基于气相色谱-超高分辨质谱的牙胶中迁移危害物筛查方法与流程

基于气相色谱
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超高分辨质谱的牙胶中迁移危害物筛查方法
技术领域
1.本发明涉及一种危害物的筛查方法，特别是涉及一种基于气相色谱
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超高分辨质谱的牙胶中迁移危害物筛查方法。


背景技术：

2.1岁以下的婴幼儿通过抓咬东西，锻炼手眼协调能力和初步探索世界。牙胶是婴幼儿专用的玩具，主要由硅胶或tpu塑胶制成。通过咀嚼牙胶可以有效缓解在出牙期的不适，刺激乳牙生长，增加咀嚼的乐趣。牙胶中潜在的化学风险物质可能在生产(使用化学添加剂和加工助剂，包括杂质和无意添加的物质)、包装、运输和存储过程中引入，并可以通过唾液转移到婴儿体内，造成累积的化学危害。目前，世界范围内牙胶产品参照玩具和儿童用品的法规进行管理。主要法规包括欧盟玩具安全指令2009/48/ec、欧盟委员会玩具安全协调标准en71、美国消费品安全改进法案、华盛顿州儿童安全保护法案中高度关注化学品清单(chcc清单)、中国玩具安全国家标准gb6675
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2014等。
3.近年来，牙胶等玩具中化学物质的检测主要限于上述法规规定的物质清单。研究人员为了确定产品是否满足法规要求，已先后在牙胶中检测到重金属、邻苯二甲酸酯、亚硝胺、防腐剂、双酚a以及其他物质。部分研究者进一步开展了这些物质的风险评估研究，从而探索这些化学物质对婴儿造成的危害。尽管牙胶中的一些目标化学物质指标符合法规的限制要求，但“合格”的产品未必就是绝对“安全”的，产品中存在的未知化学风险仍然对婴幼儿的健康构成潜在威胁。
4.牙胶玩具中的有害化学物质可能通过口腔中的唾液接触进入婴幼儿体内，对其健康构成危害。近年来，研究人员对牙胶和其他玩具中已知的目标化学物质进行了一些研究(即常规的靶向检测)，但对该类产品中存在的未知化学物质尚未见报道。


技术实现要素：

5.未知物质的鉴定通常需要复杂的分析过程，分析时间很长，最终的鉴定结果必须经过多确证点确认，需要有高的可靠性。目前现有的方法是气相色谱
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低分辨质谱(gc
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ms)结合商业标准谱图库或自建谱库进行检索。未知物质的定性分析依赖于实测谱图和标准谱图的匹配。然而，如果不同化合物的谱图非常相似，或者同分异构体之间碎片离子的差异非常细微，那么低分辨率质谱鉴定结果就不准确。超高分辨质谱，静电场轨道阱质谱(orbitrap，最高分辨率12～24万)的分辨率远高于传统的低分辨质谱(如四级杆，单位分辨率)以及飞行时间质谱(tof，最高分辨率1～2万)等普通高分辨质谱，提供了足够且准确的化学元素质量信息，使研究人员能够利用天然同位素比率和碎片信息确定未知元素组成和物质的化学结构。gc
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orbitrap ms具有高分辨率、高灵敏度、高质量精度、宽动态范围、光谱数据解卷积功能等优点，在开展牙胶中未知化学物质的分析方面具有很大的潜力。
6.本发明的目的是基于gc
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orbitrap ms非靶向筛查可能从牙胶迁移到婴儿唾液的未知化学风险物质。迄今为止，这是第一次报道采用气相色谱
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超高分辨质谱来研究牙胶玩
具中的未知化学风险物质。
7.本发明公开了一种基于气相色谱
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超高分辨质谱的牙胶中迁移危害物筛查方法，包括如下步骤：
8.步骤一、样品处理：将牙胶切小块，在模拟唾液中实验得到迁移溶液，加入乙酸乙酯
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正己烷混合溶液进行液液萃取，振动、静置和浓缩后得到待测液，上机测定；
9.步骤二、采用气相色谱
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超高分辨质谱的方法对所述待测液进行分析，其中，质谱检测时，分别采用ei模式和pci模式进行分析；
10.步骤三、根据质谱的ei模式下对牙胶样品的提取液进行全扫描检测的结果得到未知物质碎片离子的精确质量数，对采集到的数据进行解卷积处理，去除干扰离子，得到干净的质谱图，通过与空白样的比较，扣除溶剂或系统中存在的杂质峰，识别牙胶中独特的色谱峰；
11.步骤四、将未知物的质谱图在商业标准谱图库中进行检索，利用各离子峰的精确质量信息对匹配结果进行进一步过滤；
12.步骤五、当某个未知物存在多个检索得分相近的候选结果时，利用ei谱图中同位素信息进行鉴别；
13.步骤六、通过质谱的pci模式下获得的数据来测得未知物质的分子离子和分子式，进而从候选结果中选出最匹配的。
14.本发明所述的基于气相色谱
‑
超高分辨质谱的牙胶中迁移危害物筛查方法，其中，步骤一中样品处理具体包括如下步骤：
15.将牙胶试样表面光滑部分切成(10
±
1)cm2，称重后放入一个具塞的40ml玻璃比色管中，比色管中加入20ml模拟唾液，在37℃、100r/min的水浴中震荡样品240min，得到迁移溶液，将迁移溶液移至分离漏斗，加入体积比为1:1的乙酸乙酯
‑
正己烷混合溶液5ml，振动1min，静置30min，在温和氮气流吹扫下将有机相浓缩至0.5ml，上机测定。
16.本发明所述的基于气相色谱
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超高分辨质谱的牙胶中迁移危害物筛查方法，其中，步骤二中色谱分离条件如下：
17.hp
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5ms色谱柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)；载气高纯氦气(99.999％)，流量为1ml/min；进样体积：1μl，进样口温度为280℃，升温程序：初始温度为40℃，保持1min后以8℃/min速率升至310℃，保持5min。
18.本发明所述的基于气相色谱
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超高分辨质谱的牙胶中迁移危害物筛查方法，其中，步骤二中在质谱采用ei模式时，色谱仪分流进样，分流比10:1，在质谱采用pci模式时，色谱仪不分流进样；
19.质谱条件如下：全扫描full
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scan模式，扫描离子质量范围50～600m/z，每个样本分别采用ei模式和pci模式进行分析，ei电离能量为70ev，采用pci模式时以甲烷为反应气，甲烷流速为1.5ml/min，传输线和离子源温度分别为250℃和280℃，c
‑
trap和hcd碰撞气为高纯氮气(99.999％)，溶剂延迟时间为3.5min，在m/z 200条件下，质量分辨率设置为60000fwhm，tic强度阈值为1e6，最大注入时间设置为200ms，质量公差窗口设置为5ppm。
20.本发明所述的基于气相色谱
‑
超高分辨质谱的牙胶中迁移危害物筛查方法，其中，步骤三中数据解卷积参数如下：
21.使用tracefinder deconvolution plugin软件进行解卷积，为了降低基质中的化
学物质干扰，将提取离子流的质量数容许窗口范围设置为
±
5ppm，以获取具备高度选择性的提取离子流色谱图，设置精确质量偏差为
±
5ppm，信噪比阈值为3，tic强度阈值为1e6，解卷积碎片离子匹配值为99％，保留时间矫正窗口为10s时，解卷积的分离效果最好。
22.本发明所述的基于气相色谱
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超高分辨质谱的牙胶中迁移危害物筛查方法，其中，步骤四的检索匹配过程中，正匹配指数si表示测得谱图与标准谱库中的谱图对比的匹配值，hrf值表示碎片离子的实测值与标准谱库中相应碎片离子元素组成相符的精确质量百分比，保留指数也是定性分析的一个重要指标，保留指数偏差δri越小越好，当检索的综合评分大于90，si大于700，hrf大于90，δri小于100时，会过滤掉多个干扰项，有效的减少了数据分析的时间，提高鉴定结果的准确性。
23.本发明基于气相色谱
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超高分辨质谱的牙胶中迁移危害物筛查方法与现有技术不同之处在于：
24.本发明建立的气相色谱
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静电场轨道阱超高分辨质谱检测技术，可对从牙胶中迁移到唾液的未知化学物质进行高通量筛查和鉴定，由于检测初始是没有目标的盲筛，因此方法可称为非靶向筛查。本发明首次提出了牙胶玩具中未知物筛查鉴定的方法，包括样品处理条件、仪器分析条件、未知物质的定性鉴定流程等。在未知物质的定性鉴定方面，由易至难给出了可能遇到的情况案例并给出了相应的解决方案，包括多指标综合评分对比、利用物质的同位素辅助定性分析、利用正化学电离(pci)鉴定物质分子式等。本发明在牙胶玩具产品安全研究方面提出了一条全新的研究路径，区别于传统的对目标物质的靶向检测，能够发现更多的非目标的潜在未知危害物，并能实现准确的定性鉴定，这对监测牙胶等玩具中潜在的化学迁移危害、促进产品质量安全具有积极的作用。
25.下面结合附图对本发明的基于气相色谱
‑
超高分辨质谱的牙胶中迁移危害物筛查方法作进一步说明。
附图说明
26.图1为本发明方法的工作流程图；
27.图2为本发明实施例中鉴定异佛尔酮的过程；其中，(a)某一样品中检测到的未知物色谱峰列表；(b)某个未知色谱峰在进行谱库检索后按综合评分排序的候选物质清单；(c)用于识别物质的碎片离子叠加图；(d)实际谱图与标准谱图的比较；(e)每个碎片离子的丰度和实测精确质量数与理论精确质量数之间的偏差；
28.图3为本发明实施例中利用物质的同位素信息辅助鉴定的例图；其中，(a)谱库检索后根据综合评分排序的候选物质清单；(b)苯唑卡因的实际谱图与理论谱图的比较；
29.图4为本发明实施例中采用化学电离pci鉴定未知物的分子式的例图；其中，(a)谱库检索后按综合评分排序的物质清单；(b)n
‑
甲基甲酰苯胺的ei谱图；(c)n
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甲基甲酰苯胺的pci谱图；注：包括碎片离子的实测质量、元素组成、理论与实测质量偏差(ppm)，通过[m h]

、[m c2h5]

精确质量数，证实了n
‑
甲基甲酰苯胺的存在；
[0030]
图5为本发明实施例中牙胶玩具中未知物鉴定情况图。
具体实施方式
[0031]
1、材料与方法
[0032]
1.1试剂与材料
[0033]
标准品：苯酚购自德国dr.ehrenstorfer公司。正己烷和乙酸乙酯为色谱纯，购自美国j.t.baker公司。c7‑
c
40
正构烷烃混合溶液购自美国sigma
‑
aldrich公司。
[0034]
模拟唾液：0.17g mgcl2·
6h2o，0.15g cacl2·
6h2o，0.76g k2hpo4·
2h2o，0.53g k2co3，0.33g naci和0.75g kci，配置模拟唾液时先将钾、钠盐溶于900ml去离子水中，再加入钙、镁盐，全部溶解后用1％盐酸水溶液调ph至6.8
±
0.1，然后用去离子水定容至1l。避光保存，保证用前ph≈6.8
±
0.1。
[0035]
q exactive gc orbitrap型气相色谱
‑
四极杆
‑
静电场轨道阱质谱仪，配有triplus rsh自动进样器(美国thermo fisher公司)；nts
‑
4000恒温水浴振荡器(日本eyela公司)；turbovap ii型自动氮吹浓缩仪(美国biotage公司)。
[0036]
从北京的超市和商场中随机抽取了10个不同品牌的牙胶玩具样品。产地为中国(广东省，5；浙江省，3；上海，1)和韩国(1)。在进行分析之前，这些样品被分别密封包装，以避免交叉污染。
[0037]
1.2样品处理方法
[0038]
将牙胶试样表面光滑部分切成(10
±
1)cm2。称重后将样品放入一个具塞的40ml玻璃比色管中，比色管中加入20ml模拟唾液。在37℃、100r/min的水浴中震荡样品240min，得到迁移溶液。将迁移溶液移至分离漏斗，加入乙酸乙酯
‑
正己烷混合溶液5ml(1:1，v/v)，振动1min，静置30min。在温和氮气流吹扫下将有机相浓缩至0.5ml，上机测定。
[0039]
1.3分析条件
[0040]
色谱分离条件：hp
‑
5ms色谱柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)；载气高纯氦气(99.999％)，流量为1ml/min；进样体积：1μl，进样口温度为280℃。升温程序：初始温度为40℃，保持1min后以8℃/min速率升至310℃，保持5min。在质谱采用ei模式时，色谱仪分流进样，分流比10:1。在质谱采用pci模式时，色谱仪不分流进样，以增加灵敏度。
[0041]
质谱检测条件：全扫描full
‑
scan模式，扫描离子质量范围50～600m/z。每个样本分别采用电子电离(ei模式)和正化学电离(pci模式)进行分析。ei电离能量为70ev。采用pci模式时以甲烷为反应气，甲烷流速为1.5ml/min。传输线和离子源温度分别为250℃和280℃。c
‑
trap和hcd碰撞气为高纯氮气(99.999％)。溶剂延迟时间为3.5min。在m/z 200条件下，质量分辨率设置为60000fwhm，tic强度阈值为1e6。最大注入时间设置为200ms，质量公差窗口设置为5ppm。
[0042]
数据解卷积参数：使用tracefinder deconvolution plugin软件进行解卷积，为了降低基质中的化学物质干扰，将提取离子流的质量数容许窗口范围设置为
±
5ppm，以获取具备高度选择性的提取离子流色谱图。设置精确质量偏差为
±
5ppm，信噪比阈值为3，tic强度阈值为1e6，解卷积碎片离子匹配值为99％，保留时间矫正窗口为10s时，解卷积的分离效果最好。1.4牙胶玩具中未知物筛查鉴定工作流程
[0043]
本发明工作流程见图1。第一步，在质谱的ei模式下对牙胶样品的提取液进行全扫描检测，利用超高分辨质谱测得未知物质的精确质量数。第二步，对采集到的数据进行解卷积处理，去除干扰离子，得到较为干净的质谱图。通过与空白样(即在1.2中不加牙胶样品，其余步骤一样)的比较，扣除溶剂或系统中存在的杂质峰，识别牙胶中独特的色谱峰。第三步，将未知物的质谱图在商业标准谱图库中进行检索，利用各离子峰的精确质量信息对匹
配结果进行进一步过滤。正匹配指数si表示测得谱图与标准谱库中的谱图对比的匹配值，hrf值表示碎片离子的实测值与标准谱库中相应碎片离子元素组成相符的精确质量百分比。保留指数也是定性分析的一个重要指标，保留指数偏差δri越小越好。当检索的综合评分大于90，si大于700，hrf大于90，δri小于100时，会过滤掉多个干扰项，有效的减少了数据分析的时间，提高鉴定结果的准确性。第四步，当某个未知物存在多个检索得分相近的候选结果时，可以利用ei谱图中同位素信息和碎片离子进行鉴别，还可以通过获得pci数据来测得未知物质的分子离子和分子式，进而从候选结果中选出最匹配的。
[0044]
2、结果与讨论
[0045]
2.1色谱柱和样品处理方法的优化
[0046]
为了识别牙胶中潜在的物质，对于色谱柱的选择有两个必须的要求。首先，色谱柱应具有良好的热稳定性，以便检测到更多沸点较高的物质。第二，色谱柱应具有一定的极性，以分离不同极性的物质。高极性hp
‑
innowax和db
‑
wax的最高工作温度仅为250℃，不适合高沸点化合物。因此，应使用具有高热稳性的聚硅氧烷色谱柱，如弱极性的hp
‑
5ms色谱柱和中等极性的db
‑
17ms或db
‑
35ms色谱柱。此外，保留指数是未知物质定性过程中的重要参考指标，通常是使用非极性柱、弱极性柱和极性柱测得的。因此，采用hp
‑
5ms进行后续研究。
[0047]
牙胶是一种与婴幼儿口腔接触的产品。牙胶中的潜在化学物质主要通过唾液接触迁移到体内。因此，主要研究人工唾液中化学物质的迁移量。固相萃取(spe)、固相微萃取(spme)和液液萃取(lle)是常用的三种从迁移溶液中萃取物质的方法。spe和spme涉及复杂的优化过程，包括萃取材料、洗脱溶剂(spe)和吸附、解吸条件(spme)的优化。由于没有明确的目标分析物，优化这些参数难度比较大。而采用乙酸乙酯和正己烷(1:1，v/v)为萃取溶剂的lle方法，操作简单，且适用于提取溶液中不同极性的未知物质。液液萃取后，使用温和氮气流吹扫进行定量浓缩，以提高检测的灵敏度。
[0048]
2.2牙胶玩具中未知物筛查鉴定
[0049]
2.2.1基于谱库检索综合评分和保留指数进行初步鉴定
[0050]
通过数据解卷积获得样品中未知物质较为干净的谱图，在nist标准谱库中进行化合物检索和候选化合物的高分辨过滤，结合检索的正相关得分si和hrf值，对所有检索结果进行综合排序。保留指数也是定性分析的一个重要指标。在分析样品之前，用同样的分析方法研究c7‑
c
40
正构烷烃的混合溶液。通过保留时间计算化合物的保留指数，并与标准谱库中物质的保留指数进行比较。最后计算保留指数的偏差δri。δri越小，结果越可靠。然而，有个别化合物在nist库中没有保留指数的数据，所以它们的δri无法计算。
[0051]
在10个牙胶中，共筛查识别出60多个色谱峰，每一个峰均对应着众多的检索结果。一般来说，当综合得分为大于90、si值大于700、hrf值大于90、δri小于100时，鉴定化合物的可靠性较高。例如，在某个未知物色谱峰的候选结果(图2b)中，异佛尔酮的综合得分为96.2，si为807，hrf为100，δri为1。另外7个候选结果都因为评价指标不符合要求而被排除。因此，该处未知物质为异佛尔酮的可能性非常高。
[0052]
2.2.2利用物质的同位素信息辅助鉴定
[0053]
当多个候选化合物得分相近时，可以利用ei谱图中同位素信息进行鉴别。由图3a可知，未知物质检索的最佳结果为4
‑
乙酰氨基苯甲酸乙酯，综合评分为98.8，si值为945，hrf值为99.32。而未知物质的分子离子峰m/z 165.07843与同位素166.08177的丰度比为
100:9.6。根据同位素丰度比规则，该化合物最多有9个c原子，因此排除了评分最高的结果。c原子序数≤9的检索结果为c9h
11
no2和c7h7no2。考虑si≥700，hrf≥90，δri≤100，从4个候选结果(苯唑卡因、3
‑
氨基苯甲酸乙酯、6
‑
甲基吡啶
‑3‑
羧酸乙酯、4
‑
氨基苯甲酸)中选择了苯唑卡因。苯唑卡因综合得分为98.1，si值为914，hrf值为99.32，δri为20。图3b中观察到的碎片离子与苯唑卡因的裂解机理有很好的相关性。分子离子断裂2号位，失去一个ch3ch2o
‑
，即为图3中的基峰m/z 120.04437，与理论碎裂的精确质量偏差为
‑
0.17ppm。另外，在137.04718、92.04951和65.03862处可以观测到其他特征离子，质量偏差均小于1ppm。因此，该未知物最可能的结果是苯唑卡因。
[0054]
2.2.3采用正化学电离pci鉴定未知物的分子式
[0055]
对于几个综合评分相近的候选化合物，利用甲烷作为反应气体获得化学电离数据是一种可靠的鉴别方法。在正化学电离pci模式下，可以检测到[m h]

或[m c2h5]

的分子离子加合峰，从而推断化合物的分子式。如图4a所示，c
11
h
18
no3p综合得分最高为97.3，但si值仅为562。其他候选结果综合评分比较接近，δri也不能提供参考。但是这些候选化合物的分子式不同，所以化合物可以通过pci来确定。如图4b所示，在ei谱图中很难确定135.06794是否为该处化合物的分子离子峰。在图4c中，pci谱图中[m h]

的加合峰为136.07564，与理论精确质量136.07569相差
‑
0.37ppm。此外，pci谱图中常见的加合离子如[m c2h5]

(
‑
0.01ppm)可以用来验证元素组成。因此，该未知物最可能的分子式是c8h9no，物质最可能的结果是n
‑
甲基甲酰苯胺(综合评分＝97，si＝867，hrf＝99.02)。
[0056]
2.3牙胶样品中未知物质的检测情况
[0057]
利用本研究的方法，在10个牙胶中鉴定出28种物质。表1列出了所有物质的名称、cas号、基峰离子、分子式、综合评分、si值、hrf值、δri、ei模式下[m]
*
的精确质量偏差、pci模式下[m h]

的精确质量偏差、基峰离子的精确质量偏差。各物质综合得分均大于93.8，si值大于734，hrf值大于92.23，离子的精确质量偏差均在1ppm以内。除了3,4
‑
二甲基苯甲醇外，所有物质的δri都小于21，虽然3,4
‑
二甲基苯甲醇的δri为150，但是通过标准品验证，证明该结果是准确的。8种物质的保留指数没有被收录到nist库中，所以没有列出这些物质的δri。
[0058]
图5为样品中28种物质的检测结果。将基峰面积的范围划分为用圆的大小表示的8个区间。苯酚的检出率为90％，样品中的含量由低到高，覆盖了多个区间。以苯酚为例，对10种牙胶样品中的迁移量进行了定量分析，迁移量为3.40～386.60μg/l。作为参考，可以大致估计其他物质的迁移量，之后如有需要还可做进一步的定量研究。国际癌症研究机构将苯酚列为疑似致癌物质(第3类)。根据欧盟玩具安全指令2009/48/ec，苯酚的迁移量不应超过5mg/l。这10个样品均符合法规的限量要求。此外，一些经鉴定的物质也受到儿童产品法规的限制。例如，环己酮被列为第3类致癌物质。异佛尔酮对眼睛和皮肤有刺激作用。根据欧盟玩具标准en71，环己酮和异佛尔酮的迁移限值分别为46和3.0mg/l。
[0059]
其他经鉴定的物质也具有潜在的危害性，但迄今为止尚未得到相应法规的重视。例如，邻苯二甲酸二甲酯、n
‑
甲基苯胺和n
‑
甲基甲苯胺是环境优先污染物。苯并噻唑类化合物对微生物具有诱变作用，对人类具有致癌作用。光引发剂1173和4
‑
甲基二苯甲酮是具有致癌作用、皮肤接触毒性和生殖毒性的紫外光引发剂。苯甲酸异丁酯具有内分泌干扰作用。
[0060]
表1牙胶玩具中潜在有害物质鉴定清单
[0061][0062]
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。