快速检测益生菌活性试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明涉及益生菌活性检测技术领域，尤其涉及快速检测益生菌活性试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.近年来发现噻唑蓝(mtt)比色法具有简单、快速、灵敏、稳定等特点，已开始应用于益生菌活菌检测研究。但是mtt具有毒性，在离心震荡等操作过程中，也容易造成益生菌死亡，一定程度上造成了检测的不准确。从而发明快速高效准确的益生菌检测试剂盒具有重要意义。


技术实现要素：

3.基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了快速检测益生菌活性试剂盒及其检测方法，提高了测定的准确性，且检测速度快。
4.本发明提出的快速检测益生菌活性试剂盒，包括如下组分：
5.pbs缓冲液；
6.黄精多糖提取液；
7.mtt染色液；
8.二甲基亚砜。
9.优选地，所述mtt染色液的浓度为4
‑
6mg/ml。
10.本发明提出的使用上述试剂盒快速检测益生菌活性的检测方法，方法步骤如下：
11.s1：取益生菌的菌液于无菌的离心管中，加入黄精多糖提取液，离心后弃去上清液；
12.s2：在无菌环境下，向s1的菌液中加入pbs缓冲液并混合均匀，重悬菌体沉淀，涡旋震荡至无菌块为止；
13.s3：向s2的混合液中加入mtt染色液并混合均匀；
14.s4：将s3的混合液置于避光的培养箱中进行反应，反应后进行离心，弃去上清液；
15.s5：向s4离心后的反应产物中加入二甲基亚砜，涡旋震荡至无菌块，避光室温放置8
‑
12min，离心后弃沉淀，取上清液；
16.s6：将所述s5中的上清液放于紫外分光光度计中，在545nm下测得其吸光值，并根据吸光值计算活菌数。
17.优选地，所述菌液的浓度为107‑
108cfu/ml。
18.优选地，所述益生菌为包括乳杆菌、乳球菌中的一种。
19.优选地，所述益生菌、黄精多糖、pbs缓冲液、mtt染色液添加的体积比为1:0.5
‑
1:4
‑
5:0.5
‑
2:1
‑
5。
20.优选地，所述s1中离心的条件为转速8000
‑
12000rpm、时间8
‑
12min。
21.优选地，所述s4中反应的条件为：温度37℃、时间0.5
‑
4h。
22.优选地，所述s4中离心的条件为转速8000
‑
12000rpm、时间4
‑
6min。
23.优选地，所述s5中离心的条件为转速8000
‑
12000rpm、时间4
‑
6min。
24.作用机理
25.黄精多糖提取液与益生菌菌液混合，黄精多糖能够与益生菌细胞结合，保护细胞膜结构，维持稳定细胞渗透压，保护益生菌细胞内蛋白质结构稳定，从而避免益生菌在检测过程中因mmt毒性和离心、震荡而引起的损害，提高检测的准确性。
26.与现有技术相比，本发明的有益技术效果
27.(1)本发明的试剂盒中添加的黄精多糖提取液能够对益生菌细胞产生有效的保护，该方法检测的结果相对于传统的平板菌落法的误差不超过1％，检测的准确性高。
28.(2)本发明的试剂盒还具有检测速度的优点，传统的平板菌落法检测需48小时左右，而本发明的试剂盒检测方法仅需4小时即可完成检测，极大地提高了益生菌活性检测的效率。
具体实施方式
29.本发明中的黄精多糖溶液采用现有的水提醇沉法制得，黄精多糖的浓度为0.5g/l。
30.实施例1
31.本发明对市场采购的植物乳杆菌样品检测方法步骤如下：
32.s1：取市场采购的植物乳杆菌样品的菌液1ml于无菌的离心管中，按体积比1:1(益生菌:黄精多糖)加入黄精多糖提取液，在8000rpm下离心10min后，弃去上清液；
33.s2：在无菌环境下，向s1的菌液中加入4ml的pbs缓冲液(磷酸盐缓冲溶液)重悬菌体沉淀，涡旋震荡至无菌块为止；
34.s3：向s2的混合液中加入0.5ml的mtt染色液并混合均匀；
35.s4：将s3的混合液置于避光的37℃培养箱反应2h，然后12000rpm下离心5min，弃去上清液；
36.s5：向s4离心后的反应产物中加入3ml的二甲基亚砜，涡旋震荡至无菌块，避光室温放置10min，10000rpm下离心5min，弃沉淀，取上清液；
37.s6：将所述s5中的上清液放于紫外分光光度计中，在545nm下测得其吸光值，并根据吸光值测定活菌数。
38.此外还通过通过传统平板菌落法对样品的菌落数进行测定。
39.实施例2
40.本发明对市场采购的保加利亚乳杆菌样品检测方法步骤如下：
41.s1：取市场采购的保加利亚乳杆菌样品的菌液1ml于无菌的离心管中，按体积比1:0.5(益生菌:黄精多糖)加入黄精多糖提取液，在10000rpm下离心10min后，弃去上清液；
42.s2：在无菌环境下，向s1的菌液中加入4ml的pbs缓冲液重悬菌体沉淀，涡旋震荡至无菌块为止；
43.s3：向s2的混合液中加入1ml的mtt染色液并混合均匀；
44.s4：将s3的混合液置于避光的37℃培养箱反应2h，然后10000rpm下离心5min，弃去上清液；
45.s5：向s4离心后的反应产物中加入1ml的二甲基亚砜，涡旋震荡至无菌块，避光室温放置10min，10000rpm下离心5min，弃沉淀，取上清液；
46.s6：将所述s5中的上清液放于紫外分光光度计中，在545nm下测得其吸光值，并根据吸光值测定活菌数。
47.此外还通过通过传统平板菌落法对样品的菌落数进行测定。
48.实施例3
49.本发明对市场采购的约氏乳杆菌样品检测方法步骤如下：
50.s1：取市场采购的约氏乳杆菌样品的菌液1ml于无菌的离心管中，按体积比1:1(益生菌:黄精多糖)加入黄精多糖提取液，在10000rpm下离心10min后，弃去上清液；
51.s2：在无菌环境下，向s1的菌液中加入5ml的pbs缓冲液重悬菌体沉淀，涡旋震荡至无菌块为止；
52.s3：向s2的混合液中加入2ml的mtt染色液并混合均匀；
53.s4：将s3的混合液置于避光的37℃培养箱反应4h，然后10000rpm下离心5min，弃去上清液；
54.s5：向s4离心后的反应产物中加入5ml的二甲基亚砜，涡旋震荡至无菌块，避光室温放置10min，10000rpm下离心5min，弃沉淀，取上清液；
55.s6：将所述s5中的上清液放于紫外分光光度计中，在545nm下测得其吸光值，并根据吸光值测定活菌数。
56.此外还通过通过传统平板菌落法对样品的菌落数进行测定。
57.实施例4
58.本发明对市场采购的乳酸乳球菌样品检测方法步骤如下：
59.s1：取市场采购的乳酸乳球菌样品的菌液1ml于无菌的离心管中，按体积比1:0.5(益生菌:黄精多糖)加入黄精多糖提取液，在10000rpm下离心10min后，弃去上清液；
60.s2：在无菌环境下，向s1的菌液中加入4.5ml的pbs缓冲液重悬菌体沉淀，涡旋震荡至无菌块为止；
61.s3：向s2的混合液中加入3ml的mtt染色液并混合均匀；
62.s4：将s3的混合液置于避光的37℃培养箱反应2h，然后10000rpm下离心5min，弃去上清液；
63.s5：向s4离心后的反应产物中加入3ml的二甲基亚砜，涡旋震荡至无菌块，避光室温放置10min，10000rpm下离心5min，弃沉淀，取上清液；
64.s6：将所述s5中的上清液放于紫外分光光度计中，在545nm下测得其吸光值，并根据吸光值测定活菌数。
65.此外还通过通过传统平板菌落法对样品的菌落数进行测定。
66.对实施1
‑
4的样品通过传统平板菌落法和试剂盒法测定的活菌数的结果如表1所示。
67.表1活菌数检测结果
[0068][0069]
由上可知，采用本发明试剂盒法测定的活菌数相对于传统的平板菌落法的误差不超过1％，说明了本发明的试剂盒的检测精确度高，这是因为本发明添加的黄精多糖能够避免益生菌在检测过程中因mmt毒性和离心、震荡而引起的损害，此外，本发明的试剂盒检测方法大大缩短了检测时间，仅需4h即可完成检测，提高了益生菌检测的效率。
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以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。