一种基于诱导培养脐带间充质干细胞产物并添加小分子的皮肤细胞修护方案的制作方法

1.本发明属于生物技术应用领域，涉及一种基于诱导培养脐带间充质干细胞产物并添加小分子的皮肤细胞修护方案。


背景技术：

2.人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells， hucmscs）是存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有自我更新潜力强、免疫调控效果好及多向分化潜能高等特性。相比于骨髓等来源，脐带来源的hucmscs具有收集方便、操作获取无侵袭性、道德伦理障碍小、有害突变少和增殖能力强等显著优点，因此将hucmscs用于再生医学治疗是目前干细胞研究与应用领域的研究热点之一。
3.但是目前的hucmscs治疗存在许多理论难题和技术缺陷。即使是对干细胞研究大力支持的国家，在面对干细胞疗法从实验室向临床转化的审批时，也顾虑重重；其中的伦理问题一直是各国政府制定干细胞政策时要考虑的重要问题；但更为关键的是hucmscs治疗本身固有的难题和缺陷：首先是细胞诱导状态等因素不可控性，导致无法精准的诱导分化；其次是体外和体内的差别大，体内实验的成功案例不代表可以转化应用，需要大量的验证，整体上工艺和质量控制难度大，较难实现标准化，也导致治疗成本和患者花费极高；最后还存在致癌风险等安全问题。
4.大量的动物和人体实验证明，hucmscs等间充质干细胞在再生医学中发挥作用在很大程度上是由旁分泌效应主导实现的，而不是其在损伤部位的增殖和分化，外泌体作为旁分泌机制中的重要活性物质来源，被越来越多的实验证明在间充质干细胞修复损伤组织和组织再生方面起到关键作用。因此，我们考虑以外泌体等细胞产物替代细胞本身用于治疗，既可以发挥hucmscs的关键生理功能，又规避了绝大部分的干细胞相关政策限制和伦理问题，而且不使用细胞本身也不存在细胞癌变等风险。
5.作为人体最大的器官，皮肤对于人类的健康和美感具有至关重要的作用。随着人们生活水平的逐步提高，皮肤健康和衰老问题日益受到重视；随着年龄增长和损伤积累，组织中成纤维细胞等皮肤细胞产生衰老反应，是皮肤衰老、皱纹产生的本质原因。
6.hucmscs外泌体等细胞产物在减轻心血管、肺组织、肾脏、肝脏和神经元等细胞和组织的氧化应激损伤效果，已经得到较多实验证明；但是目前较少成体系的用于皮肤细胞的论文和专利，而人类皮肤常年暴露在紫外线等损伤因素之下，又是较易发生氧化应激并产生衰老的器官，因此需要专门提供针对性的修护方案。鉴于此，发明人多年以来，将hucmscs外泌体等细胞产物应用于皮肤滋养修复治疗研究，着重研究其对皮肤细胞损伤修护方面的分子机制，发现其中活性氧簇损伤和wnt信号通路是皮肤细胞的损伤修护的核心信号通路。
7.申请人检索了将hucmscs的细胞产物应用在皮肤修护方向的相关论文和专利发现，申请号202010053757.2、201410775694.6、201610529860.3和201711104768.3等专利未
对hucmscs进行恰当的诱导，用以抑制凋亡小体产生，并诱导修复特异性的外泌体等；申请号201810461283 .8等专利利用超滤或者差速超速离心等分离纯化鉴定外泌体，用于科学研究尚可，但是用于生产环节，则大大增加了使用成本，并引起部分细胞囊泡破裂等问题；申请号201410775694.6和201811409240 .1等专利在使用方法上，没有提出既不损伤细胞产物成分，又可以方便长久保存的应用技术方案；申请号202010053757.2等专利在hucmscs的细胞产物的皮肤抗衰老方向应用上，未对致癌性、过敏性等问题进行系统评估，因此安全性存疑。基于上述问题，截止本专利申请为止，尚无技术体系成熟完整、疗效显著、经济方便又安全性良好的利用hucmscs的细胞产物进行皮肤细胞损伤修护的技术方案。


技术实现要素：

8.本专利涉及的各原料或仪器如无特殊说明，均为可以通过市购获得的常规产品。
9.本专利文本中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术条件或者按照产品说明书进行。
10.本专利文本中提及的“一般培养”指hucmscs的一般细胞培养过程，不包括添加小分子抑制剂或者激活剂调控wnt、nadph氧化酶、systemxc-和pp2a-gsk3β-mcl-1等信号通路的特异性诱导性培养过程。
11.本专利文本中涉及的hucmscs分离、一般培养、鉴定等过程，均采用了业内较为公认的技术方案，此类技术仍在改进中的一般性材料准备过程，不在专利保护范围内。
12.本专利文本中涉及的液体量、细胞量等规模数据，仅视为实现本发明效果的一个实施例，应用本专利的技术体系在不同规模生产的相关产品，也应视为本专利保护范围。
13.本发明涉及一种基于诱导培养脐带间充质干细胞产物并添加小分子的皮肤细胞损伤修复方案。利用小分子抑制剂或者激活剂调控wnt、nadph氧化酶、systemxc-和pp2a-gsk3β-mcl-1等信号通路的诱导性培养hucmscs，提高其细胞产物皮肤细胞损伤修复的能力，收集诱导培养的上清；在此基础上建立和优化了添加神经酰胺(1-7%)、胱氨酸(0.5-3%)、烟酰胺(0.2-2%)和硫辛酸(0.2-1.5%)等小分子，组成保湿剂、活性氧簇消除剂和脂质过氧化保护剂等原液复合配方，既能做到外泌体冻干还原过程中活性损失相对较小，又能与hucmscs细胞产物形成互补效应，达到高效修复皮肤细胞损伤的功能。
14.1.技术过程：1.1. hucmscs分离：采集新生儿脐带（经产妇本人同意并签署知情同意书），剪成3-5 cm小段，生理盐水充分洗涤后，去表皮以及血管留取华通胶(whartons jelly,wj )；剪碎至0.5-1.0 mm3组织块，均匀平铺于t75培养瓶底部，置于37 ℃，饱和湿度，体积分数为5% co2的标准培养箱中，1.5小时后加入10 ml含5%血清替代物的α-mem培养基，放入培养箱中，间隔6天换液，待细胞克隆长至80%左右融合度时，0.05%胰酶消化传代。做病原菌排查，若未检出细菌，至第3 代hucmscs液氮冻存备用。
15.1.2. hucmscs鉴定：取状态良好的第3代hucmscs，胰酶消化，计数并分装至流式管，每管约一百万个细胞，分别pbs清洗，用抗体稀释剂重悬，分别加入对应流式直标抗体（细胞周期组加入联科生物ccs01试剂盒1 ml dna staining solution），室温避光孵育1小时后流式细胞仪检测，鉴定数据(cd105:99.1
±
0.3%, cd90:98.6
±
0.5%, cd73:99.2
±
0.2%, cd109:98.4
±
0.4%, cd45:0.0
±
0.1%, cd34:0.1
±
0.1%, hla-drd:0.0
±
0.1%)均
符合国际细胞治疗协会定义的 mscs 标志性抗原表达鉴定标准。细胞周期分析表明，g0g1期占比为73.5
±
3.4%。
16.1.3. 特异性诱导性培养：利用10 ml无血清替代物的诱导培养液对第三代3代hucmscs进行扩增(置于37℃，饱和湿度，体积分数为5% co2的标准培养箱中，加入10 ml含5%血清替代物和下述浓度诱导配方的α-mem培养基，间隔2天全量换液，待细胞至80%-90%融合时，0.05%胰酶消化并按1：3比例传代)，留取扩增期间的上清液，离心去除细胞成分，液氮冻存7-300天备用。其中关键的诱导性培养液是利用小分子抑制剂或者激活剂调控wnt、nadph氧化酶、systemxc-和pp2a-gsk3β-mcl-1等信号通路，达到使hucmscs细胞产物具有促进皮肤损伤修复的效果，典型的信号通路小分子调控配方的培养液终浓度范围为：氯化锂(2-20 mmol/l)、罗布麻宁(5-50 μmol/l)、胱氨酸(0.2-1 mmol/l)、二甲双胍(0.8-8 mmol/l)。鉴于调节某一信号通路的小分子种类较多，例如除配方所列罗布麻宁外，2-acetylphenothiazine、setanaxib、vas2870和diphenyleneiodonium chloride等均有抑制nadph氧化酶活性的效果，因此本专利的hucmscs培养产物的原液配方保护权利应视为对wnt、nadph氧化酶、systemxc-和pp2a-gsk3β-mcl-1信号通路复合调节的保护，而将某一小分子组合视为专利的实施例。
17.1.4. 原液配置与冻干：本发明在长期干细胞研究与积累中结合组学分析，经过长期的细胞实验和人类志愿者随机双盲对照实验改进和验证，摸索出以hucmscs细胞产物结合复合配方来修护皮肤细胞损伤，并得出最适合的复合配方，其成分按照质量分数计算为：神经酰胺(1-7%)、烟酰胺(0.3-2.5%)、胱氨酸(0.2-1.5%)和硫辛酸(0.2-1.5%)。本配方中各组分化学结构清楚明确、理化性质较为稳定、理论推测和实验证明不存在互相干扰问题，因此对制备方法如各组分加入的先后顺序等并无特殊要求。
18.具体操作过程为，取1.3步骤的上清液，室温解冻，添加以质量分数计算的神经酰胺(1-7%)、胱氨酸(0.5-3%)、烟酰胺(0.2-2%)和硫辛酸(0.2-1.5%)配成原液，转移至-80 ℃ 低温冰箱，将-80℃冷存凝固的原液抽真空，升华干燥，除去冰晶最后制得冻干粉，-20℃ 保存。使用前生理盐水溶解至冻干前体积。
19.2.与现有技术相比，本发明有如下优势：2.1 本发明的特异性诱导培养，利用小分子抑制剂或者激活剂调控wnt、nadph氧化酶、systemxc-和pp2a-gsk3β-mcl-1等信号通路，使hucmscs细胞产物对皮肤细胞的损伤效果得到了极大的增强，详细效果见实施例1。
20.2.2从理论上讲，本发明原液配方各成分间存在复杂的良性互作，能产生强烈的增效协同作用。
21.2.2.1. 配方能维护稳定性：烟酰胺、胱氨酸和硫辛酸均为热稳定性较高的稳定化合物，可维持配方hucmscs细胞产物中表皮生长因子等活性大分子的稳定性；硫辛酸为活性氧簇清除剂，可保护hucmscs细胞产物中活性大分子免于被氧化失活。
22.2.2.2. 配方成分存在协同作用：烟酰胺与胱氨酸有协同作用，烟酰胺是机体合成nadph的重要原料，而nadph与systemxc-复合体转运胱氨酸形成活性氧簇消除的复合网络，在活性氧簇损伤中具有互相协同依赖的关系2.3.从实验数据看，以本发明技术方案制备的冻干粉能有效缓解修复皮肤细胞损伤(数据详见实施例1)。
23.2.4.从志愿者试用效果看，本发明技术方案的效果显著强于目前市售主流方案(数据详见实施例3)。
24.2.5. 在安全性看，本配方基础液来自各hucmscs细胞产物，并经过液氮冻存7-300天，完全杀灭原有细胞，不存在细胞致癌等安全问题。
25.2.6. 原液的各组分都来自公认的低毒性营养物质，并且在预实验中专门检查了配方的细胞毒性，并保证使用剂量不超过毒性阈值的5%；主要通过小剂量的复合配方的方式增加效果。另外，精确探明了配方各成分的作用范围和毒性阈值，从而使各组分的使用剂量有一定的宽容度，利于产品开发上市。
26.2.7. 本配方使用液氮冻存7-300天的hucmscs细胞产物，而不使用hucmscs细胞本身，不属于干细胞治疗范畴，因此不在我国《干细胞临床研究管理办法(试行)》管辖范围，不受双备案制度等影响，简化流程，利用产品尽快上市。
27.2.8. 本配方外用hucmscs细胞产物，基本不引起免疫反应，因此不局限于自体来源的干细胞，因此具有来源方便，具有工业生产中可标准化质控和大规模生产等优势。
28.3. 实施例下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员易于理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
29.3.1. 实施例1 基于高通量细胞实验的有效性评估实验在前期工作基础上，利用高通量实验，筛选出本配方各组分的较优剂量为神经酰胺(4%)、烟酰胺(1.5%)、胱氨酸(1.2%)和硫辛酸(0.6%)，按照依次按照发明内容1.1、1.2、1.3和1.4组成冻干粉a。
30.并且分别制备：含5%血清替代物的α-mem培养基冻干粉(基础液组)；正常培养的hucmscs上清液冻干粉(未诱导未添加组)；氯化锂(5 mmol/l)、罗布麻宁(10 μmol/l)、胱氨酸(0.5 mmol/l)、二甲双胍(3 mmol/l)诱导培养组上清冻干粉(已诱导未添加组)。
31.基于相关文献和本发明的前期工作，将冻干粉a与上述三种作为实验对照的冻干粉以去离子水稀释至原先体积，以5%体积分数添加到hacat细胞系（人永生化角质形成细胞）培养体系(mem 15�s)中，利用cck8法测定细胞活力，在5次独立实验的数据基础上进行t检验分析。4个实验组均添加终浓度为1 mmol/ld的过氧化氢以模拟皮肤细胞收到活性氧簇损伤的过程。之后以添加5%体积分数mem 15�s培养液和的细胞生长状况为100%
±
3.9%并作为基础阴性对照，则基础液组、未诱导未添加组、已诱导未添加组和本配方冻干粉a的细胞活力分别为99.2
±
3.7%、102.2
±
4.9%、147.2
±
6.8%和189.2
±
7.4%，利用t检验分析，发现与阴性对照相比相比，基础液组、未诱导未添加组、已诱导未添加组和本配方冻干粉a的p值分别为0.8093、0.5757、0.0005和0.0001，应该解读为基础液组和未诱导未添加组差异不显著（无细胞活力变化），而已诱导未添加组和本配方冻干粉a差异极显著（细胞活力显著增加）。上述数据表明，只有对hucmscs进行本发明所建立和优化的多信号通路调节的特异性诱导培养后，相应细胞产物才具有缓解活性氧簇致皮肤细胞损伤的效果；并且添加神经酰胺(4%)、烟酰胺(1.5%)、胱氨酸(1.2%)和硫辛酸(0.6%)配方能够极大提高损伤修复效果。
32.3.2. 实施例2 本发明应用于面膜的实施例取实施例1制取的冻干粉a，添加质量分数为20倍的去离子水混匀制备成面膜液；将面
膜纸浸润在面膜液中10分钟，等待期间洗净并擦干面部，将浸润面膜纸后剩余的面膜液均匀涂抹整个面部，将面膜敷于面部保持15-20分钟，使面部皮肤完全吸收面膜液，再次用清水清洗颜面部。
33.3.3. 实施例3 基于实施例2的随机双盲对照多中心志愿者实验2017年10月至2019年1月，在北京、西安和咸阳三座城市，分别选取各城市50例志愿者(共150人，平均年龄27.6岁，男女比例0.25，体质指数21.1)，分别使用外观无法分辨的本发明所制冻干粉a、销量排名前十的面膜b和面膜c，采用随机双盲对照原则进行志愿者实验，三天每次持续使用2个月，并依据《化妆品功效宣称评价指导原则》测定修护评分数据(皮肤含水量1-10，色素沉积1-10，胶原纤维1-10，皮肤血管异常增生1-10，皮脂膜评分1-10，新增痘印疤痕1-10，皮肤脱屑1-10，皮肤异常触感1-10，皮肤毛囊评分1-10)，结果显示，配方a最终能使志愿者的皮肤修护评分增加282%，分别是使用面膜b和面膜c效果的5.69倍和6.24倍，另外使用本发明所制冻干粉a、销量排名前十的面膜b和面膜c的志愿者都未报告任何不适，复查也未发现过敏、痤疮等任何不良影响。
34.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术方案范围内，做出简单变化或等效替换，也应视为本发明的保护范围。