多重引导RNA的制作方法

技术特征：
1.一种脱氧核糖核酸(dna)分子，包括：编码crrna的多个序列，其中每个crrna侧翼是至少一个csy4切割序列，该csy4切割序列由序列gttcactgccgtataggcag(seq id no:1)组成；和编码tracrrna的序列。2.如权利要求1所述的dna分子，可操作地连接至启动子序列。3.如权利要求1或2所述的dna分子，包括两个、三个、或更多个crrna序列。4.如权利要求2所述的dna分子，其中该启动子序列是rna聚合酶ii(polii)启动子或poliii启动子。5.如权利要求2所述的dna分子，其中该启动子序列是rna pol ii启动子。6.如权利要求5所述的dna分子，其中该pol ii启动子选自下组，该组由以下各项组成：cag、ef1a、caggs、pgk、ubic、cmv、b29、结蛋白、内皮因子、flt
‑
1、gfpa、和syn1启动子。7.一种dna分子，包括与一个、两个、三个或更多个盒连接的启动子序列，这些盒包括：连接至csy4切割位点的、编码crrna的序列，该csy4切割位点由gttcactgccgtataggcag(seq id no：1)组成；和编码tracrrna的序列。8.如权利要求7所述的dna分子，包括：pol ii启动子，该pol ii启动子可操作地连接至编码第一crrna的第一序列，该第一序列连接至一个csy4切割位点，该csy4切割位点连接至编码第二crrna的第二序列，该第二序列连接至一个csy4切割位点，该csy4切割位点连接至编码第三crrna的第三序列，该第三序列连接至csy4切割位点。9.如权利要求7所述的dna分子，包括约100nt的crrna序列。10.如权利要求1或7所述的dna分子，进一步包括编码功能性csy4酶的序列。11.如权利要求1或权利要求7所述的dna分子，其中该crrna序列包括：(x
17
‑
20
)gttttagagctagaaa(seq id no:15)；以及该tracrrna序列包括：tagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc(seq id no:16)；其中x
17
‑
20
是与靶序列的、优选是紧接前间区序列邻近基序(pam)的5’的靶序列的17
‑
20个连续核苷酸的互补链互补的序列。12.如权利要求1或权利要求7所述的dna分子，包括在该分子的3’端的一个或多个u。13.一种rna分子，由如权利要求1
‑
12任一项所述的dna分子编码。14.一种载体，包括如权利要求1
‑
12任一项所述的dna分子。15.如权利要求14所述的载体，进一步包括编码功能性csy4酶的序列。16.一种在细胞中产生多个crrna的方法，该方法包括在体外使所述细胞与如权利要求13所述的rna分子接触。17.如权利要求16所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞并且所述细胞还表达外源功能性csy4酶序列。18.一种改变细胞中多个靶基因的表达的方法，该方法包括在体外使所述细胞与如权利要求1
‑
12任一项所述的dna分子或如权利要求13所述的rna分子接触，其中每个crrna包括与靶基因的至少17
‑
20nt互补的序列。19.一种改变细胞中靶基因的表达的方法，该方法包括在体外使所述细胞与如权利要求1
‑
12任一项所述的dna分子或如权利要求13所述的rna分子接触，其中每个crrna包括与
该靶基因的至少17
‑
20nt互补的序列。20.权利要求1
‑
12任一项所述的dna分子或权利要求13所述的rna分子在制备用于改变细胞中多个靶基因表达的药物中的用途，其中每个crnra包括与靶基因的至少17
‑
20nt互补的序列。21.权利要求1
‑
12任一项所述的dna分子或权利要求13所述的rna分子在制备用于改变细胞中靶基因表达的药物中的用途，其中每个crnra包括与该靶基因的至少17
‑
20nt互补的序列。

技术总结
本申请涉及多重引导RNA。用于任选地在哺乳动物细胞中将高活性CRISPR引导RNA(gRNA)从RNA聚合酶II和III启动子进行多重表达的方法和构建体。本发明至少部分地基于Csy4的发现，Csy4是一种内切核糖核酸酶，该内切核糖核酸酶识别短RNA发夹序列，可以用于切下在单个较长RNA转录物上编码的多功能gRNA(产生自RNA pol II或III启动子)，在该较长RNA转录物中的各个gRNA由Csy4切割位点隔开。gRNA由Csy4切割位点隔开。gRNA由Csy4切割位点隔开。


技术研发人员：S
受保护的技术使用者：通用医疗公司
技术研发日：2014.09.18
技术公布日：2021/11/24