大麻二酚在保护皮肤免受紫外线诱导的DNA损伤中的应用的制作方法

大麻二酚在保护皮肤免受紫外线诱导的dna损伤中的应用
技术领域
1.本发明涉及大麻二酚在保护皮肤免受紫外线诱导的光损伤中的应用，具体涉及大麻二酚在防止和/或减轻紫外线诱导的dna损伤中的应用。本发明还涉及用于防止和/或减轻紫外线诱导的dna损伤的含有大麻二酚的药物或化妆品。


背景技术：

2.紫外线(ultraviolet,uv)存在于大自然之中，是一种肉眼看不到的光线，也是一种普遍存在的致癌物质，其对皮肤健康存在威胁。由于过度暴露于uv会引起皮肤细胞凋亡、表皮和真皮异常增生以及炎症细胞浸润，从而引发多种皮肤问题，包括皮肤灼伤、多形性日光疹、红斑狼疮以及皮肤癌等。近90％的皮肤肿瘤与紫外线暴露有关，在世界范围内，因日光性皮肤疾病所产生的经济负担逐年上升。
3.根据波长的不同，uv可以分为uvc(100-280nm)，uvb(280-315nm)和uva(315-400nm)
1.。uvc的波长较短，大部分被臭氧层吸收，一般认为uva和uvb是造成皮肤损伤的主要因素。在日常情况下，皮肤暴露于uva的辐射剂量远大于uvb，但在相同剂量下，uvb对皮肤的生物学影响大于uva，uvb是皮肤急性光损伤以及皮肤肿瘤发生的主要原因
2.。
4.uvb对皮肤细胞具有复杂的作用机制，uvb可以导致细胞dna损伤，短期会引起细胞增殖降低和代谢紊乱，长期暴露会导致细胞突变、衰老和死亡。未修复突变的积累会导致细胞周期停滞以及促进恶性肿瘤的形成。
5.细胞周期分为细胞分裂期(m期)和间期，细胞间期分为g0期、g1期、s期与g2期。按dna含量可将细胞周期划分为3部分，g0/g1期为合成前期，dna含量保持二倍体；s期又称为dna合成期，dna在这一阶段完成复制和组装，dna含量介于二倍体和四倍体之间；g2/m期包括合成后期和有丝分裂期，这一阶段dna保持四倍体。uvb诱导的细胞周期阻滞通常表现为细胞周期g2/m节点功能受损
3.。
6.uvb导致的dna损伤形式主要包括碱基修饰、dna链内和链间交联、dna单链断裂以及dna双链断裂。
7.dna链内交联损伤是uvb所致细胞dna损伤最常见的类型。dna吸收uvb的光子，导致在相邻的嘧啶之间产生共价键。这种共价键可以发生在所有潜在的双嘧啶位点上(cc，ct，tc和tt，其中c是胞嘧啶，t是胸腺嘧啶)，导致形成了两种dna光损伤产物：环丁烷嘧啶二聚体(cyclobutane pyrimidine dimers,cpds)或在较低频率下形成(6，4)光产物(pyrimidine 6-4pyrimidone photoproducts,6-4pps)
4.。cpds是最常见的dna光损伤(占所有uvb辐射诱导dna损伤的70％)，修复相对较慢
5.。uvb辐射产生的cpds主要通过核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,ner)机制去除，然而由于ner的能力有限，急性uvb辐射诱导的所有cpds中约有80％可以相对有效地修复，从而达到稳定水平，而其余20％的cpds较难修复，残留在dna上。残留的cpds会增加基因组的不稳定性，并且干扰dna聚合酶的功能，导致细胞中姐妹染色单体交换(sister chromatid exchange,sce)的发生率增加，细胞复制减慢，抑制细胞增殖活性
6.。
8.dna双链断裂(dna double stranded breaks，dsbs)被认为是dna最严重的损伤。在dsbs发生后，细胞能产生一系列的应激反应，其中一个重要的反应是毛细血管共济失调突变基因起始的信号级联反应，它能使细胞周期停顿直到损伤修复
7.。γh2ax是dsbs敏感的标记。h2ax是组蛋白，可以和dna形成复合物，dsbs会引起h2ax的ser残基迅速被磷酸化(称为γh2ax或ganunah2ax)，募集dna损伤反应蛋白，并在随后的损伤修复过程中发挥着重要的作用。
9.总之，保护皮肤免受uv诱导的dna损伤对维护皮肤健康具有重要意义，但是目前用于减轻紫外线诱导的dna损伤的产品有限，临床可用产品缺乏。
10.大麻花叶提取物中的主要活性成分是大麻素，大麻植物中分离得到的大麻素有四氢次大麻酚(thcv)、大麻二酚(cbd)、次大麻二酚(cbdv)、大麻萜酚(cbg)等。其中大麻二酚作为一种非精神作用类的成分，在抗肿瘤、神经系统保护、免疫调节和抗炎抗氧化等多方面具有药用价值。目前未见大麻二酚在保护皮肤免受uv诱导的dna损伤方面的报道。
11.参考文献
12.[1]grimes d.ultraviolet radiation therapy and uvr dose models.med phys 2015；42(1):440-55.
[0013]
[2]kammeyer a,luiten rm.oxidation events and skin aging.ageing res rev 2015；21:16-29.
[0014]
[3]petrocelli t,slingerland j.uvb induced cell cycle checkpoints in an early stage human melanoma line,wm35.oncogene 2000；19(39):4480-90.
[0015]
[4]pfeifer g,besaratinia a.uv wavelength-dependent dna damage and human non-melanoma and melanoma skin cancer.photochem photobiol sci 2012；11(1):90-7.
[0016]
[5]gyenis a,umlauf d,ujfaludi z,boros i,ye t,tora l.uvb induces a genome-wide acting negative regulatory mechanism that operates at the level of transcription initiation in human cells.plos genet 2014；10(7):e1004483.
[0017]
[6]b
é
rub
é
r,drigeard desgarnier m,douki t,lechasseur a,rochette p.persistence and tolerance of dna damage induced by chronic uvb irradiation of the human genome.j invest dermatol 2018；138(2):405-12.
[0018]
[7]余艳柯,朱心强,杨军.γh2ax的检测方法简介.毒理学杂志2006；20(6):408-10.


技术实现要素：

[0019]
基于现有技术的不足，本发明的目的在于提供大麻二酚在防止和/或减轻紫外线诱导的dna损伤中的应用，即，本发明提供了大麻二酚在制备用于防止和/或减轻紫外线诱导的dna损伤的药物或化妆品中的用途。
[0020]
根据本发明的用途，所述药物或化妆品防止和/或减轻紫外线诱导的细胞周期阻滞作用，进一步地，所述细胞周期为g2/m期。
[0021]
根据本发明的用途，所述药物或化妆品防止和/或减轻紫外线诱导的dna双链断裂损伤，进一步地，所述药物或化妆品减少dna双链断裂损伤标记物γh2ax。
[0022]
根据本发明的用途，所述药物或化妆品防止和/或减轻紫外线诱导的dna链内交联损伤，进一步地，所述药物或化妆品减少dna链内交联产生的环丁烷嘧啶二聚体。
[0023]
本发明的另一目的在于提供大麻二酚在制备用于防止和/或减轻紫外线诱导的皮肤损伤的药物或化妆品中的用途，其中所述皮肤损伤为dna损伤导致的皮肤损伤。
[0024]
根据本发明的用途，上述皮肤损伤包括日晒伤、多形性日光疹、红斑狼疮、慢性光化性皮炎、光老化和皮肤癌等。
[0025]
根据本发明的用途，所述药物或化妆品防止和/或减轻紫外线诱导的细胞周期阻滞作用，进一步地，所述细胞周期为g2/m期。
[0026]
根据本发明的用途，所述药物或化妆品防止和/或减轻紫外线诱导的dna双链断裂损伤，进一步地，所述药物或化妆品减少dna双链断裂损伤标记物γh2ax。
[0027]
根据本发明的用途，所述药物或化妆品防止和/或减轻紫外线诱导的dna链内交联损伤，进一步地，所述药物或化妆品减少dna链内交联产生的环丁烷嘧啶二聚体。
[0028]
本发明的又一目的在于提供大麻二酚在制备用于防止和/或减轻紫外诱导的细胞周期阻滞作用的药物或化妆品中用途，进一步地，所述细胞周期为g2/m期。
[0029]
本发明的又一目的在于提供大麻二酚在制备用于防止和/或减轻dna链内交联损伤的药物或化妆品中的用途。所述药物或化妆品减少dna链内交联损伤产生的环丁烷嘧啶二聚体。进一步地，所述dna链内交联损伤由紫外线照射引起。
[0030]
本发明的又一目的在于提供大麻二酚在制备用于防止和/或减轻dna双链断裂损伤的药物或化妆品中的用途。所述药物或化妆品减少dna双链断裂损伤标记物γh2ax。进一步地，所述dna双链断裂损伤由紫外线照射引起。
[0031]
本发明的又一目的在于提供用于防止和/或减轻紫外线诱导的dna损伤的药物或化妆品，所述药物或化妆品包含大麻二酚。
[0032]
根据本发明的用于防止紫外线诱导的dna损伤的药物，其中所述药物还包含药用辅料，其中所述药用辅料可以为渗透压调节剂、保湿剂、表面活性剂、乳化剂、ph缓冲剂等，其中所述的渗透压调节剂可以是，例如，氯化钠、葡萄糖和/或氯化钾；所述的保湿剂可以是，例如，甜菜碱、吡咯烷酮羧酸、甘油、丙二醇、尿素和/或透明质酸；所述的表面活性剂可以是，例如，泊洛沙姆、吐温和/或司盘；所述乳化剂可以是，例如，卵磷脂、羊毛脂和/或阿拉伯胶；所述的ph缓冲剂可以是，例如，枸橼酸和枸橼酸钠、琥珀酸和琥珀酸二钠，或者磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。
[0033]
根据本发明的用于防止和/或减轻紫外线诱导的dna损伤的药物，其中所述药物可以是喷剂、乳膏、贴剂、洗剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂等形式。
[0034]
根据本发明的用于防止和/或减轻紫外线诱导的dna损伤的化妆品，其中所述化妆品可以是乳液、面霜、面膜、洗剂等形式。
[0035]
发明人发现，大麻二酚对紫外线诱导的dna损伤具有保护作用。进一步地，大麻二酚可减轻紫外线对细胞周期的阻滞作用，减轻紫外线诱导的dna双链断裂损伤，可减少由dna双链断裂损伤产生的γh2ax，以及减轻dna链内交联损伤，可减少dna链内交联损伤产生的环丁烷嘧啶二聚体。
附图说明
[0036]
图1a-1e示出cbd对uvb辐照后的hacat的细胞周期的影响。
[0037]
图2示出cbd对uvb辐照后的hacat的细胞周期影响的统计图。
[0038]
图3a-3d示出cbd对uvb辐照后的hacat的γh2ax的影响。
[0039]
图4示出cbd对uvb辐照后的hacat的cpds的影响。
具体实施方式
[0040]
下面提供实验实施例以进一步说明大麻二酚在防止和/或减轻紫外线诱导的dna损伤中的应用。
[0041]
1.实验材料
[0042]
人永生化角质形成细胞(human immortalized keratinocyte，hacat)购买自协和国家细胞共享平台；
[0043]
大麻二酚(cannabidiol，cbd)由云南汉盟制药有限公司提供，纯度≥99％。
[0044]
其他主要试剂及设备信息如下表1所示：
[0045]
表1其他主要试剂及设备信息
[0046][0047]
2.实验方法及结果
[0048]
2.1细胞复苏及传代
[0049]
细胞复苏：将冻存的hacat细胞取出后放入37℃温水锅中，快速复温至融化。将细胞悬液转移至离心管，加2ml dmem高糖培养基(含10％胎牛血清和1％100u/ml青霉素 0.1mg/ml链霉素，以下简称培养基)，按800rpm速度离心5分钟，弃上清，加5ml培养基重悬，转移至25mm2细胞培养瓶中，放置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养。
[0050]
细胞传代：待hacat融合到80％时，吸弃细胞培养瓶中原有培养基，加2ml pbs轻柔冲洗掉剩余含血清培养基，加入2ml含edta的0.25％的胰酶，放于细胞培养箱中消化约6分钟，显微镜下观察到细胞变圆开始脱落，加4ml培养基终止消化，反复轻柔吹打使贴壁细胞
脱落，按800rpm速度离心5分钟，弃上清，用2ml培养基重悬，按1：5的比例稀释细胞浓度后接种至新的培养瓶，再加入培养基至总体积为5ml，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养。选择生长旺盛，状态良好的细胞用于后续实验。
[0051]
2.2皮肤hacat光损伤模型建立
[0052]
使用含4个uvb荧光灯的sh4型紫外线光疗仪进行辐照，光源的波峰为311nm。实验前开启紫外线光疗仪，预热20分钟，以紫外辐照计测得固定位置的uvb辐照强度为0.825mw/cm2，uvb剂量(mj/cm2)＝uvb辐照强度(mw/cm2)
×
时间(s)。将实验孔板中培养基吸尽，沿侧壁轻柔加入适量pbs清洗1次，再加入少量pbs使其恰好完全覆盖细胞，避免实验过程中细胞脱水。用锡箔纸覆盖正常对照组(以下简称为正常组)，根据实验采用的uvb剂量计算辐照时间，uvb辐照时将孔板置于厚纱布包裹的冰袋上，避免过热。
[0053]
2.3流式细胞术pi/rnase检测细胞周期
[0054]
将hacat细胞以2
×
105细胞/孔均匀接种于6孔板，培养至细胞贴壁且密度达到80％时开始实验。弃培养基，并用pbs洗涤细胞一次，用pbs薄层覆盖(对于6孔板，每孔加入500μl)，并以80mj/cm2的uvb剂量辐照，正常组不进行uvb照射。辐照结束后吸去pbs，根据实验分组分别加入含有0.1％dmso或不同浓度药物的新鲜培养基，分组为：正常组、模型组(即，uvb辐照组)、uvb cbd组(4、8、16μmol/l)，继续孵育24小时后进行检测。重复三组平行样。
[0055]
倒去孔板中的培养基，用pbs轻轻摇洗2次，常规消化离心收集细胞，pbs洗1次，加入70％乙醇(4℃预冷)，轻轻吹打混匀，使细胞分散不成团，4℃过夜；将固定好的细胞按1200rpm离心5分钟，pbs洗2次，离心转速为3000rpm；加入500μl pi/rnase染色液(来自细胞周期检测试剂盒)，室温静置30分钟，用孔径70微米的过滤器过滤，流式细胞仪上机检测。
[0056]
实验结果：cbd对uvb辐照后的hacat的细胞周期的影响
[0057]
如图1a-1e所示，正常组细胞主要分布于g0/g1期；uvb辐照后(模型组)细胞分布于g2/m期比例增多，g0/g1期比例降低，阻滞在g2/m期；4、8、16μmol/l cbd作用后，g2/m期比例较模型组均降低，g0/g1期比例均升高。16μmol/l cbd作用组和模型组相比，g2/m期比例变化具有统计学意义，cbd对uvb辐照后的hacat的细胞周期影响的统计图如图2所示，**p<0.01vs模型组。
[0058]
2.4流式细胞术γh2ax检测dna双链损伤
[0059]
细胞收集固定同步骤2.3。固定好的细胞离心沉淀，离心1200rpm，5min，pbs洗2次，加50μl perm缓冲液(来自foxp3 fix/perm buffer)，加2μl的γh2ax抗体(来自fitc anti-h2ax phospho(ser139))，孵育1h，pbs洗一次，加500μl pi/rnase染色液(来自细胞周期检测试剂盒)，室温静置30分钟，用孔径70微米的过滤器过滤去除细胞团块，流式细胞仪上机检测。
[0060]
实验结果：cbd对uvb辐照后的hacat的dna双链损伤的影响
[0061]
cbd能抑制uvb辐照hacat产生的γh2ax。
[0062]
如图3a-3d所示，uvb辐照会导致γh2ax显著升高，8和16μmol/l浓度的cbd能降低细胞内γh2ax含量，特别是位于g0/g1和g2/m期的细胞。*p<0.05vs模型组，***p<0.0001vs模型组。
[0063]
2.5 elisa法检测dna链内交联损伤指标cpds
[0064]
将hacat细胞以2
×
105细胞/孔均匀接种于6孔板，培养至细胞贴壁且密度达到80％时开始实验。弃培养基，并用pbs洗涤细胞一次，用pbs薄层覆盖(对于6孔板，每孔加入500μl)，并以80mj/cm2的uvb剂量辐照，正常组不进行uvb照射。辐照结束后吸去pbs，根据实验分组分别加入含有0.1％dmso或不同浓度药物的新鲜培养基，分组为：正常组、模型组、uvb cbd组(4、8、16μmol/l)。
[0065]
孵育24小时后收集细胞，按dna基因组提取试剂盒说明书提取各组dna，用nanodrop微量分光光度计定量各组dna含量，用pbs将各组dna稀释为0.2μg/ml，置于-20℃冻存。
[0066]
参照anti-cyclobutane pyrimidine dimers说明书的建议，通过elisa检测cpds。将96孔的酶标板用0.003％硫酸鱼精蛋白包埋，清洗烘干，避光存放。将相同浓度的dna样品在100℃下变性10分钟，在冰浴中迅速冷却15分钟，按照50μl/孔的量加入酶标板，每组设置3个复孔，放在37℃下干燥过夜。取出酶标板每孔加入150μl pbst，通过拍打洗涤5次；加入2％胎牛血清在37℃孵育30分钟，防止非特异性抗体结合，洗涤；加入1：1000稀释的cpds抗体(anti-cyclobutane pyrimidine dimers)在37℃孵育30分钟，洗涤，去除多余cpds抗体；加入hrp标记的山羊抗鼠二抗在37℃孵育30分钟，洗涤；每孔加入100μl底物显色液，在37℃孵育30分钟；每孔加入50μl终止液，孵育10分钟后，在多功能酶标仪450nm处测各孔吸光度值。
[0067]
实验结果：cbd对uvb辐照后的hacat的dna链内交联损伤的影响
[0068]
不同浓度cbd均能显著抑制uvb辐照hacat产生的cpds。如图4所示，正常组cpds显著低于模型组(p<0.001)，4、8、16μmol/l cbd均能降低光损伤细胞中cpds的含量。*p<0.05vs模型组，**p<0.01vs模型组，***p<0.0001vs模型组。