一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法与流程

1.本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法。


背景技术：

2.肌肉生长抑制素基因(myostatins,mstn)是一种抑制肌肉细胞增殖生长的负调控基因，属于tgf
‑
β家族成员，故又称为gdf
‑
8。研究表明，该基因表达的抑制或突变失活，能阻断mstn对肌细胞增殖生长的抑制作用，引起广泛的肌肉增殖并显著降低体表脂肪的沉积，产生以肌纤维数量显著增加、体重显著增大为特征的肌肥大现象，即所谓的“双肌性状”。
3.制备mstn基因工程疫苗并用该疫苗进行免疫，然后利用自身的免疫系统长期生产抗mstn的抗体，该抗体完全具有专门结合和抑制mstn的能力，从而能够解除mstn对肌细胞生长的抑制作用。目前，关于利用mstn进行主动免疫的方法主要集中在畜牧业，如牛、羊、猪等，在水产领域中，尤其是斜带石斑鱼的养殖中很少有关于mstn的报道。


技术实现要素：

4.本发明克服了现有技术的不足，提供一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法。
5.为达到上述目的，本发明采用的一种技术方案为：一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.s1外源基因设计：外源基因为“kozak序列
‑
乙型脑炎病毒信号肽
‑
乙型肝炎病毒表面核心抗原
‑
ss
‑
ss
‑
th表位
‑
linker连接序列
‑
斜带石斑鱼mstn成熟肽基因序列”，将其合成并克隆至t载；
7.s2酶切：采用takara nhe i和xho i酶在37℃分别对s1中的重组质粒和pcdna3.1 载体进行双酶切，然后使用dna片段纯化试剂盒进行片段回收；
8.s3连接反应：通过t4 dna连接酶连接将s2中的载体片段和外源基因片段，反应体系在16℃下连接8h；
9.s4转化：将jm109感受态细胞从
‑
80℃超低温冰箱中取出，置于冰上溶解后，将s3中的接连产物加入，然后加入不含抗性的lb液体培养基，然后生化箱中培养，再进行pcr验证，获得阳性菌种；
10.s5质粒的大量培养及纯化：将s5中获得的阳性菌种在含有相应抗性的lb液体培养基中培养，然后在溶菌酶的作用下获得质粒溶液，质粒溶液加入纯化仪，得到纯化的质粒溶液；
11.s6质粒浓缩：s5中获得的质粒浓度为500ng/μl，对质粒进行浓缩后，将浓度分别调整为500ng/μl、1000ng/μl、2000ng/μl后于
‑
80℃保存，获得mstn自体核酸疫苗。
12.在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，外源基因的重组质粒和载体双酶切体系包括：1.0μl nhe i，1.0μl xho i，≤2.0μg基因/质粒，2.0μl 10
×
buffer，不超过20.0
μl ddh20，20.0μl total volume。在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，s2中使用dna片段纯化试剂盒进行片段回收的方法包括以下步骤：
13.s201向pcr反应液中加入3倍体积的buffer dc，然后均匀混合；
14.s202将试剂盒中的spin column安置于collection tube上；
15.s203将s201的溶液转移至spin column中，12000rpm、室温的状态下离心1min，弃滤液；
16.s204将700μl的buffer wb加入spin column中，12000rpm、室温的状态下离心30s，弃滤液；
17.s205重复操作步骤s204；
18.s206将spin column安置于collection tube上，12000rpm、室温的状态下离心1min；
19.s207取新的1.5ml的离心管并将spin column安置于上，在spin column膜的中央处加入30μl左右的elution buffer，室温静置1min；
20.s208 12000rpm、室温的状态下离心1min洗脱dna。
21.在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，s3中接连反应的反应体系如下：6.0μl外源基因片段，6.0μl载体片段，1.0μl t4 dna连接酶，1.0μl 10
×
t4 dna ligation buffer，10.0μl total volume。
22.在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，s4转化过程中包括以下步骤：
23.s401将jm109感受态细胞从
‑
80℃超低温冰箱中取出，置于冰上溶解后将上述10μl连接产物全部加入，用移液枪吹打几次；
24.s402冰上孵育45min左右，然后转移至42℃水浴锅热激90s后立即停止取出，冰上静置10min；
25.s403加入不含抗性的lb液体培养基400μl，在37℃，200rpm的摇床振荡培养60min；
26.s404 4000rpm，离心5min后取出，弃掉上层液体，留下100μl左右液体，用移液枪吹打均匀；
27.s405将上述100μl液体均匀滴到含有抗性的平板上，用涂布棒将液体涂抹分散，涂布棒在使用前必须高温灭菌，并待温度低至室温方可使用，此过程全部在超净台中操作；
28.s406将平板置于37℃生化培养箱，正面放置1h，然后倒置过夜；
29.s407挑选平板上的单个白色菌落，加入装有含抗性的1ml lb液体培养基的1.5ml离心管中，用移液枪吹打数次，在200rpm，37℃条件下震荡培养。
30.s408 3
‑
4h后，取上述培养菌液进行pcr验证；
31.s409将上述反应产物进行核酸凝胶电泳，挑选电泳结果为阳性的菌液。
32.在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，s408中的反应体系包括：5.0μl pcr mix，3.5μl primer f/r，1.0μl菌液，0.5μl ddh2o，11.0μl total volume，反应程序：94℃3min；35cycles：94℃30s；55℃1min；72℃10min，4℃无限。
33.在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，s5质粒的大量培养及纯化的步骤包括：
34.s501将阳性菌接种到6l含有相应抗性的lb液体培养基中，于37℃，200rpm摇床过夜培养；
35.s502将过夜培养的菌液分装到6个50ml离心管中，4000g离心10min，弃上清；
36.s503向每管的沉淀物中加入solutionⅰ40ml，剧烈震荡直到沉淀完全溶解，分装到200ml玻璃瓶中；
37.s504向每个玻璃瓶加入4ml的溶菌酶溶液，轻轻混匀；
38.s505取solutionⅱ80ml加入到广口瓶中，拿起玻璃瓶轻轻的快速颠倒数次以混合内容物，摇晃后放置在冰水中冰浴30min；
39.s506待溶液清亮，加入solutionⅲ，轻轻摇晃，此时产生大量絮状沉淀；
40.s507置于冰水中冰浴10min，在8层纱布上进行过滤，取全部清夜；
41.s508洗涤中空纤维过滤系统akta flux：打开akta flux，先用50ml 0.5mol/l naoh洗涤仪器，接着再加入50ml 10％酒精洗涤，最后加入50ml纯水洗涤；
42.s509使用筛孔cfp
‑4‑
e
‑
2u，将得到的质粒溶液加入纯化仪，设置参数为mixer 40，feed 50纯化，将纯化得到的溶液全部保存；
43.s510再次洗涤机器如上s508步骤；
44.s511将筛孔换成ufp
‑
300
‑
c
‑
2u，同样设置参数为mixer 40，feed50，继续纯化s510得到的溶液，将溶液纯化到原来量的一半，将所得质粒溶液保存。
45.在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，s6中质粒浓缩的步骤包括：
46.s601加入一定体积的质粒溶液，再加入质粒溶液体积1/10的乙酸钠于质粒溶液中充分混匀，乙酸钠的浓度为3mol/l，ph＝5.2，使其最终浓度为0.3mol/l；
47.s602加入2倍质粒溶液体积的冰上预冷无水乙醇，再次混匀，于
‑
20℃的环境中静止20min；
48.s603室温下12000g离心10min，小心移除上清液，吸去壁管上所有的液滴；
49.s604加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2min，小心移除上清液，吸去壁管上所有的液滴；
50.s605于室温下将开盖的离心管置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；
51.s606加适量的去离子水溶解质粒沉淀；
52.s607测得浓缩后质粒浓度，将浓度分别调整为500ng/μl、1000ng/μl、2000ng/μl后于
‑
80℃保存。
53.在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，mstn自体基因疫苗用于斜带石斑鱼进行免疫。
54.本发明解决了背景技术中存在的缺陷，本发明具备以下有益效果：
55.(1)本技术的疫苗构建技术路线简单有效，可操作性强，并且疫苗的免疫效果较好。
56.(2)经过本技术制备的mstn自体基因疫苗对斜带石斑鱼进行免疫后，注射剂量为200μg的实验组与对照组的增长速度和增重率存在显著性差异，注射剂量为100μg的实验组与对照组的增重速度存在显著性差异；在第三次注射至取样期间，注射剂量为100μg的实验组与对照组的增长速度和增重速度均存在显著性差异。
57.(3)本技术中将斜带石斑鱼的肌肉制成石蜡切片并进行he染色，显微镜下拍照(a、b、c、d)。通过adobe photoshop cs6软件进行图片处理，计算对照组与三个实验组单个肌纤维平均相对横截面积，发现与对照组相比，总体而言实验组平均肌纤维相对横截面积均大
于对照组，且随着实验组免疫剂量的增加，平均肌纤维相对横截面积增大，通过统计分析发现，对比对照组，注射剂量为100μg和200μg的实验组存在显著性。
58.(4)本技术中对养殖结束后的实验鱼进行肌肉取样，提取组织rna并反转录制成cdna模板。通过rt
‑
qpcr检测smad3、myod、myog、p21和mrf4等mstn信号通路下游及相关基因的表达量。免疫mstn自体核酸疫苗后，与对照组相比，三个剂量实验组的smad3和mrf4的mrna表达量均呈下降趋势，经过统计学分析，其中当剂量为50μg和100μg时smad3并不存在显著性差异，当剂量为200μg时差异显著，当剂量为50μgmrf4并不存在显著性差异，当剂量为100μg和200μg时差异显著；myod、myog和p21的mrna表达量均呈上升趋势，但均在剂量为200μg时才存在显著性差异。
附图说明
59.下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；
60.图1斜带石斑鱼体长增长速度图；
61.图2斜带石斑鱼体长增长率图；
62.图3斜带石斑鱼体重增重速度图；
63.图4斜带石斑鱼体重增重率图；
64.图5对照组肌纤维石蜡切片he染色；
65.图6免疫50μg组肌纤维石蜡切片he染色；
66.图7免疫100μg组肌纤维石蜡切片he染色；
67.图8免疫200μg组肌纤维石蜡切片he染色图；
68.图9单个肌纤维的平均相对面积图；
69.图10 smad3的表达量图；
70.图11 p21的表达量图；
71.图12 myog的表达量图；
72.图13 myod的表达量图；
73.图14 mrf4的表达量图。
具体实施方式
74.现在结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
75.实施例1：本实施例中公开了一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法，具体步骤如下：
76.一、方案设计：
77.(1)外源基因设计：kozak序列
‑
乙型脑炎病毒信号肽
‑
乙型肝炎病毒表面核心抗原
‑
ss
‑
ss
‑
th表位
‑
linker连接序列
‑
鱼mstn成熟肽基因序列。
78.(2)设计说明：
79.①
添加kozak序列是pcdna3.1 载体说明书中要求的，可以提高外源蛋白的表达；
80.②
添加乙型脑炎病毒信号肽是为了正确引导外源蛋白，提高蛋白生物学效率；
81.③
添加th(辅助性t细胞)表位于乙肝表面核心抗原基因内部，是为了提高蛋白的免疫原性；之所以放在内部是参考了其它文献；
82.④
添加乙肝表面核心抗原基因是为了使mstn成熟肽外源性，因为鱼体免疫系统只能识别非自身的蛋白并产生抗体，若不添加乙型脑炎病毒核心抗原只有mstn成熟肽基因的话，是不可能激发免疫系统产生抗体的；
83.⑤
添加ss(生长抑素)基因是因为ss和mstn都是抑制肌肉生长的基因；
84.⑥
添加
‑
linker连接序列是因为乙肝表面核心抗原蛋白如果和mstn成熟肽蛋白紧紧的连接在一起，可能会影响mstn成熟肽蛋白的生物学功能，就如同两个人并排走路，需要相隔一定的距离才能走好，如果把两个人的手脚绑在一起，就很难行走。所以添加一个人畜无害的连接序列及连接了两个蛋白在一起，又给两个蛋白一定的空间去发挥各自的生物学功能。
85.⑦
整个外源基因串联在一起后，需要对密码子优化，以达到在鱼体内表达最优的目的，以提高表达量。
86.(3)将外源基因“外源信号肽 乙肝病毒表面核心抗原 mstn成熟肽”交上海生工合成后，克隆至pcdna3.1 载体，最终得到重组质粒以及阳性菌。
87.二、酶切与片段回收
88.(1)双酶切：采用takara nhe i和xho i酶按如下体系在37℃分别对外源基因重组质粒和载体进行双酶切：
89.表1外源基因重组质粒和载体双酶切体系
[0090][0091]
(2)片段回收使用dna片段纯化试剂盒(takara)，按照说明书操作如下：
[0092]
①
向pcr反应液(或其它酶促反应液)中加入3倍体积的buffer dc(如果需加入的buffer dc量不足100μl时应加入100μl)，然后均匀混合；
[0093]
②
将试剂盒中的spin column安置于collection tube上；
[0094]
③
将上述操作
①
的溶液转移至spin column中，12000rpm、室温的状态下离心1min，弃滤液；
[0095]
④
将700μl的buffer wb加入spin column中，12000rpm、室温的状态下离心30s，弃滤液；
[0096]
⑤
重复操作步骤
④
；
[0097]
⑥
将spin column安置于collection tube上，12000rpm、室温的状态下离心1min；
[0098]
⑦
取新的1.5ml的离心管并将spin column安置于上，在spin column膜的中央处加入30μl左右的elution buffer，室温静置1min(注：将elution buffer加热至60℃使用)；
[0099]
⑧
12000rpm、室温的状态下离心1min洗脱dna。
[0100]
三、连接反应
[0101]
通过t4 dna连接酶连接将上述载体片段和外源基因片段，连接体系按照t4 dna连接酶说明书进行，如下表配制反应体系并在16℃连接8h：
[0102]
表2 mstn和载体连接反应体系
[0103][0104][0105]
四、转化
[0106]
(1)jm109感受态细胞从
‑
80℃超低温冰箱中取出，置于冰上溶解后将上述10μl连接产物全部加入，用移液枪吹打几次；
[0107]
(2)冰上孵育45min左右，然后转移至42℃水浴锅热激90s后立即停止取出，冰上静置10min；
[0108]
(3)加入不含抗性的lb液体培养基400μl，在37℃，200rpm的摇床振荡培养60min(进行此步时将超净台紫外打开，将含有抗性的平板在生化箱预热)；
[0109]
(4)4000rpm，离心5min后取出，弃掉上层液体，留下100μl左右液体，用移液枪吹打均匀；
[0110]
(5)将上述100μl液体均匀滴到含有抗性的平板上，用涂布棒将液体涂抹分散，涂布棒在使用前必须高温灭菌，并待温度低至室温方可使用，此过程全部在超净台中操作；
[0111]
(6)将平板置于37℃生化培养箱，正面放置1h，然后倒置过夜；
[0112]
(7)挑选平板上的单个白色菌落，加入装有含抗性的1ml lb液体培养基的1.5ml离心管中，用移液枪吹打数次，在200rpm，37℃条件下震荡培养。
[0113]
(8)3
‑
4h后，取上述培养菌液进行pcr验证，反应体系如下：
[0114]
表3菌液验证反应体系
[0115][0116]
(9)反应程序：94℃3min；35cycles：94℃30s；55℃1min；72℃10min，4℃无限。
[0117]
(10)将上述反应产物进行核酸凝胶电泳，挑选电泳结果为阳性的菌液送至测序。
[0118]
五、质粒的大量培养及纯化
[0119]
(1)将阳性菌接种到6l含有相应抗性的lb液体培养基中，于37℃，200rpm摇床过夜培养；
[0120]
(2)将过夜培养的菌液分装到6个50ml离心管中，4000g离心10min，弃上清；
[0121]
(3)向每管的沉淀物中加入solutionⅰ40ml，剧烈震荡直到沉淀完全溶解，分装到200ml玻璃瓶中；
[0122]
(4)向每个玻璃瓶加入4ml的溶菌酶溶液，轻轻混匀；
[0123]
(5)取solutionⅱ80ml加入到广口瓶中，拿起玻璃瓶轻轻的快速颠倒数次以混合内容物，摇晃后放置在冰水中冰浴30min；
[0124]
(6)待溶液清亮，加入solutionⅲ，轻轻摇晃，此时产生大量絮状沉淀；
[0125]
(7)置于冰水中冰浴10min，在8层纱布上进行过滤，取全部清夜。
[0126]
(8)洗涤中空纤维过滤系统akta flux：打开akta flux，先用50ml naoh(0.5mol/l)洗涤仪器，接着再加入50ml 10％酒精洗涤，最后加入50ml纯水洗涤。
[0127]
(9)使用筛孔cfp
‑4‑
e
‑
2u，将得到的质粒溶液加入纯化仪，设置参数为(mixer 40，feed 50)。纯化，将纯化得到的溶液全部保存。
[0128]
(10)再次洗涤机器如上(8)步骤。
[0129]
(11)将筛孔换成ufp
‑
300
‑
c
‑
2u，同样设置参数为(mixer 40，feed 50)。继续纯化刚刚得到的溶液，将溶液纯化到原来量的一半，将所得质粒溶液保存。
[0130]
六、质粒浓缩
[0131]
测得提取的质粒浓度均在500ng/μl左右，为了达到所需质粒浓度，对质粒进行浓缩。浓缩方法如下：
[0132]
(1)加入一定体积的质粒溶液，再加入质粒溶液体积1/10的乙酸钠(3mol/l，ph＝5.2)于质粒溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3mol/l；
[0133]
(2)加入2倍质粒溶液体积的冰上预冷无水乙醇，再次混匀，于
‑
20℃的环境中静止20min；
[0134]
(3)室温下12000g离心10min，小心移除上清液，吸去壁管上所有的液滴；
[0135]
(4)加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2min，小心移除上清液，吸去壁管上所有的液滴；
[0136]
(5)于室温下将开盖的离心管置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；
[0137]
(6)加适量的去离子水溶解质粒沉淀；
[0138]
(7)测得浓缩后质粒浓度，将浓度分别调整为500ng/μl、1000ng/μl、2000ng/μl后于
‑
80℃保存。
[0139]
获得500ng/μl、1000ng/μl、2000ng/μl mstn自体基因疫苗。
[0140]
实施例二：免疫
[0141]
取体长13cm左右的斜带石斑鱼180尾，如下表进行分组及免疫，其中每组分3个平行，每个平行15尾鱼苗，注射体积为100μl：
[0142]
表4
[0143]
分组浓度(ng/μl)实验组
①
500实验组
②
1000实验组
③
2000对照组生理盐水
[0144]
每组免疫3次，每次免疫时间间隔2周，第三次免疫后养殖3
‑
4周后取样。
[0145]
一、mstn自体核酸疫苗对斜带石斑鱼体重体长的影响研究
[0146]
(1)期间每次免疫时称重、测量全长；
[0147]
(2)最后一次免疫3
‑
4周后称重、测量全长，绘制生长曲线。
[0148]
其结果如图1
‑
4中所示，对于检测mstn核酸疫苗的效用来说，体重与体长的变化是最显著直观的。第一次免疫到第二次免疫期间，与对照组相比，三个实验组斜带石斑鱼体重和体长并无明显变化；在第二次免疫到第三次免疫、第三次面议到取样期间，与对照组相比，三个实验组斜带石斑鱼体重体长的增长/重速度和增长/重率总体上呈现随注射剂量增加而上升的趋势，经过统计学分析，在第二次注射到第三次注射期间，注射剂量为200μg的实验组与对照组的增长速度和增重率存在显著性差异，注射剂量为100μg的实验组与对照组的增重速度存在显著性差异；在第三次注射至取样期间，注射剂量为100μg的实验组与对照组的增长速度和增重速度均存在显著性差异。
[0149]
二、mstn自体核酸疫苗对斜带石斑鱼肌肉组织的影响研究
[0150]
1.鱼体组织样品采集
[0151]
第三次免疫后养殖3
‑
4周后对每组实验鱼用丁香酚麻醉，进行肌肉组织取样，组织块大小大约5mm
×
5mm
×
2mm左右。
[0152]
2.样品固定与包埋
[0153]
(1)将切好的组织块立刻放入4％多聚甲醛中固定24h；
[0154]
(2)组织块依次经过75％、75％、85％、95％、95％、100％、100％各级乙醇溶液脱水，各0.5h；
[0155]
(3)无水乙醇、二甲苯等量混合液2h，二甲苯、二甲苯各0.5h；
[0156]
(4)将石蜡加热至56℃融化，对组织块进行包埋。
[0157]
3.切片、展片与烤片
[0158]
(1)将包埋好的石蜡块修整，夹在切片机的夹物台上；
[0159]
(2)将刀片固定在刀夹上，刀口朝外；
[0160]
(3)推动螺旋，将刀片靠近石蜡块，但不能超过刀口，调整刀片与石蜡块之间的位置和角度，大约15
°
左右；
[0161]
(4)调整厚度调节器至切出的条带大约4
‑
10μm；
[0162]
(5)摇动转轮，将石蜡块切成蜡带，用毛笔将蜡带挑起，持续摇动转轮切片；
[0163]
(6)蜡带长度至7
‑
8cm时将蜡带挑断，放到56℃的水浴锅中展平；
[0164]
(7)将展平的蜡带贴在载玻片上，放在45℃恒温箱中烘干。
[0165]
4.he染色
[0166]
(1)使用二甲苯脱蜡，第一次5min，第二次10min，
[0167]
(2)无水乙醇、二甲苯按1:1的比例，5min；无水乙醇3min；95％酒精3min；80％酒精3min；70％酒精3min；50％酒精3min；
[0168]
(3)使用苏木精染料进行染色3min；
[0169]
(4)流水稍洗去染料10min；
[0170]
(5)再用0.5％盐酸乙醇进行分化5s，然后水洗去多余染料10min；
[0171]
(6)脱水：95％酒精2min；50％酒精2min；70％酒精2min；80％酒精2min；95％酒精2min；
[0172]
(7)伊红液染色20s，染色完成后放入95％酒精冲洗两次；
[0173]
(8)脱水：95％酒精2min；无水乙醇2min；
[0174]
(9)透明，封片：无水乙醇和二甲苯按1:1的比例进行透明2min；二甲苯2min；第二次二甲苯2min；
[0175]
(10)用树脂进行封片，自然风干。
[0176]
5.切片观察与计算
[0177]
将切片置于显微镜下进行观察与拍照，通过软件计算肌纤维横截面面积。
[0178]
如图5
‑
8所示，将斜带石斑鱼的肌肉制成石蜡切片并进行he染色，显微镜下拍照(a、b、c、d)。通过adobe photoshop cs6软件进行图片处理，计算对照组与三个实验组单个肌纤维平均相对横截面积，如图9所示，发现与对照组相比，总体而言实验组平均肌纤维相对横截面积均大于对照组，且随着实验组免疫剂量的增加，平均肌纤维相对横截面积增大，通过统计分析发现，对比对照组，注射剂量为100μg和200μg的实验组存在显著性(e)。
[0179]
三、mstn自体核酸疫苗对斜带石斑鱼mstn信号通路下游及相关基因的影响研究
[0180]
1.鱼体组织样品采集
[0181]
每组免疫3次，每次间隔2周，第三次免疫后养殖3
‑
4周后取样，采集肌肉组织样品。
[0182]
2.总rna提取
[0183]
(1)所有剪刀、镊子用75％乙醇消毒后用锡箔纸包好，高压灭菌锅灭菌，所用rna枪头用全新盒装枪头，高速离心机开4℃预冷。
[0184]
(2)将样品从
‑
80℃冰箱取出，置于冰上解冻，取rnase
‑
free 1.5ml离心管并加入600μl reagent试剂(invitrogen)，然后将样品放入其中，用研磨棒粉碎样品组织块，后加入400μl reagent试剂(invitrogen)补足至1ml，混匀后室温静置5min。
[0185]
(3)加入200μl氯仿，震荡机上震荡混匀，室温静置15min。
[0186]
(4)12000rpm、4℃的状态下离心15min，吸取上清至新的rnase
‑
free 1.5ml离心管中，注意不要吸到白色沉淀。
[0187]
(5)加入500μl异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min。
[0188]
(6)12000rpm、4℃的状态下离心10min，弃上清，加入1ml用depc灭菌水配制的75％乙醇后混匀，冰上静置3
‑
5min。
[0189]
(7)12000rpm、4℃的状态下5min，弃上清溶液，将多余液体吸出，注意不吸到rna沉淀，在超净台开盖，室温下干燥3
‑
5min。
[0190]
(8)根据rnase
‑
free 1.5ml离心管中rna沉淀的量，用50μl左右的depc灭菌水溶解沉淀的rna。
[0191]
(9)测量溶解后的rna浓度，若od 260/280值大于1.8且小于2.0，证明提取的rna质量合格，可以进行后续实验。
[0192]
(10)凝胶电泳进一步检测提取的rna质量，170v的电压下20min，结束后将核酸胶放入成像系统，若电泳图像为3条带，且28s条带最亮，18s条带稍暗，5s条带最暗，证明提取的rna质量合格，可以进行后续实验；
[0193]
(11)rna保存在
‑
80℃低温冰箱。
[0194]
3.cdna的合成
[0195]
cdna的合成使用逆转录revertra qpcr rt kit(toyobo)试剂盒，按照说明书操作如下：
[0196]
(1)取1μg rna于pcr管中，65℃水浴变性5min，冰浴5min；
[0197]
(2)按下表配制反转录体系：
[0198]
表5r na反转录体系
[0199][0200]
(3)反应程序：37℃，25min；98℃，5min；4℃，无限；
[0201]
(4)合成的cdna于
‑
80℃保存备用。
[0202]
4.实时荧光定量pcr
[0203]
(1)rt
‑
qpcr使用green realtime pcr master mix(toyobo)试剂盒，按照说明书操作如下表：
[0204]
表6荧光定量pcr体系
[0205][0206][0207]
(2)反应程序：applied biosystems quantstudio 5 real
‑
time pcr system(thermofish，usa)，按照上表所示反应体系，向384孔板中避光加入各试剂后混匀，离心15
‑
20s，接下来在thermo fisher quanstudio 5实时荧光定量pcr仪器开始pcr反应，反应程序设置为第一步：95℃，10min；第二步：95℃，15s；第三步：55℃，15s；第四步：72℃，20s(第二步至第四步循环40次)。
[0208]
5.数据处理与统计分析
[0209]
实验数据通过graphpad prism 7.0软件采用one
‑
way anova单因素方差分析方法进行显著性分析。且当p<0.05时表示差异显著，用*表示；当p<0.01时表示差异极显著，用**表示；当p<0.001时表示差异极其显著，用***表示。
[0210]
亚细胞定位图像通过adobe photoshop cs6软件进行处理。肌纤维细胞横截面图像通过adobe photoshop cs6软件计算单个肌纤维相对横截面面积，计算公式：
[0211][0212]
然后通过graphpad prism 7.0软件进行统计学分析。流式细胞仪采用flowjo软件进行图像分析。
[0213]
对养殖结束后的实验鱼进行肌肉取样，提取组织rna并反转录制成cdna模板。通过rt
‑
qpcr检测smad3、myod、myog、p21和mrf4等mstn信号通路下游及相关基因的表达量。结果如图10
‑
14所示，免疫mstn自体核酸疫苗后，与对照组相比，三个剂量实验组的smad3和mrf4的mrna表达量均呈下降趋势，经过统计学分析，其中当剂量为50μg和100μg时smad3并不存在显著性差异，当剂量为200μg时差异显著，当剂量为50μg mrf4并不存在显著性差异，当剂量为100μg和200μg时差异显著；myod、myog和p21的mrna表达量均呈上升趋势，但均在剂量为200μg时才存在显著性差异。
[0214]
以上依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关人员完全可以
在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定技术性范围。