一种高通量鲍耐高温能力的快速测评方法与流程

1.本发明涉及水产生物技术领域中针对鲍耐高温能力的测评技术，尤其是涉及区分鲍不同品种或不同养殖群体对高温耐受能力的一种高通量鲍耐高温能力的快速测评方法。


背景技术：

2.中国是世界第一养鲍大国，养殖产量占全球产量的85％以上，2019年，我国的鲍产量超过18万吨，其中，福建作为全国鲍主养区，福建省的鲍鱼年产量占全国产量的82.7％，年产值约200亿元左右，鲍鱼养殖已发展成为福建省产值第一的海水养殖种类，其主要养殖品种为原产自辽宁、山东沿岸的皱纹盘鲍。皱纹盘鲍原产地在温带的黄渤海海区，为温带种，该种经遗传改良后，耐高温能力得到提高，并南移福建开展养殖，福建鲍产业也因此快速发展，但受皱纹盘鲍原有生态习性所限，以及全球变暖等原因，每年夏季高温期均有部分养殖海域发生养殖鲍因高温不耐受而发生暴发性死亡现象，成为当前困扰鲍养殖产业健康发展的主要瓶颈之一。因此，培育耐高温鲍新品种(系)显得尤为重要，而在耐高温品种培育过程中如何快速、准确的测评育成品系的耐高温能力显得尤为重要。
3.传统的鲍耐高温能力的测评方法，多是基于夏季的养殖数据或是以半致死温度等方法为代表的实验室内评测方法，采用在自然海区夏季的养殖数据为指标，其测评周期长，且自然海区中水文条件复杂，测评结果易受其他因素影响，无法提供准确的数据，可信度低；而以半致死温度等方法为代表的实验室内测评方法，通常需要在较短时间内改变水温，以鲍的存活率为指标来完成测评工作，但这一方法对鲍的损伤极大，评测结束后，耐受性强的个体往往也无法存活，造成实验用鲍的死亡，虽然获得相关的测评数据，但无法获得选育个体用于开展后续育种工作。
4.中国专利cn 107372273 a公开一种快速区分鲍耐温性能的测定方法，该方法将待评测的鲍样品暂养于适宜的水温条件下，采用非入侵式的方法，利用胶水将红外传感器固定在对应鲍心脏准确位置的鲍贝壳上，以非入侵方式测出的鲍心率测定为基础，通过实时记录不同温度条件下的鲍心率，而后获得arrhenius曲线，进而计算每个样品的abt值，从而可测定每个样品热耐受性的差异，与其普通方法相比，该方法虽然具有操作方便对鲍鱼损伤小、可个体测定等优点，但因测定时需要采用红外传感器探寻鲍心脏的准确位置，同时需要确保获得的信号强度不低于1v，确定位置后还需要利用胶水将传感器固定于鲍壳上，找寻鲍心脏位置，并且在鲍贝壳上固定红外传感器准确反映鲍的心率这一操作对操作者的专业程度要求较高，存在心率测定不准确的风险。此外因开展上述操作步骤时，受试鲍样品需离开原本已适应的养殖海水环境，操作不当时，存在样品因撬动等操作受惊吓，或因干露导致受试鲍自身活动力受影响，如果后续放回洁净海水恢复过程处理不恰当，所测出的结果极易产生偏差。且该方法需使用红外传感器粘贴在鲍贝壳上，同一个操作人员每次所能测试样品数量受传感器数量、粘贴熟练度、放回洁净海水中再恢复时间等因素制约，往往每次只能测定数十只，完成一个群体的测评工作往往需要10～20天左右。操作过程仍较为繁琐，易出现错误测评结果，不利于大规模开展鲍耐高温品种的选育工作。因此，如何于实验室中
快速准确、高通量地评测鲍的耐高温性能，成为鲍育种工作者亟需解决的问题之一。
5.鲍拥有宽大而发达的腹足，这种足肌结构使它能够在水下深处牢牢地吸附在光滑的岩石表面，并且这种吸附力具有很高的强度。鲍鱼在持续高温胁迫下，足肌逐渐失去吸附能力，会从附着物上脱离，因此鲍的附着能力被当做判断鲍健康状态的重要指标。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供具有操作简便、单次测试样本数量大、测评周期短、受试鲍鱼不会因测评工作造成损伤，完成测评后的鲍样本可用于开展后续育种工作等优点的一种用于开展鲍耐高温能力的测评装置。
7.本发明的另一目的在于提供有助于提高鲍耐高温品种的育种效率的一种高通量鲍耐高温能力的快速测评方法。
8.所述用于开展鲍耐高温能力的测评装置包括养殖箱、海水温度调节器、制氧机、蛋白分离器、温度监测仪、水泵和附着板；所述养殖箱与蛋白分离器、水泵、海水温度调节器通过pvc水管相连；在蛋白分离器与水泵之间设有制氧机，用于向养殖海水内充入充足的氧气；所述养殖箱内装入海水用于养殖待测评鲍，水泵推动海水进行循环，流出的海水首先经蛋白分离器处理，并经海水温度控制器调节至暂养水温后重新流入养殖箱内，所述温度检测仪连接有温度探头一端，温度探头另一端置于海水液面以下，用于监测养殖箱内温度。所述养殖箱的箱顶设至少两条固定附着板的吊绳，用于将附着板从平面拉成垂直。
9.所述养殖箱可采用常规养殖水族箱，可根据待测评鲍样品数量选择不同大小尺寸。
10.所述附着板可采用亚克力材质塑料板，板的表面光滑；附着板的尾部设有用于吊绳穿插以利于其悬挂的通孔。
11.一种高通量鲍耐高温能力的快速测评方法，包括以下步骤：
12.1)选择不同种类或品种的鲍，将待测评鲍贴上标签，测量鲍样品生长参数后，暂养于养殖箱内，设置水温和盐度，投喂新鲜江蓠、龙须菜或海带，每日更换四分之一的新鲜海水，及时清理残饵与粪便，饲养喂养5～15天，以保证受测鲍鱼处于正常的状态；
13.在步骤1)中，所述设置水温和盐度，水温控制在18～22℃，盐度在30～35，溶解氧浓度不低于6mg/l，ph不低于8.0；所述水温优选20℃。
14.2)暂养至第7天时，将测评用附着板放入养殖箱底，待受测试鲍逐渐爬行至测评用的附着板后，从18℃起，按1℃/h的速率逐步升温，在28℃时将附着有鲍的附着板垂直悬挂于养殖海水中，然后继续将养殖海水提升至最终胁迫温度30～34℃；
15.在步骤2)中，所述最终胁迫温度优选32℃。
16.3)从水温达最终胁迫温度时开始计时，记录每个个体失去附着能力从附着板上掉落的时间，即高温下维持吸附能力的时间；将失去附着能力掉落的个体移至新鲜海水中恢复，新鲜海水的初始水温为14～18℃，恢复时间3天，每天上升1℃，并记录3天内的死亡情况；测评全程在黑暗的房间中进行，观察和移动鲍样品需使用光源时，所使用光源的波长在550～600nm；利用spass 22对数据进行统计分析，利用graphpad prism 8和r包绘图。
17.本发明基于鲍区别于其他主养贝类所特有的附着能力，开发一种高通量、操作方便的鲍耐高温能力测评方法，利用鲍拥有宽大而发达的腹足，腹足吸力极强，可牢固吸附在
光滑表面的物理特性，以鲍个体在持续高温胁迫下，足肌逐渐失去吸附能力，会从附着物上脱离的时间作为指征，测评不同鲍鱼个体对高水温的耐受能力。具有操作简便、单次测试样本数量大、测评周期短、受试鲍鱼不会因测评工作造成损伤，完成测评后的鲍样本可用于开展后续育种工作等优点，有助于提高鲍耐高温品种的育种效率。利用本发明可避免环境对受试鲍样品造成影响，测试结果精准度高，可大量开展鲍耐高温性状的测评工作。
附图说明
18.图1是开展鲍耐高温能力测评装置的结构组成示意图。
19.图2是皱纹盘鲍南方群体和北方群体热应激附着持续时间(had)比较图。
20.图3是皱纹盘鲍、绿盘鲍、绿鲍的热应激附着持续时间(had)比较图。
具体实施方式
21.以下实施例将结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。未说明的可采用市售商品。
22.如图1所示，所述用于开展鲍耐高温能力的测评装置实施例包括养殖箱(12)、海水温度调节器(1)、制氧机(2)、蛋白分离器(3)、温度监测仪(5)、水泵(13)和附着板(8)；所述养殖箱(12)的箱顶设至少两条固定附着板的吊绳(7)，用于将附着板从平面拉成垂直；所述养殖箱(12)与蛋白分离器(3)、水泵(13)、海水温度调节器(1)通过pvc水管(11)相连；在蛋白分离器(3)与水泵(13)之间设有制氧机(2)，用于向养殖海水内充入充足的氧气；所述养殖箱(12)内装入海水(10)用于养殖待测评鲍(9)，水泵(13)推动海水进行循环，流出的海水(10)首先经蛋白分离器(3)处理，并经海水温度控制器(1)调节至暂养水温后重新流入养殖箱(12)内，所述温度检测仪(5)连接有温度探头(4)一端，温度探头(4)另一端置于海水液面(6)以下，用于监测养殖箱内温度。
23.所述养殖箱(12)可采用常规养殖水族箱，可根据待测评鲍样品数量选择不同大小尺寸。
24.所述附着板(8)可采用亚克力材质塑料板，板的表面光滑。附着板(8)的尾部相应设有用于吊绳(7)穿插以利于其悬挂的通孔。
25.所述高通量鲍耐高温能力的快速测评方法实施例，包括以下步骤：
26.1)开展鲍耐高温能力测评时，选择不同种类或品种的鲍，将待测评鲍(9)样品贴上标签，测量鲍样品生长参数后，暂养于养殖箱内，养殖箱为常规养殖水族箱，可根据待测评鲍样品数量选择不同大小尺寸。养殖箱内水温控制在20℃，盐度在30～35，制氧机(2)向养殖海水内充入充足的氧气，确保溶解氧浓度不低于6mg/l，ph不低于8.0，投喂新鲜江蓠、龙须菜或海带，每日更换四分之一的新鲜海水，及时清理残饵与粪便，饲养喂养5～15天，以保证受测鲍鱼处于正常的状态；
27.待测评鲍(9)养殖于养殖箱(12)内，养殖箱内装海水(10)，由水泵推动海水进行循环，流出的海水(10)首先经蛋白分离器(3)处理，并经海水温度控制器(1)调节至暂养水温后重新流入养殖箱(12)内，暂养水温控制在20℃，盐度在30～35，溶解氧浓度不低于6mg/l，ph不低于8.0，投喂新鲜江蓠、龙须菜或海带，每日更换四分之一的新鲜海水，及时清理残饵与粪便，饲养喂养5～15天，以保证受测鲍鱼处于正常的状态。
28.所述蛋白分离器可选择厂家型号包括：安丘格尔环保设备有限公司，型号：geer
‑
db5。
29.所述制氧机可选择生产厂家：山东远图环境技术有限公司，型号：yt
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9000
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10p。
30.2)暂养至第7天时，将测评用附着板(8)放入养殖箱(12)底，待受测试鲍逐渐爬行至测评用附着板后，从20℃起，按1℃/h的速率逐步升温，在28℃时将附着有鲍的附着板垂直悬挂于养殖海水中，然后继续将养殖海水提升至最终胁迫温度32℃。
31.3)从水温达32℃时开始计时，记录每个个体失去附着能力从附着板上掉落的时间，即高温下维持吸附能力的时间——热应激附着持续时间(had)；将失去附着能力掉落的个体移至新鲜海水中恢复，新鲜海水的初始水温为16℃，恢复时间3天，每天上升1℃，并记录3天内的死亡情况。测评全程在黑暗的房间中进行，观察和移动鲍样品需使用光源时，所使用光源的波长在550～600nm。利用spass 22对数据进行统计分析，利用graphpad prism 8和r包绘图。
32.以下给出具体实施例。
33.实施例1：
34.对皱纹盘鲍南方群体(代号：yx)和皱纹盘鲍北方群体(代号：dl)的耐高温性状开展测评，比较二者的耐高温能力。
35.取皱纹盘鲍南方群体和皱纹盘鲍北方群体鲍样本各50只，每只鲍贝壳上贴上标签暂养于鲍耐高温能力测评装置中，皱纹盘鲍南方群体平均壳长为5.3cm，皱纹盘鲍北方群体的平均壳长为5.5cm，测评装置内的海水温度控制在20℃，海水盐度33，溶解氧浓度6.2mg/l，ph为8.1，投喂新鲜龙须菜，每日更换四分之一的新鲜海水，及时清理残饵与粪便，正常喂养10天，确认受测鲍鱼处于正常的状态；暂养至第7天时，将测评用附着板放入缸底，待受测试鲍鱼逐渐爬行至测评附着板后，从20℃起，按1℃/h的速率逐步升温，在28℃时将附着有鲍的附着板垂直悬挂于养殖水体中，然后继续提升养殖箱内水温至32℃。
36.从达到32℃时开始计时，记录每个个体失去附着能力从附着板上掉落的时间，即高温下维持吸附能力的时间(had)。对失去附着能力掉落的个体及时移至16℃的新鲜海水中恢复，进行为期3天的恢复观察，恢复时间3天，每天上升1℃，并记录3天内的死亡情况。测评全程在黑暗的房间中进行，观察和移动鲍样品需使用光源时，所使用光源的波长在550
‑
600nm。利用spass 22对数据进行统计分析，利用graphpad prism 8和r包绘图。
37.皱纹盘鲍南方群体和北方群体had测量结果如图2。由图2可以看出，在had 50上南方群体高于北方群体(yx:4.96h；dl:3.49h)，同样在had的平均值上南方群体为5.49
±
2.47h显著高于北方群体4.06
±
2.49h(p＝0.019<0.05)；南北方群体在变异系数有较大差异，数值上yx：47.85％小于dl：68.88％，反映出南方群体经过长时间的南方高温驯化更为均一，掉落更为集中；虽然起始掉落时间都在1h内，但南方群体(0.72～11.27h)在最大附着持续时间上明显高于北方群体(0.34～10.02)，表明南方群体具有更高的耐高温能力，该群体具有高温选育潜力。
38.实施例2：
39.对皱纹盘鲍(代号：dd)、绿鲍(代号：ff)和绿盘鲍(皱纹盘鲍
♀×
绿鲍
♂
)(代号：ff)的耐高温性状开展测评，比较三者间的耐高温能力。
40.取皱纹盘鲍、绿鲍和绿盘鲍样本各60只，每只鲍贝壳上贴上标签暂养于鲍耐高温
能力测评装置中的养殖箱内，皱纹盘鲍平均壳长为7.8cm，绿鲍的平均壳长为8.1cm，绿盘鲍的平均壳长为7.4cm，测评装置内海水温度20℃，海水盐度32，溶解氧浓度6.5mg/l，ph为8.1，投喂新鲜龙须菜，每日更换四分之一的新鲜海水，及时清理残饵与粪便，正常喂养9天，确认受测鲍鱼处于正常的状态；暂养至第7天时，将测评用附着板放入缸底，待受测试鲍鱼逐渐爬行至测评附着板后，从20℃起，按1℃/h的速率逐步升温，在28℃时将附着有鲍的附着板垂直悬挂于养殖水体中，然后继续提升养殖箱内水温至33℃。
41.从水温达到33℃时开始计时，记录每个个体失去附着能力从附着板上掉落的时间，即高温下维持吸附能力的时间(had)。对失去附着能力掉落的个体及时移至17℃的新鲜海水中恢复，进行为期3天的恢复观察，恢复时间3天，每天上升1℃，并记录3天内的死亡情况。测评全程在黑暗的房间中进行，观察和移动鲍样品需使用光源时，所使用光源的波长在550～600nm。利用spass 22对数据进行统计分析，利用graphpad prism 8和r包绘图。
42.皱纹盘鲍(dd)、绿盘鲍(df)、绿鲍(ff)在32℃下had的测量结果如图3。dd无论在起始掉落时间(0.42h)，had50(4.95h)，平均掉落时间(5.11
±
2.40h)，最长吸附时间(10.97h)都处于最小；df在起始掉落时间(0.79h)，had50(7.47h)，平均吸附时间(7.26
±
3.53h)、变异系数(0.49)都比其它两种鲍大；ff的had平均值(6.89
±
3.23h)和中位数(6.89h)接近，显著高于dd(p＝0.015<0.05)。
43.从图3可以看出，皱纹盘鲍(dd)无论在起始掉落时间(0.42h)，had50(4.95h)，平均掉落时间(5.11
±
2.40h)，最长吸附时间(10.97h)都处于最小；绿盘鲍(df)在起始掉落时间(0.79h)，had50(7.47h)，平均吸附时间(7.26
±
3.53h)、变异系数(0.49)都比其它两种鲍大；绿鲍(ff)的had平均值(6.89
±
3.23h)和中位数(6.89h)接近，显著高于皱纹盘鲍(dd)(p＝0.015<0.05)。说明皱纹盘鲍(dd)的耐高温能力最低，杂交种绿盘鲍(df)耐高温能力更高，显示出杂种优势。
44.本发明并不限于上述举例，在本发明的实质范围内做出的变化与等效修饰，仍应属于本发明保护范围内。