一种肝胆酸的检测试剂盒及其制备方法与流程

1.本发明涉及体外诊断试剂技术领域，尤其涉及一种肝胆酸的检测试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.甘胆酸(cholyglycine,cg)是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一。cg正常代谢途径为肠
‑
肝循环，由肝细胞合成，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指肠，帮助食物消化。95％胆酸在回肠末端重吸收，经门静脉再回肝脏，由肝细胞摄取再利用。在血清中主要以蛋白结合形式存在，溢入体循环的总量小于1％。在正常情况下，外周血中胆酸含量甚微，血清cg浓度稳定在较低水平。当肝细胞受损时，肝细胞摄取cg能力下降，致使血中cg含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍，而返流血液循环的cg含量增高，也使血cg含量增高。因此，目前用ria(radioimmunoassay放射免疫测定法)法测定血清甘胆酸(scg)是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。
3.正常人血清甘胆酸含量为1.3
±
0.8mg/l，范围可在0
‑
2.7mg/l内波动，肝炎诊断低限值为＜3.18mg/lo各类肝炎、原发性肝癌、肝硬化患者血cg均明显高于正常人，且呈递性增高；胆石症伴黄疸患者胆管、胆囊排泄功能障碍可引起血清cg显著升高；肝硬化、梗阻性肝病、肠
‑
肝循环障碍血清cg水平高于正常人。
4.甘胆酸是妊娠晚期血清中最主要的胆汁酸组分。正常妊娠时孕妇血清cg水平随孕周逐步增高，至足月妊娠cg值较非孕时增加部分妊娠妇女血清cg值可出现生理性升高，临床上并没有明显的icp症状(妊娠期肝内胆汁淤积症)。随着cg值的升高程度不同，对母婴有着不同程度的损伤，且cg值越高危害越大。
5.目前临床应用中，使用生化分析仪检测甘胆酸的测定方法主要是胶乳免疫比浊法，此方法在检测样本时，由于肝胆酸cg与包被抗肝胆酸cg抗体胶乳颗粒试剂反应时，出现凝集现象，如此会发生蛋白质抱团式凝聚，影响透射比浊检测时吸光度变化不稳定及灵敏度不高的现象。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种肝胆酸的检测试剂盒及其制备方法，所述肝胆酸的检测试剂盒可有效地避免蛋白质抱团式凝聚，以提高检测的灵敏度以及准确性。
7.为达到上述技术效果，本发明采用了以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供的一种肝胆酸的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括r1试剂和r2试剂，其中，所述r1试剂包括：缓冲液、离子溶液、表面活性剂、溴化乙二甲胺、聚乙二醇以及防腐剂；所述r2试剂包括包被有超敏化的抗肝胆酸抗体的胶乳颗粒、缓冲液、防腐剂以及助悬剂。
9.进一步地，所述r1试剂和r2试剂的体积比为3:1。
10.进一步地，所述试剂r1中离子溶液是氯化钠、氯化钾、氯化镁溶液中的一种或多种。
11.进一步地，所述试剂r1、试剂r2中的缓冲液是pbs磷酸盐缓冲液、tris三羟甲基氨基甲烷缓冲液、氨基乙酸缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种，优选地，所述缓冲液为氨基乙酸缓冲液。
12.进一步地，所述试剂r1、试剂r2中的防腐剂中的防腐剂是叠氮钠、proclin300、proclin950或亚硝酸钠中的一种，优选地，所述防腐剂是叠氮钠。
13.进一步地，所述胶乳颗粒为聚苯乙烯胶乳颗粒，且所述聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径为100nm
‑
500nm，优选为200nm
‑
250nm。
14.进一步地，所述助悬剂是甘油、丙二醇、山梨醇中的一种或多种，优选地，所述助悬剂为甘油、丙二醇、山梨醇三者的混合液。
15.进一步地，所述r1试剂包括：氨基乙酸缓冲液50mmol/l、氯化钠10g/l、brij
‑
660.1％w/v、溴化乙二甲胺1％w/v、peg600010g/l以及叠氮钠1g/l；所述r2试剂包括包被有超敏化的抗肝胆酸抗体的胶乳颗粒0.1％w/v、氨基乙酸缓冲液缓冲液50mmol/l、叠氮钠1g/l、甘油12％w/v、山梨醇6％w/v以及丙二醇6％w/v。
16.进一步地，所述包被有超敏化的抗肝胆酸抗体的胶乳颗粒制备步骤包括：
17.s1：加入ph7.0的乙磺酸稀释至浓度为1
‑
3％w/v的胶乳颗粒溶液；加入ph7.0的乙磺酸稀释至浓度为0.05
‑
0.15％w/v的抗肝胆酸抗体溶液；
18.s2：将抗体溶液加入到胶乳颗粒溶液中，室温下搅拌偶联2小时，1800rpm离心20分钟，去除上清液，所得沉淀即为偶联超敏化的抗肝胆酸抗体的胶乳颗。
19.第二方面，本发明还提供一种肝胆酸的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
20.(1)：r1试剂的配制
21.在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入氨基乙酸缓冲液，搅拌30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、底部无沉淀后，调节ph值到6.00
‑
8.50之间，之后加入氯化钠溶液，待物料完全溶解后再按照继续投入表面活性剂、溴化乙二甲胺、聚乙二醇peg 6000以及防腐剂叠氮钠，继续搅拌30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明、底部无沉淀，最后定容至最终体积；
22.(2)：r2试剂的配制
23.在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入的氨基乙酸缓冲液，搅拌30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、底部无沉淀后，调节ph值到7.00
‑
8.00之间，依次投入叠氮钠、甘油、的丙二醇、山梨醇、以及抗肝胆酸抗体胶乳颗粒，继续搅拌30分钟至全部物料完全溶解，最后定容至最终体积。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
25.本发明采用胶乳增强免疫透射比浊法对肝胆酸进行检测，采用两点终点法在生化分析仪上进行检测，具有准确性好、精密度高、操作简便等特点。样本中的肝胆酸cg与超敏化的抗肝胆酸cg抗体胶乳颗粒试剂反应，出现凝集现象，在反应体系中添加助悬剂，可以使抗原抗体特异性结合反应所产生的凝集微球颗粒不会出现抱团式集结，在助悬剂的作用
下，样本中的肝胆酸cg与超敏化的抗肝胆酸cg抗体胶乳颗粒反应的凝集微球颗粒均匀悬浮在反应液中，最大程度保持在透射比浊检测时吸光度的稳定，而不会发生蛋白质抱团式凝聚，影响检测吸光度变化不稳定、灵敏度低的现象。
附图说明
26.图1为实施例1和对比例1实验对比结果；
27.图2为实施例2和对比例1实验对比结果；
28.图3为实施例3和对比例1实验对比结果；
29.图4为实施例4和对比例1实验对比结果；
30.图5为实施例1
‑
实施例4的重复性标准差对比；
31.图6为实施例1
‑
实施例4的重复性变异系数cv对比。
具体实施方式
32.下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
33.实施例1
34.本实施例所提供的血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，其中，所述r1试剂包括：
[0035][0036]
所述r2试剂包括：
[0037][0038]
实施例2
[0039]
本实施例所提供的血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，其中，所述r1试剂包括：
[0040][0041]
所述r2试剂包括：
[0042][0043]
实施例3
[0044]
本实施例所提供的血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，其中，所述r1试剂包括：
[0045][0046][0047]
所述r2试剂包括：
[0048][0049]
实施例4
[0050]
本实施例所提供的血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，其中，所述r1试剂包括：
[0051][0052]
所述r2试剂包括：
[0053][0054]
实施例5
[0055]
本实施例采用对比例1作为对照(本对比例1采用国家食品药品监督管理局认可的北京九强生物公司的肝胆酸(gg)检测试剂盒)
[0056]
5.1实验方法如下：
[0057]
采用本实施例1
‑
4及对比例1的检测试剂盒制备方法，进行准确度及稳定性性能评价：
[0058]
在实验过程中，采用如下测试方法：
[0059]
在检测过程中以全自动贝克曼au480生化分析仪为例，设置主波长为：600nm；比色杯光径为1.0cm；终点法(end)；上升反应。
[0060]
具体的操作步骤如表1所示，但是表1仅限操作步骤中的一种实例，不限制保护范围。
[0061]
表1测定样本肝胆酸cg含量的检测步骤
[0062][0063]
在测定样本前，需要进行校准和质控程序，使用配套的校准品作校准曲线，本发明的校准曲线如图1所示，采用6点非线性法定标。校准曲线每7天重新制作一次，当发生如下情形时，需要重新校准:试剂批号更换时，仪器更换零部件或者保养时，质控品或样本结果异常时。质控程序:采用配套的质控品，每天进行质控实验；每个浓度质控品重复测量10次，计算精密度cv，控制在质控品偏差范围内。
[0064]
根据校准曲线，计算样本的肝胆酸cg含量：
[0065][0066]
5.2准确度验证：
[0067]
比对试验：参照上述测试方法，收集新鲜的临床样本共40份，所选肝胆酸cg浓度在试剂线性范围内并均匀分布。用实施例1
‑
4与对比例1进行对比实验，计算对比结果的相关系数(r)和直线回归方程，原始数据如表2所示，统计结果如附图1
‑
附图4所示：
[0068]
表2三种实施例试剂盒检测40例样本中的肝胆酸cg含量(mg/l)
[0069][0070]
如附图1
‑
4的统计结构所示，根据线性回归方程：y＝ax b，从三组对比结果的r2可以看出，实施例4与对比例1的对比结果相关性要明显优于实施例1、实施例2、实施例3，说明采用本发明方法实施例4制备的肝胆酸液体双试剂准确度较高。
[0071]
5.3分析灵敏度实验
[0072]
将采用本发明实施例1
‑
4的方法配制的检测试剂进行检测限实验。
[0073]
将待测样本(含被分析物)用混合人血清(含被分析物浓度水平较低)或5％牛血清白蛋白生理盐水溶液进行稀释，使其接近于线性范围(线性范围低限为0.25mg/l)低限浓度水平的样本，要求为5个浓度水平，浓度水平间隔应小于线性范围低限的10％。每个浓度水平重复测定5次。分别稀释出浓度为0.20mg/l、0.22mg/l、0.24mg/l、0.26mg/l、0.28mg/l，根
据实验测试结果记录数据，并分别计算实施例1
‑
4所测结果的sd、cv值，对所测结果进行统计分析，统计分析结果如图5、图6所示。
[0074]
表3采用实施例1的方法配制的试剂灵敏度数据单位(mg/l)
[0075][0076]
表4采用实施例2的方法配制的试剂灵敏度数据单位(mg/l)
[0077][0078]
表5采用实施例3的方法配制的试剂灵敏度数据单位(mg/l)
[0079][0080]
表6采用实施例4的方法配制的试剂灵敏度数据单位(mg/l)
[0081][0082]
由表3
‑
6实验数据及统计分析图5、图6可以看出，采用本发明实施例4方法制得的试剂在线性低限附近测得的实验结果全面由于实施例1
‑
3，它的重复性cv值都小于10％，满足肝胆酸cg检测试剂盒的性能指标。实施例1
‑
3方法制得的试剂只能在浓度较高的水平4
‑
5间才能满足试剂性能的要求，重复性cv小于10％。显然通过以上对比可以得出，加入配比合适的助悬剂可以有效的提高试剂的分析灵敏度，大大提高检测试剂盒对低值检测的准确性。
[0083]
综上性能评价可知，采用本发明实施例4方法配制的肝胆酸cg液体双试剂具有准确度高、灵敏度高的优点，可以满足临床需求，在临床诊断各类肝炎、原发性肝癌、肝硬化、梗阻性肝病、肠
‑
肝循环障碍等各类肝脏疾病有很好的应用价值。
[0084]
本发明的工作原理如下：包被有超敏化的抗肝胆酸抗体胶乳颗粒，与含有肝胆酸抗原的样本混合时，会发生免疫反应(抗原抗体特异性结合)，反应液出现凝集现象，从而使反应液的浊度发生变化，引起吸光度的变化，其大小与样品中肝胆酸抗原含量成正比。将吸光度变化与已知浓度的校准品比较，可以定量计算得出样品中肝胆酸的含量。
[0085]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。