本公开涉及JAK1途径抑制剂及其在治疗胃肠道疾病或病症中的用途。
背景技术
溃疡性结肠炎(UC)是全世界范围内最常见形式的炎症性肠病。它是一种慢性、特发性、复发性粘膜疾病，其通常累及直肠并在近端延伸以累及结肠，导致弥漫性脆性和糜烂伴出血。疾病程度与症状严重程度之间存在一定的相关性；然而，在许多患者中病程是温和的(Solberg等人，Scand.J.Gastroenterol.2009；44：431-440)。在大多数患者中，所述疾病的特征在于症状发作期和缓解期，并且随着时间的推移，患者也可能经历疾病延长。
UC患者通常经历直肠出血和腹泻的反复发作，常常与痉挛性腹痛和里急后重相关。标志性临床表现包括腹泻、直肠出血、粘液排出、里急后重、尿急和腹痛。特别是在更严重的病例中，患者也可能会经历疲劳、发热、体重减轻和脱水。UC的死亡率一般不会增加，但所述疾病可能呈现为危及生命的暴发性结肠炎。大多数患者在慢性间歇性过程后具有由疾病缓解期隔开的疾病活性增加期。在初始诊断之后，大约一半的患者将在任何单一时间点具有活动性疾病并且大约90％将具有以间歇性发作为特征的病程。
发展中国家的UC发病率从二十世纪中期起一直在稳定增加。UC的年发病率是每100,000人1.2至20.3例，最高发病率可见于北欧和北美洲群体中(Loftus等人，Gastroenterology 2004；126：1504-1517)。UC的典型发作发生在15至30岁之间(Andres等人，Gastroenterol.Clin.North Am.1999；28：255-281)。男性和女性似乎以相等的比例受到影响。西方化的环境和生活方式被视为炎症性肠病的风险因素。
当前UC疗法包括美沙拉明(mesalamine)、糖皮质激素、硫嘌呤以及TNFα和α4β7整合素的抑制剂。许多患者对这些疗法没有反应或具有不持续的反应。
尽管有这些治疗选择，但对于难治性、重度暴发性疾病或在一些情况下对于癌症预防而言，显著比例的UC患者仍需要结肠切除术。虽然UC患者常常被视为要通过结肠切除术和恢复性直肠结肠切除术来治愈，但生活质量可能不良并且手术可能会出现短期和长期并发症，包括女性生育力降低和发展结肠袋炎。
目前，没有当前药理学疗法能够提供UC的治愈。初级治疗目标是诱导缓解并且然后维持该状态。
因此，需要开发新疗法来治疗胃肠道疾病或病症，例如溃疡性结肠炎。本申请解决了这种需求和其他需求。
技术实现要素：
本文提供了治疗有需要的受试者的胃肠道疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐。
本文提供了一种用于治疗有需要的受试者的胃肠道疾病或病症的JAK1途径抑制剂。
本文提供了一种JAK1途径抑制剂用于制造用于治疗有需要的受试者的胃肠道疾病或病症的药剂的用途。
附图说明
图1描绘了针对以25mg单一剂量施用化合物1之后的个别最大粪便浓度的平均值的平均血浆浓度-时间曲线。
图2描绘了以25mg单一剂量施用化合物1之后的粪便浓度的个别血浆浓度-时间曲线。
图3描绘了在1小时温育之后健康和溃疡性结肠炎受试者的结肠中的[14C]化合物1浓度。
图4描绘了在如实施例3中所描述的患者中由化合物1处理组(PD可评价受试者)引起的IL-6和TPO诱导的STAT3磷酸化的变化。
图5描绘了在如实施例3中所描述的患者中IL-6刺激的STAT3磷酸化的抑制与功效度量(静态医师总体评估(sPGA)和银屑病面积和严重程度指数(PASI)相较于基线的变化)之间的相关性。
图6A描绘了在如实施例3中所描述的个体中在循环1第15天时IL-6诱导的STAT3磷酸化的变化。
图6B描绘了在如实施例3中所描述的个体中在循环1第15天时TPO诱导的STAT3磷酸化的变化。
图7A-7D显示了在自发性结肠炎的IL-10敲除小鼠模型中每天两次化合物1处理(30mg/kg)使症状(图7A)、大体组织(gross tissue)异常(图7B)减轻并且使组织病变的组织学证据(图7C-7D)减少。数据表示平均值 sem，n＝每个处理组9-10个。*p＜0.05，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图8A-8C显示了在噁唑酮诱导的结肠炎的小鼠模型中每天两次化合物1处理(30mg/kg)使症状(图8A)、组织损伤(图8B)和炎性肿胀(图8C)减轻。数据表示平均值 sem，n＝每个处理组8个。非参数双尾克鲁斯卡尔-沃利斯与邓恩氏检验(Kruskal-Wallis with Dunn′s test)用于结肠炎疾病和宏观评估。参数双尾ANOVA与霍尔姆-斯达克氏检验(Holm-Sidak′s test)用于结肠重量分析，*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001。
图9A-9B显示了在小鼠中TNBS诱导的结肠炎模型中经口施用(图9A)或经由结肠内注射(图9B)的每天两次化合物1处理使疾病严重程度显著降低。数据表示平均值 sem，n＝每个处理组3-8个。*p＜0.05，**p＜0.01。
图10显示了在自发性结肠炎的IL-10敲除(KO)小鼠模型中以30mg/kg每天两次用化合物1处理抑制疾病发作的结果。数据表示平均值 SEM，n＝每个处理组9-10个，并且p值是使用卡普兰-梅尔存活曲线(Kaplan-Meier survival curve)分析来计算的。SEM，标准平均误差。
图11A-11D表明在小鼠中TNBS诱导的结肠炎模型中经口(图11A)或经由结肠内注射(图11B)每天两次用化合物1处理使疾病严重程度显著降低。高剂量经口(图11C)和低剂量结肠内(图11D)达成超过IC50覆盖度的持续药物暴露。数据表示平均值 SEM，n＝每个处理组8个。IBD，炎症性肠病；SEM，标准平均误差。*p＜0.05，**p＜0.01。
图12A显示了在自发性结肠炎小鼠模型中在经口施用化合物1之后IL-10KO小鼠结肠中差异表达基因的火山图。
图12B显示了在自发性结肠炎小鼠模型中与媒介物组相比在化合物1处理的小鼠中统计显著性差异表达的基因。
图13A-13D显示了在炎症性肠病(IBD)的噁唑酮诱导的鼠模型中全身性和局部化结肠内化合物1递送的结果。在小鼠中噁唑酮诱导的结肠炎模型中经口(图13A、图13C)或结肠内(图13B、图13D)施用每天两次化合物1处理显著改善粪便硬度并且降低粪便潜血评分。数据表示平均值 SEM，n＝每个处理组8个。SEM：标准平均误差。**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图14A-14E显示了与媒介物相比由经口给予或直接给予至结肠中的化合物1引起的结肠缩短的代表图。在噁唑酮诱导的鼠结肠炎模型中与各别媒介物处理的对照(图14A、图14C)相比经口(图14B)和结肠内(图14D)化合物1处理显著改善结肠缩短。结肠长度数据(图14E)是以平均值 SEM作图，n＝每个处理组8个。SEM：标准平均误差。****p＜0.0001。
图15A-15B表明全身化合物1递送与对IL-10KO小鼠中的结肠形态的显著保护作用相关。图15A显示代表性结肠并且图15B显示苏木精/曙红染色的结肠切片。图15B中的白色箭头指示单核细胞浸润的区域。20x放大倍数，条柱＝100μm。
具体实施方式
本发明尤其提供一种治疗有需要的受试者的胃肠道疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐。
本文所描述的方法利用JAK1途径抑制剂，特别是JAK1选择性抑制剂。JAK1选择性抑制剂是相较于其他詹纳斯激酶(Janus kinases)优先抑制JAK1活性的化合物。JAK1在失调时可引起或促成疾病状态的许多细胞因子和生长因子信号传导途径中起关键作用。JAK1已显示与其他JAK合作介导与包括溃疡性结肠炎(UC)在内的许多炎症性病症相关的许多炎性细胞因子的信号传导。通过靶向多个UC相关细胞因子途径抑制JAK/STAT信号传导具有同时减轻炎症、减少主要免疫细胞的细胞活化和增殖的潜能并且因此对于UC治疗而言代表一种有前景的治疗策略。用于治疗UC的托法替尼(Tofacitinib)最近由FDA批准。然而，作为全身作用的泛JAK抑制剂，托法替尼疗法似乎带有增加的免疫抑制风险(Sandborn等人，N.Engl.J.Med.2017；376：1723-1736)。
JAK1途径抑制剂，明确地说化合物1(即，{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈，参见表1)，当以持续释放形式并且以低于用于全身疗法的剂量的剂量施用时，使结肠暴露最大化，同时使全身暴露最小化(参见例如实施例1)。因此，JAK1途径抑制剂的功效预期主要通过局部而非全身JAK1抑制来介导。
另外，患有胃肠道疾病的患者可受益于JAK1抑制，特别是选择性JAK1途径抑制。JAK1的选择性抑制剂可为有效的，同时避免不必要的并且可能不希望的抑制其他JAK激酶的作用。
因此，本文提供了治疗受试者的胃肠道相关疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐，其中在施用JAK1途径抑制剂之后JAK1途径抑制剂的最大粪便浓度大于或等于约25nM；并且在施用JAK1途径抑制剂之后最大总血浆浓度(C最大)小于或等于约450nM。
最大粪便浓度可通过在施用JAK1途径抑制剂之后一段时间(例如施用JAK1途径抑制剂之后0至约48小时)使用例如液相色谱法加串联质谱(LC-MS/MS)分析测量粪便浓度来测定。测量化合物1的粪便浓度可通过本文实施例C中所描述的方法来进行。
在一些实施方案中，在施用JAK1途径抑制剂之后JAK1途径抑制剂的最大粪便浓度大于或等于约25nM、约30nM、约35nM、约40nM、约45nM、约50nM、约55nM、约60nM、约65nM、约70nM、约75nM、约80nM、约85nM、约90nM、约95nM或约100nM。在一些实施方案中，在施用JAK1途径抑制剂之后JAK1途径抑制剂的最大粪便浓度大于或等于约50nM。在一些实施方案中，在施用JAK1途径抑制剂之后JAK1途径抑制剂的最大粪便浓度在约25nM与100nM之间。
最大总血浆浓度(即，C最大)可通过在施用JAK1途径抑制剂之后一段时间(例如施用JAK1途径抑制剂之后0至约48小时)使用例如液相色谱法加串联质谱(LC-MS/MS)分析测量血浆浓度来测定。测量化合物1的血浆浓度可通过本文实施例C中所描述的方法来进行。
在一些实施方案中，在施用JAK1途径抑制剂之后JAK1途径抑制剂的最大总血浆浓度小于或等于约450nM、约425nM、约400nM、约375nM、约350nM、约325nM、约300nM、约275nM、约250nM、约225nM、约200nM、约175nM、约150nM、约125nM、约100nM、约75nM或约50nM。在一些实施方案中，在施用JAK1途径抑制剂之后JAK1途径抑制剂的最大总血浆浓度小于或等于约150nM。在一些实施方案中，在施用JAK1途径抑制剂之后JAK1途径抑制剂的最大总血浆浓度小于或等于约141nM。在一些实施方案中，在施用JAK1途径抑制剂之后JAK1途径抑制剂的最大总血浆浓度小于或等于约100nM。在一些实施方案中，最大总血浆浓度在约25nM与100nM之间。
在一些实施方案中，在施用JAK1途径抑制剂之后JAK1途径抑制剂的最大未结合血浆浓度小于或等于约150nM。最大未结合血浆浓度可由JAK1途径抑制剂的最大总血浆浓度(参见例如实施例C)和体外蛋白结合得到，体外蛋白结合可通过平衡渗析来确定。在一些实施方案中，在施用JAK1途径抑制剂之后JAK1途径抑制剂的最大未结合血浆浓度小于或等于约150nM、约125nM、约100nM、约75nM、约50nM或约25nM。在一些实施方案中，在施用JAK1途径抑制剂之后JAK1途径抑制剂的最大未结合血浆浓度小于或等于约100nM。
在一些实施方案中，在施用JAK1途径抑制剂之后JAK1途径抑制剂的最大未结合血浆浓度小于或等于约50nM。
在一些实施方案中，最大未结合血浆浓度相较于最大粪便浓度的比率小于或等于约6、约5、约4、约3、约2或约1。在一些实施方案中，最大未结合血浆浓度相较于最大粪便浓度的比率小于或等于约2。在一些实施方案中，最大未结合血浆浓度相较于最大粪便浓度的比率在约1与约6之间。
在本文所提供的方法的一些实施方案中，胃肠道相关疾病或病症选自溃疡性结肠炎、克罗恩病(Crohn′s disease)和乳糜泻。
在一些实施方案中，胃肠道疾病是复发性、难治性或复发性和难治性溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，受试者未能对先前针对溃疡性结肠炎所施用的治疗作出反应。在其他实施方案中，受试者对先前针对溃疡性结肠炎所施用的治疗不耐受。在一些实施方案中，先前施用的治疗选自(a)口服皮质类固醇，(b)AZA或6-MP，或(c)生物剂疗法，例如英夫利昔单抗(infliximab)或阿达木单抗(adalimumab)。
I.JAK1途径抑制剂
本文所描述的方法利用JAK1途径抑制剂。在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂相较于JAK2、JAK3和TYK2对JAK1具选择性(即，JAK1选择性抑制剂)。举例来说，本文所描述的化合物或其药学上可接受的盐相较于JAK2、JAK3和TYK2中的一者或多者优先抑制JAK1。在一些实施方案中，化合物相较于JAK2优先抑制JAK1(例如，具有＞1的JAK2/JAK1 IC50比率)。在一些实施方案中，化合物或盐相较于JAK2对JAK1具有高约10倍的选择性。在一些实施方案中，化合物或盐如通过在1mM ATP下测量IC50(例如参见实施例A)所计算相较于JAK2对JAK1具有高约3倍、约5倍、约10倍、约15倍或约20倍的选择性。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂是表1的化合物或其药学上可接受的盐。表1中的化合物是选择性JAK1抑制剂(即，JAK1途径抑制剂，其相较于JAK2、JAK3和TYK2具选择性)。在1mM ATP下通过实施例A的方法获得的IC50值示于表1中。
表1
表示＜10nM(测定条件参见实施例A)
表示≤100nM(测定条件参见实施例A)
表示≤300nM(测定条件参见实施例A)
a对映异构体1的数据
b对映异构体2的数据
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂是{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂是{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈己二酸盐。
{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈及其己二酸盐的合成和制备可见于例如2011年3月9日提交的美国专利公开第2011/0224190号、2012年9月6日提交的美国专利公开第2013/0060026号和2014年3月5日提交的美国专利公开第2014/0256941号中，所述专利公开中的每一者通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂是4-[3-(氰甲基)-3-(3′，5′-二甲基-1H，1′H-4，4′-联吡唑-1-基)氮杂环丁烷-1-基]-2，5-二氟-N-[(1S)-2，2，2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂是4-[3-(氰甲基)-3-(3′，5′-二甲基-1H，1′H-4，4′-联吡唑-1-基)氮杂环丁烷-1-基]-2，5-二氟-N-[(1S)-2，2，2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺磷酸盐。
4-[3-(氰甲基)-3-(3′，5′-二甲基-1H，1′H-4，4′-联吡唑-1-基)氮杂环丁烷-1-基]-2，5-二氟-N-[(1S)-2，2，2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺及其磷酸盐的合成和制备可见于例如2014年5月16日提交的美国专利公开第2014/0343030号中，所述专利公开通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂是((2R，5S)-5-{2-[(1R)-1-羟乙基]-1H-咪唑并[4，5-d]噻吩并[3，2-b]吡啶-1-基}四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂是((2R，5S)-5-{2-[(1R)-1-羟乙基]-1H-咪唑并[4，5-d]噻吩并[3，2-b]吡啶-1-基}四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈单水合物。
((2R，5S)-5-{2-[(1R)-1-羟乙基]-1H-咪唑并[4，5-d]噻吩并[3，2-b]吡啶-1-基}四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈的合成及其无水和单水合物形式的表征描述于2013年10月31日提交的美国专利公开第2014/0121198号和2015年4月29日提交的美国专利公开第2015/0344497号中，所述专利公开中的每一者通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，表1的化合物是通过以下专利公开中所描述的合成程序来制备：2011年3月9日提交的美国专利公开第2011/0224190号、2014年5月16日提交的美国专利公开第2014/0343030号、2013年10月31日提交的美国专利公开第2014/0121198号、2010年5月21日提交的美国专利公开第2010/0298334号、2010年8月31日提交的美国专利公开第2011/0059951号、2011年11月18日提交的美国专利公开第2012/0149681号、2011年11月18日提交的美国专利公开第2012/0149682号、2012年6月19日提交的美国专利公开2013/0018034、2012年8月17日提交的美国专利公开第2013/0045963号和2013年5月17日提交的美国专利公开第2014/0005166号，所述专利公开中的每一者通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂选自以下专利公开的化合物或其药学上可接受的盐：2011年3月9日提交的美国专利公开第2011/0224190号、2014年5月16日提交的美国专利公开第2014/0343030号、2013年10月31日提交的美国专利公开第2014/0121198号、2010年5月21日提交的美国专利公开第2010/0298334号、2010年8月31日提交的美国专利公开第2011/0059951号、2011年11月18日提交的美国专利公开第2012/0149681号、2011年11月18日提交的美国专利公开第2012/0149682号、2012年6月19日提交的美国专利公开2013/0018034、2012年8月17日提交的美国专利公开第2013/0045963号和2013年5月17日提交的美国专利公开第2014/0005166号，所述专利公开中的每一者通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂是式I化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
X是N或CH；
L是C(＝O)或C(＝O)NH；
A是苯基、吡啶基或嘧啶基，其中的每一者任选地被1个或2个独立选择的R1基团取代；并且
每个R1独立地是氟或三氟甲基。
在一些实施方案中，式I化合物是{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，式I化合物是4-{3-(氰甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-1-基}-N-[4-氟-2-(三氟甲基)苯基]哌啶-1-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，式I化合物是[3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-1-(1-{[2-(三氟甲基)嘧啶-4-基]羰基}哌啶-4-基)氮杂环丁烷-3-基]乙腈或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂是式II化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
R2是C1-6烷基、C1-6卤烷基、C3-6环烷基或C3-6环烷基-C1-3烷基，其中所述C1-6烷基、C3-6环烷基和C3-6环烷基-C1-3烷基各自任选地被1、2或3个独立地选自氟、-CF3和甲基的取代基取代；
R3是H或甲基；
R4是H、F或Cl；
R5是H或F；
R6是H或F；
R7是H或F；
R8是H或甲基：
R9是H或甲基；
R10是H或甲基；并且
R11是H或甲基。
在一些实施方案中，式II化合物是4-[3-(氰甲基)-3-(3′，5′-二甲基-1H，1′H-4，4′-联吡唑-1-基)氮杂环丁烷-1-基]-2，5-二氟-N-[(1S)-2，2，2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂是式III化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
Cy4是四氢-2H-吡喃环，其任选地被1个或2个独立地选自以下的基团取代：CN、OH、F、Cl、C1-3烷基、C1-3卤烷基、氰基-C1-3烷基、HO-C1-3烷基、氨基、C1-3烷基氨基和二(C1-3烷基)氨基，其中所述C1-3烷基和二(C1-3烷基)氨基任选地被1、2或3个独立地选自F、Cl、C1-3烷基氨基磺酰基和C1-3烷基磺酰基的取代基取代；并且
R12是CH2-OH、-CH(CH3)-OH或-CH2-NHSO2CH3。
在一些实施方案中，式III化合物是((2R，5S)-5-{2-[(1R)-1-羟乙基]-1H-咪唑并[4，5-d]噻吩并[3，2-b]吡啶-1-基}四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂是按以游离碱计每天约1mg至约100mg、约3mg至约100mg、约5mg至约100mg、约10mg至约100mg、约10mg至约75mg或约25mg至约75mg的量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂是按以游离碱计每天约1mg至约100mg、约3mg至约100mg、约5mg至约100mg、约10mg至约100mg、约10mg至约75mg或约25mg至约75mg的量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂是按以游离碱计每天约10mg至约100mg的量施用。因此，在一些实施方案中，选择性JAK1途径抑制剂是按以游离碱计每天约1mg、约3mg、约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg或约100mg的量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约50mg至约100mg的日剂量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约25mg至约50mg的日剂量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约25mg至约75mg的日剂量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约1mg的日剂量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约2mg的日剂量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约2.5mg的日剂量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约3mg的日剂量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约5mg的日剂量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约10mg的日剂量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约15mg的日剂量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约25mg的日剂量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约30mg的日剂量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约50mg的日剂量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约100mg的日剂量施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是每天以约25mg的剂量施用一次。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约1mg/kg至约50mg/kg的日剂量(例如以每天一次或两次剂量)施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约3mg/kg至约30mg/kg的日剂量(例如以每天一次或两次剂量)施用。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约3mg/kg的每天两次(BID)剂量施用，总计每天施用约6mg/kg。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约3mg/kg的每天两次(BID)结肠内剂量施用，总计每天施用约6mg/kg。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约30mg/kg的每天两次(BID)剂量施用，总计每天施用约60mg/kg。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以约30mg/kg的每天两次(BID)口服剂量施用，总计每天施用约60mg/kg。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是每天以约25mg的剂量施用两次，总计每天施用约50mg。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是每天以约50mg的剂量施用一次。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是每天以约50mg的剂量施用两次，总计每天施用约100mg。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是每天以约100mg的剂量施用一次。
在一些实施方案中，JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以一个或多个持续释放剂型施用，所述一个或多个持续释放剂型各自包含JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐。
本文提供了一种治疗受试者的胃肠道疾病的方法，所述方法包括向受试者施用约25mg至100mg的日剂量的JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐，其中JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐是以一个或多个持续释放剂型施用，所述一个或多个持续释放剂型包含JAK1途径抑制剂或其药学上可接受的盐。
本文所描述的实施方案旨在以任何合适的组合进行组合，如同所述实施方案是多个附属项一般(例如与选择性JAK1途径抑制剂及其剂量有关的实施方案、与最大血浆浓度(总血浆浓度或未结合血浆浓度)有关的实施方案、与本文所公开的化合物的任何盐形式有关的实施方案、与胃肠道相关疾病的个别类型有关的实施方案以及与组合物和/或施用有关的实施方案可以任何组合进行组合)。
本文还提供了一种治疗选自由以下组成的组的胃肠道疾病的方法：炎症性肠道病症、溃疡性结肠炎、自发性结肠炎、克罗恩病和乳糜泻。在一些实施方案中，胃肠道疾病选自由溃疡性结肠炎、克罗恩病和乳糜泻组成的组。
在一些实施方案中，胃肠道疾病选自由炎症性肠道病症和自发性结肠炎组成的组。
在一些实施方案中，胃肠道疾病是自发性结肠炎。
举例来说，本文提供了一种治疗有需要的受试者的选自由溃疡性结肠炎、克罗恩病和乳糜泻组成的组的胃肠道疾病的方法，所述方法包括向受试者施用{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈或其药学上可接受的盐，其中在施用{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈或其药学上可接受的盐之后{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈的最大粪便浓度大于约25nM，并且其中在施用{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈或其药学上可接受的盐之后{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈的最大总血浆浓度小于约150nM。
本文还提供了一种治疗受试者的选自由溃疡性结肠炎、克罗恩病和乳糜泻组成的组的胃肠道疾病的方法，所述方法包括每天向受试者施用一次以游离碱计约25mg至约100mg的剂量的{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈或其药学上可接受的盐，其中剂量包含一个或多个持续释放剂型，所述一个或多个持续释放剂型各自包含{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈或其药学上可接受的盐。
本文还提供了一种治疗受试者的选自由溃疡性结肠炎、克罗恩病和乳糜泻组成的组的胃肠道疾病的方法，所述方法包括每天向受试者施用两次以游离碱计约25mg的剂量的{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈或其药学上可接受的盐，其中剂量包含一个或多个持续释放剂型，所述一个或多个持续释放剂型各自包含{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈或其药学上可接受的盐。
本文还提供了一种治疗受试者的选自由溃疡性结肠炎、克罗恩病和乳糜泻组成的组的胃肠道疾病的方法，所述方法包括每天向受试者施用两次以游离碱计约50mg的剂量的{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈或其药学上可接受的盐，其中剂量包含一个或多个持续释放剂型，所述一个或多个持续释放剂型各自包含{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈或其药学上可接受的盐。
{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)异烟酰基]哌啶-4-基}-3[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈或其药学上可接受的盐(表1，化合物1)的持续释放剂型可见于2014年8月6日提交的美国公开第2015-0065484号中，所述公开特此通过引用整体并入。也参见下文的实施例B。
仅仅为了简洁起见，本文中未单独列举所有可能的组合。
本文所描述的化合物可以是不对称的(例如具有一个或多个立体中心)。除非另外指出，否则预期所有立体异构体，例如对映异构体和非对映异构体。含有不对称取代的碳原子的化合物可被分离呈光学活性或外消旋形式。关于如何从非光学活性起始物质制备光学活性形式的方法是本领域中已知的，例如通过解析外消旋混合物或通过立体选择性合成。烯烃、C＝N双键等的许多几何异构体也可存在于本文所描述的化合物中，并且本发明中涵盖所有此类稳定异构体。描述了本发明化合物的顺式和反式几何异构体并且可被分离呈异构体混合物形式或呈分离的异构体形式。
在一些实施方案中，化合物具有(R)-构型。在一些实施方案中，化合物具有(S)-构型。
化合物的外消旋混合物的解析可通过本领域中已知的许多方法中的任一者来进行。示例性方法包括使用手性解析酸的分步再结晶，所述手性解析酸是光学活性成盐有机酸。适合于分步再结晶方法的解析剂是例如光学活性酸，例如D和L形式的酒石酸、二乙酰酒石酸、二苯甲酰酒石酸、苦杏仁酸、苹果酸、乳酸或各种光学活性樟脑磺酸，例如β-樟脑磺酸。适合于分步结晶方法的其他解析剂包括立体异构纯形式的α-甲基苯甲胺(例如S和R形式，或非对映异构纯形式)、2-苯基甘氨醇、降麻黄碱、麻黄碱、N-甲基麻黄碱、环己基乙胺、1，2-二氨基环己烷等。
外消旋混合物的解析也可通过在填充有光学活性解析剂(例如二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)的柱上洗脱来进行。合适的洗脱溶剂组合物可由本领域技术人员确定。
本文所描述的化合物也包括互变异构体形式。互变异构体形式由单键与相邻双键交换以及伴随的质子迁移引起。互变异构体形式包括质子异变互变异构体，其是具有相同经验式和总电荷的异构质子化状态。示例性质子异变互变异构体包括酮-烯醇对、酰胺-亚胺酸对、内酰胺-内酰亚胺对、烯胺-亚胺对和环形形式，其中质子可占据杂环系统的两个或更多个位置，例如1H-咪唑和3H-咪唑；1H-1，2，4-三唑、2H-1，2，4-三唑和4H-1，2，4-三唑；1H-异吲哚和2H-异吲哚；以及1H-吡唑和2H-吡唑。互变异构体形式可处于平衡中或通过适当取代在空间上锁定至一种形式中。
本文所描述的化合物也可包括同位素标记的本公开化合物。“同位素地”或“放射性标记的”化合物是其中一个或多个原子被原子量或质量数不同于在自然界中通常发现(即天然存在)的原子量或质量数的原子置换或取代的本公开化合物。可并入本公开化合物中的合适的放射性核素包括但不限于2H(对于氚也写作D)、3H(对于氚也写作T)、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、18F、35S、36Cl、82Br、75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I和131I。举例来说，本公开化合物中的一个或多个氢原子可被氚原子置换(例如式(I)、(II)、或(III)的C1-6烷基或表1的化合物的一个或多个氢原子可任选地被氚原子取代，例如-CD3取代-CH3)。
除非名称指示特定立体异构体，否则如本文所用的术语“化合物”意在包括所描绘结构的所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。除非另外指明，否则本文中以名称或结构鉴定为一种特定互变异构体形式的化合物旨在包括其他互变异构体形式。
在一些实施方案中，本文所描述的化合物或其盐是基本上分离的。“基本上分离”意指化合物至少部分地或基本上与形成或检测到它的环境分离。部分分离可包括例如富集本文所描述的化合物的组合物。基本上分离可包括含有至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％、至少约90重量％、至少约95重量％、至少约97重量％或至少约99重量％的本文所描述的化合物或其盐的组合物。用于分离化合物及其盐的方法是本领域中的常规方法。
所有化合物及其药学上可接受的盐可与其他物质(例如水和溶剂)一起存在(例如水合物和溶剂化物)或者可被分离。当呈固态时，本文所描述的化合物及其盐可以各种形式存在并且可例如采取溶剂化物(包括水合物)的形式。化合物可呈任何固态形式，例如多晶型物或溶剂化物，因此除非明确指明，否则本说明书中提及化合物及其盐应理解为涵盖化合物的任何固态形式。
短语“药学上可接受”在本文中用于指在合理医学判断范围内适合于与人类和动物的组织接触而不会有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症并且符合合理效益/风险比的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
本发明还包括本文所描述的化合物的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中通过将现有酸或碱部分转化成其盐形式来对母体化合物进行修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于具有例如胺的碱性残基的无机酸或有机酸盐；具有例如羧酸的酸性残基的碱性或有机盐；等等。本发明的药学上可接受的盐包括所形成的母体化合物的例如来自无毒无机或有机酸的无毒盐。本发明的药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。一般而言，此类盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当碱或酸于水中或有机溶剂中或两者的混合物中反应来制备；一般而言，非水介质如醚、乙酸乙酯、醇(例如甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇)或乙腈(MeCN)是优选的。合适的盐的列表可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，(Mack Publishing Company，Easton，1985)，第1418页；Berge等人，J.Pharm.Sci.，1977，66(1)，1-19；和Stahl等人，Handbook of Pharmaceutical Salts.：Properties，Selection，and Use，(Wiley，2002)中。在一些实施方案中，本文所描述的化合物包括N-氧化物形式。
术语“个体”、“患者”和“受试者”可互换使用，并且指任何动物，包括哺乳动物，优选是小鼠、大鼠、其他啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物，并且最优选是人类。
短语“治疗有效量”是指活性化合物或药剂在组织、系统、动物、个体或人类中引发研究者、兽医、医生或其他临床医师所探寻的生物或医学反应的量。
术语“治疗(treating/treatment)”是指以下中的一者或多者：(1)抑制疾病；例如抑制经历或展现疾病、疾患或病症的病变或症状的个体的疾病、疾患或病症(即阻止病变和/或症状的进一步发展)；以及(2)改善疾病；例如改善经历或展现疾病、疾患或病症的病变或症状的个体的疾病、疾患或病症(即逆转病变和/或症状)，例如降低疾病的严重程度。在一个实施方案中，治疗包括预防或降低发展疾病的风险；例如预防或降低可能易患疾病、疾患或病症但未经历或展示疾病的病变或症状的个体发展疾病、疾患或病症的风险。
对于术语“例如”和“诸如”及其语法等效形式，除非另外明确陈述，否则应理解为后接短语“但不限于”。
除非上下文另外明确指示，否则如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。
如本文所用，术语“约”意指“大约”(例如加上或减去所指示值的约10％)。
组合疗法
本文所描述的方法还可包括施用一种或多种额外的治疗剂。这些治疗剂包括抗炎剂、类固醇、免疫抑制剂或治疗性抗体。
例如，本文所描述的方法可与例如以下的当前UC疗法组合使用：口服关沙拉明(5-ASA)、口服皮质类固醇、氮杂硫嘌呤(AZA)、6-巯基嘌呤(6-MP)和甲氨蝶呤、英夫利昔单抗、维多珠单抗(vedolizumab)、粘膜地址素细胞粘附分子(MADCAM1)抑制剂和粪便移植。
例如，可将口服5-ASA(关沙拉明，例如约1600毫克/天至约2400毫克/天)或柳氮磺胺吡啶(多至例如约1000毫克/天至4000毫克/天)与JAK1途径抑制剂一起施用用于本文所描述的方法中的任一者。
作为另一实例，可将口服皮质类固醇(例如约0.5毫克/天至约60毫克/天泼尼松(prednisone)或口服皮质类固醇等效物)与JAK1途径抑制剂一起施用用于本文所描述的方法中的任一者。
作为另一实例，也可将约50毫克/天至约225毫克/天的氮杂硫嘌呤、多至例如约30毫克/天至约112.5毫克/天的6-巯基嘌呤或每周多至例如约25mg的甲氨蝶呤与JAK1途径抑制剂一起施用用于本文所描述的方法中的任一者。在一些实施方案中，将氮杂硫嘌呤以约50毫克/天至约100毫克/天与JAK1途径抑制剂一起施用用于本文所描述的方法中的任一者。在其他实施方案中，将6-巯基嘌呤以约30毫克/天至约50毫克/天与JAK1途径抑制剂一起施用用于本文所描述的方法中的任一者。
作为另一实例，可将用于诱导和维持的2-10mg/kg(例如5mg/kg)的一系列英夫利昔单抗与JAK1途径抑制剂一起施用用于本文所描述的方法中的任一者。在一些实施方案中，在零周、两周和六周时以5mg/kg施用英夫利昔单抗，接着此后每八周一次。
作为另一实例，可将约200至约400mg(例如300mg)的剂量的维多珠单抗与JAK1途径抑制剂一起施用用于本文所描述的方法中的任一者。在一些实施方案中，在零周、两周和六周时施用维多珠单抗，接着此后每八周一次。
当向受试者施用超过一种药剂时，其可同时、依序或组合施用(例如对于超过两种药剂)。
组合物
化合物可以药物组合物形式施用。这些组合物可以医药技术中众所周知的方式来制备，并且可视指示局部或全身治疗并且视待治疗的区域而定通过多种途径来施用。施用可为经表面(包括透皮、经表皮、经眼和至粘膜，包括经鼻内、经阴道和经直肠递送)、经肺(例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过喷雾器；经气管内或经鼻内)、经口或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内肌肉内或注射或输注；或颅内(例如鞘内或心室内)施用。肠胃外施用可呈单一团注剂量形式，或者可例如通过连续灌注泵进行。用于表面施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾、液体和粉末。常规药物载体；水性、粉末或油性基质；增稠剂等可为必需的或需要的。在一些实施方案中，施用是经口施用。在一些实施方案中，施用是结肠内施用。
药物组合物可含有作为活性成分的化合物或其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的载体(赋形剂)的组合。在一些实施方案中，组合物适合用于表面施用。在制备组合物时，活性成分通常与赋形剂混合，由赋形剂稀释或密封于呈例如胶囊、香囊、纸或其他容器形式的此类载体内。当赋形剂充当稀释剂时，其可为充当活性成分的媒介物、载体或介质的固体、半固体或液体材料。因此，组合物可呈片剂、丸剂、粉末、糖锭、香囊、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或于液体介质中)、含有例如多至10重量％的活性化合物的软膏、软质和硬质明胶胶囊、栓剂、无菌可注射溶液和无菌包装粉末的形式。
在制备制剂时，活性化合物可在与其他成分组合之前经研磨以提供适当的粒度。如果活性化合物是基本上不溶性的，则其可研磨至小于200目的粒度。如果活性化合物是基本上水溶性的，则可通过研磨调节粒度以在制剂中提供基本上均匀的分布，例如约40目。
可使用例如湿磨的已知研磨程序来研磨化合物以获得适合用于片剂形成和其他制剂类型的粒度。本发明化合物的细粉状(纳米颗粒)制剂可通过本领域中已知的方法来制备，参见例如WO 2002/000196。
合适的赋形剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。制剂可另外包括：润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化和悬浮剂；防腐剂，例如甲基-苯甲酸盐和丙基羟基-苯甲酸盐；以及甜味剂和调味剂。本发明的组合物可经配制以在通过采用本领域中已知的程序向患者施用之后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
用于配制药物组合物的组分具有高纯度并且基本上不含可能有害的污染物(例如至少国家食物级，通常至少分析级，并且更通常至少医药级)。特定而言，对于人类消耗，组合物优选是根据如美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)的适用法规中所规定的优良制造规范标准进行制造或配制。例如，合适的制剂可为无菌的和/或基本上等张的和/或完全符合美国食品和药物管理局的所有优良制造规范法规。
活性化合物可在广泛剂量范围内有效并且通常以治疗有效量施用。然而，应了解，实际上施用的化合物量将通常由医师根据相关情况来确定，包括待治疗的疾患、所选施用途径、所施用的实际化合物、个别患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重程度等。
本发明化合物的治疗剂量可根据例如进行治疗的特定用途、化合物的施用方式、患者的健康和状况以及处方医师的判断而变化。药物组合物中的本发明化合物的比例或浓度可视许多因素而变化，包括剂量、化学特性(例如疏水性)和施用途径。
对于制备例如片剂的固体组合物，主要活性成分与药物赋形剂混合以形成含有本发明化合物的均匀混合物的固体预配制组合物。当提及这些预配制组合物为均匀的时，活性成分通常均匀分散在整个组合物中，使得组合物可容易地再分成同等有效的单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊。这种固体预制剂接着再分成含有例如约0.1至约1000mg的本发明活性成分的上文所描述的类型的单位剂型。
本发明的片剂或丸剂可包覆包衣或以其他方式混配以提供得到延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内部剂量和外部剂量组分，后者呈于前者上的包膜的形式。两个组分可由肠溶层隔开，所述肠溶层用以抵抗在胃中的崩解并且准许内部组分完好地传送至十二指肠中或在释放时有所延迟。多种材料可用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括许多聚合酸和聚合酸与例如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的材料的混合物。
本发明的化合物和组合物可并入其中以便经口或通过注射施用的液体形式包括水溶液、经适当调味的糖浆、水性或油性悬浮液和用食用油(例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)调味的乳液以及酏剂和类似药物媒介物。
向患者施用的化合物或组合物的量将视正在施用什么、施用目的(例如预防或治疗)、患者状态、施用方式等而变化。在治疗应用中，可以足以治愈或至少部分抑制疾病症状及其并发症的量向已罹患疾病的患者施用组合物。有效剂量将视正在治疗的疾病疾患而定，并且由主治临床医师根据例如以下的因素来判断：疾病的严重程度、患者的年龄、体重和一般状况等。
向患者施用的组合物可为呈上文所描述的药物组合物的形式。这些组合物可通过常规灭菌技术来灭菌，或者可经无菌过滤。水溶液可按原样包装供使用，或经冻干，冻干制剂在施用之前与无菌水性载体组合。化合物制剂的pH通常将在3与11之间，更优选5至9并且最优选7至8。应了解，前述赋形剂、载体或稳定剂中的某些的使用将引起医药盐的形成。
试剂盒
本申请还包括适用的药物试剂盒，其包括一个或多个容器，所述一个或多个容器含有包含治疗有效量的化合物或其实施方案中的任一者的药物组合物。如本领域技术人员将容易显而易知的，此类试剂盒还可包括各种常规药物试剂盒组分中的一者或多者，例如含有一种或多种药学上可接受的载体的容器、额外容器等。试剂盒中还可包括呈插页形式或呈标签形式的说明书，其指示待施用的组分的量、施用准则和/或混合组分的准则。
实施例
将经由特定实施例更详细地描述本发明。以下实施例是出于说明目的而提供，并且不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地识别多个非关键参数，其可被改变或修改以得到基本上相同的结果。
实施例A：体外JAK激酶测定
根据Park等人，Analytical Biochemistry 1999，269，94-104中所描述的以下体外测定，针对对JAK靶标的抑制活性对可用于治疗细胞因子相关疾病或病症的JAK1途径抑制剂进行测试。使用杆状病毒使人类JAK1(氨基酸837-1142)、JAK2(氨基酸828-1132)和JAK3(氨基酸781-1124)的具有N端His标签的催化结构域在昆虫细胞中表达并纯化。通过测量生物素化肽的磷酸化来测定JAK1、JAK2或JAK3的催化活性。通过均相时间分辨荧光(HTRF)检测磷酸化肽。针对每个激酶在40微升反应中测量化合物的IC50，所述40微升反应含有于含100mM NaCl、5mM DTT和0.1mg/mL(0.01％)BSA的50mM Tris(pH 7.8)缓冲液中的酶、ATP和500nM肽。对于1mM IC50测量，反应中的ATP浓度是1mM。反应在室温下进行1小时并且接着使用20μL含45mM EDTA、300nM SA-APC、6nM Eu-Py20的测定缓冲液(Perkin Elmer，Boston，MA)停止反应。与铕标记的抗体的结合进行40分钟并且在融合板读数器(Perkin Elmer，Boston，MA)上测量HTRF信号。在此测定中对表1中的化合物进行测试并且显示其具有表1中的IC50值。
实施例B：化合物1的持续释放制剂的制备
使用呈下表中所示的量的赋形剂制备包含化合物1的持续释放片剂。SR1片剂使用方案A，SR2片剂使用方案B，SR3片剂和25mg SR片剂使用方案C，并且SR4片剂使用方案D。这些程序公开于美国专利公开第2015/0065484号中，所述专利公开涉及化合物1的持续释放剂型。
方案A：
步骤1.个别地将化合物1的己二酸盐、微晶纤维素、羟丙甲纤维素(Methocel K100 LV和Methocel K4M)和单水合乳糖过筛。
步骤2.将来自步骤1的经过筛材料转移至合适的掺合器中并混合。
步骤3.将来自步骤2的掺合物转移至合适的造粒机中并混合。
步骤4.在混合的同时添加纯化水。
步骤5.将来自步骤4的颗粒转移至合适的干燥器中并干燥直至LOD小于3％。
步骤6.将来自步骤5的颗粒过筛。
步骤7.将经过筛的硬脂酸镁与步骤6中的颗粒在合适的掺合器中混合。
步骤8.在合适的旋转压片机上对步骤7中的最终掺合物进行压制。
方案B：
步骤1.个别地将式I化合物的己二酸盐、微晶纤维素、羟丙甲纤维素和预胶凝淀粉过筛。
步骤2.将来自步骤1的经过筛材料转移至合适的掺合器中并混合。
步骤3.将来自步骤2的掺合物转移至合适的造粒机中并混合。
步骤4.在混合的同时添加纯化水。
步骤5.将来自步骤4的颗粒转移至合适的干燥器中并干燥直至LOD小于3％。
步骤6.将来自步骤5的颗粒过筛。
步骤7.个别地将polyox、丁基化羟基甲苯和胶态聚硅氧二氧化物过筛。
步骤8.将来自步骤6的颗粒和来自步骤7的材料转移至合适的掺合器中并混合。
步骤9.将经过筛的硬脂酸镁添加至步骤8中的材料中并继续掺合。
步骤10.在合适的旋转压片机上对步骤9中的最终掺合物进行压制。
方案C：
步骤1.通过合适的网筛个别地将单水合乳糖、式I化合物的己二酸盐、微晶纤维素和羟丙甲纤维素过筛。
步骤2.将来自步骤1的经过筛材料转移至合适的掺合器中并混合。
步骤3.将来自步骤2的掺合物转移至合适的造粒机中并混合。
步骤4.在混合的同时添加纯化水。
步骤5.通过合适的网筛将润湿颗粒过筛。
步骤6.将来自步骤5的颗粒转移至合适的干燥器中并干燥直至LOD小于3％。
步骤7.对来自步骤6的颗粒进行研磨。
步骤8.将经过筛的硬脂酸镁与步骤7中的颗粒在合适的掺合器中混合。
步骤9.在合适的旋转压片机上对步骤8中的最终掺合物进行压制。
方案D：
步骤1.通过合适的网筛个别地将预胶凝淀粉、式I化合物的己二酸盐、羟丙甲纤维素和一部分所需微晶纤维素过筛。
步骤2.将来自步骤1的经过筛材料转移至合适的掺合器中并混合。
步骤3.将来自步骤2的掺合物转移至合适的造粒机中并混合。
步骤4.在混合的同时添加纯化水。
步骤5.通过合适的网筛将润湿颗粒过筛。
步骤6.将来自步骤5的颗粒转移至合适的干燥器中并干燥直至LOD小于3％。
步骤7.对来自步骤6的颗粒进行研磨。
步骤8.将剩余部分的微晶纤维素和一半碳酸氢钠过筛。
步骤9.将来自步骤7的经研磨颗粒和来自步骤8的经筛选材料转移至合适的掺合器中并混合。
步骤10.将剩余部分的碳酸氢钠过筛并与步骤9中的掺合物混合。
步骤11.将硬脂酸镁过筛并与步骤10中的掺合物混合。
步骤12.在合适的旋转压片机上对步骤11中的最终掺合物进行压制。
SR1：100mg持续释放片剂的组合物
a己二酸盐至游离碱的换算因子是0.7911
b造粒之后添加
c在加工期间去除
SR2：100mg持续释放片剂的组合物
a己二酸盐至游离碱的换算因子是0.7911
b造粒之后添加
c在加工期间去除
SR3(100mg)：100mg持续释放片剂的组合物
a己二酸盐至游离碱的换算因子是0.7911
b造粒之后添加
c在加工期间去除
SR4：100mg持续释放片剂的组合物
a己二酸盐至游离碱的换算因子是0.7911
b造粒之后添加
c在加工期间去除
d部分在造粒之前添加并且部分在造粒之后添加
25mg SR：25mg持续释放片剂的组合物
a己二酸盐至游离碱的换算因子是0.7911
b造粒之后添加
c在加工期间去除
实施例C：血浆和粪便中的化合物1生物分析
可使用两种不同测定来理解JAK1抑制的功能活性。第一种是基于标准细胞的测定，并且另一种使用全血。前者使用人类外周血单核细胞(PBMC)进行；简言之，使用IL-6刺激细胞以增加JAK1活性，这经由磷酸化STAT3来测量。当添加增加浓度的化合物1时，观测到对应的磷酸化STAT3减少。这种测定适合评估不含血清蛋白的样品(例如粪便样品)中的JAK1活性和/或化合物1的抑制活性。
为了评估在富含血清的介质(例如血浆或全血)中化合物1的抑制活性，使用全血进行测定；简言之，使用IL-6刺激全血样品并且测定磷酸化STAT3的水平。这种测定可在体外(向人类血液样品中掺入化合物1)或离体(从给予化合物1的人类受试者收集的全血样品)进行。
I.人类血浆中的化合物1
用于分析人类血浆中的化合物1的方法已经验证。简言之，将50μL的人类血浆样品放置于96孔板中。在添加50μL的内标(溶解于50：50乙腈∶水中)的等分试样之后，添加100μL的0.1M NaHCO3的等分试样。接着，添加800μL的甲基-叔丁醚(MtBE)并且将样品盖住并涡旋处理。在离心之后，将700μL的MtBE层转移至干净的96孔板中。接着将样品在氮气下在约50℃下干燥。接着将250μL的重构溶液(乙腈：水，50：50，v/v)的等分试样添加至每个样品中。将板放置于自动取样器托盘中并且注入LC-MS/MS中进行分析。使用与HPLC泵和自动取样器耦合的AB Sciex 4000或Sciex 6500 QTRAP质谱仪进行LC-MS/MS分析。使用等度洗脱在Waters T3(50mm×2.1mm)HPLC柱上实现色谱分离。质谱仪以正ESI模式操作。化合物1的多反应监测(MRM)转换为m/z 554.1→186.0并且内标为m/z558.1→190.0。使用Analyst软件进行峰面积积分并且在WatsonLIMS中计算浓度。根据下式，使用加权线性回归使用在5nM至5000nM范围内的10个浓度水平计算浓度：
y＝ax b(加权因子＝1/x2)
其中：x＝化合物1浓度(nM)；y＝峰面积比；a＝斜率；并且b＝截距。
对于人类血浆中的化合物1，定量下限是5nM并且校准曲线在5nM至5000nM范围内。
II.人类粪便中的化合物I
用于分析人类粪便中的化合物1的方法是合格方法。在临床位点以1∶1匀浆收集人类粪便样品[1份水(mL)：1份粪便(g)]。在样品分析之前，将额外的水添加至样品匀浆中以实现1∶19的最终粪便与水的比率作为校准标准和QC样品。对最终匀浆进行处理并且使用校准标准和QC样品进行分析。
对于人类匀浆分析，简言之，将100μL的粪便匀浆(空白、QC和研究样品)放置于试管中。在添加20μL的内标的等分试样并混合之后，添加200μL的0.1MNaHCO3的等分试样并且涡旋处理。接着添加2mL的MtBE并且将样品涡旋处理。在离心之后，将MtBE层转移至干净试管中。接着将样品在氮气下在约40℃下干燥。接着将1mL的重构溶液(乙腈∶水，50：50，v/v)的等分试样添加至各样品中并且涡旋处理。接着在干净试管中将10μL的样品用3mL重构溶液稀释。将样品转移至自动取样器小瓶中并且将10μL注入LC-MS/MS中进行分析。使用与HPLC泵和自动取样器耦合的AB Sciex API 4000或API 4000QTrap质谱仪进行LC-MS/MS分析。使用梯度洗脱在AgilentEclipse Plus C8 50x 4.6mm，5μm HPLC柱上实现色谱分离。质谱仪以正ESI模式操作。化合物1的MRM转换为m/z 554.3→186.2并且内标为m/z 558.4→190.2。使用Analyst软件进行峰面积积分并且在Watson LIMS中计算浓度。根据下式，使用加权线性回归使用在1μg/g至300μg/g(1.8μM至542μM)范围内的8个浓度水平计算人类粪便匀浆的浓度：
y＝ax b(加权因子＝1/x2)
其中x＝人类粪便匀浆中的化合物1浓度(μg/g)，y＝峰面积比，a＝斜率，并且b＝截距。
实施例1：选择性JAK1抑制剂化合物I用于治疗溃疡性结肠炎的给药策略
化合物1是当前正在开发的用于肿瘤和自身免疫疾病的JAK1抑制剂。进行临床和离体研究以理解结肠分布，这对于溃疡性结肠炎(UC)是重要的。
方法：在单一持续释放25mg口服剂量(参见例如实施例B，25mg SR组合物)之后测定血浆和粪便(结肠替代物)中的化合物1浓度。也在单独研究中测定单一100mg剂量之后血浆中的化合物1浓度(对于测量血浆中的化合物1浓度，参见例如实施例C)。离体研究：将来自健康和UC受试者的结肠组织样品(每组2个)安装于竖直乌辛扩散室(Ussing diffusion chamber)上。以100和1000nM将[14C]化合物1施加至腔室顶侧并温育1h。从供应和接收侧收集样品用于测定化合物1浓度。将结肠组织快速冷冻用于定量自动放射摄影术。
结果：以持续释放制剂形式递送化合物1，27.1％的剂量作为粪便中未改变的化合物1而被消除(对于测量粪便中的化合物1浓度，参见例如实施例C)。在单一25mg剂量的化合物1之后，十二个患者中有八个具有超过JAK1抑制的体外IC50(即，58nM)的最大粪便浓度(图1和图2)。最大粪便PK平均值(SD)，GM＝93.4nM(41.4nM)，85.5nM，其中PK是药物动力学，SD是标准偏差，并且GM是几何平均值。最大粪便浓度是直接由所观测的粪便数据取得的，例如0-24小时收集的粪便中的浓度。
在全血中对于任一剂量，全身浓度低于JAK1抑制的IC50，平均值(SD)25mg的C最大＝18.9(7.46)nM并且100mg为84.4(45.8)nM (图1和下表)。
使用标准非隔室药物动力学方法来分析化合物1血浆浓度。直接由所观测的血浆浓度数据取得C最大(最大血浆浓度)和T最大(出现最大血浆浓度的时间)。使用终端分布阶段中浓度数据的对数-线性回归来估计终端阶段分布速率常数(λz)，并且以ln(2)/λz估计t1/2。AUC全部定义为使用用于增加的浓度的线性梯形法则和用于降低的浓度的对数梯形法则计算的从时间0至最后一次观测的血浆浓度-时间曲线下面积。AUC0-无穷大是以AUC0-t Ct/λz计算，其中AUC0-t定义为从时间0至最后一个可测量浓度的血浆浓度-时间曲线下面积(也使用线性向上/对数向下梯形法则计算)，并且Ct是最后一个可测量浓度。Cl/F是表观清除率并且以剂量/AUC0-无穷大计算。Vz/F是以剂量/(λz*AUC0-无穷大)计算的基于终端阶段的分布的表观体积。
在离体情况下，从接收侧未检测到化合物1相关放射性。化合物1以浓度依赖性方式渗透至粘膜层中并且在较低程度上渗透至粘膜下层(参见实施例2)。
概述：推荐将约25mg至约100mg BID(每天两次)或约25mg至约200mg QD(每天一次)的剂量范围用于在UC患者中的研究以使结肠暴露最大化，同时使全身暴露的可能最小化。
实施例2：通过微射线自动摄影术(MARG)和定量自动放射发光摄影术(QARL)进行健康和溃疡性结肠炎受试者的结肠中的[14C]化合物1的组织渗透和分布分析
I.目标
这项研究的目标是使用定量自动放射发光摄影术(QARL)和微射线自动摄影术(MARG)在从健康结肠和溃疡性结肠炎(UC)人类受试者收集的结肠样品中确定[14C]化合物1相关放射性的组织分布。
II.材料和方法
A.样品提交
来自两个健康和UC受试者的两小片结肠样品(总计八个样品)由Analytical Biological Services Inc.(Wilmington，DE)提供并储存在-70℃下直至使用。
B.剂量制剂
对于研究中的所有组织，在实验当天制备剂量制剂，即，100nM和1000nM。将[14C]化合物1(1.06mg)溶解于二甲亚砜(DMSO；1.514mL)中以制备1mM储备溶液(0.7mg/mL)。将储备溶液(20μL)用克雷布氏-林格氏碳酸氢盐(Krebs-Ringer bicarbonate，KRB)缓冲液(20mL)稀释以达到1000nM的最终浓度。将1000nM剂量制剂(2mL)用KRB缓冲液(18mL)稀释以达到100nM的最终浓度。两种剂量制剂的pH为约5.5。
在温育之前对剂量制剂进行分析，以确定放射性浓度和均质性。从配制容器的顶部、中间和底部取得100μL等分试样，并且将各自称重并用DMSO稀释至10mL用于放射性分析。通过液体闪烁计数(LSC)对每个10mL稀释液的三份等分试样进行分析。
C.温育和样品收集
对于健康组织，使用竖直乌辛扩散室系统(Harvard Apparatus，Holliston，MA)进行肠道组织渗透研究。将冷冻组织解冻至环境温度并且用预升温的用于给药制剂的KRB缓冲液冲洗，然后轻轻放置于设备上。在含测试物品的KRB缓冲液添加至粘膜侧的情况下，在37℃下从粘膜至浆膜进行渗透持续1小时。通过曝气器用气泡搅拌乌辛室的含有空白KRB缓冲液的接收侧。归因于样品的有限利用度，将UC组织安装(粘膜侧向上)于两端切开的聚丙烯管的一个末端，并且在浆膜侧放上含空白KRB缓冲液的带搅拌棒的小瓶。将含有测试物品的KRB添加至管中并且因此在温育期间组织的粘膜侧暴露于测试物品。在37℃下温育1小时之后，从供应侧与接收侧取得样品(100-500μL)，并且接着转移至1.5mL管用于评价渗透。将组织样品从腔室(健康组织)或管子(UC组织)轻轻移出并且在液氮冷却的异戊烷中快速冷冻约30秒。将个别经冷冻的健康和UC结肠样品包埋于晶胶(Cryogel)介质中，较大健康组织样品1/2分成初级样品和次级样品。
D.样品分析
通过LSC分析供应侧与接收侧的[14C]化合物1浓度。定量下限(LLOQ)被确定为2倍于背景(21dpm)。
以将允许组织以每个切片中呈现的从粘膜至浆膜层的横截面进行切片的方式安装组织样品以便进行切片。
将样品在约-20℃下以40μm(对于QAPL)和6-8μm(对于MARG)冷冻切片并且通过解冻安装随后加热固定于载玻片加温器上收集至玻璃显微镜载玻片上。对于QARL，从每个样品获得约3个组织切片。在QARL切片之后，对于MARG，获得每个载玻片3个切片为一组的约10组切片。
E.QARL
将具有40μm切片的载玻片安装于纸板衬垫上，用塑料包裹物覆盖，并且与[14C]外加血液校准标准(在0.00030μCi/g至7.72μCi/g范围内的10种浓度，一式三份)一起共暴露于荧光成像屏。将成像板、切片和校准标准放置于衬铜铅安全箱中的不透光暴露盒中，在室温下进行4天暴露。使用Typhoon FLA 9500图像采集系统(GE Healthcare，Sunnyvale，CA)扫描成像板并且将所得图像存储于专用QPS计算机服务器上。使用图像分析软件(微型计算机成像装置(MCID图像分析系统，Interfocus Imaging，Cambridge，Linton，UK)使用由[14C]外加血液校准标准产生的图像产生图像校准曲线。
F.MARG
将所有组织切片解冻安装至在黑暗中预涂有摄影乳液的替换玻璃显微镜载玻片上，并且在载玻片加温器上加热固定。接着将载玻片放置于含有干燥剂的黑色载玻片盒中。将载玻片盒用黑色电工胶带粘好并且在4℃下放入衬铅容器中。使载玻片暴露于摄影乳液持续72h、1周、10天、2周、4周、6周和8周。使用柯达(Kodak)D19替换显影剂和柯达定影剂使载玻片显影。将载玻片用苏木精和&曙红染色。使用安装于奥林巴斯(Olympus)BX51显微镜上的数字相机获得代表性结果的检验和数字显微照片。使放射性位置在载玻片上可视化为由暴露于放射性测试物品的乳液产生的银沉淀黑色小颗粒。观测和结论是基于所有样品的评价。使用MARG图像不能产生关于定量组织浓度的结论。
G.数据分析
被确定用于图像分析校准的所有反应曲线是使用加权一阶多项式线性方程(1/MDC/mm2)产生。通过相对误差得到拟合优度的数值估计，其中每个校准标准的相对误差的绝对值≤0.250将被接受。
标准曲线计算：
反应(MDC/mm2)＝a1 x浓度(密度-标准(μCi/g)) a0
其中：
密度-标准＝浓度(μCi/g)
MDC/mm2＝每单位组织面积的分子动态计数
a1＝斜率
a0＝y截距
使用标准曲线根据以下等式计算每个标准的相对误差：
对于每个组，LLOQ被确定为3倍于平均背景。对十个目标区域取样以确定每个组的平均值。
健康组织的LLOQ＝3x(0.00111)＝0.0033μCi/g，UC组织的LLOQ＝3x(0.00106)＝0.0032μCi/g
使用轮廓图像分析取样技术获得组织浓度数据。
轮廓成像涉及使用通过使用MCID“轮廓”功能提供的条带型取样区域在每个切片的图像上以规律间隔(50μm)收集浓度数据。浓度数据是在切片上连续获得并且对应于每个样品的标记层。
III.结果
A.剂量制剂分析
对于给药当天的给药前等分试样，剂量制剂中的放射性浓度平均为4.53和48.7nCi/mL(80.7和868nM)。制剂的各自一式三份进行分析的三份等分试样的分析的变异系数分别是1.5％和0.7％，这表明制剂是均质的(下表)。
a使用总计八个结肠样品(每组两个样品)。
b使用校正因子调节剂量水平(1.264；总/游离碱)。
给药前和给药后制剂的放射性纯度＞96％。
B.渗透研究
在1h温育之后健康和UC受试者的结肠中[14C]化合物1的渗透结果列于下表中(其中INCB039110是化合物1)。
A：顶侧(粘膜，供应室；含测试物品的KRB缓冲液)；B：基底外侧(浆膜，接收室；空白KRB缓冲液)；UC：溃疡性结肠炎
a使用竖直乌辛扩散室系统进行温育。
b使用两端切开的聚丙烯管进行温育。
c组2中的受试者2在牢牢盖住管子时破裂，这可能是由于因UC疾患而丢失可延伸性。在1h温育之后在组4中的受试者2中发现渗漏。
d样品体积为0.05mL。
e所呈现的所有数据均已扣除背景值(21 dpm)
f所呈现的所有数据是双重复实验的平均值。
在试图用组织牢牢盖住聚丙烯管的一个末端时，组2中的受试者2的组织内部被破坏，这可能是由于因UC疾患而损失可延伸性。虽然由于在1h温育期间发生渗漏，未测得组4中受试者2的渗透结果，但将这种组织样品用于QARL和MARG。基底外侧(接收室)的所有[14C]化合物1浓度低于LLOQ。
C.自动放射摄影分析
QARL
将样品层中个别样品浓度曲线数据的概述在图3中作图并列于下表中(其中INCB039110是化合物1)。
BQL：低于定量极限(健康组织＜0.0033μCi/g并且UC组织＜0.0032μCi/g)；
UC：溃疡性结肠炎
a使用竖直乌辛扩散室系统进行温育。
b使用两端切开的聚丙烯管进行温育。
所收集的峰表示结肠组织层中的变异性。[14C]化合物1主要分布于粘膜层中，但在粘膜下层中被检测到(7个组织中的5个)。
MARG
在第一组载玻片(72小时样品)中未观测到MARG反应，后续载玻片所产生的反应在4-8周之间趋于平稳。在样品间的组织层、药物浓度以及健康和UC疾患中药物源性放射性的相对浓度是一致的。在所有样品中最高浓度存在于绒毛和相关隐窝中，随后是粘膜下层。在肌层中几乎没有观测到放射性。在肌层外部处于背景水平。
实施例3：IL-6介导的STAT3磷酸化和JAK1
白介素-6(IL-6)通过共同gp130受体和特定IL-6Rα共受体进行信号传导以活化詹纳斯激酶(JAK)-信号转导和转录活化因子(STAT)信号传导途径(Heinrich等人，The Biochemical journal.2003；374：1-20)。溃疡性结肠炎活组织检查已鉴定IL-6为肠道发炎区域内的主导细胞因子并且其浓度与梅奥内窥镜得分(Mayo endoscopic score)相关(参考：Bernado等人，2012)。已在来自类风湿性关节炎患者(RA)的外周血单核细胞(PBMC)中描述异常炎性IL-6/STAT3途径活化(P等人，Rheumatology，第54卷，第6期，2015年6月1日，1103-1113)并且抗IL-6疗法展示显著临床功效(Expert Rev Clin Immunol.2017年6月；13(6)：535-551；JDermatolog Treat.2018年9月；29(6)：569-578)。斑块型银屑病(Ps)的发病机理由IL-23介导的T辅助细胞17(Th17)/IL-17炎症驱动(参考文献)。IL-6在促进STAT3依赖性IL-23受体诱导中发挥关键作用，而STAT3依赖性IL-23受体诱导又对赋予Th17细胞完全效应功能必不可少(Zhou等人，Nat.Immunol.2007；8：967-974；Hirota等人，J.Exp.Med.2007；204：41-47；Calautti等人，Iht J MolSci.2018年1月；19(1)：171)。通过JAK/STAT途径的信号转导的抑制可在细胞因子驱动的基于细胞的测定中间接测量。磷酸化STAT水平的评估是响应于JAK1的刺激来测量，常常使用重组人类IL-6。
已在自身免疫疾病RA和Ps中研究化合物1的全身作用。在两个研究中测量用IL-6(JAK1抑制标记物)和TPO(JAK2抑制标记物)刺激之后STAT3磷酸化的抑制。在Ps患者中，研究100mg QD、200mg QD、200mg BID和600mg QD的剂量。响应于离体IL-6刺激，存在化合物1浓度依赖性pSTAT3抑制。然而，响应于TPO，在100mg QD、200mg QD和200mg BID的剂量下不存在显著pSTAT3抑制(图4)。在初级功效度量第28天sPGA相较于基线的平均变化中也存在剂量依赖性反应(参见下表)。
表.在患有斑块型银屑病(mITT群体中所观测的案例)的患者中第28天静态医师总体评估相较于基线的变化(其中INCB039110是化合物1)
a将在第一剂量的研究药物之前所评估的最后一次未丢失的sPGA测量视为基线。
b基于每个活性处理组与安慰剂之间的2样品t检验；多重比较未进行调整。
200mg BID(p＝0.053)和600mg QD(p＝0.003)的剂量展现临床意义的相较于基线的变化，而100mg或200mg QD的剂量并未并且不在统计学上不同于安慰剂(分别p＝0.270，p＝0.118)。离体IL-6刺激的STAT3的抑制的药效动力学标记物与功效终点之间存在良好相关性(图5)。未记录到嗜中性粒细胞减少，这与在100mg QD、200mgQD和200mg BID的剂量下未记录到显著JAK2抑制(如由TPO刺激的pSTAT3抑制所确定)的观测相符；嗜中性粒细胞减少和其他血细胞减少被认为明确地是JAK2抑制促成的骨髓抑制的结果(BissonnetteR等人，J Dermatolog Treat，201627(4)332-338；Mascarenhas等人，Haematolgica 2017 102(2)：327-335.)。
在RA患者中，研究100mg QD和BID、200mg BID、300mg QD、400mg BID和600mg QD的剂量，并且再次观测到IL-6诱导的pSTAT3的剂量依赖性抑制的总趋势(图6A和图6B)。也观测到TPO诱导的pSTAT3抑制增加的总趋势。然而，最大抑制似乎在200mg BID给药之后观测到。也值得注意的是，与安慰剂相比，100mg QD剂量具有较小的TPO诱导的pSTAT3抑制。在这项研究中，存在若干ANC降低但未观测到剂量依赖性倾向的案例。在功效方面，在剂量范围内剂量依赖性趋势不明显，但在第84天访视(初级终点访视)时对于600mg QD处理组，在化合物1与安慰剂之间显示ACR20、ACR50和ACR70反应中的统计显著性差异。
总体来说，RA和Ps患者的临床数据表明，基于聚集物安全性、功效和生物标记物数据，100mg QD剂量具有最小全身效应。鉴于化合物1在剂量方面展示超线性(supralinear)PK，50mg BID之后的每天暴露预期低于100mg QD。
实施例4：用于评价化合物1在中度至重度溃疡性结肠炎中的安全性和功效的2期双盲剂量范围安慰剂对照研究与开放标签延伸
I.目标
这项研究将评价口服化合物1在患有中度至重度活性UC的参与者中的安全性和功效。化合物1将以SR制剂来施用。化合物1在人类中的口服生物利用度是适中的，约30％的所施用剂量在粪便中完好地作为母体化合物被分泌。IL-6刺激的STAT3磷酸化的抑制是JAK1抑制的度量。50mg BID的剂量的化合物1预期产生超过PBMC中IL-6刺激的STAT3磷酸化的抑制的体外IC50值(58nM)的粪便浓度(约200nM)。然而，与这种剂量相关的对应血浆浓度预期是低的，C最大值(51nM)远低于141nM的离体全血IC50值。因此，化合物1的功效预期主要通过局部而非全身JAK1抑制来介导。
作为选择性和局部作用JAK1抑制剂，化合物1可具有在其他JAK抑制剂中所见的消炎特性，而没有贫血或嗜中性粒细胞减少的相关风险。鉴于化合物1在所选剂量范围内的有利安全概况，将容许同时使用免疫抑制UC疗法(AZA、6-MP和甲氨蝶呤)。
II.总体设计
在部分A(n＝30)和部分B(n＝176)中总共将招募约206个参与者，持续12周。部分A和部分B都是随机化、双盲、安慰剂对照和平行设计。
在部分A中，30个参与者将以按2∶1分派比随机分配以接受50mg BID或安慰剂。部分A参与者将在第4周完成过夜、诊所内访视(in-clinic visit)。在此访视时，将获得用于粪便药物浓度分析的24小时粪便样品和用于血浆药物浓度PK分析的连续血液样品。除在基线处和在第12周进行内窥镜检查之外，部分A参与者(仅)也将在第4周进行内窥镜检查。部分A旨在建立50mg BID 2∶1比率的机制的证据，而部分B旨在评价QD或BID给予的25与100mg之间的剂量范围的总日剂量的临床功效。待用于部分B中的剂量方案将在部分A之后选择。完成部分A或部分B和所有相关研究程序(包括第12周的内窥镜检查)的参与者有资格进入研究的对应40周OLE期。
在部分B中，176个参与者将以1∶1∶1∶1比率随机分配到3个剂量水平的化合物1片剂中的1者或安慰剂。除安慰剂之外，待包括在部分B中的剂量是25mg BID、50mg BID和100mg QD。部分B中的剂量方案将在部分A结束时确认(在QD或BID施用的25与100mg之间的总日剂量范围内)。部分B参与者将在基线处和第12周进行内窥镜检查。此外，总共24个部分B参与者(每个处理组6个)将在第4周完成过夜、诊所内访视。在此访视时，将获得用于粪便药物浓度的24小时粪便收集和用于PK分析的连续血液样品。
在部分A与部分B两者中在筛选和双盲治疗期直至完成第12周评估期间用于UC的背景稳定疗法不应改变。
在此期间需要开始用于UC的新疗法的参与者应进行内窥镜检查并且使用按研究者的判断给出的适当护理处理标准退出研究。在第12周内窥镜检查之后，每天皮质类固醇剂量可按研究者的判断有所增加或降低。除部分A和部分B的第12周数据的分析外，也计划将3项额外期中分析用于此研究：
1.第一期中分析将在部分A中随机化的15个参与者的第4周数据可用时进行。非盲PK/PD组将评价全身暴露并且进行初步生物标记物分析以确定化合物1对JAK/STAT信号传导途径是否有影响。
2.第二期中分析将在这15个参与者达到第12周时进行。除考虑PK/PD结果之外，如果此部分展现的功效证据不足，则可终止研究。
3.第三期中分析将在部分B中随机化的88个参与者的第12周数据可用之后进行。如果功效证据不足，则可终止研究。
在部分A结束时，SRC(包含主办者研究团队的成员)将在不设盲情况下进行对部分A的最终分析以综述所有安全性和PD数据，以便断定进行部分B或终止研究。用于部分B的剂量方案的选择将由此数据分析告知。部分B剂量方案将是QD或BID，总日剂量介于25与100mg之间。此外，部分A和部分B OLE期中的剂量方案可由主办者研究团队基于部分A结果进行修改)。部分AOLE中的剂量是50mg BID。部分B OLE期中的剂量可随后在相同剂量范围(25mg至100mg总日剂量)内修改。
当88个参与者已完成部分B的第12周时，DMC可建议继续研究(在下一预定分析之前将未揭示关于当前安全分析的结果的细节)或者可建议停止研究(基于缺乏功效或任何安全性发现)。他们也可关于部分B的OLE剂量的修改提出建议。
双盲期的最终分析将在所有部分B参与者已完成第12周时进行。
最终研究分析将在所有参与者已完成研究的OLE期(包括30天跟踪期)之后进行。
III.研究处理
IV.功效评估
在整个方案中将使用以下定义的基于梅奥得分的功效终点的定义。
A.基于梅奥得分的功效终点的定义列表
B.内窥镜检查
在基线处和第12周需要内窥镜检查(优选结肠镜检查)。此外，仅对于所有部分A参与者，在第4周需要内窥镜检查(根据地点判断是结肠镜检查或柔性乙状结肠镜检查)。将进行此程序以确定3组分梅奥得分，包括其中任何脆性产生至少2的得分的mMES(食品和药物管理局.Guidance for Industry：Ulcerative Colitis：Clinical Trial En dpoints.2016.https：//www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplia nceRegulatoryInformation/Guidances/UCM515143.pdf)。内窥镜检查与预定访视之间的持续时间不应超过14天。内窥镜检查将也允许用于夹捏活组织检查以评价粘膜组织中的PD效应。
经训练的内窥镜医师将进行内窥镜检查。在可能的情况下，同一内窥镜医师将在所有访视时进行内窥镜检查。所有结果将如研究手册中所描述集中读取和宣告。
内窥镜检查期间获得的活组织检查试样的组织学评估也可如单独章节中所描述由经训练的病理学家综述。
C.炎症性肠病问卷(IBDQ)
IBDQ是用于测量患有炎症性肠病(包括UC)的参与者的疾病特异性生活质量的经心理测量学验证的患者报告结果手段。IBDQ包含32项，其分组至4个维度中，所述4个维度如下评分：
·肠道症状：10至70。
·全身症状：5至35。
·情绪功能：12至84。
·社会功能：5至35。
总IBDQ得分在32至224范围内。对于总得分和每个领域，较高得分指示优选的生活质量。至少170的得分对应于临床缓解并且增加至少16分被视为指示临床意义的改善。
IBDQ将在基线处和每个指定研究访视时评估。
D.3组分梅奥得分
3组分梅奥得分将用于测量这项研究中UC的疾病活性。3组分梅奥得分(无PGA的梅奥得分，在0至9分范围内)由以下3种子得分组成，所述3种子得分各自评级为0至3，较高得分指示较严重的疾病：
·粪便频率(0-3)
·直肠出血(0-3)
·mMES(0-3)
3组分梅奥得分将在基线处和各指定研究访视时基于并入如由中心读数器所评估的内窥镜检查结果来确定。当中心内窥镜检查结果丢失时，如由研究者所确定的内窥镜检查子得分将用于计算。
3组分梅奥得分是使用来自访视之前最近3天的可用数据的粪便频率和直肠出血数据计算。由以下时期收集的数据将不包括在此计算中：
·摄入用于便秘或腹泻的药物的日期。
·影响粪便频率或血液含量的程序日期或程序的制剂(例如灌肠剂、其他泻药、透明液体膳食)。
·使用抗蠕动剂(例如洛哌丁胺(loperamide))后48小时。
·内窥镜检查之后48小时。
E.医师总体评估
PGA将与3组分梅奥得分分开计算。PGA承认以下3个标准：
·参与者每天对腹部不适的回忆，和
·参与者的总体健康感觉，和
·参与者的其他观测(例如身体发现)和参与者的表现状态。
PGA标准将如下评分：
·0＝正常
·1＝轻度疾病
·2＝中度疾病
·3＝重度疾病
PGA将在基线处和每个指定研究访视时评估。
V.药物动力学评估
A.血液和粪便样品收集
在PK访视(第2周和第12周)时，参与者在到达研究地点之前必须克制不要摄入研究药物。应收集给药前PK样品。在收集给药前PK样品之后，将施用化合物1，并且将从参与者收集后续时间的样品。将记录PK分析的血液收集；最后一次给予研究药物；和抽血前最后2次进餐(例如前一晚的晚餐和当天早上的早餐)的日期和时间。
在第4周，部分A中的所有参与者和部分B参与者的子集(n＝约24个)将完成过夜、住院诊所访视。在此访视时，参与者将收集24小时粪便样品以测定粪便中的化合物1粪便浓度，并且将获得用于分析血浆药物浓度的连续血液样品(参见例如实施例C)。内窥镜检查(结肠镜检查或柔性乙状结肠镜检查)将在参与者从CRU出来之前进行并且通过中心读数器评估。
表.药物动力学血液样品时间安排
a所有参与者将具有在第2周、第4周和第12周收集的给药前、1小时和2小时样品的样品。仅参与者的子集(即，部分A中的那些和部分B中的约24个)将进行第4周额外血液取样(5、8、12和24小时取样)和第4周持续24小时的粪便收集。
VI.目标和终点
实施例5.自发性结肠炎的临床前小鼠模型
白介素-10(IL-10)敲除(KO)小鼠模型反映了例如溃疡性结肠炎和克罗恩病的炎症性肠病(IBD)的多因子性，因为IL-10KO小鼠BALB/cAnNTac-Il70em7Tac自发地发展结肠炎。IL-10KO小鼠中的结肠炎由CD4 T辅助细胞1-样T细胞的异常反应和通过詹纳斯激酶/信号转导和转录活化因子(JAK/STAT)途径进行信号传导的促炎性细胞因子的过量分泌引起。化合物1是有效JAK1抑制剂，相较于JAK2、JAK3和TYK2具22至＞500倍选择性，并且当前正在临床试验中被研究作为用于中度至重度溃疡性结肠炎的单一疗法。
基于BALB/c品系背景的雌性IL-10纯合子敲除小鼠由Taconic(USA)提供。从6周龄向前，通过口服灌胃每天两次施用化合物1和媒介物(10mL/kg)。按0-3评级量表定量腹泻(0＝正常；1＝软但仍成形；2＝非常软；3＝腹泻)。通过CO2窒息将小鼠安乐死并且测量结肠长度和重量。基于以下标准按0至10的量表对组织病变进行评分：淋巴细胞浸润于粘膜中并且肠道相关淋巴组织定位于固有层/粘膜下、粘膜糜烂/溃疡和透壁性炎症。对体重、粪便硬度、粪便潜血和直肠出血进行评分。记录直肠脱落的发生率。
关于总疾病负荷(如7A中所示)和作为重度疾病标志的直肠脱落发作(如图7B中所示)观测到显著改善。如图7C-7D中所示，在离体情况下，化合物1处理的小鼠的结肠组织的特征为组织病变减少。以30mg/kg经口每天两次施用化合物1显著(p＜0.001)延迟结肠炎发作并且调节疾病相关的体重减轻。与媒介物对照相比，在用化合物1处理的动物中累积临床疾病得分显著(p＜0.0001)降低。直肠脱落的发生率也显著(p＜0.01)较低。施用化合物1使得结肠结构性病变显著(p＜0.01)减少。相较于媒介物对照，在用化合物1处理的小鼠中淋巴细胞浸润和透壁性炎症也显著(p＜0.01)减轻。如图10中所示，也发现在IL-10 KO小鼠模型中，如由显著较慢的疾病发作所证实，化合物1改善自发性结肠炎，并且如图12A-12B中所示，与媒介物对照相比，化合物1处理在IL-10 KO小鼠的结肠中产生差异基因表达概况。如图15A-15B中所示，全身化合物1递送与在IL-10 KO小鼠中对结肠形态的显著保护作用相关。
这些数据表明化合物1可适合作为用于IBD(例如自发性结肠炎)治疗的治疗剂。
实施例6.在小鼠模型中实验诱导的炎症性肠病
例如溃疡性结肠炎和克罗恩病的炎症性肠病(IBD)是一组由免疫系统与胃肠道组织之间的复杂相互作用引起的特发性慢性和复发性炎症疾患。IBD发病机理中的多个细胞因子和生长因子通过詹纳斯激酶/信号转导和转录活化因子途径进行信号传导。
如下文所描述，在BALB/c小鼠中通过结肠内注射2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)或4-乙氧基亚甲基-2-苯基-2-噁唑啉-5-酮(噁唑酮)以触发免疫反应来建立IBD的临床前模型。对体重、粪便硬度和粪便血液进行评分。其他读出包括结肠重量与长度比和组织学评价。收集血液用于药物动力学分析。
噁唑酮诱导的结肠炎小鼠模型
雄性BALB/c小鼠是商购的(Charles River Laboratories)。在第0天，通过将噁唑酮(150μL，3％于丙酮/橄榄油，4∶1v/v中)施加至事先剃毛的喙侧背部将小鼠致敏。在第5天用噁唑酮将动物再致敏。在直肠内噁唑酮攻击之前使小鼠空腹。通过结肠内滴注噁唑酮溶液(1mg，于0.1mL 40％乙醇中)诱导远端结肠炎，此后，使动物保持在竖直位置30秒以确保溶液保持在结肠中。假对照小鼠单独接受0.1mL 40％乙醇。通过口服灌胃每天两次施用化合物1和媒介物(10mL/kg)。按0-3评级量表定量腹泻(0＝正常；1＝软但仍成形；2＝非常软；3＝腹泻)。使用S-Y潜血纸(实用医疗器械，中国台湾)按0-3量表检测粪便潜血(0＝阴性；1＝阳性；2＝可见血液迹线；3＝直肠出血)。在第8天，通过CO2窒息将小鼠安乐死并且测量结肠长度和重量。此外，将腹腔打开时，注意到结肠与其他器官之间的附着，也注意到在移除各结肠并称重之后存在结肠溃疡。如表A中所示，按0-12量表进行宏观评分。归一化结肠重量表示组织相对于假对照小鼠有所增加。
表A.
直肠内施用含噁唑酮的乙醇媒介物触发直接组织损伤并且诱导免疫反应从而导致粘膜炎症，远端结肠中的上皮微溃疡和组织病理学变化令人想到人类溃疡性结肠炎(参见例如Kojima等人，J.Pharmacol.Sci.2004，96(3)：307-313)。后一炎症阶段由Th2细胞因子的产生(例如IL-4、IL-5和IL-13分泌)驱动(参见例如Randhawa等人，J.Physiol.Pharmacol.2014，18(4)：279-288)。
每天化合物1处理(30mg/kg BID)有效加快腹泻和直肠出血的恢复(如图8A中所示)，改善宏观组织病变(如图8B中所示)，并且使作为炎性肿胀的替代读出的归一化结肠重量减小(如图8C中所示)。这些数据与所公布的结果一致，证实托法替尼抑制噁唑酮诱导的结肠炎(参见例如Beattie等人，J.Inflamm.(Lond).2017，14：28)，并且表明显著比例的抗炎功效是由JAK1抑制驱动。此外，与媒介物处理的对照相比，每天两次化合物1处理(经口或结肠内显著改善粪便硬度并且降低粪便潜血评分(参见图13A-13D)，并且与各别媒介物处理的对照相比，化合物1处理显著改善结肠缩短(参见图14A-14E)。
TNBS诱导的结肠炎模型
购买雄性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)并且通过结肠内滴注TNBS(2，4，6-三硝基苯磺酸溶液，1mg，于0.1mL 50％乙醇中)诱导远端结肠炎。通过口服灌胃(PO)以30mg/kg或通过结肠内注射(IC)以3mg/kg每天两次(BID)施用化合物1处理。在TNBS致敏后3至5天时，按0-3评级量表定量腹泻(0＝正常；1＝软但仍成形；2＝非常软；3＝腹泻)。
如图9A中所示，与媒介物处理的动物相比，经口化合物1处理显著腹泻症状。该数据与图8A中所示的噁唑酮诱导模型数据一致。如图9B中所示，直接递送至结肠的低剂量化合物1处理也高度有效地增强疾病恢复。举例来说，在噁唑酮模型中，30mg/kg PO BID的化合物1显示显著(p＜0.05)结肠缩短减少(参见图14A-14B和图14E)和重量增加。3mg/kg IC BID的化合物1也使结肠缩短显著(p＜0.05)减少(参见图14C-14E)。
与对照相比，30mg/kg或3mg/kg结肠内剂量的每天两次口服剂量(PO)的化合物1显著(p＜0.05)改善粪便硬度。此外，在3mg/kg IC BID下实现粪便血液得分的显著(p＜0.05)降低。此外，两种施用途径(口服，IC)均产生粪便硬度和粪便血液得分的显著(p＜0.05)改善。3mg/kg IC BID的化合物1改善总结肠宏观损伤。结肠内剂量的化合物1维持低于JAK1 IC50的全身药物暴露，但实现与实验IBD类似的抑制。总之，这些数据表明化合物1可适合作为用于IBD治疗的治疗剂。
直肠内施用半抗原化剂(TNBS)赋予宿主免疫系统结肠蛋白质免疫原性并由此引发以CD4 T细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润固有层为特征的T辅助细胞(Th)1介导的免疫反应。以30mg/kg经口施用化合物1或以3mg/kg直接施用至结肠中以确定局部化JAK1抑制是否将有效。如图11A中所示，与噁唑酮模型一致，与媒介物处理的动物相比，口服化合物1使疾病得分恢复加快。如图11B中所示，直接施用至结肠中的低剂量化合物1更快地诱导恢复并且似乎介导更大的治疗反应。
在另一研究中，循环和组织药物浓度的定量清楚地区分局部与全身JAK1靶标抑制。如图11C中所示，口服给药产生约11μM的峰值循环药物水平，这类似于结肠浓度。相比之下，如图11D中所示，局部化化合物1递送的特征为约0.04μM的最小峰值全身浓度，但在结肠组织中持续暴露≥0.45μM。因此，在发炎胃肠道组织内战略靶向或释放JAK1抑制剂可潜在地实现改进的效益-风险概况。
直接施用至肠道炎症位点的低剂量化合物1在TNBS诱导的结肠炎中是高度有效的，并且这种处理反应与全身JAK1抑制无关，因为化合物1血浆浓度是最小的。该数据有力地支持局部化JAK抑制可足以实现治疗反应由此避免全身免疫抑制的必要性的基本原理。在不受理论束缚的情况下，据认为这些数据也表明JAK1是驱动发病机理的主要机制。
根据前述描述，除本文所描述的那些外，本发明的各种修改对本领域技术人员而言将是显而易见的。此类修改也旨在属于所附权利要求范围内。本申请中所引用的每个参考文献，包括所有专利、专利申请和公开，都通过引用整体并入本文。
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