复方芬苯达唑制剂中有关物质的测定方法与流程

1.本发明涉及药物检测技术领域，尤其涉及一种复方芬苯达唑制剂中有关物质的测定方法。


背景技术：

2.芬苯达唑是一种苯并咪唑类抗寄生虫药，对多种致病性体内寄生虫具有广谱抗虫活性。对于易感寄生虫，苯并咪唑类药物的作用机制是通过选择性结合并破坏微管蛋白，阻止微管蛋白聚合成微管，最终干扰细胞内微管转动系统。苯并咪唑类药物还可以干扰蠕虫的代谢途径，抵制苹果酸脱氢酶和富马酸还原酶等代谢酶，芬苯达唑可用于驱除犬的下列寄生虫：蛔虫、钩虫、鞭虫和绦虫(豆状绦虫)，对犬复殖孔绦虫无作用。吡喹酮是一种用于人类及动物的驱虫药，用于治疗绦虫及吸虫，对于宠物的所有绦虫成虫有极高的驱虫活性，对绦虫的幼虫也有极好的驱虫活性，对于犬猫，吡喹酮用量5mg/kg的推荐剂量对泡状带绦虫、豆状带绦虫、带状带绦虫、犬复孔绦虫、中殖孔绦虫、多头绦虫、细粒棘球绦虫的各个阶段虫体都十分有效，可以100％的驱除犬细粒棘球绦虫。芬苯达唑与吡喹酮二者合用能够扩大抗寄生虫谱，因此混合使用来制备复方芬苯达唑片，现有一种复方芬苯达唑片，规格为芬苯达唑500mg：吡喹酮50mg，临床用于治疗动物体内寄生虫蛔虫、钩虫、鞭虫、绦虫混合感染。
3.复方芬苯达唑片在制备过程和储存过程中会降解产生杂质而影响产品的质量。这些杂质即药物质量控制中的有关物质，对于芬苯达唑需要控制的杂质主要有三个：芬苯达唑杂质a(methyl(1h-benzimidazol-2-yl)carbamate)、芬苯达唑杂质b(methyl(5-chloro-1h-benzimidazol-2-yl)carbamate)、芬苯达唑杂质1(5-phenylthio)-2-aminobenzimidazole)，对于吡喹酮需要控制的杂质主要有三个：吡喹酮杂质a(2-benzoyl-1,2,3,6,7,11b-hexahydro-4h-pyrazino[2,1-a]isoquinolin-4-one)、吡喹酮杂质b(2-(cyclohexylcarbonyl)-2,3,6,7-tetrahydro-4h-pyrazino[2,1-a]isoquinolin-4-one)、吡喹酮杂质c(2-(n-formylhexahydrohippuroyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-1-one)，对于降解产生的有关物质，在复方芬苯达唑片剂中需要进行质量控制，因此，实现复方芬苯达唑片的芬苯达唑有关物质和吡喹酮有关物质的分离与分析，对于复方芬苯达唑片的质量控制具有重要的现实意义。
[0004]
目前的含芬苯达唑的制剂或含吡喹酮的制剂都没有进行有关物质控制，这样不利于产品质量控制，制备和储存过程中产生的杂质可能危害动物的生命安全和健康，因此需要制定复方芬苯达唑制剂中有关物质的测定方法。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种复方芬苯达唑制剂中有关物质的测定方法，能够实现芬苯达唑及其有关物质与吡喹酮及其有关物质的分离与分析，并且分离度好，专属性强，灵敏度高，准确度高，高效快捷，费用低廉。
[0006]
为实现以上目的，本发明提供一种复方芬苯达唑制剂中有关物质的测定方法，所
述复方芬苯达唑制剂包含芬苯达唑与吡喹酮，所述有关物质包括芬苯达唑有关物质与吡喹酮有关物质，所述芬苯达唑有关物质包括芬苯达唑杂质a、芬苯达唑杂质b和芬苯达唑杂质1，所述吡喹酮有关物质包括吡喹酮杂质a、吡喹酮杂质b和吡喹酮杂质c；
[0007]
所述复方芬苯达唑制剂中有关物质的测定方法包括芬苯达唑有关物质的测定方法与吡喹酮有关物质的测定方法；
[0008]
所述芬苯达唑有关物质的测定方法包括：将所述复方芬苯达唑制剂溶解于溶剂中，制备得到第一供试品溶液；将所述第一供试品溶液稀释n1倍，得到第一对照溶液；将所述第一供试品溶液与所述第一对照溶液分别注入液相色谱仪，得到色谱图；所述芬苯达唑有关物质的含量按下式(1)计算：
[0009][0010]
式(1)中，杂质含量表示芬苯达唑杂质a、芬苯达唑杂质b或芬苯达唑杂质1的含量；ai为所述第一供试品溶液中芬苯达唑杂质a、芬苯达唑杂质b或芬苯达唑杂质1的峰面积；abi为所述第一对照溶液中芬苯达唑的峰面积；f为芬苯达唑杂质a、芬苯达唑杂质b或芬苯达唑杂质1的校正因子；n1表示所述第一对照溶液相对于所述第一供试品溶液的稀释倍数；
[0011]
所述吡喹酮有关物质的测定方法包括：将所述复方芬苯达唑制剂溶解于溶剂中，制备得到第二供试品溶液；将所述第二供试品溶液稀释n2倍，得到第二对照溶液；将所述第二供试品溶液与所述第二对照溶液分别注入液相色谱仪，得到色谱图；所述吡喹酮有关物质的含量按下式(2)计算：
[0012][0013]
式(2)中，杂质含量表示吡喹酮杂质a、吡喹酮杂质b或吡喹酮杂质c的含量；ai为所述第二供试品溶液中吡喹酮杂质a、吡喹酮杂质b或吡喹酮杂质c的峰面积；abi为所述第二对照溶液中吡喹酮的峰面积；f为吡喹酮杂质a、吡喹酮杂质b或吡喹酮杂质c的校正因子；n2表示所述第二对照溶液相对于所述第二供试品溶液的稀释倍数。
[0014]
本发明一些实施例中，测定所述芬苯达唑有关物质与所述吡喹酮有关物质的含量时，所述第一供试品溶液、所述第一对照溶液、所述第二供试品溶液、所述第二对照溶液的液相色谱条件均包括：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢钠水溶液和己磺酸钠甲醇溶液的混合溶液为流动相，柱温20℃～30℃，流速为每分钟0.5ml～1.5ml，进样量5微升～20微升；
[0015]
测定所述芬苯达唑有关物质的含量时，检测波长为278nm～282nm；测定所述吡喹酮有关物质的含量时，检测波长为208nm～212nm。
[0016]
可选的，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为0.5％(w/v)；所述己磺酸钠甲醇溶液的浓度为0.2％～0.3％(w/v)；所述混合溶液由体积比为40:60的磷酸二氢钠水溶液和己磺酸钠甲醇溶液混合而成，所述混合溶液采用磷酸调节ph值为3.0～3.5。
[0017]
优选的，测定所述芬苯达唑有关物质的含量时，检测波长为280nm；测定所述吡喹酮有关物质的含量时，检测波长为210nm。
[0018]
本发明一些实施例中，测定所述芬苯达唑有关物质的含量时，所述第一供试品溶液的制备方法包括：将复方芬苯达唑制剂与1％(v/v)盐酸甲醇溶液混合后进行超声处理，
完全溶解后添加65％(v/v)甲醇水溶液至预定浓度，其中，所述1％(v/v)盐酸甲醇溶液与所述65％(v/v)甲醇水溶液的体积比为1～2:1～2；将所述第一供试品溶液稀释为第一对照溶液时，采用65％(v/v)甲醇水溶液进行稀释。
[0019]
本发明一些实施例中，测定所述吡喹酮有关物质的含量时，所述第二供试品溶液的制备方法包括：将复方芬苯达唑制剂与60％(v/v)乙腈水溶液混合后进行超声处理，完全溶解后添加60％(v/v)乙腈水溶液至预定浓度；将所述第二供试品溶液稀释为第二对照溶液时，采用60％(v/v)乙腈水溶液进行稀释。
[0020]
本发明一些实施例中，测定所述芬苯达唑有关物质的含量时，所述第一供试品溶液中芬苯达唑的含量为0.5mg/ml～2mg/ml；测定所述吡喹酮有关物质的含量时，所述第二供试品溶液中吡喹酮的含量为0.2mg/ml～1mg/ml。
[0021]
本发明一些实施例中，测定所述芬苯达唑有关物质的含量时，所述第一对照溶液相对于所述第一供试品溶液的稀释倍数n1为100～300，可选的，n1为200；
[0022]
测定所述吡喹酮有关物质的含量时，所述第二对照溶液相对于所述第二供试品溶液的稀释倍数n2为100～300，可选的，n2为200。
[0023]
具体的，测定所述芬苯达唑有关物质的含量时，所述芬苯达唑杂质a的校正因子f为0.4888，所述芬苯达唑杂质b的校正因子f为0.7546，所述芬苯达唑杂质1的校正因子f为0.9884；
[0024]
具体的，测定所述吡喹酮有关物质的含量时，所述吡喹酮杂质a的校正因子f为0.8233，所述吡喹酮杂质b的校正因子f为1.2227，所述吡喹酮杂质c的校正因子f为0.7713。
[0025]
本发明一些实施例中，所述复方芬苯达唑制剂为片剂。
[0026]
具体的，上述色谱条件下，所述第一供试品溶液的色谱图中，芬苯达唑保留时间约为22分钟，芬苯达唑杂质a、芬苯达唑杂质b、芬苯达唑杂质1相对于芬苯达唑相对保留时间分别约为0.16、0.29、0.80；所述第一对照溶液的色谱图中，芬苯达唑保留时间约为22分钟。
[0027]
具体的，上述色谱条件下，所述第二供试品溶液的色谱图中，吡喹酮保留时间约为19分钟，吡喹酮杂质a、吡喹酮杂质b、吡喹酮杂质c相对于吡喹酮保留时间分别约为0.48、2.55、1.87；所述第二对照溶液的色谱图中，吡喹酮保留时间约为19分钟。
[0028]
具体的，在复方芬苯达唑制剂的质量控制过程中，测定所述芬苯达唑有关物质的含量时，针对所述第一对照溶液相对于所述第一供试品溶液的稀释倍数n1为200的情况，所述第一供试品溶液的色谱图中芬苯达唑杂质a、芬苯达唑杂质b、芬苯达唑杂质1及其它单个杂质的峰面积均不得大于所述第一对照溶液的色谱图中芬苯达唑的峰面积，所述第一供试品溶液的色谱图中各杂质峰的面积之和不得大于所述第一对照溶液的色谱图中芬苯达唑的峰面积的2倍，以上两种情况中出现任何一个大于的情况即说明产品中杂质含量严重超标，出现了严重的质量问题。
[0029]
具体的，在复方芬苯达唑制剂的质量控制过程中，测定所述吡喹酮有关物质的含量时，针对所述第二对照溶液相对于所述第二供试品溶液的稀释倍数n2为200的情况，所述第二供试品溶液的色谱图中吡喹酮杂质a、吡喹酮杂质b及吡喹酮杂质1的峰面积均不得大于所述第二对照溶液的色谱图中吡喹酮的峰面积，出现任何一个大于的情况即说明产品中杂质含量严重超标，出现了严重的质量问题。
[0030]
本发明的有益效果：
[0031]
本发明复方芬苯达唑制剂中有关物质的测定方法采用加校正因子的自身对照法对芬苯达唑三个已知杂质以及吡喹酮三个已知杂质进行测定，实现了芬苯达唑及其有关物质与吡喹酮及其有关物质的分离与分析，并且分离度好，专属性强，灵敏度高，准确度高，方法简单，费用低廉，采用该测定方法对于复方芬苯达唑制剂的质量控制具有重要的现实意义。
[0032]
由于复方芬苯达唑制剂所用的杂质对照品(包括芬苯达唑杂质a、芬苯达唑杂质b、芬苯达唑杂质1、吡喹酮杂质a、吡喹酮杂质b、吡喹酮杂质c)都需要从国外进口，价格极其昂贵，采购周期3～6个月，无法满足正常生产需要，为了实现了芬苯达唑及其有关物质与吡喹酮及其有关物质的分离与分析，并且达到分离度好，专属性强，灵敏度高，准确度高的效果，更有效的控制产品质量，本技术采用加校正因子自身对照法控制复方芬苯达唑片制剂中的杂质，这样可以不必购买昂贵的杂质对照品，节省大量费用和时间，有利于工业化生产，有利于更精准的控制产品质量。
附图说明
[0033]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。
[0034]
图1为本技术实施例1中芬苯达唑有关物质的测定方法中供试品溶液的色谱图；
[0035]
图2为本技术实施例1中芬苯达唑有关物质的测定方法中对照溶液的色谱图；
[0036]
图3为本技术实施例1中吡喹酮有关物质测定方法中供试品溶液的色谱图；
[0037]
图4为本技术实施例1中吡喹酮有关物质的测定方法中对照溶液的色谱图；
[0038]
图5为芬苯达唑有关物质专属性试验空白溶剂色谱图；
[0039]
图6为芬苯达唑有关物质专属性试验空白辅料色谱图；
[0040]
图7为芬苯达唑有关物质专属性试验阴性样品(吡喹酮 空白辅料)色谱图；
[0041]
图8为芬苯达唑有关物质专属性试验混合杂质对照品溶液色谱图；
[0042]
图9为吡喹酮有关物质专属性试验空白溶剂色谱图；
[0043]
图10为吡喹酮有关物质专属性试验空白辅料色谱图；
[0044]
图11为吡喹酮有关物质专属性试验阴性样品(芬苯达唑 空白辅料)色谱图；
[0045]
图12为吡喹酮有关物质专属性试验混合杂质对照品色谱图；
[0046]
图13为测定芬苯达唑及其杂质检测限的色谱图；
[0047]
图14为测定吡喹酮及其杂质检测限的色谱图；
[0048]
图15为测定芬苯达唑及其杂质定量限的色谱图；
[0049]
图16为测定吡喹酮及其杂质定量限的色谱图。
具体实施方式
[0050]
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0051]
本技术实施例中，盐酸甲醇溶液(1
→
100)指1％(v/v)盐酸甲醇溶液，由(36.0wt％～38.0wt％)盐酸与甲醇混合而成，盐酸添加量为盐酸甲醇溶液总体积的1％。
[0052]
实施例1
[0053]
芬苯达唑有关物质的测定：
[0054]
取复方芬苯达唑片细粉约0.16g(相当于芬苯达唑100mg)，置100ml量瓶中，加盐酸甲醇溶液(1
→
100)50ml超声15分钟溶解，放冷至室温，加65％(v/v)甲醇水溶液稀释至100ml刻度线，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液(芬苯达唑浓度约为1mg/ml)。
[0055]
精密量取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，用65％(v/v)甲醇水溶液稀释至200ml刻度线，摇匀，作为对照溶液。
[0056]
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(agi1ent zorbax sb-c18，250mm
×
4.6mm，3.5μm或效能相当的色谱柱)，以0.5％(w/v)磷酸二氢钠溶液:含0.313％(w/v)己磺酸钠的甲醇溶液(40:60)(用磷酸调ph值到3.5)为流动相，检测波长为280nm，柱温25℃，流速为每分钟1.0ml。取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％。精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图(图1和图2)。图1为供试品溶液的色谱图，图2为对照溶液的色谱图。
[0057]
吡喹酮有关物质的测定：
[0058]
取复方芬苯达唑片细粉约0.64g(约相当于吡喹酮40mg)，置100ml量瓶中，加60％(v/v)乙腈水溶液适量超声15分钟溶解，放冷，加60％(v/v)乙腈水溶液稀释至100ml刻度线，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液(吡喹酮浓度约为0.4mg/ml)。
[0059]
精密量取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，用60％(v/v)乙腈水溶液稀释至200ml刻度线，摇匀，作为对照溶液。
[0060]
照芬苯达唑有关物质检查项下的方法测定：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(agi1ent zorbax sb-c18，250mm
×
4.6mm，3.5μm或效能相当的色谱柱)，以0.5％(w/v)磷酸二氢钠溶液:含0.313％(w/v)己磺酸钠的甲醇溶液(体积比40:60)(用磷酸调ph值到3.5)为流动相。检测波长为210nm，柱温25℃，流速为每分钟1.0ml。取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％。精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图(图3和图4)。图3为供试品溶液的色谱图，图4为对照溶液的色谱图。
[0061]
1.波长的选择
[0062]
芬苯达唑有关物质波长的选择：
[0063]
分别精密量取芬苯达唑杂质a对照品储备液、芬苯达唑杂质b对照品储备液、芬苯达唑杂质1对照品储备液10ml，用65％(v/v)甲醇水溶液稀释至100ml，制备成为10μg/ml的杂质对照品溶液，取芬苯达唑对照品储备液1ml用65％(v/v)甲醇水溶液稀释至25ml，制备成为8μg/ml的芬苯达唑对照品溶液。
[0064]
结果：芬苯达唑、芬苯达唑杂质a、芬苯达唑杂质b、芬苯达唑杂质1在吸收波长280nm
±
2nm处均有最大或较大吸收，选择280nm作为检测波长。
[0065]
吡喹酮有关物质波长的选择：
[0066]
以乙腈-水(60:40)为溶剂，分别配制吡喹酮对照品、吡喹酮杂质a、吡喹酮杂质b、吡喹酮杂质c浓度为4μg/ml的溶液，同法制备吡喹酮阴性样品溶液分别于200nm～400nm波
长范围内进行扫描。
[0067]
结果：吡喹酮和吡喹酮杂质a、吡喹酮杂质b、吡喹酮杂质c在吸收波长210nm
±
2nm处均有最大或较大吸收，采用210nm为检测波长。
[0068]
2.分离专属性试验
[0069]
芬苯达唑有关物质专属性试验
[0070]
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(agi1ent zorbax sb-c18，250mm
×
4.6mm，3.5μm)，以0.5％(w/v)磷酸二氢钠溶液:含0.313％(w/v)己磺酸钠的甲醇溶液(40:60)(用磷酸调ph值到3.5)为流动相，检测波长为280nm，柱温25℃，流速为每分钟1.0ml。
[0071]
供试品溶液的配制：
[0072]
取复方芬苯达唑片细粉约0.16g(相当于芬苯达唑100mg)，置100ml量瓶中，加盐酸甲醇溶液(1
→
100)50ml超声15分钟溶解，放冷，加65％(v/v)甲醇水溶液稀释至100ml刻度线，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液(芬苯达唑浓度为1mg/ml)。
[0073]
精密量取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，用65％(v/v)甲醇水溶液稀释至200ml刻度线，摇匀，作为对照溶液(芬苯达唑浓度为5μg/ml)。
[0074]
芬苯达唑对照品溶液的配制：
[0075]
取芬苯达唑对照品20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加盐酸甲醇溶液(1
→
100)50ml使溶解，并用甲醇稀释并定容，摇匀，配制成浓度为0.2mg/ml的对照品储备溶液，备用。
[0076]
芬苯达唑杂质对照品溶液的配制：
[0077]
取芬苯达唑杂质a对照品10mg，精密称定，加盐酸甲醇溶液(1
→
100)使溶解并定容100ml，摇匀，作为储备溶液(芬苯达唑杂质a浓度为100μg/ml)。
[0078]
取芬苯达唑杂质b对照品10mg，精密称定，加盐酸甲醇溶液(1
→
100)使溶解并定容100ml，摇匀，作为储备溶液(100μg/ml)。
[0079]
取芬苯达唑杂质1对照品10mg，精密称定，加盐酸甲醇溶液(1
→
100)使溶解并定容100ml，摇匀，作为储备溶液(100μg/ml)。
[0080]
芬苯达唑和杂质a、b、1混合对照品溶液的配制：
[0081]
取0.2mg/ml的芬苯达唑对照品储备液适量，用甲醇稀释制成每1ml中含100μg的芬苯达唑对照品储备液，取芬苯达唑、芬苯达唑杂质a、芬苯达唑杂质b、芬苯达唑杂质1对照品储备液(100μg/ml)各适量，用65％(v/v)甲醇水溶液稀释制成每1ml中约含5μg的芬苯达唑和杂质a、b、1混合对照品溶液。
[0082]
空白辅料溶液的配制：
[0083]
取处方量的空白辅料50mg，置100ml量瓶中加盐酸甲醇溶液(1
→
100)50ml超声15分钟溶解，冷却，加65％(v/v)甲醇水溶液稀释至100ml刻度线，摇匀，作为空白辅料溶液。
[0084]
芬苯达唑阴性样品(吡喹酮 空白辅料)溶液的配制：
[0085]
取处方量的空白辅料50mg 吡喹酮原料10mg，置100ml量瓶中加盐酸甲醇溶液(1
→
100)50ml超声15分钟溶解，冷却，加65％(v/v)甲醇水溶液稀释至100ml刻度线，摇匀，作为芬苯达唑阴性样品溶液。
[0086]
取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20％；再取空白溶剂(盐酸甲醇溶液(1
→
100)：65％(v/v)甲醇水溶液＝1:1)、空白辅料溶液、芬苯达唑阴性样品溶液、供试品溶液、芬苯达唑和杂质a、b、1混合对照品溶液各20μ
l分别注入液相色谱仪，记录色谱图。图5为空白溶剂色谱图，图6为空白辅料色谱图，图7为吡喹酮阴性样品溶液色谱图，图8为混合杂质对照品溶液色谱图。
[0087]
试验结果：溶剂峰、未知杂质、芬苯达唑已知杂质、主峰吡喹酮、芬苯达唑及其杂质的分离度均达到要求，空白溶剂、空白辅料、芬苯达唑阴性样品对已知杂质和未知杂质、主峰芬苯达唑没有干扰，说明该杂质检测方法专属性强。
[0088]
吡喹酮有关物质专属性试验
[0089]
色谱条件：在用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(agi1ent zorbax sb-c18，250mm
×
4.6mm，3.5μm)，以0.5％(w/v)磷酸二氢钠溶液:含0.313％(w/v)己磺酸钠的甲醇溶液(40:60)(用磷酸调ph值到3.5)为流动相，检测波长为210nm，柱温25℃，流速为每分钟1.0ml。
[0090]
(1)供试品溶液：取本品，置研钵中研细，取适量(相当于吡喹酮40mg)置100ml量瓶中，加乙腈-水(60:40)适量超声15分钟溶解，放冷，并用乙腈-水(60:40)稀释至100ml刻度线，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
[0091]
(2)对照溶液：精密量取上述供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，用乙腈-水(60:40)稀释至200ml刻度线，摇匀，作为对照溶液。
[0092]
(3)吡喹酮对照品溶液：取吡喹酮对照品20mg，精密称定，置100ml量瓶中，用乙腈-水(60:40)稀释至100ml刻度线，摇匀，作为对照品储备液(200μg/ml)。
[0093]
(4)吡喹酮杂质对照品溶液：分别取吡喹酮杂质a、吡喹酮杂质b与吡喹酮杂质c的对照品各适量，分别加乙腈-水(60:40)溶解并稀释制成每1ml约含上述对照品均为200μg的对照品溶液，分别作为杂质对照品储备液。
[0094]
(5)空白辅料溶液：取处方量的空白辅料200mg，置100ml量瓶中，加乙腈-水(60:40)超声15分钟溶解，放冷，并稀释至100ml刻度线，过滤，取续滤液作为空白辅料溶液。
[0095]
(6)吡喹酮阴性样品(芬苯达唑 空白辅料)溶液：取处方量的空白辅料200mg 处方量芬苯达唑400mg共600mg，置100ml量瓶中，加乙腈-水(60:40)超声15分钟溶解，放冷，并稀释至100ml刻度线，过滤，取续滤液作为吡喹酮阴性样品溶液。
[0096]
(7)混合杂质对照品溶液：取芬苯达唑、芬苯达唑杂质a、芬苯达唑杂质b、芬苯达唑杂质1、吡喹酮、吡喹酮杂质a、吡喹酮杂质b和吡喹酮杂质c的对照品储备液各适量，加乙腈-水(60:40)稀释制成每1ml中约含2μg的吡喹酮和吡喹酮杂质a、b、c，每1ml中约含5μg的芬苯达唑和芬苯达唑杂质a、b、1的混合溶液，作为混合杂质对照品溶液。
[0097]
取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20％；再取空白溶剂(乙腈-水(60:40))、空白辅料溶液、吡喹酮阴性样品溶液、混合杂质对照品溶液、供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。图9为空白溶剂色谱图，图10为空白辅料色谱图，图11为吡喹酮阴性样品色谱图，图12为混合杂质对照品溶液色谱图。
[0098]
试验结果表明，各杂质峰之间分离度好，溶剂峰不影响主峰吡喹酮及其杂质峰的检出，阴性样品中芬苯达唑及其杂质对已知杂质无干扰，但在吡喹酮出峰处有很小的吸收峰，对阴性样品稀释200倍后对主峰吡喹酮没有影响。
[0099]
总的来说，溶剂峰、未知杂质、吡喹酮已知杂质、主峰吡喹酮、芬苯达唑及其杂质的分离度均达到要求，空白辅料、阴性样品对已知杂质、主峰吡喹酮没有影响，该杂质检测方
法专属性强。
[0100]
3.检测限
[0101]
(1)芬苯达唑及其杂质检测限
[0102]
将芬苯达唑对照品溶液、芬苯达唑杂质a对照品溶液、芬苯达唑杂质b对照品溶液、芬苯达唑杂质1对照品溶液的储备液用65％(v/v)甲醇水溶液稀释至样品溶液中主峰的响应值约为噪音水平的3倍，记录色谱图(图13)；
[0103]
结果：芬苯达唑的检测限为19.52ng/ml，芬苯达唑杂质a的检测限为3.96ng/ml，芬苯达唑杂质b的检测限为6.85ng/ml，芬苯达唑杂质1的检测限为16.66ng/ml。
[0104]
(2)吡喹酮及其杂质检测限
[0105]
将吡喹酮对照品溶液、吡喹酮杂质a对照品溶液、吡喹酮杂质b对照品溶液、吡喹酮杂质c对照品溶液的储备液用乙腈-水(60:40)稀释至样品溶液中主峰的响应值约为噪音水平的3倍，记录色谱图(图14)；
[0106]
结果：吡喹酮的检测限为13.9ng/ml，吡喹酮杂质a的检测限为6.3ng/ml，吡喹酮杂质b的检测限为42.8ng/ml，吡喹酮杂质c的检测限为20.2ng/ml。
[0107]
(3)芬苯达唑及其杂质定量限
[0108]
将芬苯达唑对照品溶液、芬苯达唑杂质a对照品溶液、芬苯达唑杂质b对照品溶液、芬苯达唑杂质1对照品溶液的储备液用65％(v/v)甲醇水溶液稀释至样品溶液中主峰的响应值约为噪音水平的10倍，记录色谱图(图15)；
[0109]
结果：芬苯达唑的定量限为89.45ng/ml，芬苯达唑杂质a的定量限为17.80ng/ml，芬苯达唑杂质b的定量限为24.65ng/ml，芬苯达唑杂质1的定量限为66.64ng/ml。
[0110]
(4)吡喹酮及其杂质定量限
[0111]
将吡喹酮对照品溶液、吡喹酮杂质a对照品溶液、吡喹酮杂质b对照品溶液、吡喹酮杂质c对照品溶液的储备液用乙腈-水(60:40)稀释至样品溶液中主峰的响应值约为噪音水平的10倍，记录色谱图(图16)；
[0112]
结果：吡喹酮的定量限为37.6ng/ml，吡喹酮杂质a的定量限为23.4ng/ml，吡喹酮杂质b的定量限为235.4ng/ml，吡喹酮杂质c的定量限为111.1ng/ml。
[0113]
4.线性方程：
[0114]
芬苯达唑及其杂质线性方程：
[0115]
取芬苯达唑杂质a、b、1对照品各10mg，精密称定，加盐酸甲醇溶液(1
→
100)使溶解并定容100ml，摇匀，作为芬苯达唑杂质a、b、1对照品混合溶液，浓度为100μg/ml；取芬苯达唑对照品20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加盐酸甲醇溶液(1
→
100)50ml使溶解，用甲醇稀释并定容，摇匀，配制成浓度为0.2mg/ml的对照品储备溶液，精密量取芬苯达唑对照品储备溶液、芬苯达唑杂质a、b、1对照品混合溶液各适量，用65％(v/v)甲醇水溶液稀释制成每1ml中含10μg的芬苯达唑和杂质a、b、1混合对照品溶液，作为线性储备液。依次精密量取线性储备液10ml、5ml、2ml、1ml，置20ml量瓶，加65％(v/v)甲醇水溶液稀释至20ml刻度，配制成浓度为5μg/ml、2.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml线性浓度溶液；再依次精密量取线性储备液1ml，分别置50ml、200ml量瓶，加65％(v/v)甲醇水溶液稀释至刻度，配制成浓度为0.2μg/ml、0.05μg/ml线性浓度溶液(芬苯达唑杂质a、杂质b、杂质1限度均为0.5％)；取系列对照品溶液(10、5、2.5、1.0、0.5、0.2、0.05μg/ml)各20μl，依法测定，记录峰面积，以浓度为横坐标，
峰面积为纵坐标作图，得芬苯达唑、杂质a、b、1的回归方程及线性范围。
[0116]
校正因子计算公式为f＝k
芬苯达唑
/k
杂质
(k为线性方程斜率)。
[0117]
其中，k
芬苯达唑
为芬苯达唑的线性方程斜率，k
杂质
为芬苯达唑杂质a、b、1的线性方程斜率。
[0118]
芬苯达唑杂质a线性方程：y＝1.3964x-0.0071，r2＝1.0000，范围0.0516～10.32μg/ml。
[0119]
芬苯达唑杂质b线性方程：y＝0.9046x-0.0058，r2＝1.0000，范围0.0563～11.26μg/ml。
[0120]
芬苯达唑杂质1线性方程：y＝0.6906x-0.0059，r2＝1.0000，范围0.0595～11.90μg/ml。
[0121]
芬苯达唑线性方程：y＝0.6826x-0.0045，r2＝1.0000，范围0.0508～110.165μg/ml。
[0122]
其中，x表示含量，单位：μg/ml y表示峰面积(响应值)。
[0123]
由以上方程可以得知，芬苯达唑杂质a的校正因子为0.4888(0.6826/1.3964)，芬苯达唑杂质b的校正因子为0.7546(0.6826/0.9046)，芬苯达唑杂质1的校正因子为0.9884(0.6826/0.6906)。
[0124]
吡喹酮及其杂质线性方程：
[0125]
分别精密量取吡喹酮和吡喹酮杂质a、b、c对照品储备液(200μg/ml)1ml，至50ml量瓶，加乙腈-水(60:40)稀释至刻度，制备吡喹酮和吡喹酮杂质a、b、c混合对照品溶液(4μg/ml)，作为线性储备液，依次精密量取线性储备液5ml，分别至10ml、20ml、50ml、200ml量瓶，加乙腈-水(60:40)稀释至刻度，配制成浓度为2μg/ml、1μg/ml、0.4μg/ml、0.1μg/ml线性浓度溶液；依次精密量取0.1μg/ml线性浓度溶液5ml、2ml、1ml，置10ml量瓶，加乙腈-水(60:40)稀释至刻度，配制成浓度为0.05μg/ml，0.02μg/ml，0.01μg/ml线性浓度溶液(吡喹酮杂质a、杂质b、杂质c限度均为0.5％)。取系列对照品溶液(4、2、1、0.4、0.1、0.05、0.02、0.01μg/ml)各20μl，依法测定，记录峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，得吡喹酮、杂质a、b、c的回归方程及线性范围。
[0126]
校正因子计算公式为f＝k
吡喹酮
/k
杂质
(k为线性方程斜率)。
[0127]
其中k
吡喹酮
为吡喹酮的线性方程斜率，k
杂质
为吡喹酮杂质a、b、c的线性方程斜率。
[0128]
吡喹酮杂质a线性方程：y＝1.8780x 0.0038，r2＝1.0000，0.0105～4.2160μg/ml。
[0129]
吡喹酮杂质b线性方程：y＝1.2645x-0.0147，r2＝1.0000，0.0534～4.2720μg/ml。
[0130]
吡喹酮杂质c线性方程：y＝2.0046x 0.2095，r2＝0.9983，0.0101～4.0240μg/ml。
[0131]
吡喹酮线性方程：y＝1.5461x 0.0083，r2＝1.0000，0.0099～3.9601μg/ml。
[0132]
其中，x表示含量，单位：μg/ml，y表示峰面积(响应值)。
[0133]
由以上方程可以得知，吡喹酮杂质a的校正因子为0.8233(1.5461/1.8780)，吡喹酮杂质b的校正因子为1.2227(1.5461/1.2645)，吡喹酮杂质c的校正因子为0.7713(1.5461/2.0046)。
[0134]
由以上数据可知，芬苯达唑杂质1校正因子为0.9884，在0.9-1.1范围内，校正因子可以按1来计算，芬苯达唑杂质a、芬苯达唑杂质b、吡喹酮杂质a、吡喹酮杂质b、吡喹酮杂质c校正因子均不在0.9-1.1范围内，采用加校正因子的自身对照法对已知杂质进行定量。
[0135]
准确度试验
[0136]
芬苯达唑杂质a、b、1回收率
[0137]
取芬苯达唑杂质a、b、1对照品各10mg，精密称定，加盐酸甲醇溶液(1
→
100)使溶解并定容100ml，摇匀，作为芬苯达唑杂质a、b、1对照品混合溶液，浓度为100μg/ml；取芬苯达唑对照品20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加盐酸甲醇溶液(1
→
100)50ml使溶解，用甲醇稀释并定容，摇匀，配制成浓度为0.2mg/ml的对照品储备溶液，再用甲醇稀释制成每1ml中含100μg的芬苯达唑对照品溶液。分别精密量取芬苯达唑杂质a、b、1对照品混合溶液和芬苯达唑对照品溶液(100μg/ml)4ml、5ml、6ml分别置100ml的量瓶中(平行三份)，分别加入相应比例处方量的吡喹酮及其他辅料，加50ml的盐酸甲醇溶液(1
→
100)超声溶解15分钟，取出放冷，加65％(v/v)甲醇水溶液稀释至100ml刻度，摇匀，过滤，作为供试品溶液，同时分别精密量取芬苯达唑杂质a、b、1对照品混合溶液和芬苯达唑对照品溶液(100μg/ml)1ml，置20ml的量瓶中，加65％(v/v)甲醇水溶液稀释至20ml刻度，制得芬苯达唑和杂质a、b、1混合对照品溶液(5μg/ml)。取混合对照品溶液和9份供试品溶液各20μl注入色谱仪，按芬苯达唑杂质检查项下色谱条件进样检测，记录峰面积，并计算回收率和rsd，芬苯达唑杂质回收率见下表：
[0138]
[0139][0140]
各浓度下的平均回收率在90％～108％之间，9个回收率数据的rsd均在2.0％范围内符合要求，高、中、低三种浓度的回收率均符合规定，表明该方法的准确度良好。
[0141]
吡喹酮杂质a、b、c回收率：
[0142]
分别精密量取吡喹酮、杂质a、杂质b、杂质c对照品储备液(200μg/ml)10ml，置50ml量瓶，用乙腈-水(60:40)稀释至刻度，得40μg/ml混合杂质对照品二级储备液，分别精密量取40μg/ml混合杂质对照品二级储备液1ml置25ml量瓶(平行3份)，1ml置20ml量瓶(平行3份)，3ml置50ml量瓶(平行3份)，分别加入相应比例处方量的芬苯达唑及空白辅料，加乙腈-水(60:40)适量，超声溶解15分钟，取出放冷，用乙腈-水(60:40)稀释至刻度，摇匀，过滤，作为供试品溶液；精密量取40μg/ml混合杂质对照品二级储备液1ml，置20ml量瓶，用乙腈-水(60:40)稀释至刻度，得2μg/ml吡喹酮和杂质a、b、c混合对照品溶液，取9份供试品溶液和混合对照品溶液各20μl注入色谱仪，按吡喹酮杂质检查项下色谱条件进样检测，记录峰面积，并计算回收率和rsd，吡喹酮杂质回收率见下表：
[0143][0144]
各浓度下的平均回收率在90％～108％之间，9个回收率数据的rsd均在2.0％范围内符合要求，高、中、低三种浓度的回收率均符合规定，表明该方法的准确度良好。
[0145]
重复性试验
[0146]
芬苯达唑重复性试验
[0147]
取同一批供试品，按供试品溶液制备方法制备6份，每1ml中分别含芬苯达唑1mg的供试品溶液，并将供试品溶液用65％甲醇稀释200倍，制成每1ml中分别含芬苯达唑5μg的对照溶液；取芬苯达唑杂质a、b、1对照品各10mg，精密称定，加盐酸甲醇溶液(1
→
100)使溶解并定容100ml，摇匀，作为芬苯达唑杂质a、b、1对照品混合溶液，浓度为100μg/ml；取芬苯达唑对照品20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加盐酸甲醇溶液(1
→
100)50ml使溶解，用甲醇稀释并定容，摇匀，配制成浓度为0.2mg/ml的对照品储备溶液，精密量取芬苯达唑对照品储备溶液、芬苯达唑杂质a、b、1对照品混合溶液各适量，用65％(v/v)甲醇水溶液稀释制成每1ml中含5μg的芬苯达唑和杂质a、b、1混合对照品溶液，依法测定，计算杂质a、b、1的含量。重复性试验(n＝6)结果见下表：
[0148][0149]
结果：杂质a、杂质b、杂质1含量rsd％小于6％、符合中国兽药典质量标准精密度可接受范围，表明杂质a、杂质b、杂质1、总杂质本方法重复性好。
[0150]
吡喹酮重复性试验
[0151]
取供试品适量，加乙腈-水(60:40)适量超声15分钟溶解，放冷，用乙腈-水(60:40)稀释制成每1ml中含吡喹酮0.4mg的供试品溶液，制备6份，并将供试品溶液用乙腈-水(60:40)稀释200倍，制成每1ml中分别含吡喹酮2μg的对照溶液；分别精密量取吡喹酮和吡喹酮杂质a、b、c对照品储备液适量，用乙腈-水(60:40)稀释制成每1ml中含吡喹酮和吡喹酮杂质a、b、c 2μg的混合对照品溶液，依法测定，计算杂质a、b、c含量。重复性试验(n＝6)结果见下表：
[0152]
[0153][0154]
结果：杂质a、杂质b、杂质c的rsd小于6％，符合中国兽药典质量标准精密度可接受范围，表明杂质a、杂质b、杂质c重复性好。
[0155]
耐用性试验
[0156]
芬苯达唑有关物质耐用性试验
[0157]
芬苯达唑有关物质耐用性试验变动因素见下表：
[0158][0159]
芬苯达唑有关物质耐用性试验结果见下表：
[0160]
[0161][0162]
在测定条件流速、流动相比例、波长、ph有小的变动，换用不同批号色谱柱以后，主峰与杂质峰之间以及杂峰与杂峰之间仍能分离良好，分离度均大于1.5，采用校正因子法测定的有关物质结果rsd≤6，校正因子在色谱条件较小改变情况下耐用性良好，各杂质峰的拖尾因子不大于2.0，杂质峰与其他成分峰达到基线分离；杂质a、杂质b、杂质c含量的rsd小于6％，说明该芬苯达唑有关物质检查的色谱条件耐用性良好。
[0163]
吡喹酮耐用性试验
[0164]
在复方芬苯达唑片吡喹酮有关物质测定条件，改变以下条件，测定各杂质测定结果，吡喹酮有关物质耐用性试验变动因素见下表：
[0165][0166]
吡喹酮有关物质耐用性试验结果见下表：
[0167][0168][0169]
在流速、流动相有机相比例、色谱柱批号变动时，主峰与杂质峰之间以及杂峰与杂峰之间仍能分离良好，校正因子在改变色谱柱批号情况下耐用性良好，各杂质峰的拖尾因子不大于2.0，杂质峰与其他成分峰达到基线分离；杂质a、b、c含量的rsd小于6％，说明在改变流动相有机相比例
±
1％、流速、色谱柱批号的情况下耐用性良好。
[0170]
供试液稳定性
[0171]
芬苯达唑有关物质供试品溶液稳定性
[0172]
按照分析方法配置对照品储备溶液测定其峰面积，然后将对照品储备溶液贮存冰箱冷藏室(4℃)中，在1、2、4、5和7天时测定其峰面积。按杂质检查方法配制供试品溶液、自身对照溶液、芬苯达唑和杂质对照品混合溶液，常温下0～48h分别测定主成分与杂质的含量。
[0173]
可接受的标准为：主成分的含量变化的绝对值应不大于2.0％，杂质含量的绝对值在
±
0.1％以内，并不得出现新的大于报告限度的杂质。
[0174]
《中国兽药典》2015年版一部中芬苯达唑原料有关物质测定法中，供试品溶液是将原料用盐酸甲醇(1
→
100)为溶剂溶解，英国药典、美国药典原料和制剂均采用0.1m盐酸甲醇溶液作为提取溶剂。用盐酸甲醇(1
→
100)为溶剂，原料待测溶液较为稳定，对制剂的待测溶液稳定性做进一步研究。取小试样品10片，置研钵中研细，取细粉适量(约相当于芬苯达唑100mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加盐酸甲醇(1
→
100)50ml，超声处理15分钟，并用65％甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，作为供试品溶液。照上述色谱条件，于0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、30h、33h、36h、39h、42h、46h、48h精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，考察有关物质的变化情况(外标法)，按照英国药典芬苯达唑杂质对照品溶液的配制方法，芬苯达唑杂质a、b、1用盐酸甲醇溶解制成100μg/ml混合储备液，芬苯达唑对照品用50ml盐酸甲醇溶解，甲醇稀释制成200μg/ml储备液，再用甲醇稀释制成100μg/ml储备液；精密量取杂质混合储备液(100μg/ml)10ml，芬苯达唑储备液(200μg/ml)5ml至20ml量瓶，用甲醇稀释至刻度配制成50μg/ml的芬苯达唑和杂质对照品混合储备液；精密量取杂质混合储备液1ml，芬苯达唑储备液(100μg/ml)1ml至20ml量瓶，用65％甲醇稀释至刻度，配制成5μg/ml的芬苯达唑和杂质对照品溶液。计算杂质含量。芬苯达唑和杂质对照品混合储备液稳定性的测定结果见下表：
[0175][0176]
供试品溶液稳定性的测定结果见下表：
[0177][0178]
供试品杂质含量的测定结果见下表：
[0179][0180]
结果表明，主成分的含量变化的绝对值小于2.0％，杂质含量的绝对值在
±
0.1％以内，没有出现新的大于报告限度的杂质，48小时内芬苯达唑不降解，也说明供试品溶液在48小时内很稳定；对照品储备液峰面积的rsd值小于2.0％，说明对照品储备液贮存冰箱冷藏室(4℃)中在7天内稳定。
[0181]
吡喹酮杂质对照品溶液和供试品溶液稳定性
[0182]
取小试样品10片，置研钵中研细，取本品细粉适量0.64g(约相当于吡喹酮40mg)，置100ml量瓶中，加乙腈-水(60:40)适量超声15分钟溶解，放冷，加乙腈-水(60:40)稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，用乙腈-水(60:40)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；分别精密量取吡喹酮、杂质a、杂质b、杂质c对照品储备液(200μg/ml)10ml，置50ml量瓶，用乙腈-水(60:40)稀释至刻度，得40μg/ml混合杂质对照品二级储备液。照复方芬苯达唑片芬苯达唑有关物质检查项下的方法测定，检测波长为210nm，于0h、3h、6h、9h、12h精密量取供试品溶液及对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪,记录色谱图，以外标法计算杂质含量；于0、1、3、4、7和15天时测定40μg/ml混合杂质对照品二级储备液峰面积。杂质对照品储备液稳定性的测定结果见下表：
[0183][0184]
供试品溶液稳定性的测定结果见下表：
[0185][0186]
供试品溶液杂质含量的测定结果见下表：
[0187][0188][0189]
结果表明，供试品溶液主成分吡喹酮的含量变化的绝对值小于2.0％，杂质含量的绝对值在
±
0.1％以内，说明供试品溶液在12小时内很稳定；对照品储备液峰面积的rsd值小于2.0％，说明对照品储备液贮存冰箱冷藏室(4℃)中在15天内稳定。
[0190]
本技术复方芬苯达唑制剂中有关物质的测定方法按照《中国兽药典》2015版附录与《兽药质量标准分析方法验证指导原则》进行，经回收率、重复性、耐用性、供试液稳定性等方法学研究，均达到方法学研究指标要求，所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，通过对复方芬苯达唑制剂中有关物质进行检测和控制，能够确保复方芬苯达唑制剂的安全性，从而更有效的防治犬猫寄生虫感染性疾病。该方法适合复方芬苯达唑制剂中有关物质的检测要求。
[0191]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。