一种从柑橘中提取橙皮苷物制备成橙皮素的方法与流程

1.本发明涉及植物有效成分的提取技术领域，尤其涉及一种从柑橘中提取橙皮苷物制备成橙皮素的方法。


背景技术：

2.橙皮素是一类天然黄酮类化合物，广泛存在水果等物质中，其被广泛应用于医学，食品中，橙皮素主要是利用橙皮苷水解制备而成，而柑橘中含有丰富的橙皮苷，而我国柑橘资源丰富，每年都会造成大量浪费，及现有橙皮素制备的工艺复杂条件，造成了制取的橙皮素的成本的增加。
3.综上所述，本发明通过设计一种从柑橘中提取橙皮苷物制备成橙皮素的方法来解决存在的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种从柑橘中提取橙皮苷物制备成橙皮素的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种从柑橘中提取橙皮苷物制备成橙皮素的方法，其具体步骤如下：
7.s1，将柑橘干燥后粉碎，筛网过滤，称取100kg粉末加入溶剂提取，调整ph为碱性，将其置于自制的超声逆流提取装置中进行提取120min，过滤，收集提取液，提取两次后，合并提取液，将合并后的提取液进行浓缩，浓缩至原提取液体积的1/(2～4)，过滤，调节ph至3
‑
4，静置沉淀8h，过滤收集沉淀，用纯水清洗沉淀至中性并干燥成粉，称重，得柑橘粗提物；
8.s2，利用生物酶对所得柑橘粗提物进行酶促水解反应，首先，使用淀粉酶，果胶酶，蛋白酶对柑橘粗提物中的淀粉，果胶，蛋白进行水解后，其次，使用鼠李糖苷酶对其进行水解，生成单葡萄糖橙皮素，并使用β
‑
葡萄糖苷酶对生成的单葡萄糖橙皮素进行进一步水解，反应完成后静置沉淀并过滤，得橙皮素粗品，最后使用乙醇对所得橙皮素粗品进行重结晶，制得精制橙皮素，乙醇浓度(v/v)为50％
‑
95％；
9.s3，对精制橙皮素的含量测定包括：
10.1)试剂和仪器
11.仪器：高效液相色谱仪，电子分析天平，超声清洗器；试剂：乙腈(色谱纯)、甲酸(色谱纯)、橙皮素对照品(≥98％)，一级水，其中高效液相色谱仪的色谱条件为色谱柱：c
18
液相色谱柱，长250mm，内径4.6mm，粒度5μm；流动相：乙腈：甲酸水溶液(体积分数为0.5％)＝40:60；柱温：30℃；泵：等度泵；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长：285nm和运行时间：15min；
12.2)分析步骤
13.a)对照品溶液的制备：准确称取0.01g橙皮素对照品，精确至0.0001g，用流动相溶解，移入100ml容量瓶中，加流动相定容至100ml,所得溶液用0.45μm滤膜过滤，滤液备用。
14.b)试样溶液的制备：准确称取0.01g试样，精确至0.0001g，用流动相溶解，移入100ml容量瓶中，加流动相定容至100ml,所得溶液用0.45μm滤膜过滤，滤液备用。
15.c)测定：在上述色谱条件下，分别对对照品溶液和试样溶液进行测定，记录其主峰面积。
16.d)结果计算：橙皮素含量的质量分数w1按以下公式计算
[0017][0018]
式中：
[0019]
a1—试样溶液色谱图中主峰的峰面积值；
[0020]
m2—对照品的质量，单位为克(g)；
[0021]
w2—对照品中橙皮素含量的质量分数(％)；
[0022]
a2—对照品溶液色谱图中的主峰的峰面积值；
[0023]
m1—试样的质量，单位为克(g)。
[0024]
作为本发明优选的方案，所述s1中溶剂为乙醇、水或两者混合物，所述s2中生物酶为自行发酵获得，其中淀粉酶，果胶酶及蛋白酶均通过土壤中筛选的枯草芽孢杆菌菌株发酵所得，所述鼠李糖苷酶，β
‑
葡萄糖苷均通过土壤中筛选的黑曲霉发酵所得。
[0025]
作为本发明优选的方案，所述生物酶酶活性为：淀粉酶酶活性为70000u、果胶酶酶活性为50000u、蛋白酶酶活性为50000u、鼠李糖苷酶酶活性为100000u、β
‑
葡萄糖苷酶酶活为100000u。
[0026]
作为本发明优选的方案，所述生物酶与底物的质量比分别为淀粉酶：底物为1：10～1：50、果胶酶：底物为1:10～1:50、蛋白酶：底物为1:10～1:30、鼠李糖苷酶：底物为1:10～1:70、β
‑
葡萄糖苷酶：底物为1:10～1:60。
[0027]
作为本发明优选的方案，所述生物酶与底物的质量比分别为淀粉酶：底物为1:15～1:40、果胶酶：底物为1:15～1:40、蛋白酶：底物为1:15～1:30、鼠李糖苷酶：底物为1:15～1:60、β
‑
葡萄糖苷酶：底物为1:15～1:50。
[0028]
作为本发明优选的方案，所述生物酶与底物的质量比分别为淀粉酶：底物为1:20～1:40、果胶酶：底物为1:20～1:40、蛋白酶：底物为1:20～1:30、鼠李糖苷酶：底物为1:20～1:60、β
‑
葡萄糖苷酶：底物为1:20～1:50。
[0029]
作为本发明优选的方案，所述生物酶与底物的质量比分别为淀粉酶：底物为1:20、果胶酶：底物为1:20、蛋白酶：底物为1:20、鼠李糖苷酶：底物为1:30、β
‑
葡萄糖苷酶：底物为1:30。
[0030]
作为本发明优选的方案，所述s2中水解反应的反应条件为：温度50℃、ph为5.5和时间为5h。
[0031]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0032]
1、本发明中，通过设计从柑橘中提取橙皮苷制备成橙皮素的方法，从而利用废弃柑橘生产橙皮素，相比传统以橙皮苷作为原料制备橙皮素的工艺，减少了中间损耗，及减少橙皮苷的提纯、干燥环节，大大缩短了生产周期，解决了每年都会造成大量浪费，及现有橙皮素制备的工艺复杂条件，造成了制取的橙皮素的成本的增加的问题。
具体实施方式
[0033]
下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0034]
本发明提供一种技术方案：
[0035]
一种从柑橘中提取橙皮苷物制备成橙皮素的方法，其具体步骤如下：
[0036]
s1，将柑橘干燥后粉碎，筛网过滤，称取100kg粉末加入溶剂提取，调整ph为碱性，将其置于自制的超声逆流提取装置中进行提取120min，过滤，收集提取液，提取两次后，合并提取液，将合并后的提取液进行浓缩，浓缩至原提取液体积的1/(2～4)，过滤，调节ph至3
‑
4，静置沉淀8h，过滤收集沉淀，用纯水清洗沉淀至中性并干燥成粉，称重，得柑橘粗提物；
[0037]
s2，利用生物酶对所得柑橘粗提物进行酶促水解反应，首先，使用淀粉酶，果胶酶，蛋白酶对柑橘粗提物中的淀粉，果胶，蛋白进行水解后，其次，使用鼠李糖苷酶对其进行水解，生成单葡萄糖橙皮素，并使用β
‑
葡萄糖苷酶对生成的单葡萄糖橙皮素进行进一步水解，反应完成后静置沉淀并过滤，得橙皮素粗品，最后使用乙醇对所得橙皮素粗品进行重结晶，制得精制橙皮素，乙醇浓度(v/v)为50％
‑
95％；
[0038]
s3，对精制橙皮素的含量测定包括：
[0039]
1)试剂和仪器
[0040]
仪器：高效液相色谱仪，电子分析天平，超声清洗器；试剂：乙腈(色谱纯)、甲酸(色谱纯)、橙皮素对照品(≥98％)，一级水，其中高效液相色谱仪的色谱条件为色谱柱：c
18
液相色谱柱，长250mm，内径4.6mm，粒度5μm；流动相：乙腈：甲酸水溶液(体积分数为0.5％)＝40:60；柱温：30℃；泵：等度泵；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长：285nm和运行时间：15min；
[0041]
2)分析步骤
[0042]
a)对照品溶液的制备：准确称取0.01g橙皮素对照品，精确至0.0001g，用流动相溶解，移入100ml容量瓶中，加流动相定容至100ml,所得溶液用0.45μm滤膜过滤，滤液备用。
[0043]
b)试样溶液的制备：准确称取0.01g试样，精确至0.0001g，用流动相溶解，移入100ml容量瓶中，加流动相定容至100ml,所得溶液用0.45μm滤膜过滤，滤液备用。
[0044]
c)测定：在上述色谱条件下，分别对对照品溶液和试样溶液进行测定，记录其主峰面积。
[0045]
d)结果计算：橙皮素含量的质量分数w1按以下公式计算
[0046][0047]
式中：
[0048]
a1—试样溶液色谱图中主峰的峰面积值；
[0049]
m2—对照品的质量，单位为克(g)；
[0050]
w2—对照品中橙皮素含量的质量分数(％)；
[0051]
a2—对照品溶液色谱图中的主峰的峰面积值；
[0052]
m1—试样的质量，单位为克(g)。
[0053]
作为本发明进一步优选的方案，所述s1中溶剂为乙醇、水或两者混合物，所述s2中生物酶为自行发酵获得，其中淀粉酶，果胶酶及蛋白酶均通过土壤中筛选的枯草芽孢杆菌菌株发酵所得，所述鼠李糖苷酶，β
‑
葡萄糖苷均通过土壤中筛选的黑曲霉发酵所得。
[0054]
作为本发明进一步优选的方案，所述生物酶酶活性为：淀粉酶酶活性为70000u、果胶酶酶活性为50000u、蛋白酶酶活性为50000u、鼠李糖苷酶酶活性为100000u、β
‑
葡萄糖苷酶酶活为100000u。
[0055]
作为本发明进一步优选的方案，所述生物酶与底物的质量比分别为淀粉酶：底物为1：10～1：50、果胶酶：底物为1:10～1:50、蛋白酶：底物为1:10～1:30、鼠李糖苷酶：底物为1:10～1:70、β
‑
葡萄糖苷酶：底物为1:10～1:60。
[0056]
作为本发明进一步优选的方案，所述生物酶与底物的质量比分别为淀粉酶：底物为1:15～1:40、果胶酶：底物为1:15～1:40、蛋白酶：底物为1:15～1:30、鼠李糖苷酶：底物为1:15～1:60、β
‑
葡萄糖苷酶：底物为1:15～1:50。
[0057]
作为本发明进一步优选的方案，所述生物酶与底物的质量比分别为淀粉酶：底物为1:20～1:40、果胶酶：底物为1:20～1:40、蛋白酶：底物为1:20～1:30、鼠李糖苷酶：底物为1:20～1:60、β
‑
葡萄糖苷酶：底物为1:20～1:50。
[0058]
作为本发明进一步优选的方案，所述生物酶与底物的质量比分别为淀粉酶：底物为1:20、果胶酶：底物为1:20、蛋白酶：底物为1:20、鼠李糖苷酶：底物为1:30、β
‑
葡萄糖苷酶：底物为1:30。
[0059]
作为本发明进一步优选的方案，所述s2中水解反应的反应条件为：温度50℃、ph为5.5和时间为5h。
[0060]
具体实施案例：
[0061]
实施例1：将烘干柑橘粉碎，过100目筛网后，称取100kg粉末，加入溶剂水，料液比(w/v)为1:10，调节溶液ph至11.0，将其置于自制的超声逆流提取装置中进行提取120min，过滤，收集提取液；提取两次后，合并提取液，将合并后的提取液进行浓缩，浓缩至原提取液体积的1/3，调节浓缩后的提取液ph至3.0，静置沉淀8h，过滤收集沉淀，用纯水清洗沉淀至中性并干燥成粉，称重，得柑橘粗提物，将称重后的柑橘粗提物加水，料液比(w/v)为1:40，分别加入淀粉酶(1：20)、果胶酶(1：20)、蛋白酶(1：20)、鼠李糖苷酶(1：30)、β
‑
葡萄糖苷酶(1：30)进行水解反应，反应条件为：温度50℃，ph为5.5，时间为5h，反应完成后静置沉淀并过滤，得橙皮素粗品，然后使用95％乙醇对所得橙皮素粗品进行重结晶，制得精制橙皮素，检测得橙皮素含量的质量分数为95％。
[0062]
实施例2：将烘干柑橘粉碎，过100目筛网后，称取100kg粉末，加入溶剂水，料液比(w/v)为1:15，调节溶液ph至11.0，将其置于自制的超声逆流提取装置中进行提取120min，过滤，收集提取液，提取两次后，合并提取液，将合并后的提取液进行浓缩，浓缩至原提取液体积的1/4，调节浓缩后的提取液ph至3.0，静置沉淀8h，过滤收集沉淀，用纯水清洗沉淀至中性并干燥成粉，称重，得柑橘粗提物，将称重后的柑橘粗提物加水，料液比(w/v)为1:50，分别加入淀粉酶(1：30)、果胶酶(1：30)、蛋白酶(1：30)、鼠李糖苷酶(1：40)、β
‑
葡萄糖苷酶(1：40)进行水解反应，反应条件为：温度50℃，ph为5.5，时间为5h，反应完成后静置沉淀并过滤，得橙皮素粗品，然后使用75％乙醇对所得橙皮素粗品进行重结晶，制得精制橙皮素，检测得橙皮素含量的质量分数为93％。
[0063]
实施例3：将烘干柑橘粉碎，过50目筛网后，称取100kg粉末，加入溶剂水，料液比(w/v)为1:20，调节溶液ph至11.0，将其置于自制的超声逆流提取装置中进行提取120min，过滤，收集提取液，提取两次后，合并提取液，将合并后的提取液进行浓缩，浓缩至原提取液体积的1/2，调节浓缩后的提取液ph至3.0，静置沉淀8h，过滤收集沉淀，用纯水清洗沉淀至中性并干燥成粉，称重，得柑橘粗提物，将称重后的柑橘粗提物加水，料液比(w/v)为1:55，分别加入淀粉酶(1：35)、果胶酶(1：35)、蛋白酶(1：30)、鼠李糖苷酶(1：50)、β
‑
葡萄糖苷酶(1：50)进行水解反应，反应条件为：温度50℃，ph为5.5，时间为5h。反应完成后静置沉淀并过滤，得橙皮素粗品，然后使用80％乙醇对所得橙皮素粗品进行重结晶，制得精制橙皮素，检测得橙皮素含量的质量分数为91％。
[0064]
分别取上述实施例1、实施例2和实施例3制得的精制橙皮素，分别通过橙皮素含量测定，具体步骤如下：
[0065]
1)试剂和仪器
[0066]
仪器：高效液相色谱仪，电子分析天平，超声清洗器；试剂：乙腈(色谱纯)、甲酸(色谱纯)、橙皮素对照品(≥98％)，一级水，其中高效液相色谱仪的色谱条件为色谱柱：c
18
液相色谱柱，长250mm，内径4.6mm，粒度5μm；流动相：乙腈：甲酸水溶液(体积分数为0.5％)＝40:60；柱温：30℃；泵：等度泵；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长：285nm和运行时间：15min；
[0067]
2)分析步骤
[0068]
a)对照品溶液的制备：准确称取0.01g橙皮素对照品，精确至0.0001g，用流动相溶解，移入100ml容量瓶中，加流动相定容至100ml,所得溶液用0.45μm滤膜过滤，滤液备用。
[0069]
b)试样溶液的制备：准确称取0.01g试样，精确至0.0001g，用流动相溶解，移入100ml容量瓶中，加流动相定容至100ml,所得溶液用0.45μm滤膜过滤，滤液备用。
[0070]
c)测定：在上述色谱条件下，分别对对照品溶液和试样溶液进行测定，记录其主峰面积。
[0071]
d)结果计算：橙皮素含量的质量分数w1按以下公式计算
[0072][0073]
式中：
[0074]
a1—试样溶液色谱图中主峰的峰面积值；
[0075]
m2—对照品的质量，单位为克(g)；
[0076]
w2—对照品中橙皮素含量的质量分数(％)；
[0077]
a2—对照品溶液色谱图中的主峰的峰面积值；
[0078]
m1—试样的质量，单位为克(g)。
[0079]
检测得实施例1中橙皮素含量的质量分数为95％，检测得实施例2中橙皮素含量的质量分数为93％，检测得实施例3中橙皮素含量的质量分数为91％。
[0080]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。