.23：61(1983)；还参见levy等人，science 228：190(1985)；during等人，ann.neurol.25：351(1989)；howard等人，j.neurosurg.71：105(1989))。可使用langer的综述(science 249：1527
‑
1533(1990))中所讨论的其他控释系统。
[0285]
活性成分在所选介质中的最佳浓度可根据本领域技术人员众所周知的程序凭经验确定，并且将取决于所期望的最终药物制剂和所采用的用途。
[0286]
本公开还提供了一种药包或药盒，其包括一个或多个填充有本公开的药物组合物的一种或多种成分的容器，所述成分至少将包括本发明的化合物和一种或多种如本文所述的检查点抑制剂抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，药盒可含有一个或多个提供药学上可接受的赋形剂例如稀释剂的另外的容器。在一个实施方案中，药盒可包含至少一个容器，其中所述容器可包括本发明的化合物、本公开的检查点抑制剂抗体或其抗原结合片段。药盒还可包括一套说明书，用于制备最终药物组合物并将其施用于有需要的受试者，以治疗检查点分子介导的疾病或病症。
[0287]
在本公开的一些实施方案中，免疫治疗剂是免疫细胞群，其可与本发明的化合物组合施用以治疗患有癌症的受试者。在一些实施方案中，免疫治疗剂是免疫细胞群，诸如白细胞(有核白细胞)，其包含(例如，表达)与所关注的抗原结合的受体。本公开的白细胞可以是例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞或单核细胞。在一些实施方案中，白细胞是淋巴细胞。淋巴细胞的实例包括t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞或nkt细胞。
在一些实施方案中，t细胞是cd4 th(t辅助)细胞、cd8 细胞毒性t细胞、γδt细胞或调节性(抑制性)t细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是树突状细胞。
[0288]
在一些实施方案中，将本公开的免疫细胞遗传工程化以表达抗原结合受体。如果细胞含有工程化(外源)核酸，则认为所述细胞是“工程化的”。可通过任何已知(例如，常规)方法将本公开的工程化核酸引入到细胞中。例如，可通过以下方式将工程化核酸引入到细胞中：电穿孔(参见，例如，heiser wc transcription factor protocols：methods in molecular biology.tm.2000；130：117
‑
134)、化学法(例如，磷酸钙或脂质)、转染(参见，例如，lewis wh等人，somatic cell genet.1980may；6(3)：333
‑
47；chen c.等人，mol cell biol.1987august；7(8)：2745
‑
2752)、与含有重组质粒的细菌原生质体融合(参见，例如，schaffner w.proc natl acad sci usa.1980april；77(4)：2163
‑
7)、将纯化的dna直接显微注射到细胞核中(参见，例如，capecchi mr cell.1980november；22(2pt 2)：479
‑
88)，或逆转录病毒转导。
[0289]
本公开的一些方面提供了“过继细胞”方法，其涉及从患有癌症的受试者中分离免疫细胞(例如，t细胞)，对免疫细胞进行基因工程化(例如，以表达抗原结合受体，诸如嵌合抗原受体)，离体扩增细胞，然后将免疫细胞重新引入到受试者中。相对于通过常规基因递送和疫苗接种方法可获得的工程化免疫细胞，这种方法在受试者中产生更多的工程化免疫细胞。在一些实施方案中，将免疫细胞从受试者中分离，在没有遗传修饰的情况下离体扩增，然后重新引入到受试者中。
[0290]
本公开的免疫细胞包含与抗原结合的受体，所述抗原诸如由外源递送的核酸编码的抗原，如本文提供的。在一些实施方案中，将白细胞进行修饰(例如，遗传修饰)以表达与抗原结合的受体。在一些实施方案中，受体可以是天然存在的抗原受体(通常在免疫细胞上表达)、重组抗原受体(通常不在免疫细胞上表达)或嵌合抗原受体(car)。本公开涵盖的天然存在的和重组的抗原受体包括t细胞受体、b细胞受体、nk细胞受体、nkt细胞受体和树突状细胞受体。“嵌合抗原受体”是指被工程化成识别并结合由肿瘤细胞表达的抗原的人工免疫细胞受体。一般来说，car是为t细胞设计的，并且是t细胞受体(tcr)复合物的信号传导结构域和抗原识别结构域(例如，抗体的单链片段(scfv))的嵌合体(enblad等人，human gene therapy.2015；26(8)：498
‑
505)，其公开内容以引用方式整体并入本文。
[0291]
在一些实施方案中，抗原结合受体是嵌合抗原受体(car)。表达car的t细胞被称为“car t细胞”。在一些实施方案中，car t细胞受体包含t细胞受体(tcr)复合物的信号传导结构域和抗原识别结构域(例如，抗体的单链片段(scfv))(enblad等人，human gene therapy.2015；26(8)：498
‑
505)，其公开内容以引用方式整体并入本文。
[0292]
car有四代，每一代都含有不同的组分。第一代car通过铰链结构域和跨膜结构域将抗体衍生的scfv接合到t细胞受体的cd3zeta(zeta.或z)胞内信号传导结构域。第二代car掺入额外的结构域，例如cd28、4
‑
1bb(41bb)或icos，以提供共刺激信号。第三代car含有两个与tcr cd3
‑
zeta链融合的共刺激结构域。第三代共刺激结构域可包括，例如cd3z、cd27、cd28、4
‑
1bb、icos或ox40的组合。在一些实施方案中，car含有通常来源于单链可变片段(scfv)的胞外域(例如cd3)、铰链、跨膜结构域和内域，具有来源于cd3z和/或共刺激分子的一个(第一代)、两个(第二代)或三个(第三代)信号传导结构域(maude等人，blood.2015；125(26)：4017
‑
4023；kakarla和gottschalk，cancer j.2014；20(2)：151
‑
155)，其公开内容
以引用方式整体并入本文。
[0293]
在一些实施方案中，嵌合抗原受体(car)是重定向用于通用细胞因子杀伤(truck)的t细胞，也称为第四代car。truck是car重定向的t细胞，用作媒介物以产生和释放在靶组织(例如，靶肿瘤组织)中累积的转基因细胞因子。在car与靶标衔接时释放转基因细胞因子。truck细胞可在靶标中沉积多种治疗细胞因子。这可在靶部位产生治疗浓度并避免全身毒性。
[0294]
car通常在其功能特性上有所不同。t细胞受体的cd3zeta信号传导结构域在被衔接时会激活并诱导t细胞增殖，但会导致失能(anergy)(身体防御机制缺乏反应，导致外周淋巴细胞耐受性的直接诱导)。当淋巴细胞对特定抗原没有反应时，则认为它们是失能的。在第二代car中加入共刺激结构域提高了修饰的t细胞的复制能力和持久性。cd28或4
‑
1bb car在体外观察到相似的抗肿瘤作用，但临床前体内研究表明4
‑
1bb car可产生优异的增殖和/或持久性。临床试验表明，这两种第二代car都能够在体内诱导大量t细胞增殖，但含有4
‑
1bb共刺激结构域的car似乎持续时间更长。第三代car合并了多个信号传导结构域(共刺激)以增强效力。第四代car另外还用转基因细胞因子的组成型或诱导型表达盒进行了修饰，所述转基因细胞因子由car t细胞释放以调节t细胞反应。参见，例如，enblad等人，human gene therapy.2015；26(8)：498
‑
505；chmielewski和hinrich，expert opinion on biological therapy.2015；15(8)：1145
‑
1154，其公开内容以引用方式整体并入本文。
[0295]
在一些实施方案中，例示性免疫治疗剂是第一代嵌合抗原受体car。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是第三代car。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是第二代car。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是第三代car。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是第四代car或重定向用于通用细胞因子杀伤(truck)的t细胞。
[0296]
在一些实施方案中，嵌合抗原受体(car)包含含有抗原结合结构域的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在一些实施方案中，car是全人源的。在一些实施方案中，car的抗原结合结构域对一种或多种抗原具有特异性。在一些实施方案中，“间隔区”结构域或“铰链”结构域位于car的胞外结构域(包含抗原结合结构域)和跨膜结构域之间，或位于car的胞质结构域和跨膜结构域之间。“间隔区结构域”是指起到在多肽链中将跨膜结构域与胞外结构域和/或胞质结构域连接起来的作用的任何寡肽或多肽。“铰链结构域”是指起到为car或其结构域提供灵活性或防止car或其结构域的空间位阻的作用的任何寡肽或多肽。在一些实施方案中，间隔区结构域或铰链结构域可包含最多至300个氨基酸(例如，10至100个氨基酸，或5至20个氨基酸)。在一些实施方案中，一个或多个间隔区结构域可被包括在car的其他区域中。
[0297]
在一些实施方案中，本公开的car包含抗原结合结构域，诸如对肿瘤抗原特异的单链fv(scfv)。结合结构域的选择取决于定义靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，可选择抗原结合结构域以识别在与特定疾病状态诸如癌症或自身免疫疾病相关的靶细胞上充当细胞表面标志物的配体。因此，可充当本公开的car中抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的实例包括与癌细胞和/或其他形式的患病细胞相关的那些标志物。在一些实施方案中，通过工程化所期望的抗原结合结构域来将car工程化以靶向所关注的肿瘤抗原，所述抗原结合结构域特异性地结合肿瘤细胞上的由工程化核酸编码的抗原，如本文所提供。
[0298]“特异性结合”靶标或表位的抗原结合结构域(例如，scfv)是本领域理解的术语，
并且确定此类特异性结合的方法也是本领域已知的。如果分子与特定靶抗原的反应或结合比与替代靶标的反应或结合更频繁、更迅速、更持久和/或亲和力更大，则称所述分子表现出“特异性结合”。特异性结合第一靶抗原的抗原结合结构域(例如，scfv)可以或可以不特异性结合第二靶抗原。因此，“特异性结合”并不一定需要(尽管它可包括)排他性结合。
[0299]
在一些实施方案中，将表达car的免疫细胞进行遗传修饰以识别多个靶标或抗原，这允许识别肿瘤细胞上的独特靶标或抗原表达模式。可结合多个靶标的car的实例包括：“分裂信号car”，其限制了对表达多种抗原的肿瘤的完全免疫细胞激活；“串联car”(tancar)，其含有具有两个scfv的胞外域；和“通用胞外域car”，其掺入了抗生物素蛋白或异硫氰酸荧光素(fitc)特异性scfv，以识别已与带标签的单克隆抗体(mab)孵育的肿瘤细胞。
[0300]
如果car识别两种不同的抗原(具有两个不同的抗原识别结构域)，则认为它是“双特异性的”。在一些实施方案中，双特异性car由在单个转基因受体上串联存在的两个不同的抗原识别结构域构成(称为tancar；参见，例如，grada z等人molecular therapy nucleic acids 2013；2：e105，以引用方式整体并入本文)。因此，在一些实施方案中，方法包括将包含本发明的化合物和免疫治疗剂的组合递送至肿瘤，其中免疫治疗剂是编码抗原的工程化核酸；或将诱导自身抗原表达的工程化核酸递送至肿瘤，并将表达双特异性car的免疫细胞递送至肿瘤，所述双特异性car结合两种抗原，其中一种抗原由工程化核酸编码。
[0301]
在一些实施方案中，car是抗原特异性抑制性car(icar)，其可用于例如避免脱肿瘤毒性(fedorov，vd等人sci.transl.med.2013年12月11日在线发表，以引用方式整体并入本文)。icar含有抗原特异性抑制性受体，例如，以阻断可能由额外肿瘤靶标表达引起的非特异性免疫抑制。icar可基于例如，抑制性分子ctla
‑
4或pd
‑
1。在一些实施方案中，这些icar阻断来自t细胞的由它们的内源性t细胞受体或激活性car所激活的t细胞反应。在一些实施方案中，这种抑制作用是暂时的。
[0302]
在一些实施方案中，car可用于过继细胞转移，其中将免疫细胞从受试者中取出并进行修饰以便使其表达对抗原，例如，肿瘤特异性抗原具有特异性的受体。然后可识别并杀死癌细胞的修饰的免疫细胞被重新引入到受试者中(pule等人，cytotherapy.2003；5(3)：211
‑
226；maude等人，blood.2015；125(26)：4017
‑
4023，其各自以引用方式整体并入本文)。
[0303]
根据本公开的其他方面，本发明疫苗中的肿瘤抗原组分是任何天然或合成的肿瘤相关蛋白或肽或肿瘤相关蛋白和/或肽或糖蛋白或糖肽的组合。在其他方面，抗原组分可以是患者特异性的，或者是许多或大多数患有特定类型癌症的患者所共有的。根据一方面，抗原组分由来源于从接受治疗的患者取出的肿瘤组织的细胞裂解物组成。在另一方面，裂解物可由来源于肿瘤组织的外泌体(exosomes)工程化或合成。在又一方面，抗原组分由来源于从一个或多个无关个体或从肿瘤细胞系提取的肿瘤组织的细胞裂解物组成。
[0304]
在各种实施方案中，例示性免疫治疗剂包含一种或多种癌症疫苗，用于与本发明的化合物组合使用。疫苗的肿瘤相关抗原组分可通过多种众所周知的技术中的任一种来制造。对于个别蛋白质组分，抗原蛋白是通过标准色谱方法诸如高压液相色谱法或亲和色谱法从肿瘤组织或肿瘤细胞系中分离而来，或者它是通过标准重组dna技术在诸如大肠杆菌、酵母或植物的合适表达系统中合成而来。然后通过标准色谱方法从表达系统中纯化肿瘤相关抗原蛋白。就肽抗原组分而言，这些通常通过标准自动合成制备。可通过加入氨基酸、脂
质和其他剂来修饰蛋白质和肽，以改善它们到疫苗递送系统(诸如多层脂质体)中的掺入。对于来源于患者自身肿瘤或来自其他个体的肿瘤或细胞系的肿瘤相关抗原组分，肿瘤组织或来源于肿瘤组织的单细胞悬液通常在合适的缓冲液中均质化。还可将匀浆分级，诸如通过离心，以分离特定的细胞组分，诸如细胞膜或可溶性材料。可直接使用肿瘤材料，或者可使用含有低浓度合适剂(诸如去污剂)的缓冲液提取肿瘤相关抗原以供掺入到疫苗中。适用于从肿瘤组织、肿瘤细胞和肿瘤细胞膜中提取抗原蛋白的去污剂的实例是二庚酰基磷脂酰胆碱。来源于肿瘤组织或肿瘤细胞的外泌体，无论是患者自体的还是异源的，均可用于供掺入疫苗中的抗原组分或用作提取肿瘤相关抗原的起始材料。
[0305]
在本公开的一些实施方案中，组合疗法包含本发明的化合物与癌症疫苗免疫治疗剂组合。在各种实例中，癌症疫苗包括至少一种肿瘤相关抗原、至少一种免疫刺激剂和任选地至少一种基于细胞的免疫治疗剂。在一些实施方案中，本公开的癌症疫苗中的免疫刺激剂组分是具有增强治疗性癌症疫苗有效性的能力，以诱导患者体内针对癌细胞的体液和细胞免疫反应的任何生物反应调节剂(brm)。根据一方面，免疫刺激剂是细胞因子或细胞因子的组合。此类细胞因子的实例包括干扰素，诸如ifn
‑
γ，白细胞介素，诸如il
‑
2、il
‑
15和il
‑
23，集落刺激因子，诸如m
‑
csf和gm
‑
csf，以及肿瘤坏死因子。根据另一方面，所公开的癌症疫苗的免疫刺激剂组分包括一种或多种佐剂型免疫刺激剂，诸如apc toll样受体激动剂或共刺激/细胞粘附膜蛋白，具有或不具有免疫刺激细胞因子。toll样受体激动剂的实例包括脂质a和cpg，以及共刺激/粘附蛋白，诸如cd80、cd86和icam
‑
1。
[0306]
在一些实施方案中，免疫刺激剂选自由以下组成的组：ifn
‑
gamma(ifn
‑
γ)、il
‑
2、il
‑
15、il
‑
23、m
‑
csf、gm
‑
csf、肿瘤坏死因子、脂质a、cpg、cd80、cd86和icam
‑
1，或它们的组合。根据其他方面，基于细胞的免疫治疗剂选自由以下组成的组：树突状细胞、肿瘤浸润性t淋巴细胞、针对患者肿瘤类型的嵌合抗原受体修饰的效应t细胞、b淋巴细胞、自然杀伤细胞、骨髓细胞和患者免疫系统的任何其他细胞，或它们的组合。在一个方面，癌症疫苗免疫刺激剂包括一种或多种细胞因子，诸如白细胞介素2(il
‑
2)、gm
‑
csf、m
‑
csf和干扰素
‑
γ(ifn
‑
γ)，一种或多种toll样受体激动剂和/或佐剂，诸如单磷酰脂质a、脂质a、胞壁酰二肽(mdp)脂质缀合物和双链rna，或一种或多种共刺激膜蛋白和/或细胞粘附蛋白，诸如cd80、cd86和icam
‑
1，或以上的任何组合。在一个方面，癌症疫苗包括免疫刺激剂，其是选自由白细胞介素2(il
‑
2)、gm
‑
csf、m
‑
csf和干扰素
‑
γ(ifn
‑
γ)组成的组的细胞因子。在另一方面，癌症疫苗包括免疫刺激剂，其是选自由单磷酰脂质a、脂质a和胞壁酰二肽(mdp)脂质缀合物和双链rna组成的组的toll样受体激动剂和/或佐剂。在又一方面，癌症疫苗包括免疫刺激剂，其是选自由cd80、cd86和icam
‑
1组成的组的共刺激膜蛋白和/或细胞粘附蛋白。
[0307]
在各种实施方案中，免疫治疗剂可包括癌症疫苗，其中癌症疫苗掺入可潜在地用于构建根据本发明的融合蛋白的任何肿瘤抗原，并且特别是以下各项：
[0308]
(a)癌症
‑
睾丸抗原，包括ny
‑
eso
‑
1、ssx2、scp1以及rage、bage、gage和mage家族多肽，例如gage
‑
1、gage
‑
2、mage
‑
1、mage
‑
2、mage
‑
3、mage
‑
4、mage
‑
5、mage
‑
6和mage
‑
12，其可用于例如解决黑色素瘤、肺、头颈部、nsclc、乳腺、胃肠道和膀胱肿瘤；(b)与各种实体瘤如结直肠癌、肺癌、头颈癌相关的突变抗原，包括p53；与例如黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌相关的p21/ras；与例如黑色素瘤相关的cdk4；与例如黑色素瘤相关的mum1；与例如头颈癌相关的胱天蛋白酶8(caspase
‑
8)；与例如膀胱癌相关的cia 0205；hla
‑
a2
‑
r1701、与例如黑色
素瘤相关的β连环蛋白；与例如t细胞非霍奇金淋巴瘤相关的tcr；与例如慢性粒细胞白血病相关的bcr
‑
abl；磷酸丙糖异构酶；kia 0205；cdc
‑
27以及ldlr
‑
fut；(c)过表达的抗原，包括与例如结直肠癌相关的半乳糖凝集素4；与例如霍奇金病相关的半乳糖凝集素9；与例如慢性粒细胞白血病相关的蛋白酶3；与例如各种白血病相关的wt 1；与例如肾癌相关的碳酸酐酶；与例如肺癌相关的醛缩酶a；与例如黑色素瘤相关的prame；与例如乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌相关的her
‑
2/neu；乳腺珠蛋白、与例如肝细胞瘤相关的甲胎蛋白；与例如结直肠癌相关的ksa；与例如胰腺癌和胃癌相关的胃泌素；端粒酶催化蛋白、与例如乳腺癌和卵巢癌相关的muc
‑
1；与例如肾细胞癌相关的g
‑
250；与例如乳腺癌、结肠癌相关的p53；以及与例如乳腺癌、肺癌和胃肠道癌如结直肠癌相关的癌胚抗原；(d)共有抗原，包括黑色素瘤
‑
黑色素细胞分化抗原，诸如mart
‑
1/melan a；gpl00；mc1r；黑色素细胞刺激激素受体；酪氨酸酶；与例如黑色素瘤相关的酪氨酸酶相关蛋白1/trp1和酪氨酸酶相关蛋白2/trp2；(e)与例如前列腺癌相关的前列腺相关抗原，包括pap、psa、psma、psh
‑
p1、psm
‑
p1、psm
‑
p2；(f)与骨髓瘤和b细胞淋巴瘤相关的免疫球蛋白独特型。在某些实施方案中，一种或多种taa可选自pi5、hom/mel
‑
40、h
‑
ras、e2a
‑
prl、h4
‑
ret、igh
‑
igk、myl
‑
rar、爱泼斯坦巴尔病毒抗原(epstein barr virus antigen)、ebna、人乳头瘤病毒(hpv)抗原(包括e6和e7)、乙型肝炎和丙型肝炎病毒抗原、人嗜t淋巴细胞病毒抗原、tsp
‑
180、pl85erbb2、pl 80erbb
‑
3、c
‑
met、mn
‑
23h1、tag
‑
72
‑
4、ca 19
‑
9、ca 72
‑
4、cam 17.1、numa、k
‑
ras、pi 6、tage、psca、ct7、43
‑
9f、5t4、791 tgp72、β
‑
hcg、bca225、btaa、ca 125、ca 15
‑
3(ca 27.29\bcaa)、ca 195、ca 242、ca
‑
50、cam43、cd68\kp1、co
‑
029、fgf
‑
5、ga733(epcam)、htgp
‑
175、m344、ma
‑
50、mg7
‑
ag、mov18、nb/70k、ny
‑
co
‑
1、rcas1、sdccag16、ta
‑
90(mac
‑
2结合蛋白/亲环蛋白c相关蛋白)、taal6、tag72、tlp、tps或它们的任何组合。
[0309]
在一些实施方案中，本公开提供了与癌症疫苗组合使用的本发明化合物，所述癌症疫苗可包括肿瘤抗原，所述肿瘤抗原包含人蛋白质的完整氨基酸序列、其一部分或特异性免疫原性表位。
[0310]
在各种实施方案中，例示性免疫治疗剂可包括可用以编码可用于合成癌症疫苗的任一种或多种上述癌症抗原的mrna。在一些例示性实施方案中，基于mrna的癌症疫苗可具有一种或多种以下特性：a)编码每种癌症抗原的mrna散布有裂解敏感位点；b)编码每种癌症抗原的mrna没有接头而直接相互连接；c)编码每种癌症抗原的mrna用单个核苷酸接头彼此连接；d)每种癌症抗原均包含20
‑
40个氨基酸，并包括位于中央的snp突变；e)至少40％的癌症抗原对来自受试者的mhc i类分子具有最高亲和力；f)至少40％的癌症抗原对来自受试者的mhc ii类分子具有最高亲和力；g)至少40％的癌症抗原对hla
‑
a、hla
‑
b和/或drb1的预测结合亲和力ic＞500nm；h)mrna编码1至15种癌症抗原；i)10
‑
60％的癌症抗原对mhc i类具有结合亲和力，并且10
‑
60％的癌症抗原对mhc ii类具有结合亲和力；和/或j)编码癌症抗原的mrna被布置成使得癌症抗原进行排序以使假表位减至最少。
[0311]
在各种实施方案中，包含本发明化合物和如本文公开的癌症疫苗免疫治疗剂的组合可用于在受试者中引发针对癌症抗原的免疫反应。所述方法涉及与在同一组合物或单独组合物中施用本发明化合物相组合，同时施用或依序给药地，向受试者施用包含至少一种具有编码至少一种抗原多肽或其免疫原性片段的开放阅读框的rna多核苷酸的rna疫苗，从而在受试者中诱导对所述抗原多肽或其免疫原性片段具有特异性的免疫反应，其中相对于
用预防有效剂量的传统抗癌疫苗接种的受试者中抗抗原多肽抗体滴度，所述受试者中的抗抗原多肽抗体滴度在疫苗接种后增加。“抗抗原多肽抗体”是与抗原多肽特异性结合的血清抗体。
[0312]
预防有效剂量是在临床上可接受的水平上预防癌症进展的治疗有效剂量。在一些实施方案中，治疗有效剂量是疫苗包装说明书中列出的剂量。如本文所用，传统疫苗是指除本发明的mrna疫苗之外的疫苗。例如，传统的疫苗包括但不限于活微生物疫苗、灭活微生物疫苗、亚单位疫苗、蛋白抗原疫苗、dna疫苗等。在示例性实施方案中，传统疫苗是已获得监管批准和/或由国家药物监管机构，例如美国的食品与药物管理局(fda)或欧洲药品管理局(ema)注册的疫苗。
[0313]
在一些实施方案中，相对于用预防有效剂量的传统抗癌疫苗接种的受试者中的抗抗原多肽抗体滴度，受试者中的抗抗原多肽抗体滴度在疫苗接种后增加1log至10log。在一些实施方案中，相对于用预防有效剂量的传统抗癌疫苗接种的受试者中的抗抗原多肽抗体滴度，受试者中的抗抗原多肽抗体滴度在疫苗接种后增加1log。在一些实施方案中，相对于用预防有效剂量的传统抗癌疫苗接种的受试者中的抗抗原多肽抗体滴度，受试者中的抗抗原多肽抗体滴度在疫苗接种后增加2log。
[0314]
本发明的方面提供了核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽的开放阅读框的rna多核苷酸，其中所述rna多核苷酸存在于用于体内施用于宿主的制剂中，所述制剂赋予对于可接受百分比的人受试者而言优于所述第一抗原的血清保护标准的抗体滴度。在一些实施方案中，由本发明的mrna疫苗产生的抗体滴度是中和抗体滴度。在一些实施方案中，中和抗体滴度大于蛋白质疫苗。在其他实施方案中，由本发明的mrna疫苗产生的中和抗体滴度大于佐剂蛋白疫苗。在其他实施方案中，由本发明的mrna疫苗产生的中和抗体滴度是1,000
‑
10,000、1,200
‑
10,000、1,400
‑
10,000、1,500
‑
10,000、1,000
‑
5,000、1,000
‑
4,000、1,800
‑
10,000、2000
‑
10,000、2,000
‑
5,000、2,000
‑
3,000、2,000
‑
4,000、3,000
‑
5,000、3,000
‑
4,000或2,000
‑
2,500。中和滴度通常表示为达到斑块数量减少50％所需的最高血清稀释度。
[0315]
在优选的方面，本公开的rna疫苗免疫治疗剂(例如，mrna疫苗)在接种的受试者的血液或血清中产生预防和/或治疗有效水平、浓度和/或滴度的抗原特异性抗体。如本文所定义，术语抗体滴度是指在受试者，例如人受试者中产生的抗原特异性抗体的量。在示例性实施方案中，抗体滴度表示为仍然给出阳性结果的最大稀释度(在连续稀释度中)的倒数。在示例性实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(elisa)确定或测量抗体滴度。在示例性实施方案中，通过中和测定，例如通过微量中和测定确定或测量抗体滴度。在某些方面，抗体滴度测量值表示为比率，诸如1∶40、1∶100等。
[0316]
在本发明的示例性实施方案中，有效疫苗产生的抗体滴度为大于1∶40、大于1∶100、大于1∶400、大于1∶1000、大于1∶2000、大于1∶3000、大于1∶4000、大于1∶500、大于1∶6000、大于1∶7500、大于1∶10000。在示例性实施方案中，在疫苗接种后10天、接种后20天、接种后30天、接种后40天或接种后50天或更多天产生或达到抗体滴度。在示例性实施方案中，在向受试者施用单剂量疫苗后产生或达到滴度。在其他实施方案中，在多剂量后产生或达到滴度，例如在第一次和第二次剂量(例如，加强剂量)后。在本发明的示例性方面，抗原特异性抗体以g/ml为单位测量或以iu/l(国际单位每升)或miu/ml(毫国际单位每毫升)为单
位测量。在本发明的示例性实施方案中，有效疫苗严生>0.5μg/ml、＞0.1μg/ml、＞0.2μg/ml、＞0.35μg/ml、＞0.5μg/ml、＞1μg/ml、＞2μg/ml、＞5μg/ml或＞10μg/ml。在本发明的示例性实施方案中，有效疫苗产生＞10miu/ml、＞20miu/ml、＞50miu/ml、＞100miu/ml、＞200miu/ml、＞500miu/ml或＞1000miu/ml。在示例性实施方案中，在接种后10天、接种后20天、接种后30天、接种后40天或接种后50天或更多天产生或达到抗体水平或浓度。在示例性实施方案中，在向受试者施用单剂量疫苗后产生或达到所述水平或浓度。在其他实施方案中，在多剂量后产生或达到所述水平或浓度，例如在第一次和第二次剂量(例如，加强剂量)后。在示例性实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(elisa)确定或测量抗体水平或浓度。在示例性实施方案中，通过中和测定，例如通过微量中和测定确定或测量抗体水平或浓度。还提供了核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽或多联体(concatemeric)多肽的开放阅读框的rna多核苷酸，其中所述rna多核苷酸存在于供体内施用于宿主以用于引发比由具有稳定元件或与佐剂一起配制且编码所述第一抗原多肽的mrna疫苗引发的抗体效价更持久的高抗体效价的制剂中。在一些实施方案中，将rna多核苷酸配制成在单次施用一周内产生中和抗体。在一些实施方案中，佐剂选自阳离子肽和免疫刺激性核酸。在一些实施方案中，阳离子肽是鱼精蛋白。
[0317]
免疫治疗剂包含核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有开放阅读框、包含至少一个化学修饰或任选无核苷酸修饰的rna多核苷酸，所述开放阅读框编码第一抗原多肽或多联体多肽，其中所述rna多核苷酸存在于用于体内施用至宿主以使得所述宿主中的抗原表达水平显著超过由具有稳定元件或与佐剂一起配制且编码所述第一抗原多肽的mrna疫苗产生的抗原表达水平的制剂中。
[0318]
其他方面提供了核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有开放阅读框、包含至少一个化学修饰或任选无核苷酸修饰的rna多核苷酸，所述开放阅读框编码第一抗原多肽或多联体多肽，其中所述疫苗具有比未修饰的mrna疫苗产生等效抗体滴度所需的少至少10倍的rna多核苷酸。在一些实施方案中，rna多核苷酸以25
‑
100微克的剂量存在。
[0319]
本发明的方面还提供了一种被配制用于递送至人受试者的单位使用(unit of use)疫苗，所述疫苗包含介于10μg与400μg之间的一种或多种具有开放阅读框、包含至少一个化学修饰或任选无核苷酸修饰的rna多核苷酸，所述开放阅读框编码第一抗原多肽或多联体多肽；以及药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方案中，疫苗还包含阳离子脂质纳米颗粒。
[0320]
本发明的方面提供了产生、维持或恢复个体或个体群体中对肿瘤的抗原记忆的方法，所述方法包括向所述个体或群体施用抗原记忆加强核酸疫苗，所述疫苗包含(a)至少一种rna多核苷酸，所述多核苷酸包含至少一个化学修饰或任选无核苷酸修饰和两个或更多个密码子优化的开放阅读框，所述开放阅读框编码一组参考抗原多肽；以及(b)任选地，药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方案中，通过选自由肌内施用、皮内施用和皮下施用组成的组的途径将疫苗施用于个体。在一些实施方案中，施用步骤包括使受试者的肌肉组织与适用于注射所述组合物的装置相接触。在一些实施方案中，施用步骤包括与电穿孔组合使受试者的肌肉组织与适用于注射所述组合物的装置相接触。
[0321]
本发明的方面提供了对受试者接种疫苗的方法，所述方法包括以对受试者接种疫苗的有效量向所述受试者施用介于25μg/kg与400μg/kg之间单次剂量的核酸疫苗，所述核
酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽或多联体多肽的开放阅读框的rna多核苷酸。
[0322]
其他方面提供了核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有开放阅读框、包含至少一个化学修饰的rna多核苷酸，所述开放阅读框编码第一抗原多肽或多联体多肽，其中所述疫苗具有比未修饰的mrna疫苗产生等效抗体滴度所需的少至少10倍的rna多核苷酸。在一些实施方案中，rna多核苷酸以25
‑
100微克的剂量存在。
[0323]
在一些实施方案中，本发明的化合物可与双特异性抗体免疫治疗剂组合使用。双特异性抗体可包括具有第一抗原结合部分和结合细胞毒性免疫细胞的第二抗原结合位点的蛋白质构建体。第一抗原结合位点可结合用本发明的组合特异性治疗的肿瘤抗原。例如，第一抗原结合部分可结合选自以下的肿瘤抗原的非限制性实例：egfr、hgfr、her2、ep
‑
cam、cd20、cd30、cd33、cd47、cd52、cd133、cea、gpa33、粘蛋白(mucins)、tag
‑
72、cix、psma、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、gm2、vegf、vegfr、整合素avβ3、整合素α5β1、muc1、erbb2、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap和腱生蛋白(tenascin)等。在一些实施方案中，与对应的非肿瘤细胞相比，第一抗原结合部分对在肿瘤细胞上过表达的蛋白质或肽具有特异性。在一些实施方案中，与对应的非肿瘤细胞相比，第一抗原结合部分对在肿瘤细胞上过表达的蛋白质具有特异性。如此处所用，“对应的非肿瘤细胞”是指与肿瘤细胞的来源具有相同细胞类型的非肿瘤细胞。值得注意的是，此类蛋白质不一定与肿瘤抗原不同。非限制性实例包括癌胚抗原(cea)，其在大多数结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃肠道癌中过表达；调蛋白(heregulin)受体(her
‑
2、neu或c
‑
erbb
‑
2)，其在乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和宫颈癌中经常过表达；表皮生长因子受体(egfr)，其在一系列实体瘤中高表达，所述实体瘤包括乳腺、头颈部、非小细胞肺和前列腺中的那些实体瘤；去唾液酸糖蛋白受体；转铁蛋白受体；丝酶抑制蛋白(serpin)酶复合物受体，其在肝细胞上表达；成纤维细胞生长因子受体(fgfr)，其在胰腺导管腺癌细胞上过表达；血管内皮生长因子受体(vegfr)，用于抗血管生成基因疗法；叶酸受体，其在90％的非粘液性卵巢癌中选择性过表达；细胞表面糖萼(glycocalyx)；碳水化合物受体；和多聚免疫球蛋白受体。
[0324]
第二抗原结合部分是与细胞毒性免疫细胞(cik细胞)表面上表达的抗原或蛋白质或多肽特异性结合的任何分子。适用于本公开的在细胞毒性免疫细胞表面上表达的示例性非限制性抗原可包括cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd11a、cd11b、cd14、cd16a、cd27、cd28、cd45、cd45ra、cd56、cd62l、fc受体、lfa、lfa
‑
1、tcrαβ、ccr7、巨噬细胞炎性蛋白1a、穿孔素、pd
‑
1、pd
‑
l1、pd
‑
l2或ctla
‑
4、lag
‑
3、ox40、41bb、light、cd40、gitr、tgf
‑
β、tim
‑
3、sirp
‑
α、tigit、vsig8、btla、siglec7、siglec9、icos、b7h3、b7h4、fas、btnl2、cd27和fas配体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分结合细胞毒性免疫细胞，例如cik细胞的cd3。在一些实施方案中，第二抗原结合部分结合细胞毒性免疫细胞的cd56。在一些实施方案中，第二抗原结合部分结合细胞毒性免疫细胞的fc受体。在一些实施方案中，双特异性抗体的fc区结合细胞毒性免疫细胞的fc受体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分是与在细胞毒性免疫细胞(例如cik细胞)表面上表达的抗原特异性结合的任何分子。第二抗原结合部分对于细胞毒性免疫细胞上的抗原具有特异性。示例性的细胞毒性免疫细胞包括但不限于cik细胞、t细胞、cd8 t细胞、激活的t细胞、单核细胞、自然杀伤(nk)细胞、nkt细胞、淋巴因子激活的杀伤(lak)细胞、巨噬细胞，和树突状细胞。第二抗原结合部分与在细胞毒性免疫细胞表面上表
达的抗原特异性结合。适合于本公开的调节的在细胞毒性免疫细胞表面上表达的示例性非限制性抗原可包括cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd11a、cd11b、cd14、cd16a、cd27、cd28、cd45、cd45ra、cd56、cd62l、fc受体、lfa、lfa
‑
1、tcrαβ、ccr7、巨噬细胞炎性蛋白1a、穿孔素、pd
‑
1、pd
‑
l1、pd
‑
l2或ctla
‑
4、lag
‑
3、ox40、41bb、light、cd40、gitr、tgf
‑
β、tim
‑
3、sirp
‑
α、tigit、vsig8、btla、siglec7、siglec9、icos、b7h3、b7h4、fas、btnl2、cd27和fas配体。在其他实施方案中，双特异性抗体调节剂是共刺激分子的激活剂(例如，ox40激动剂)。在一个实施方案中，ox40激动剂是针对ox40和另一种肿瘤抗原或共刺激抗原的双特异性抗体分子。ox40激动剂可单独施用，或与其他免疫调节剂组合施用，例如与pd
‑
1、pd
‑
l1、ctla
‑
4、ceacam(例如，ceacam
‑
1、
‑
3和/或
‑
5)、tim
‑
3或lag
‑
3的抑制剂(例如抗体构建体)组合施用。在一些实施方案中，抗ox40抗体分子是结合gitr和pd
‑
1、pd
‑
l1、ctla
‑
4、ceacam(例如，ceacam
‑
1、
‑
3和/或
‑
5)、tim
‑
3或lag
‑
3的双特异性抗体。在一个示例性实施方案中，ox40抗体分子与抗pd
‑
1抗体分子(例如，如本文所述的抗pd
‑
1分子)组合施用。ox40抗体分子和抗pd
‑
1抗体分子可以是单独抗体组合物的形式，或作为双特异性抗体分子。在其他实施方案中，ox40激动剂可与其他共刺激分子，例如gitr、cd2、cd27、cd28、cds、icam
‑
1、lfa
‑
1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4
‑
1bb(cd137)、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7
‑
h3或cd83配体的激动剂组合施用。在一些实施方案中，第二抗原结合部分结合细胞毒性免疫细胞，例如cik细胞上的fc受体。
[0325]
在一些实施方案中，双特异性抗体免疫治疗剂对肿瘤抗原和cik细胞具有特异性，这使得表达肿瘤抗原的肿瘤细胞靠近cik细胞，通过cik细胞的抗肿瘤细胞毒性导致肿瘤细胞的消除。在一些实施方案中，双特异性抗体对肿瘤抗原具有特异性但对cik细胞不具有特异性，然而，双特异性抗体的fc区可结合cik细胞的fc受体，进而使肿瘤细胞靠近cik细胞，通过cik细胞的抗肿瘤细胞毒性导致肿瘤细胞的消除。在一些实施方案中，双特异性抗体对cik细胞具有特异性但对肿瘤细胞不具有特异性，然而，双特异性抗体的fc区可结合肿瘤细胞的fc受体，进而使肿瘤细胞靠近cik细胞，通过cik细胞的抗肿瘤细胞毒性导致肿瘤细胞的消除。
[0326]
在一些实施方案中，本发明的化合物可与与免疫细胞衔接的多价抗体/融合蛋白/构建体免疫治疗剂组合使用。在各种实施方案中，示例性免疫治疗剂可包括可包含重组结构的与免疫细胞衔接的多价抗体/融合蛋白/构建体，例如所有不模仿原始igg结构的工程化抗体。在此，利用使抗体片段多聚化的不同策略。例如，缩短v结构域之间的肽接头会迫使scfv自结合成二聚体(双抗体；55kda)。双特异性双抗体由在同一细胞中表达的两个vha
‑
vlb和vhb
‑
vla片段的非共价结合形成。这导致形成具有两个不同结合位点的异源二聚体。单链双抗体(sc
‑
双抗体)是双特异性分子，其中vha
‑
vlb和vhb
‑
vla片段通过额外的第三接头连接在一起。串联双抗体(tandabs)是由两个sc双抗体产生的四价双特异性抗体。
[0327]
还包括本领域已知的双双抗体。这种130
‑
kda分子是通过双抗体与igg的ch3结构域的n
‑
末端融合形成的，导致形成igg样结构。另外的双抗体衍生物是三抗体和四抗体，它们通过将接头缩短至＜5或0
‑
2个残基而折叠成三聚体和四聚体片段。还例示了(scfv)2构建体，称为
‘
双特异性t细胞衔接子’(bite)。bite是双特异性单链抗体，由通过灵活的接头接合的两个scfv抗体片段组成，所述两个scfv抗体片段分别针对靶细胞上的表面抗原和t细胞上的cd3。还例示了二价(fab)2和三价(fab)3抗体形式。还例示了由scfv产生的微抗体
和三聚体抗体。可用于靶向肿瘤抗原的示例性构建体可包括以下一种或多种：双抗体、单链(sc)
‑
双抗体(scfv)2、微型抗体、微抗体、bamase
‑
barstar、scfv
‑
fc、sc(fab)2、三聚体抗体构建体、三体抗体构建体、三聚体抗体抗体构建体、三体抗体构建体、collabody抗体构建体、(scfv
‑
tnfa)3、f(ab)3/dnl。示例性的细胞毒性免疫细胞包括但不限于cik细胞、t细胞、cd8 t细胞、激活的t细胞、单核细胞、自然杀伤(nk)细胞、nkt细胞、淋巴因子激活的杀伤(lak)细胞、巨噬细胞，和树突状细胞。
[0328]
在一些实施方案中，本发明的化合物可与放射性缀合物免疫治疗剂组合使用。
[0329]
在各种实施方案中，放射性缀合物是小分子或大分子(本文中称为“细胞靶向剂”)，例如多肽、抗体或其抗体片段，偶联至或以其他方式附连至一种放射性核素或多种放射性核素，使得放射性缀合物与其靶标(癌细胞上或癌细胞中的蛋白质或分子)的结合将导致所述癌细胞的死亡或发病。在各种实施方案中，放射性缀合物可以是用放射性核素标记的细胞靶向剂，或者细胞靶向剂可偶联或以其他方式附连于含有多种放射性核素的粒子或微粒或纳米粒子，其中放射性核素是相同的或不同的。用于合成放射性缀合物的方法是本领域已知的，并且可包括与有毒放射性核素缀合的免疫球蛋白或其抗原结合部分的类别。
[0330]
在一些实施方案中，与癌细胞结合的分子可称为“细胞靶向剂”。如本文所用，示例性细胞靶向剂可允许含药物的纳米粒子或放射性核素靶向特定类型的所关注的细胞。细胞靶向剂的实例包括但不限于结合或靶向肿瘤相关抗原的小分子(例如，叶酸、腺苷、嘌呤)和大分子(例如，肽或抗体)。肿瘤相关抗原的实例包括但不限于腺苷受体、αvβ3、氨肽酶p、甲胎蛋白、癌抗原125、癌胚抗原、c小窝蛋白1(ccaveolin
‑
1)、趋化因子受体、凝聚素、癌胎抗原、cd20、上皮肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、ras、p53、her2/neu、erbb2、erbb3、erbb4、叶酸受体、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性抗原、嘌呤受体、辐射诱导的细胞表面受体、丝酶抑制蛋白b3、丝酶抑制蛋白b4、鳞状细胞癌抗原、血小板反应蛋白、肿瘤抗原4、肿瘤相关糖蛋白72、酪氨酸酶和酪氨酸激酶。在一些实施方案中，细胞靶向剂是与叶酸受体(fr)特异性结合的叶酸或叶酸衍生物。在一些实施方案中，细胞靶向剂是抗体、双特异性抗体、三特异性抗体或其抗原结合构建体，其特异性结合选自以下的癌抗原：egfr、hgfr、her2、ep
‑
cam、cd20、cd30、cd33、cd47、cd52、cd133、cea、gpa33、粘蛋白、tag
‑
72、cix、psma、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、gm2、vegf、vegfr、整合素αvβ3、整合素α5β1、muc1、erbb2、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap和腱生蛋白等。
[0331]
在放射性缀合物中使用叶酸作为靶向剂还允许靶向肿瘤细胞和调节性t(treg)细胞进行破坏。众所周知，大量的treg细胞会抑制肿瘤免疫。具体而言，treg细胞通过接触依赖性或细胞因子(例如，il
‑
10、tgf
‑
β等)分泌抑制(外来和自身)反应性t细胞，而不杀死它们。fr4在treg细胞上选择性上调。已经证明，fr4的抗体阻断在荷瘤小鼠中耗尽了treg细胞并激发了肿瘤免疫。因此，携带细胞毒剂的叶酸包被的pbm纳米粒子会破坏表达fr的细胞，这将直接(即，brca细胞)和间接(即，乳腺肿瘤相关和外周treg细胞)抑制肿瘤进展。
[0332]
在另一个实施方案中，靶向剂是能够结合由以下组成(但不限于)的肿瘤相关抗原的抗体或肽或与免疫细胞衔接的多价抗体/融合蛋白/构建体：腺苷受体、αvβ3、氨肽酶p、甲胎蛋白、癌抗原125、癌胚抗原、小窝蛋白1、趋化因子受体、凝聚素、癌胎抗原、cd20、人生长因子受体(hgfr)、上皮肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、muc1、ras、p53、her2/neu、erbb2、erbb3、erbb4、叶酸受体、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性抗原、嘌呤受体、辐射诱导的
细胞表面受体、丝酶抑制蛋白b3、丝酶抑制蛋白b4、鳞状细胞癌抗原、血小板反应蛋白、肿瘤抗原4、肿瘤相关糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸激酶等。
[0333]
在一些实施方案中，如本文所述的化合物可与用于治疗癌症的疫苗接种方案组合使用。在一些实施方案中，如本文所述的化合物可与免疫治疗剂诸如疫苗组合使用。在各种实施方案中，示例性疫苗包括用于刺激对癌症抗原的免疫反应的那些疫苗。
[0334]
可与载剂材料合并以产生单一剂型的本文公开的化合物或其盐和额外的一种或多种另外治疗剂(在包含如上所述的另外治疗剂的那些组合物中)的量将根据所治疗的宿主和特定的施用模式而变化。在某些实施方案中，将本发明的组合物配制为使得可施用剂量在0.01
‑
100mg/kg体重/天之间的本发明化合物。
[0335]
另外的治疗剂和本文公开的化合物可协同作用。因此，在此类组合物中另外治疗剂的量可少于仅利用所述治疗剂的单药疗法中所需的量，或者考虑到使用较低剂量，对患者的副作用可更少。在某些实施方案中，在此类组合物中可施用剂量在0.01
‑
10,000μg/kg体重/天之间的另外的治疗剂。
[0336]
标记的化合物和测定方法
[0337]
本发明的另一个方面涉及本发明的标记化合物(放射性标记、荧光标记等)，其不仅可用于成像技术，而且可用于体外和体内测定中，用于定位和定量组织样本，包括人类中的蛋白激酶，以及用于通过标记化合物的抑制结合来鉴定蛋白激酶配体。因此，本发明包括含有此类标记化合物的蛋白激酶测定。
[0338]
本发明还包括本发明的同位素标记的化合物。“同位素”或“放射性标记的”化合物是本发明的化合物，其中一个或多个原子由原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的(即，天然存在的)原子质量或质量数的原子替换或取代。可掺入本发明化合物中的合适放射性核素包括但不限于2h(对于氘还写作d)、3h(对于氚还写作t)、
11
c、
13
c、
14
c、
13
n、
15
n、
15
o、
17
o、
18
o、
18
f、
35
s、
36
cl、
82
br、
75
br、
76
br、
77
br、
123
i、
124
i、
125
i和
131
i。掺入本发明放射性标记化合物中的放射性核素将取决于所述放射性标记化合物的具体应用。例如，对于体外金属蛋白酶标记和竞争测定，掺入3h、
14
c、
82
br、
125
i、
131
i或
35
s的化合物通常最有用。对于放射性成像应用，
11
c、
18
f、
125
i、
123
i、
124
i、
131
i、
75
br、
76
br或
77
br通常最有用。
[0339]
应当理解，“放射性标记的”或“标记的化合物”是掺入了至少一种放射性核素的化合物。在一些实施方案中，放射性核素选自由3h、
14
c、
125
i、
35
s和
82
br组成的组。
[0340]
本发明可还包括用于将放射性同位素掺入到本发明化合物中的合成方法。将放射性同位素掺入有机化合物中的合成方法是本领域众所周知的，并且本领域普通技术人员将容易认识到适用于本发明化合物的方法。
[0341]
在筛选测定中可使用本发明的标记化合物来鉴定/评估化合物。例如，被标记的新合成或鉴定的化合物(即，测试化合物)可通过跟踪标记以监测其与蛋白激酶接触时的浓度变化，来评估其结合蛋白激酶的能力。例如，可评估测试化合物(标记的)减少另一种已知结合蛋白激酶的化合物(即，标准化合物)的结合的能力。因此，测试化合物与标准化合物竞争结合蛋白激酶的能力与其结合亲和力直接相关。相反，在一些其他筛选测定中，标准化合物是标记的并且测试化合物是未标记的。因此，监测标记的标准化合物的浓度以评估标准化合物与测试化合物之间的竞争，并因此确定测试化合物的相对结合亲和力。
[0342]
合成
[0343]
本发明的化合物可通过下述合成程序制备。用于制备这些化合物的起始材料和试剂可购自商业供应商，诸如sigma aldrich chemical co.(milwaukee，wis.)或bachem(torrance，ca)，或通过本领域技术人员已知的方法按照参考文献中所阐述的程序制备，所述参考文献诸如fieser and fieser's reagents for organic synthesis，第1
‑
17卷(john wiley and sons，1991)；rodd's chemistry of carbon compounds，第1
‑
5卷和增刊(elsevier science publishers，1989)；organic reactions，第1
‑
40卷(john wiley and sons，1991)；march's advanced organic chemistry，(john wiley and sons，第4版)以及larock's comprehensive organic transformations(vch publishers inc.，1989)。这些方案仅说明可合成本发明化合物的一些方法，并且可以对这些方案进行各种修改并且将向参考本公开的本领域技术人员提出建议。如果需要，可使用常规技术分离和纯化反应的起始材料和中间体，所述常规技术包括但不限于过滤、蒸馏、结晶、色谱等。可使用包括物理常数和光谱数据的常规手段表征此类材料。
[0344]
除非有相反规定，否则本文所述的反应在大气压下和约
‑
78℃至约150℃，更优选约0℃至约125℃范围内，且最优选约室温(或环境)温度，例如约20℃的温度下发生。除非另有说明(如在氢化的情况下)，否则所有反应均在氮气气氛下进行。
[0345]
本文公开和要求保护的化合物在其结构中可具有不对称碳原子或季铵化氮原子，并可通过本文所述的合成制备为单一立体异构体、外消旋体或对映体和非对映体的混合物。化合物也可作为几何异构体存在。所有此类单一立体异构体、外消旋体和几何异构体以及它们的混合物都旨在处于本发明的范围内。
[0346]
本发明的一些化合物可作为互变异构体存在。例如，在存在酮或醛的情况下，分子可以烯醇形式存在；在存在酰胺的情况下，分子可作为亚胺酸存在；在存在烯胺的情况下，分子可作为亚胺存在。所有此类互变异构体都在本发明的范围内。
[0347]
从立体异构体的外消旋混合物或非外消旋混合物中制备和/或分离(separation)和分离(isolation)单一立体异构体的方法是本领域众所周知的。例如，旋光(r)
‑
和(s)
‑
异构体可使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术拆分。对映体(r
‑
和s
‑
异构体)可通过本领域普通技术人员已知的方法拆分，例如通过：形成可以分离的非对映体盐或复合物，例如通过结晶；通过形成可以分离的非对映体衍生物，例如通过结晶；一种对映体与对映体特异性试剂的选择性反应，例如酶促氧化或还原，随后分离修饰和未修饰的对映体；或在手性环境中的气液或液相色谱，例如在手性载体上，诸如结合有手性配体的二氧化硅，或在手性溶剂的存在下。应当理解，在所期望的对映体通过上述分离程序之一转化为另一种化学实体的情况下，可能需要另一步骤来释放所期望的对映体形式。或者，可通过使用旋光性试剂、底物、催化剂或溶剂的不对称合成或通过不对称转化将一种对映体转化成另一种对映体来合成特定的对映体。对于富集特定对映体的对映体混合物，主要组分对映体可通过重结晶进一步富集(伴随产率损失)。
[0348]
此外，本发明化合物可以非溶剂化形式以及用药学上可接受的溶剂诸如水、乙醇等的溶剂化形式存在。一般来说，出于本发明的目的，将溶剂化形式认为等同于非溶剂化形式。
[0349]
本发明的方法可作为半连续或连续过程，更优选作为连续过程进行。
[0350]
除非另有说明，否则如上所述的本发明可在溶剂或两种或更多种溶剂的混合物的
存在下进行。具体地说，溶剂是水性溶剂或有机溶剂，诸如醚类溶剂(例如，四氢呋喃、甲基四氢呋喃、二异丙醚、叔丁基甲基醚或二丁基醚)、脂肪烃溶剂(例如，己烷、庚烷或戊烷)、饱和脂环烃溶剂(例如环己烷或环戊烷)或芳烃溶剂(例如甲苯、邻二甲苯、间二甲苯或对二甲苯，或叔丁基苯)或它们的混合物。
[0351]
未在本文中明确公开其合成路线的起始材料和试剂通常可购自商业来源或使用本领域技术人员熟知的方法容易地制备。
[0352]
方法
[0353]
一方面提供了制备式ia化合物：
[0354][0355]
或其药学上可接受的盐的方法，其包括
[0356]
将式(a)化合物
[0357][0358]
其中r1、r2、q1、q2和x如本文公开的式i或式ia的任何实施方案中所定义，
[0359]
与式(b)化合物反应
[0360][0361]
其中r3、r4、y、z如本文公开的式i或ia的任何实施方案中所定义，r6是甲基，且r
b
是离去基团，
[0362]
以产生式ia化合物。
[0363]
在这个方面的一些实施方案中，r
b
是卤基；在一些情况下，r
b
是cl。
[0364]
另一方面提供了制备式iia化合物：
[0365][0366]
或其药学上可接受的盐的方法，其包括
[0367]
将式(c)化合物
[0368][0369]
其中r1和r
2a
如本文公开的式ii或iia的任何实施方案中所定义，
[0370]
与式(d)化合物反应
[0371][0372]
其中r6是甲基，并且r
b
是离去基团，
[0373]
以产生式iia化合物。
[0374]
在这个方面的一些实施方案中，r
b
是卤基；在一些情况下，r
b
是cl。
[0375]
另一方面提供了一种方法，其包括：
[0376]
将式(e)化合物
[0377][0378]
其中r6是甲基，
[0379]
与式(f)化合物反应
[0380][0381]
以产生式(g)化合物
[0382][0383]
并且任选地，进一步将式(g)化合物与lioh反应以形成式(h)化合物
[0384][0385]
并且任选地，进一步使式(h)化合物与socl2反应以形成式(j)化合物
[0386][0387]
在这个方面的一些实施方案中，式(e)和式(f)的反应在hatu和dipea的存在下进行。
[0388]
在这个方面的一些实施方案中，r6是甲基。在其他实施方案中，r6是
‑
ch2oh。在其他实施方案中，r6是
‑
ch2och3。
[0389]
另一方面提供了制备式iiia化合物
[0390][0391]
或其药学上可接受的盐的方法，其包括
[0392]
将式(k)化合物
[0393][0394]
其中r1、r2、q1、q2和x如本文公开的式i’或式iiia的任何实施方案中所定义，
[0395]
与式(l)化合物反应
[0396][0397]
其中r4和z如本文公开的式i’或iiia的任何实施方案中所定义，r6是甲基，并且r
b
是离去基团，
[0398]
以产生式iiia化合物。
[0399]
另一方面提供了一种产生式ic或式ic’化合物：
[0400][0401]
或其药学上可接受的盐的方法，其包括：
[0402]
将式i或式i
′
化合物与cyp450酶接触，以产生式ic或ic'化合物，其中式i和式i
′
化合物具有以下结构：
[0403][0404]
或其药学上可接受的盐，其中a、r1、r2、r3、r4、r5、r6、q1、q2、q3、x、y和z如本文公开的式i或式i’的任何实施方案中所定义。
[0405]
另一方面提供了一种产生式ie或式ie’化合物：
[0406]
[0407]
或其药学上可接受的盐的方法，其包括：
[0408]
将式id或式id
′
化合物与cyp450酶接触，以产生式ie或ie
′
化合物，其中式id和式id
′
化合物具有以下结构：
[0409][0410]
或其药学上可接受的盐，其中a、r1、r2、r3、r4、q1、q2、q3、x、y和z如本文公开的式i或式i’的任何实施方案中所定义。
[0411]
另一方面提供了一种产生式ig或式ig’化合物：
[0412][0413]
或其药学上可接受的盐的方法，其包括：
[0414]
将式if或式if
′
化合物与cyp450酶接触，以产生式ig或ig'化合物，其中式if和式if
′
化合物具有以下结构：
[0415][0416]
或其药学上可接受的盐，其中a、r1、r2、r3、r4、q1、q2、q3、x、y和z如本文公开的式i或式i’的任何实施方案中所定义。
[0417]
在这个方面的一些实施方案中，所述方法在有机溶剂的存在下进行。
[0418]
实施例
[0419]
以下实施例是出于进一步说明的目的提供，而非旨在限制要求保护的发明的范
围。
[0420]
实施例1：4
‑
((6，7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)氧基)苯胺(3)
[0421][0422]
6，7
‑
二甲氧基
‑4‑
(4
‑
硝基苯氧基)喹啉(2)：向化合物1(10g，44.7mmol，1eq)和4
‑
硝基苯酚(8.70g，62.5mmol，1.4eq)在2,6
‑
二甲基吡啶(50ml)中的混合物中加入dmap(1.10g，9.0mmol，2.01e
‑
1eq)。将混合物在140℃下搅拌36h。将反应冷却至室温，加入meoh(32g)，然后加入k2co3水溶液(4g在水(62g)中)。将所得混合物在0℃下搅拌2h。将所得沉淀物过滤并用水(200ml)洗涤以得到呈黄色固体状的化合物2(8.0g，54.8％产率)。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.63(d，1h)，8.39
‑
8.28(m，2h)，7.49(s，1h)，7.38(s，1h)，7.30
‑
7.15(m，1h)，7.26(s，1h)，6.70(d，1h)，4.07(s，3h)，4.01(s，3h)；对于c
17
h
14
n2o5的ms(ei)，实测值为326.8(mh )。
[0423]4‑
((6，7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)氧基)苯胺(3)：向化合物2(2.0g，6.1mmol，1eq)在etoh(40ml)和水(8ml)中的混合物中加入fe(1.71g，30.6mmol，5.0eq)和nh4cl(2.62g，49.0mmol，8.0eq)。将混合物在85℃下搅拌3h。将反应物过滤，并且滤液经无水na2so4干燥并浓缩以得到粗产物。向该粗产物中加入etoac(150ml)和dcm(150ml)。将所得混合物过滤，并将滤液浓缩以得到呈黄色固体状的化合物3(1.1g，60.6％产率)。1h nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ8.42(d，1h)，7.50(s，1h)，7.36(s，1h)，6.99
‑
6.84(m，2h)，6.74
‑
6.56(m，2h)，6.36(d，1h)，5.16(s，2h)，3.93(d，6h)；对于c
17
h
16
n2o3的ms(ei)，实测值为297.2(mh )。
[0424]
实施例2：1
‑
((4
‑
氟苯基)(甲基)氨基甲酰基)环丙烷
‑1‑
碳酰氯(8)
[0425][0426]1‑
((4
‑
氟苯基)(甲基)氨基甲酰基)环丙烷
‑1‑
羧酸甲酯(6)：将hatu(73g，192.0mmol，1.2eq)加入化合物4(20g，159.8mmol，19.23ml，1eq)、化合物5(23.03g，159.82mmol，1eq)和dipea(59g，456.5mmol，79.51ml，2.9eq)在dmf(100ml)中的溶液中。将反应混合物在10
‑
20℃下搅拌17h。将混合物用水(500ml)稀释并用etoac(2
×
500ml)进行萃取。将合并的有机萃取物用饱和nacl水溶液(3
×
100ml)洗涤，经无水na2so4干燥，并真空浓缩以得到呈棕色油状的粗化合物6(85g)，其无需进一步纯化即用于后续反应。对于c
13
h
14
fno3的ms(ei)，实测值为251.9(mh )。
[0427]1‑
((4
‑
氟苯基)(甲基)氨基甲酰基)环丙烷
‑1‑
羧酸(7)：向化合物6(40g，79.6mmol，1eq)在thf(200ml)和水(40ml)中的溶液中加入lioh
·
h2o(6.68g，159.2mmol，2eq)。将混合物在50℃下搅拌6h。将混合物真空浓缩以除去有机溶剂。将所得水性混合物用etoac(300ml)洗涤，然后用hcl水溶液(12m)酸化至ph4
‑
5。过滤收集所得沉淀物，并真空干燥，得到呈黄色固体状的化合物7(9.0g，37.56mmol，产率47.2％)。1h nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ12.53(br s，1h)，7.35(br d，2h)，7.23
‑
7.19(m，2h)，3.13(s，3h)，1.20(br s，2h)，0.96(br s，2h)；对于c
12
h
12
fno3的ms(ei)，实测值为237.8(mh )。
[0428]1‑
((4
‑
氟苯基)(甲基)氨基甲酰基)环丙烷
‑1‑
碳酰氯(8)：将化合物7(1.3g，5.48mmol，1eq.)在socl2(20ml)中的混合物在85℃下搅拌12h。将反应混合物在减压下浓缩并与无水dcm(4
×
30ml)共蒸发以得到呈棕色油状的化合物8(1.3g，92.8％产率)，其无需进一步纯化即用于后续反应。ms(ei)在用甲醇淬灭后得到对应的甲酯c
13
h
14
fno3，实测值为252.1(mh )。
[0429]
或者，可使用如先前在wo2012109510 a1和wo2010051373 a1中所描述的用于合成相关化合物1
‑
((4
‑
氟苯基)氨基甲酰基)环丙烷
‑1‑
碳酰氯的相同方法合成化合物8，将4
‑
氟苯胺替换为4
‑
氟
‑
n
‑
甲基苯胺。
[0430]
实施例3：1
‑
n
‑
[4
‑
(6，7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)氧苯基]
‑1‑
n'
‑
(4
‑
氟苯基)
‑1‑
n
′‑
甲基环丙烷
‑
1，1
‑
二羧酰胺盐酸盐(9)
[0431][0432]1‑
n
‑
[4
‑
(6，7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)氧苯基]
‑1‑
n
′‑
(4
‑
氟苯基)
‑1‑
n
′‑
甲基环丙烷
‑
1，1
‑
二羧酰胺盐酸盐(9)：向化合物3(1.5g，5.1mmol，1eq)在dcm(30ml)中的混合物加入化合物8(1.3g，5.1mmol，1.0eq)。将混合物在6
‑
11℃下搅拌12h。将反应混合物过滤，并且将所得固体用dcm(3
×
50ml)洗涤并干燥以得到呈灰色固体状的化合物9的盐酸盐(1.76g，63.2％产率)。1h nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ9.83(br s，1h)，8.82(d，1h)，7.74(s，2h)，7.56(br s，2h)，7.33
‑
7.27(m，4h)，7.10(t，2h)，6.79(d，1h)，4.04(s，6h)，3.25(s，3h)，1.45
‑
1.39(m，2h)，1.25(br s，2h)；对于c
29
h
26
fn3o5的ms(ei)，实测值为516.3(mh )。
[0433]
实施例4：n
‑
(4
‑
((6，7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)氧基)
‑3‑
氟苯基)
‑
n
‑
(4
‑
氟苯基)
‑
n
‑
甲基环丙烷
‑
1，1
‑
二羧酰胺(10)
[0434][0435]
n
‑
(4
‑
((6，7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)氧基)
‑3‑
氟苯基)
‑
n
‑
(4
‑
氟苯基)
‑
n
‑
甲基环丙烷
‑
1，1
‑
二羧酰胺(10)：将化合物8(1.08g，4.22mmol，1.33eq.)和化合物3a(1.0g，
3.18mmol，1eq.)在ch2cl2(10ml)中的溶液在10
‑
20℃下搅拌16h。将混合物用nahco3水溶液(30ml)稀释并用dcm(3
×
30ml)进行萃取。将合并的有机层用无水na2so4干燥并真空浓缩。将所得残余物通过硅胶柱色谱(在石油中的50％
‑
100％etoac)纯化，浓缩并冻干以得到呈白色固体状的化合物10(957.0mg，56.4％严率)。1h nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ9.93(br s，1h)，8.49(d，1h)，7.52(s，1h)，7.48(br d，1h)，7.41(s，1h)，7.38
‑
7.32(m，1h)，7.28(br d，3h)，7.10(br t，2h)，6.41(d，1h)，3.95(s，6h)，3.24(s，3h)，1.47
‑
1.40(m，2h)，1.30
‑
1.18(m，2h)；对于c
29
h
25
f2n3o5的ms(ei)，实测值为534.0(mh )。化合物3a可由化合物1和4
‑
硝基
‑2‑
氟苯酚以与实施例1中由化合物1和4
‑
硝基苯酚制备化合物3相同的方式制备。
[0436]
实施例5：根据实施例4使用3
‑
氟
‑4‑
[6
‑
甲氧基
‑7‑
(3
‑
吗啉
‑4‑
基
‑
丙氧基)
‑
喹啉
‑4‑
基氧基]
‑
苯胺(us2013/0197230)替代化合物3制备n
‑
(3
‑
氟
‑4‑
((6
‑
甲氧基
‑7‑
(3
‑
吗啉代丙氧基)喹啉
‑4‑
基)氧基)苯基)
‑
n
‑
(4
‑
氟苯基)
‑
n
‑
甲基环丙烷
‑
1，1
‑
二羧酰胺(11)。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.54(s，1h)，8.48(d，1h)，7.69
‑
7.63(m，1h)，7.57(s，1h)，7.44(s，1h)，7.23
‑
7.19(m，2h)，7.15
‑
7.09(m，4h)，6.39(d，1h)，4.28(t，2h)，4.04(s，3h)，3.73(t，4h)，3.38(s，3h)，2.61
‑
2.55(m，2h)，2.49(s，4h)，2.13(quin，2h)，1.38
‑
1.32(m，2h)，1.13
‑
1.07(m，2h)；对于c
35
h
36
f2n4o6的ms(ei)，实测值为669.1[m na]

。
[0437]
实施例8：4
‑
((3
‑
氟
‑5‑
(1
‑
((4
‑
氟苯基)(甲基)氨基甲酰基)环丙烷
‑1‑
羧酰胺基)吡啶
‑2‑
基)氧基)
‑7‑
甲氧基喹啉
‑6‑
羧酸(33)。
[0438][0439]4‑
((3
‑
氟
‑5‑
硝基吡啶
‑2‑
基)氧基)
‑7‑
甲氧基喹啉
‑6‑
羧酸甲酯(30)：在16℃下向化合物28(5.0g，21.44mmol，1eq)在ch3cn(80ml)中的溶液一次性加入cs2co3(13.97g，42.88mmol，2eq)。将混合物在16℃下搅拌30min。加入化合物29(4.54g，25.73mmol，1.2eq)。将混合物在16℃下搅拌12h。将所得固体过滤并用150mletoac进行洗涤。将滤饼用水(200ml)稀释并用dcm(3
×
150ml)进行萃取。将合并的有机相用饱和nacl水溶液(50ml)洗涤，过滤并在减压下浓缩以得到呈黄色固体状的化合物30(3.5g，43.7％产率)。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.93(d，1h)，8.85(d，1h)，8.46(s，1h)，8.42(dd，1h)，7.59(s，1h)，7.22(d，1h)，4.06(s，3h)，3.95(s，3h)；对于c
17
h
12
fn3o6的ms(ei)，实测值为373.9(mh )。
[0440]4‑
((5
‑
氨基
‑3‑
氟吡啶
‑2‑
基)氧基)
‑7‑
甲氧基喹啉
‑6‑
羧酸甲酯(31)：向化合物30(3.5g，9.38mmol，1eq)在水(5ml)和etoh(40ml)中的混合物中加入fe(2.62g，46.88mmol，5eq)和nh4cl(5.02g，93.76mmol，10eq)并将混合物在80℃下搅拌2h。加入etoh(250ml)并将所得混悬液通过的垫过滤。将滤饼用etoh(3
×
80ml)洗涤。将滤液浓缩至干燥，用水(50ml)洗涤并真空干燥以得到黄色固体状化合物31(2.5g，77.67％产率)，其无需进一步纯
化即用于后续反应。对于c
17
h
14
fn3o4的ms(ei)，实测值为343.9(mh )。
[0441]4‑
((3
‑
氟
‑5‑
(1
‑
((4
‑
氟苯基)(甲基)氨基甲酰基)环丙烷
‑1‑
羧酰胺基)吡啶
‑2‑
基)氧基)
‑7‑
甲氧基喹啉
‑6‑
羧酸甲酯(32)：在10℃下将化合物7(600mg，2.53mmol，1eq)混悬在无水dcm(8ml)中并且在氮气下搅拌加入(cocl)2(321.02mg，2.53mmol，221.40μl，1eq)，随后加入dmf(18.49mg，252.92mmol，19.46μl，0.1eq)。将混合物在10℃下搅拌1h。将样品用苄胺(bnnh2)进行淬灭。在减压下除去溶剂并将所得粗酰基氯缓慢加入到化合物31(600mg，1.75mmol，1eq)在dmac(8ml)中的溶液中。将所得反应混合物在10℃下搅拌1h，然后倒入饱和nh4cl水溶液(50ml)中并用dcm(3
×
30ml)进行萃取。将合并的有机相用饱和nahco3水溶液(20ml)、饱和nacl水溶液(10ml)洗涤，经无水na2so4干燥并真空浓缩以得到呈黄色固体状的化合物32(730mg，74.2％产率)。对于c
29
h
24
f2n4o6的ms(ei)，实测值为563.5(mh )。
[0442]4‑
((3
‑
氟
‑5‑
(1
‑
((4
‑
氟苯基)(甲基)氨基甲酰基)环丙烷
‑1‑
羧酰胺基)吡啶
‑2‑
基)氧基)
‑7‑
甲氧基喹啉
‑6‑
羧酸(33)：向化合物32(730mg，1.30mmol，1eq)在水(10ml)和thf(2ml)中的混合物中缓慢加入lioh(2m，3.24ml，5eq)并将反应混合物在10℃下搅拌1h。将反应混合物浓缩并将残余物用水(20ml)稀释并用hcl水溶液(1m)酸化直至ph＝3。将所得固体过滤并用h2o(2.0ml)进行洗涤以得到呈黄色固体状的化合物33(600mg，84.3％产率)。对于c
28
h
22
f2n4o6的ms(ei)，实测值为549.0(mh )。
[0443]
实施例9：1
‑
n
‑
[5
‑
氟
‑6‑
[7
‑
甲氧基
‑6‑
(甲基氨基甲酰基)喹啉
‑4‑
基]氧吡啶
‑3‑
基]
‑1‑
n
′‑
(4
‑
氟苯基)
‑1‑
n
′‑
甲基环丙烷
‑
1，1
‑
二羧酰胺(34)。
[0444][0445]1‑
n
‑
[5
‑
氟
‑6‑
[7
‑
甲氧基
‑6‑
(甲基氨基甲酰基)喹啉
‑4‑
基]氧吡啶
‑3‑
基]
‑1‑
n
′‑
(4
‑
氟苯基)
‑1‑
n
′‑
甲基环丙烷
‑
1，1
‑
二羧酰胺(34)：向化合物33(200mg，364.64μmol，1eq)在dmf(3ml)中的溶液中加入hatu(152.51mg，401.10μmol，1.1eq)和diea(141.38mg，1.09mmol，190.54μl，3eq)并在10℃下搅拌30min。加入甲胺盐酸盐(73.86mg，1.09mmol，3eq)并将反应混合物在10℃下搅拌12h。将反应混合物倒入水(30ml)中并用dcm(3
×
20ml)进行萃取。将合并的有机相用饱和氯化钠水溶液(10ml)洗涤，真空浓缩，并且所得残留物通过制备型hplc(柱：ht c18 highload 150mm*25mm*5um，梯度：24
‑
54％乙腈水溶液(0.04％nh3·
h2o 10mm nh4hco3)，流速：30ml/min)纯化以得到呈黄色固体状的化合物34(81.6mg，39.8％产率)。1h nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ8.78(d，1h)，8.45(s，1h)，8.38(br d，1h)，8.08(br s，1h)，7.88(br s，1h)，7.56(s，1h)，7.33
‑
7.24(m，2h)，7.17
‑
7.09(m，2h)，6.91(d，1h)，4.03(s，3h)，3.24(s，3h)，2.83(d，3h)，1.48
‑
1.41(m，2h)，1.23(br s，2h)；对于c
29
h
25
f2n5o5的ms(ei)，实测值为562.0(mh )。
[0446]
实施例10：根据实施例9使用nh4cl替代甲胺盐酸盐制备1
‑
n
‑
[6
‑
(6
‑
氨基甲酰基
‑7‑
甲氧基喹啉
‑4‑
基)氧基
‑5‑
氟吡啶
‑3‑
基]
‑1‑
n
′‑
(4
‑
氟苯基)
‑1‑
n
′‑
甲基环丙烷
‑
1，1
‑
二羧酰胺(35)。1h nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ10.21(br s，1h)，8.78(d，1h)，8.53(s，1h)，8.09(br s，1h)，7.93
‑
7.70(m，3h)，7.56(s，1h)，7.35
‑
7.22(m，2h)，7.18
‑
7.08(m，2h)，6.91(d，1h)，
4.04(s，3h)，3.24(s，3h)，1.50
‑
1.39(m，2h)，1.23(br s，2h)；对于c
28
h
23
f2n5o5的ms(ei)，实测值为548.0(mh )。
[0447]
实施例11：1
‑
n
‑
[4
‑
[(6，7
‑
二甲氧基
‑
1，5
‑
萘啶
‑4‑
基)氧基]
‑3‑
氟苯基]
‑1‑
n
′‑
(4
‑
氟苯基)
‑1‑
n
′‑
甲基环丙烷
‑
1，1
‑
二羧酰胺(44)
[0448][0449]
2，3
‑
二甲氧基
‑5‑
硝基吡啶(37)：将新切割的钠(0.6g，26mmol)分批加入meoh(50ml)中，并将混合物在室温下搅拌直至钠溶解。加入化合物36(3.0g，15.9mmol)并将反应混合物在室温下搅拌1h。加入水(100ml)并将混合物过滤。将固体用水洗涤并干燥以得到化合物37(2.78g，95％产率)。对于c7h8n2o4的ms，实测值为185(mh )。
[0450]
2，3
‑
二甲氧基
‑5‑
硝基吡啶(38)：在氩气下向化合物37(2.78g，15.1mmol)在etoac(40ml)中的溶液中加入10％pd/c(53％水，880mg)。在一种h2气氛下将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后通过过滤。将滤液在真空下浓缩以提供呈棕色固体状的粗化合物38(2.31g，100％产率)。对于c7h
10
n2o2的ms，实测值为155(mh )。
[0451]5‑
(((5，6
‑
二甲氧基吡啶
‑3‑
基)亚氨基)甲基)
‑
2，2
‑
二甲基
‑
1，3
‑
二氧杂环己烷
‑
4，6
‑
二酮(40)：将原甲酸三乙酯(12ml)和化合物39(1.44g，10.0mmol)的溶液在106℃下搅拌2.5h，随后加入化合物38(1.54g，10.0mmol)，同时维持相同温度。几分钟内出现沉淀物。将不均匀混合物在105℃下再加热10min，冷却至室温并过滤。将固体用己烷洗涤并干燥以得到粗化合物40(3.6g)。对于c
14
h
16
n2o6的ms，实测值为309(mh )。
[0452]
6，7
‑
二甲氧基
‑
1，5
‑
萘啶
‑4‑
醇(41)：将化合物40(1.55g，5.03mmol)在二苯醚
(12ml)中的溶液在250℃下加热30min，然后冷却至室温。加入乙醚并将混合物过滤以得到呈棕色固体状的粗化合物40(0.92g，89％产率)。对于c
10
h
10
n2o3的ms，实测值为207(mh )。
[0453]8‑
(2
‑
氟
‑4‑
硝基苯氧基)
‑
2，3
‑
二甲氧基
‑
1，5
‑
萘啶(42)：将化合物41(1.0g，4.8mmol)、1，2
‑
二氟
‑4‑
硝基苯(0.93g，6.8mmol)和cs2co3(6.6g，20mmol)在乙腈(20ml)中的混合物在室温下搅拌过夜。加入etoac(80ml)并将所得混合物过滤。将滤液真空蒸发，并且将所得残余物通过硅胶色谱纯化以得到化合物42(670mg，40％产率)。对于c
16
h
12
fn3o5的ms，实测值为346(mh )。
[0454]4‑
((6，7
‑
二甲氧基
‑
1，5
‑
萘啶
‑4‑
基)氧基)
‑3‑
氟苯胺(43)：将化合物42(620mg，1.8mmol)、nh4cl(500mg，9.3mmol)和fe(260mg，4.6mmol)在meoh/水(20/5ml)中的混合物回流1h并冷却至室温。将混合物通过过滤，并将滤液浓缩以除去meoh。向残余物中加入饱和nahco3水溶液(6ml)，并将所得混合物用etoac进行萃取。将有机萃取物经无水na2so4干燥并真空浓缩以得到呈棕色固体状的粗化合物43(530mg，94％产率)。对于c
16
h
14
fn3o3的ms，实测值为316(mh )。
[0455]1‑
n
‑
[4
‑
[(6，7
‑
二甲氧基
‑
1，5
‑
萘啶
‑4‑
基)氧基]
‑3‑
氟苯基]
‑1‑
n
′‑
(4
‑
氟苯基)
‑1‑
n'
‑
甲基环丙烷
‑
1，1
‑
二羧酰胺(44)：向化合物43(31mg，0.10mmol)和化合物7(46mg，0.20mmo1)在dmf(1ml)中的混合物中加入hatu(120mg，0.32mmol)，随后加入diea(0.10ml，0.57mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。加入饱和nahco3水溶液(2ml)和水(2ml)并将所得混悬液过滤。固体通过硅胶色谱纯化，然后通过制备型hplc纯化以得到化合物44(12mg，23％产率)。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.71(s，1h)，8.42(d，1h)，8.25(s，1h)，7.74
‑
7.59(m，1h)，7.22(dd，2h)，7.04(s，2h)，7.02(d，2h)，6.82(dd，1h)，4.15(s，3h)，4.08(s，3h)，3.30(s，3h)，1.28(q，2h)，1.02(q，2h)；对于c
28
h
24
f2n4o5的ms，实测值为535(mh )。
[0456]
实施例12：1
‑
n
‑
[4
‑
(6，7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)氧基苯基]
‑1‑
n'
‑
(4
‑
氟苯基)
‑1‑
n'
‑
(甲氧基甲基)环丙烷
‑
1，1
‑
二羧酰胺(49)
[0457][0458]1‑
((4
‑
氟苯基)氨基甲酰基)环丙烷
‑1‑
羧酸甲酯(46)：在0℃下向化合物45(1.00g，4.48mmol，1eq)在meoh(10ml)中的溶液中加入5ocl2(5.33g，44.80mmol，3.25ml，10eq)。将混合物在65℃下搅拌2h。将反应混合物在减压下浓缩，并且将所得残余物通过硅胶柱色谱(pe/etoac＝1/0至3/1)纯化以得到呈灰白色固体的化合物46(550mg，51.8％产率)。对于c
12
h
12
fno3的ms，实测值为237.9(mh )。
[0459]1‑
((4
‑
氟苯基)(甲氧基甲基)氨基甲酰基)环丙烷
‑1‑
羧酸甲酯(47)：在0℃下向化
合物46(400mg，1.69mmol，1eq)在thf(5ml)中的溶液中加入nah(202.32mg，5.06mmol，60％纯度，3.0eq)。将反应混合物在10℃下搅拌0.5h。加入氯(甲氧基)甲烷(678.79mg，8.43mmol，640.37μl，5.0eq)，并且将所得混合物在氮气气氛下在10℃搅拌12h。加入水(20ml)，并且将所得混合物用etoac(3
×
20ml)进行萃取。将合并的有机萃取物用水(10ml)、饱和nacl水溶液(10ml)洗涤，经无水na2so4干燥并在减压下浓缩以得到呈黄色油状的粗化合物47(474mg)，其无需进一步纯化即用于后续反应。对于c
14
h
16
fno4的ms，实测值303.9[m na]

。
[0460]1‑
((4
‑
氟苯基)(甲氧基甲基)氨基甲酰基)环丙烷
‑1‑
羧酸(48)：向化合物47(474mg，1.69mmol，1eq)在thf(3ml)和水(3ml)中的溶液中加入lioh
·
h2o(282.86mg，6.74mmol，4.0eq)。将混合物在10℃下搅拌12h。加入水(20ml)，并且将所得混合物用etoac(3
×
20ml)洗涤。通过加入1n hcl水溶液将水层酸化至ph3
‑
4。将所得混合物用etoac(3
×
20ml)进行萃取。将合并的有机萃取物用水(20ml)、饱和nacl水溶液(20ml)洗涤，经无水na2so4干燥并在减压下浓缩以得到呈无色油状的化合物48(290mg，64.4％产率)，其无需进一步纯化即用于后续反应。
[0461]1‑
n
‑
[4
‑
(6，7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)氧基苯基]
‑1‑
n'
‑
(4
‑
氟苯基)
‑1‑
n'
‑
(甲氧基甲基)环丙烷
‑
1，1
‑
二羧酰胺(49)：向化合物48(260mg，972.86μmol，1eq)和化合物3(230.62mg，778.29μmol，0.8eq)在吡啶(5ml)中的溶液中加入edci(373.00mg，1.95mmol，2.0eq)。将混合物在10℃下搅拌12h。将混合物在减压下浓缩。加入水(50ml)，并且将所得混合物用etoac(3
×
30ml)进行萃取。用水(20ml)、饱和nacl水溶液(20ml)洗涤合并的有机萃取物，经无水na2so4干燥并在减压下浓缩。将所得残余物通过硅胶柱色谱(dcm/meoh＝1/0至5/1)纯化，随后通过制备型hplc(柱：venusil asb phenyl 150*30mm*5um；流动相：[水(0.05％hcl)
‑
acn]；b％：30％
‑
60％，10min)进一步纯化以得到溶液。将饱和nahco3水溶液(2ml)加入到溶液中，然后用dcm(3
×
20ml)对其进行萃取。用水(10ml)、饱和nacl水溶液(10ml)洗涤合并的有机萃取物，经无水na2so4干燥并在减压下浓缩。将所得残余物溶解在水(20ml)和乙腈(mecn)(5ml)的混合物中并将所得溶液冻干以得到呈白色固体状的化合物49(41mg，72.9％严率)。1h nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ9.58(s，1h)，8.48(d，1h)，7.51(s，1h)，7.46(br d，2h)，7.40(s，1h)，7.29(br dd，2h)，7.19
‑
7.08(m，4h)，6.43(d，1h)，5.03(s，2h)，3.95(d，6h)，3.30(s，3h)，1.47
‑
1.41(m，2h)，1.27(br s，2h)；对于c
30
h
28
fn3o6的ms，实测值为546.1(mh )。
[0462]
实施例13：1
‑
n'
‑
[4
‑
(6，7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)氧基
‑3‑
氟苯基]
‑1‑
n
‑
(4
‑
氟苯基)
‑1‑
n'
‑
甲基环丙烷
‑
1，1
‑
二羧酰胺(51)
[0463][0464]4‑
((6，7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)氧基)
‑3‑
氟
‑
n
‑
甲基苯胺(50)：向化合物3a(200mg，636.31μmol，1eq)和(hcho)
n
(3.82mg，1.27mmol，2eq)在dcm(5ml)中的混合物中加入nabh(oac)3(269.72mg，1.27mmol，2eq)和diea(164.48mg，1.27mmol，221.67μl，2eq)。将混合物
systems#294
‑
hg
‑
250)刺激10min，用冷pbs洗涤，并立即用130μl冷1x裂解缓冲液[20mm tris、137mm氯化钠、2mm edta、10％甘油、1％np
‑
40替代物、1mm活化的原钒酸钠、1mm pefabloc sc(sigma
‑
aldrich#11429868001)、蛋白酶/磷酸酶抑制剂片剂(thermo fisher#a32959)]裂解。通过离心澄清裂解物，并以100μl/孔加入到pathscan磷酸
‑
met(pantyr)sandwich elisa(cell signaling technology#7333)中。根据制造商的说明进行测定。阳性对照孔(100％活性)含有hgf刺激、dmso处理的细胞裂解物。阴性对照孔(0％活性)含有hgf刺激、参考抑制剂处理的细胞裂解物。ic
50
值通过非线性回归分析使用activitybase xe(idbs)中的4参数逻辑曲线拟合来计算。
[0469]
实施例c：在huvec细胞中的kdr自磷酸化elisa。将人脐静脉内皮细胞或huvec(lonza#c2519a)在含有1％青霉素链霉素(thermo fisher#15140
‑
122)的egm
‑
2生长培养基(lonza#cc
‑
3162)中以2
×
104细胞/孔接种到96孔板(corning#3904)上。将huvec细胞在37℃、5％co2下孵育24h，然后在含有1％青霉素链霉素的无血清ebm
‑
2基础培养基(lonza#cc
‑
3156)中饥饿24h。将测试化合物在新鲜无血清培养基中连续稀释以产生8点剂量曲线，最终浓度为0.3％dmso(媒介物)，并加入到细胞中并孵育1h。然后将细胞用100ng/ml重组人vegf165(r&d systems#293
‑
ve
‑
500)刺激5min，用冷pbs洗涤，并立即用130μl冷1x裂解缓冲液[20mm tris、137mm氯化钠、2mm edta、10％甘油、1％np
‑
40替代物、1mm活化的原钒酸钠、1mm pefabloc sc(sigma
‑
aldrich#11429868001)、蛋白酶/磷酸酶抑制剂片剂(thermo fisher#a32959)]裂解。收集裂解物并以100ul/孔加入到人磷酸
‑
kdr duoset ic elisa(r&d systems#dyc1766
‑
2)中。根据制造商的说明进行测定，并使用人磷酸
‑
kdr对照(r&d systems#841421)作为标准外推样品磷酸
‑
kdr浓度。阳性对照孔(100％活性)含有vegf165刺激、dmso处理的细胞裂解物。阴性对照孔(0％活性)含有未受刺激的细胞裂解物。ic
50
值通过非线性回归分析使用activitybase xe(idbs)中的4参数逻辑曲线拟合来计算。
[0470]
实施例d：在瞬时转染的293a细胞中的mer自磷酸化elisa。将293a细胞(thermo fisher#r70507)在含有10％fbs(thermo fisher#26140
‑
079)、1％mem neaa(thermo fisher#11140
‑
050)、1％glutamax(thermo fisher#35050
‑
061)和1％青霉素链霉素(thermo fisher#15140
‑
122)的dmem(thermo fisher#11995
‑
040)中以1.5
×
106细胞/孔接种到100mm培养皿(greiner#664169)上。将293a细胞在37℃、5％co2下孵育24h，然后使用transit lt1转染试剂(mirus
‑
bio#mir2305)用6μg mertk dna(genecopoeia#ex
‑
z8208
‑
m02)进行转染。孵育24h后，将转染的293a细胞在dmem生长培养基中以1
×
105细胞/孔接种到96孔板(corning#3904)上过夜。将测试化合物在新鲜无血清培养基中连续稀释以产生8点剂量曲线，最终浓度为0.3％dmso(媒介物)，并加入到细胞中并孵育1h。然后立即用150μl冷1x裂解缓冲液[20mm tris、137mm氯化钠、2mm edta、10％甘油、1％np
‑
40替代物、1mm活化的原钒酸钠、1mm pefabloc sc(sigma
‑
aldrich#11429868001)、蛋白酶/磷酸酶抑制剂片剂(thermo fisher#a32959)]裂解细胞。通过离心澄清裂解物，并以50μl/孔加入到人磷酸
‑
mer duoset ic elisa(r&d systems#dyc2579
‑
2)中。根据制造商的说明进行测定，并使用人磷酸
‑
mer对照(r&d systems#841793)作为标准外推样品磷酸
‑
mer浓度。阳性对照孔(100％活性)含有dmso处理的细胞裂解物。阴性对照孔(0％活性)含有参考抑制剂处理的细胞裂解物。ic
50
值通过非线性回归分析使用activitybase xe(idbs)中的4参数逻辑曲线拟合来计算。
[0471]
实施例e：将如本文所例示的本公开的化合物在实施例a、b、c和d的测定中进行测试并且显示出在以下范围内的ic
50
值：a：ic
50
≤10nm；b：10nm＜ic
50
≤100nm；c：100nm＜ic
50
≤300nm；d：ic
50
＞300nm。“nt”表示未测试。结果在表2中提供。
[0472]
表2.所选化合物的生物活性
[0473]
[0474][0475]
实施例f：微粒体测定
[0476]
通过细胞色素p450(cyp450)(例如，cyp3a4、cyp2c9)介导的i期氧化和通过其他途径的代谢，肝微粒体组织级分用于体外评定化合物的代谢稳定性。人、小鼠、大鼠和狗肝微粒体组织级分获自corning gentest和bioreclamationivt。
[0477]
测定在96孔微量滴定板中进行。在肝微粒体存在下，将化合物在37℃下孵育(n＝1)。反应混合物(25μl)在含有3.3mm mgcl2的100mm磷酸钾、ph7.4缓冲液中包含终浓度为1μm的测试化合物、0.5mg/ml肝微粒体(lm)蛋白和1mm nadph。将代谢程度计算为与0
‑
min对照反应孵育相比，测试化合物的消失。包括维拉帕米(verapamil)作为阳性对照以验证测定性能。
[0478]
在四个时间点中的每个时间点，将150μl淬灭溶液(100％乙腈和0.1％甲酸)与内标(用于正esi模式的布西丁(bucetin))转移到每个孔中。将板密封并在10℃下以4000rpm离心15分钟。将上清液转移到新板中用于lc/ms/ms分析。
[0479]
使用ab sciex api 4000仪器与shimadzu lc
‑
20ad lc泵系统联接，在lc/ms/ms上
分析所有样品。使用waters atlantis t3 dc18反相hplc柱(20mm
×
2.1mm)以0.5ml/min的流速分离分析样品。流动相由含0.1％甲酸的水(溶剂a)和含0.1％甲酸的100％乙腈(溶剂b)组成。测定条件总结在表3中。洗脱条件详见表4。
[0480]
表3.测定条件
[0481]
[化合物]1μm[lm]0.5mg/ml[nadph]1mm缓冲液100mm磷酸钾，ph7.4，含3.3mm mgcl2时间0、15、30和60min温度37℃
[0482]
表4.洗脱条件
[0483]
时间(min)流速(μl/min)％a％b05009820.35009821.35002981.75002981.715009822.5500982
[0484]
结果：将如本文所例示的本公开的化合物在此实施例f的测定中进行测试。作为计算的内在清除率和肝微粒体中测试化合物的t1/2值的代谢稳定性结果在表5中列出。参考化合物维拉帕米表现与预期一致。
[0485]
表5.微粒体稳定性数据
[0486][0487]
其他实施方案
[0488]
出于清楚和理解的目的，已通过说明和实施例详细地描述了前述公开内容。本发
明已参考各种具体和优选实施方案和技术加以描述。然而，应理解可在保持处于本发明的精神和范围内的同时作出许多变化和修改。对于本领域技术人员而言将很明显，变化和修改可在随附权利要求书的范围内实施。因此，应当理解，以上描述旨在是例示性而非限制性。因此，本发明的范围不应参考以上描述来确定，而是替代地应参考以下随附权利要求连同所述权利要求所享有的等效物的全部范围来确定。