一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法与流程

1.本发明涉及分子生物学领域，特别是一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法。


背景技术：

2.临床上有大量的病例需要进行感染病原菌的检测，其中每年至少有50万例为重症感染病人。目前，临床检测病原微生物主要通过传统的细菌培养鉴定方法，其过程包括微生物的培养及分离、物种鉴定及药敏试验。传统的病原检测方法存在病原周期长，检测覆盖度低，部分病原无法检测或需要很长时间才能检出，以及无法得到病原的丰度信息等局限性。近年来，高通量基因测序技术的发展，使得我们能够直接从患者的脑脊液、胸水、腹水、肺泡灌洗液等样本中提取核酸，短时间内一次性检测样本中几乎所有潜在的病原体。
3.但是市场上的检测方法还是不能检测出较低丰度的致病微生物，且为了检测细菌种类的覆盖率高，需要大量时间，市场需要一种能够降低测序时间的方法，本发明通过找到覆盖细菌的16s与真菌的its基因待测区域的自主设计的引物和新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）技术解决以上问题。


技术实现要素：

4.为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，本发明通过设计覆盖细菌的16s与真菌的its基因待测区域的引物组合并结合新型纳米孔测序法，实现快速进行微生物的基因组比对和种属鉴定，便于实现感染性疾病病原微生物的快速临床诊断，使该检测方法具备高通量，快速检测的优势。
5.为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，包括如下步骤：步骤一，设计覆盖细菌的16s与真菌的its基因待测区域的自主设计的引物，序列为seq01
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04；步骤二，在seq01
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04的正向引物的5’端加上aggtcttcacgatacgtcgag碱基序列，反向引物的5’端加上gtccaatcagttgcagcttcag碱基序列，得到第二轮扩增时与barcode引物退火时相结合的序列，将第二轮扩增时与barcode引物退火时相结合的序列混合形成引物池；步骤三，接收样本，提取dna；步骤四，采用引物池进行第一轮扩增，纯化；再选用barcode进行第二轮扩增，纯化；步骤五，构建最终文库；步骤六，将最终文库进行纳米孔测序，分析确认样本感染的病原微生物。
6.前述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，步骤二中所述第二轮扩增时与barcode引物退火时相结合的序列按照浓度比例1：1：1：1混合形成引物池。
7.前述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，样本包括：肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液或edta抗凝血。
8.前述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，步骤四中第一轮扩增的反应体系包括：2*pcrmix12.5μl，引物池3μl，模板dna9.5μl；反应程序为：105℃热盖；95℃3min；95℃30sec，62℃1min，72℃1min，25个循环；72℃3min；4℃hold；纯化采用磁珠纯化。
9.前述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，步骤四中第二轮扩增的反应体系包括：2*pcrmix12.5μl，barcode引物3μl，第一轮扩增纯化产物10.5μl；反应程序为：105℃热盖；95℃3min；95℃30sec，64℃30sec，72℃1min，12个循环；72℃3min；4℃hold；纯化采用磁珠纯化。
10.前述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，步骤五中构建最终文库的具体方法是：（1）文库pooling，得到文库mixdna；（2）末端修复：末端修复反应体系为：endprepmix415μl，文库mixdnaxμl，ddh2o50
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xμl；pcr程序为：105℃热盖，25℃15min，65℃15min，4℃hold；（3）磁珠纯化；（4）接头连接：接头连接反应体系为：上一步的dna样本25μl，连接缓冲液10μl，rapiddnaligase5μl，adaptermix1μl，ddh2o9μl；pcr程序为：105℃热盖；20℃15min；4℃hold；（5）磁珠纯化；（6）产物质检；（7）最终文库配置体系为：sequencingbuffer18.8μl，loadingbeads12.8μl，libraryxμl，ddh2o15.4
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xμl。
11.前述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，步骤六中纳米孔测序使用nanopore公司的minion测序仪，测序试剂盒：sqk
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lsk109，测序芯片：r9。
12.前述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，步骤六中将最终文库进行纳米孔测序，分析确认样本感染的病原微生物的具体步骤是：a）芯片上机前质检；b）诱发：诱发剂配置体系为：flushbuffer500μl，flushtether15μl，ddh2o200μl；c）加样；d）测序；e）下机数据分析：下机数据与数据库中的序列进行比对，分析每个样本中各种菌株的丰度，确认样本感染的病原微生物。
13.采用上述技术方案后，本发明的有益之处在于：
本发明通过设计覆盖细菌的16s与真菌的its基因待测区域的引物组合配合纳米孔测序技术能够同时检测临床样本中可能存在的所有的病原微生物的较长片段的核酸，这是目前大部分检测手段中不具备的能力；本发明操作简便，具备高通量、敏感、准确全面；本发明配合纳米孔测序仪minion，即可完成测序，此款测序仪小巧灵活，可以随时随地实时测序，最快数十分钟即可获得目标序列，在一天内即可实现从开始处理样本到得到检测报告。
附图说明
14.图1是本发明文库构建流程示意图；图2是用于与本发明实验的金黄色葡萄球菌检测结果进行比较的金黄色葡萄球菌qpcr结果示意图；图3是用于与本发明实验的白色念珠菌检测结果进行比较的白色念珠菌qpcr结果示意图。
具体实施方式
15.以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
16.根据如下的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法验证本发明的技术效果，包括如下步骤：步骤一，设计覆盖细菌的16s与真菌的its基因待测区域的自主设计的引物，序列为seq01
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04；引物序列如下表1；需要说明的是：由于细菌的16s与真菌的its基因均为通用片段，在一定程度上存在较高的一致性，在下载了非常多种类菌的16s与真菌的its基因进行比较，设计引物，再通过阳性样本的实验后，发现这样的引物组合能够同时检测临床样本中可能存在的所有的病原微生物的较长片段的核酸，且准确度高，引物组合具有协同作用，其扩增产物细菌16s在~1200bp，真菌its在~800bp。
17.表基因待测区域的通用引物步骤二，在seq01
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04的正向引物的5’端加上aggtcttcacgatacgtcgag碱基序列，反向引物的5’端加上gtccaatcagttgcagcttcag碱基序列，得到第二轮扩增时与barcode引物退火时相结合的序列，将第二轮扩增时与barcode引物退火时相结合的序列混合形成引物池；作为一种优选，引物池的浓度比例为1：1：1：1。
18.步骤三，接收样本，提取dna；本实验以肺泡灌洗液为例，样本的接收与dna提取1，收样及给样本编码，在excel表格内记录样本名称及其他信息。
19.2，样本前处理取500μl样本于2ml ep管内，加入10μl的蛋白酶k，5μl的溶菌酶以及0.05mm氧化锆研磨珠，使用研磨机进行研磨，90s为一循环，研磨3个循环，每次循环之间休息15s。
20.3，dna的提取取一个干净的1.5ml ep管加入500μl的裂解液，3μl的内控，最后加入400μl研磨好的样本。75℃孵育10min后，加入400μl的无水乙醇，充分混匀后加入15μl 提取磁珠，充分混匀室后温静置5min。将孵育完成的 ep管放置磁力架上并吸弃上清，加入600μl洗涤液，充分混匀后再次放置磁力架上并吸弃上清，加入800μl现配的80%乙醇，充分混匀后再次放置磁力架上并吸弃上清。待磁珠基本干燥时，加入65μl洗脱液室温孵育5min。将孵育完成的 ep管放置磁力架上吸取上清。
21.4，核酸浓度检测使用qubit4.0检测提取出核酸浓度。
22.步骤四，采用引物池进行第一轮扩增，纯化；再选用barcode进行第二轮扩增，纯化；1，在pcr仪上设定如下表2程序。
23.表22，按照下表3配置反应液于0.2ml pcr试管中，然后放入pcr仪中运行全部程序。
24.表3
3，产物纯化将室温的纯化磁珠与上述产物按照3:5的体积比混合，室温孵育5分钟。将试管放于磁力架上，静置，小心洗出上清，避免干扰磁珠。加入80%乙醇，静置30秒；小心吸出上清，避免干扰磁珠；再次加入80%乙醇，静置30秒；小心吸出上清，避免干扰磁珠，风干磁珠。加入20μl洗脱液，室温静置5分钟。将试管放于磁力架上，静置，小心洗出上清18μl，避免干扰磁珠，将上清转移至新的0.2ml pcr试管中。
25.4，如表4在pcr仪上设定如下程序。
26.表45，按照下表5配置反应液于0.2ml pcr试管中，然后放入pcr仪中运行全部程序。
27.表5目前纳米孔测序常用barcode有96种，以区分同批次的不同样本，具体见下表6：表6 nanopore barcode序列
1，产物纯化将室温的纯化磁珠与上述产物按照3:5的体积比混合，室温孵育5分钟。将试管放于磁力架上，静置，小心洗出上清，避免干扰磁珠。加入80%乙醇，静置30秒；小心吸出上清，
避免干扰磁珠；再次加入80%乙醇，静置30秒；小心吸出上清，避免干扰磁珠，风干磁珠。加入20μl洗脱液，室温静置5分钟。将试管放于磁力架上，静置，小心洗出上清18μl，避免干扰磁珠，将上清转移至新的0.2ml pcr试管中。
28.2，扩增产物质检使用qubit4.0检测扩增产物浓度，同时使用琼脂糖凝胶电泳，观察产物条带大小。
29.步骤五，构建最终文库；1，文库pooling根据qubit检测结果，按照每个样本50ng的上样量进行计算，并按照该计算体积进行文库的pooling，充分混匀，得到文库mix。
30.2，末端修复在pcr仪上设定如下表7程序。
31.表7末端修复反应体系如下表8：表8注意：文库pooling的体积若大于50μl，可根据实际情况微调或混多个上样量相近的文库pooling。
32.3，产物纯化将室温的纯化磁珠与上述产物按照4:5的体积比混合，室温孵育5分钟。将试管放于磁力架上，静置，小心洗出上清，避免干扰磁珠。加入80%乙醇，静置30秒；小心吸出上清，避免干扰磁珠；再次加入80%乙醇，静置30秒；小心吸出上清，避免干扰磁珠，风干磁珠。加入20μl洗脱液，室温静置5分钟。将试管放于磁力架上，静置，小心洗出上清18μl，避免干扰磁珠，将上清转移至新的0.2ml pcr试管中。
33.4，接头连接在pcr仪上设定如下表9程序：表9
接头连接反应体系如下表10：表10注意：amx为nanopore专用接头，可根据实际样本dna上样量进行调整。
34.5，产物纯化将室温的纯化磁珠与上述产物按照3:5的体积比混合，室温孵育5分钟。将试管放于磁力架上，静置，小心洗出上清，避免干扰磁珠。125μl短片段缓冲液short fragment buffer(sfb)，静置30秒；小心吸出上清，避免干扰磁珠；125μl短片段缓冲液short fragment buffer(sfb)，静置30秒；小心吸出上清，避免干扰磁珠，风干磁珠。加入20μl洗脱液，室温静置5分钟。将试管放于磁力架上，静置，小心洗出上清18μl，避免干扰磁珠，将上清转移至新的0.2ml pcr试管中。
35.注意：若之前混合多个文库pooling在纯化前进行混合。
36.6，产物质检使用qubit4.0检测纯化产物。
37.7，最终文库配置体系如下表11：表11
注意：根据测出的浓度计算100ng的产物进行最终文库的构建。
38.步骤六，将最终文库进行纳米孔测序，分析确认样本感染的病原微生物。
39.使用nanopore公司的minion测序仪（测序试剂盒：sqk
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lsk109，测序芯片：r9）8，芯片上机前质检上机前1小时提前从4度冰箱中拿出，室温静置30min；插上数据线，与上机电脑相连接进行芯片质检，确认芯片中可使用的孔数。
40.注意：若芯片剩余可用孔数过低，应拿取一张新的芯片重复上述步骤。
41.9，诱发诱发剂配置体系如下表12：表12将配置好的诱发剂取800μl加入芯片，静置5分钟；将剩余诱发剂加入芯片。
42.10，加样诱发完成后，将最终文库从加样孔全部加入。加样完毕后，盖上芯片所有的盖子，插上数据线，与上机电脑相连接，设置上机程序后开始测序。
43.11，测序注意：开始测序后，应等待一段时间，直到电压稳定，观察barcode数据是否正常。
44.12，下机数据下机数据与数据库中的序列进行比对，分析每个样本中各种菌株的丰度，确认样本感染的病原微生物。
45.实验一：利用本发明的检测方法，对已知革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和白色念珠菌阳性样本检测结果如下表13、图2、3所示：将样本进行10倍梯度稀释后进行提取，稀释液选用同类型阴性样本，进行纳米孔测序。
46.表13纳米孔测序结果
结果分析：表13和图2中选择了已知革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的阳性样本，选用同类型的阴性样本进行10倍梯度稀释，分别取样本原液、10倍稀释、102倍稀释、103倍稀释、104倍稀释进行提取，将提取后的dna分别使用本发明和qpcr两种方法进行检测。表13中的totalreads代表使用本发明测序得到的所有结果序列数，reads数则代表使用本发明测序检测到能够匹配到革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的序列数，百分比则为检测到的金黄色葡萄球菌的序列数在总序列数的占比。随着样本稀释倍数增加，金黄色葡萄球菌的序列数在总序列数的占比在降低，但仍可以检测到低丰度的金黄色葡萄球菌。图2为qpcr结果可以发现当样本稀释至104倍后，qpcr无法检测到金黄色葡萄球菌。
47.表13和图3选择了已知白色念珠菌的阳性样本选用同类型的阴性样本进行10倍梯度稀释，分别取样本原液、10倍稀释、102倍稀释进行提取将提取后的dna分别使用本发明和qpcr两种方法进行检测。表13中的totalreads代表使用本发明测序得到的所有结果序列数，reads数则代表使用本发明测序检测到能够匹配到白色念珠菌的序列数，百分比则为检测到的白色念珠菌的序列数在总序列数的占比。随着样本稀释倍数增加，白色念珠菌的序列数在总序列数的占比在降低，但仍可以检测到低丰度的白色念珠菌。图2为qpcr结果可以发现当样本稀释至102倍后，qpcr无法检测到白色念珠菌。
48.根据这两组革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌阳性样本和白色念珠菌阳性样本进行的检测方法的比较结果可知：本发明通过设计覆盖细菌的16s与真菌的its基因待测区域的引物组合配合纳米孔测序技术能够同时检测临床样本中可能存在的所有的病原微生物的较长片段的核酸，且快速准确，这是市场上的检测手段中不具备的能力，具有广泛的市场前景。
49.除上述优选实施例外，本发明还有其他的实施方式，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求书中所定义的范围。