脂肪细胞提取物在修复神经损伤中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种组织提取物，尤其涉及一种从离体的脂肪组织中提取的混合物，对受损神经具有修复作用。


背景技术：

2.创伤、肿瘤、脑血管疾病和代谢异常等各种原因均会致使神经损伤。神经损伤是对累及神经系统的疾病的概括统一性描述，临床常见的引起的急慢性神经损伤性是临床常见疾病，严重危害人类健康，按损伤部位不同可分为中枢和外周神经损伤，。中枢神经损伤主要包括脊髓损伤、中风、脑出血、脑梗、脑瘫及其后遗症等，具有高发病率、致残率和死亡率；外周神经损伤主要包括视神经、面神经、坐骨神经和臂丛神经损伤等。目前对神经损伤的治疗方法主要包括手术治疗、抗炎治疗、去自由基损伤治疗等，然而，目前的治疗手段仍存在手术风险高、操作复杂、亦或药物疗效不确切等问题，尚缺乏有效的治疗药物。


技术实现要素：

3.本发明的一个目的在于提供一种提取物，从离体的脂肪组织中获得，在制备修复神经损伤药物中的应用。
4.本发明的另一个目的在于提供一种组合物，其以从离体的脂肪组织中获得的提取物为活性成分，用于修复神经损伤。
5.本发明的再一个目的在于提供一种医疗器械，其以从离体的脂肪组织中获得的提取物为活性成分，用于修复神经损伤。
6.本发明所称的提取物，应理解为通过分离纯化的手段获得，这些手段如：但不限于萃取、静置分层、离心、层析和结晶等，为水溶性物质。
7.本发明的提取物，是一种从脂肪组织中先通过乳糜化等物理方式破碎，再经分离获得(stem cell res ther.2018，8；9，294)的水溶性物质。
8.本发明的提取物系脱细胞脂肪活性蛋白(cell free fat extract，ceffe)
9.本发明的提取物，由离体脂肪先经乳糜化，再经离心后而得，取其中的液体层。
10.本发明的提取物，由离体脂肪先经乳糜化，再经单次或多次冻融循环(如：冻存于-80℃后于37℃解冻)，最后离心而得，取其中的液体层。
11.分离获得提取物临床上可以应用于修复神经损伤。向提取物中再加入辅料制成液体制剂。或采用冷冻干燥的方法，以有效保存提取物的生物活性，使用前再加入辅料配成组合物(如：制剂)。或与其他的材料，如：生物相容材料或生物可降解材料制成医疗器械，如：敷料或支架。
12.本发明的组合物，以从离体的脂肪组织中获得的提取物为活性成分，还包括各种与所含化合物或组合物相适应的药物辅料，以制成有利于给药(drugdelivery)的剂型，如：但不仅限于水溶液注射剂、粉针剂、丸剂、散剂、片剂、贴剂、栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂和控释剂等。这些药用辅料既可以是各种制剂
中常规使用的，如：但不仅限于等渗剂、缓冲液、矫味剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂等；也可以是为了与所述物质相适应而选择使用的，如：乳化剂、增溶剂、抑菌剂、止痛剂和抗氧剂等，这类辅料能有效提高组合物所含化合物的稳定性和溶解性或改变化合物的释放速率和吸收速率等，从而改善各种化合物在生物体内的代谢，进而增强组合物的给药效果。此外，还可以为实现特定的给药目的或方式，如：缓释给药、控释给药和脉冲给药等，而使用的辅料，如：但不仅限于明胶、白蛋白、壳聚糖、聚醚和聚酯类高分子材料，如：但不仅限于，聚乙二醇、聚氨酯、聚碳酸酯及其共聚物等。所称的“有利于给药”的主要表现有：但不仅限于提高治疗效果、提高生物利用度、降低毒副作用和提高患者顺应性等。
13.在水溶液注射剂中，辅料一般包括等渗剂和缓冲液，以及必要的乳化剂(如： tweeen-80、pluronic和poloxamer等)、增溶剂和抑菌剂等。此外，还包括含有药学上可接受的其它药用辅料，如：抗氧剂、ph调节剂和止痛剂等。
14.用于制取口服液体制剂的辅料一般包括溶剂，以及必要的矫味剂、抑菌剂、乳化剂和着色剂等。
15.用于制取片剂的辅料一般包括填充剂(如：淀粉、糖粉、糊精、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙和甘露醇等)、粘合剂(如：乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶溶液、蔗糖溶液和聚乙烯吡咯烷酮的水溶液或醇溶液等)、崩解剂(如：干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠)和润滑剂(如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇4,000、聚乙二醇6,000和月桂醇硫酸镁等)等。
16.用于制取乳剂的辅料一般为水、油(如：脂肪酸)、乳化剂，以及必要的防腐剂和矫味剂等。
17.用于制取颗粒剂的辅料与片剂类似，但造粒过程不同。根据需要，将制得的颗粒剂与助流剂混合后装入胶囊即得胶囊剂。
18.将本发明的提取物给予受试动物，经证实，ceffe治疗能够有效减轻小鼠脑缺血后脑组织损伤，减轻神经功能损伤与行为学恢复，表明ceffe能够修复神经损伤，具有神经再生作用，表明ceffe对中枢神经损伤性疾病(如：但不限于脊髓损伤、中风、脑出血、脑梗、脑瘫及其后遗症等)或外周神经损伤性疾病(如：但不限于视神经、面神经、坐骨神经和臂丛神经损伤等)等具有治疗作用。
附图说明
19.图1为各组小鼠脑梗死体积统计图。
具体实施方式
20.以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
21.本发明以下实施例所用的各项试验方法具体说明如下：
22.1)离体脂肪组织
23.脂肪组织获取自行常规脂肪抽吸术的健康女性。具体方法如：局部注射肿胀液麻醉后，使用具有大侧孔(2mm
×
7mm)的3mm吸脂抽脂套管连接20ml注射器，人工负压下放射状抽吸，将获得的脂肪直立静止，去除肿胀液后，生理盐水漂洗2-3 遍备用。清洗后的脂肪组织1200g4℃离心3分钟。
24.2)神经功能评分
25.为评价小鼠的平衡，运动和反射能力，采用改良神经功能评分(modifiedneurological severity scores，mnss)法(doi：10.1212/wnl.59.4.514)，对第1天、第 3天、第7天和第14天的小鼠进行评估。严重程度评分等级范围为0到14，其中0 表示正常，较高的评分表示更严重的伤害。
26.3)脑梗死体积计算
27.采用imagej软件画出大脑半球梗塞和非梗塞组织之间的边界，对侧大脑半球体积减去同侧非梗死半球体积＝梗死体积。
28.4)统计分析
29.数据采用spss软件进行成组t检验，对数据差异显著性进行统计分析，结果以平均数
±
标准差表示。
30.实施例1
31.离体脂肪组织于容器内离心后，去除上次油层和下层水层，将中央层脂肪经2 个10ml注射器连接三通管反复匀速推打30次进行机械乳糜化。乳糜化后脂肪冻存于-80℃后于37℃解冻。单次冻融循环后脂肪1200g4℃离心5分钟。离心后脂肪共分为4层，第一层为油层，第二层为残余脂肪组织，第三层为液体层，第四层为细胞/组织碎片。将第一层与第二层弃去，小心吸取液体层，避免底层沉淀污染，将液体经0.22μm滤器过滤除菌，去除细胞碎片，分装冻存于-20℃保存，使用时4℃解冻。
32.实施例2
33.6周龄c57雄性小鼠采用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，分离小鼠颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉及其分支，在颈外动脉壁剪一小切口，从颈外动脉插入一条型号 6-0尼龙缝合线，再将线栓送至颈内动脉，并向上至大脑中动脉，通过使用激光多普勒血流仪(moorinstruments，devon，uk)监测表面脑血流量确定阻塞的成功(降至基线脑血流量的10％)。阻塞1小时后，将线栓从动脉缓慢拔出，将线栓入口结扎，观察脑血流监测仪的血流恢复至100％。实验组造模后即刻(day0)给予尾静脉注射 ceffe治疗(5μl/g体重)，每3日注射一次，共注射5次，空白对照组给予等体积磷酸缓冲盐溶液(pbs，ph7.4)注射，各组样本量均为8例。
34.实施例3
35.本实验采用mnss评分标准对ceffe治疗后小鼠神经运动功能障碍进行评价，结果如表1所示。与pbs相比，ceffe治疗组小鼠在第7天和第14天的神经功能评分显著下降 (p＜0.01，p＜0.05)，说明ceffe治疗能够降低mcao小鼠神经功能评分，有效减轻神经功能损伤。
36.表1各组小鼠mnss评分
[0037][0038]
*
p＜0.05，
**
p＜0.01
[0039]
实施例4
[0040]
为测量小鼠运动功能恢复，于第3天、第7天和第14天对小鼠进行旋转试验，该试验要求老鼠在疲劳转棒仪上保持平衡。动物首先在杆上适应1分钟，然后转杆开始转动并在2分钟内稳定地加速至每分钟40转，记录小鼠在转棒上的保持时间。试验重复3次，结果如表2。
[0041]
ceffe治疗组小鼠第3天、第7天与第14天在疲劳转棒以上运动时间较pbs 组显著延长(p＜0.0001，p＜0.0001，p＜0.01)。表明ceffe能够促进mcao小鼠的行为功能恢复。
[0042]
表2各组小鼠转棒上保持时间
[0043][0044][0045]
*
p＜0.05，
***
p＜0.0001
[0046]
实施例5
[0047]
模型小鼠术后14天经神经行为测试后，采用0.9％生理盐水及4％多聚甲醛溶液灌注，取出脑组织，浸于4％多聚甲醛溶液中过夜，30％蔗糖充分脱水，ocr包埋，将脑组织以20mm厚度冠状位连续切片，使用甲酚紫对切片染色，计算模型小鼠脑梗死体积，结果参见图1。ceffe治疗组小鼠脑梗死体积(infarct volumn)明显低于对照组(p＜0.05)，说明ceffe治疗能够有效减轻脑组织损伤。