一种美白组合物、制备方法及应用与流程

1.本发明属于化妆品领域，涉及一种美白组合物、制备方法及应用。


背景技术：

2.表皮是由基底层发育而成，基底层由基底细胞和黑色素细胞组成，黑色素细胞产生黑色素，是人体色素系统中色素合成的基础。细胞内生成的黑色素，通过树状突起运输到角质层细胞内。它以1：36比例与角质层形成细胞，构成一个表皮单位，存在于表皮细胞层，黑素细胞通过合成核素形成皮肤颜色，同时吸收紫外线，使机体免受紫外线的损害。皮肤颜色的深浅是由黑素细胞合成的黑素数量的多少决定的。
3.美白作为化妆品护肤的一大热点，长久以来受到亚洲女性的广泛关注。而近年来，消费者对美白祛斑类护肤品的功效关注度持续上升，因此市场上涌出大量美白淡斑产品。但目前国内外的美白类化妆品都具有一些问题，如普遍美白效果差等。而美白效果好的化妆品经常含有氢醌和汞盐，其毒副作用较大，长期使用会造成皮肤永久褪色和接触性皮炎。因此需要寻找一些天然且安全有效的美白产品。
4.为防止黑色素沉积，通常采取以下两种方法：第一，抑制黑色素的生成，通过抑制络氨酸酶的生成和络氨酸酶的活性，或干扰黑色素生成的中间体，从而防止产生色素斑。第二，黑色素的还原，光氧化的防止。通过角质细胞刺激黑色素的消减，使已生成的黑色素淡化。本发明拟通过两种作用方式的同步进行。阻断黑色素链的传递，以此达到有效美白的效果。
5.红景天是生长在北半球高寒无污染地带的珍稀药用植物。为多年生草本植物，高10
‑
20厘米。根粗壮，圆锥形，肉质，褐黄色，根颈部具多数须根，根茎短，粗状，圆柱形，被多数覆瓦状排列的鳞片状的叶。生长在海拔1800—2500米高寒无污染地带，其生长环境恶劣，因而具有很强的生命力和特殊的适应性。可作药用，能够补气清肺，益智养心，是一味作用广泛的中药。亦有很大的美容效果，可作护肤品，也可食用。采用酵母菌对红景天植株进行发酵，能够保留植物的全部功效成分及其活性，避免了化学提取方法造成的活性成分流失，且与发酵滤液中的活性成分具有协同增效的作用。
6.雏菊的英文“daisy”源自盎格鲁撒克逊语中的“daeseage”或“白昼的眼睛”，指这种花随日出日落而开合的方式。其拉丁名称“bellis perennis”源自“bellus”(美丽)和“perennis”(持久)，如今雏菊是栽种最广泛的家庭花卉之一，是意大利的国花。为多年生或一年生葶状草本，高10厘米左右。叶基生，草质，匙形，顶端圆钝，基部渐狭成柄，上半部边缘有疏钝齿或波状齿。雏菊中含有丰富的香精油、菊色素、氨基酸和多种微量元素，其中黄酮类成分的含量比其他的菊花高32％到61％。，具有很好的美白功效，被广泛应用于各类美白产品中。
7.兰撒果树(laium domesticum)，是东南亚的典型树种，从泰国半岛到东部婆罗洲(印度尼西亚)，果实甜并有香味，是一种非常流行的甜点。在一些地方，果皮被用于治疗腹泻和肠痉挛，且有很好的抗氧化活性，种子磨碎可治疗发烧，树皮可口服用作治疗痢疾和疟
疾，叶子萃取后可作为化妆品原料，实现资源有效利用。mir
‑
490
‑
3p与酪氨酸酶mrna配对后可以控制黑色素细胞中酪氨酸酶的合成过程，减少酪氨酸酶的产生。研究表明，兰撒果叶提取物能够促进mir
‑
490
‑
3p的增加。
8.目前市面上的化妆品美白功效原料，存在靶点单一，难渗透吸收的问题，部分原料甚至存在溶解性差，稳定性差的的问题。本发明欲选用红景天，兰撒果叶和出具三种天然原料，红景天提取物及其水解物能够抑制c
‑
amp反应元件结合蛋白(creb)的磷酸化，抑制相关转录因子(mitf)和酪氨酸酶相关蛋白1(trp
‑
1)的表达，通过调节黑色素creb/mitf/tvrosinase生成通路发挥作用；雏菊花中的黄酮类成分可有效抑制角质形成细胞中et
‑
1的表达，并阻断黑素细胞中的受体mc
‑
1(黑皮质素受体1)，抑制黑色素在角质形成细胞的转移；而mir
‑
490
‑
3p是一段与酪氨酸酶mrna高度互补的mirna，在黑色素creb/mitf/tvrosinase生成通路中可与红景天提取物以及雏菊提取物发挥协同增效作用，兰撒果叶提取物能够促进mir
‑
490
‑
3p的增加。


技术实现要素：

9.本发明针对黑色素产生及转移的多种途径，将酵母菌发酵红景天产物提取物、雏菊提取物、兰撒果叶提取物进行科学配比，一方面通过阻断蛋白质的转录来影响酪氨酸酶的产生过程，另一方面能通过竞争性和非竞争性两种方式阻断酪氨酸酶与底物结合，抑制酪氨酸酶活性，阻断黑色素在角质形成细胞中的转移，从而达到有效美白的效果。
10.为了实现上述目的，本技术一方面提供了一种美白组合物，由如下质量比的组分混合得到：包括红景天发酵产物提取物、雏菊提取物、兰撒果叶提取物＝(5
‑
15):(2
‑
5):(0.1
‑
0.5)。
11.作为优选，所述红景天发酵产物提取物：雏菊提取物：兰撒果叶提取物＝10:2:0.5或5：3:0.5或10:2：0.3。
12.作为优选，所述美白组合物通过如下方法制备：
13.(1)将红景天、雏菊和兰撒果叶原料分别粉碎；
14.(2)向粉碎后的红景天、雏菊、兰撒果叶粉末中分别加入5
‑
10倍量的去离子水，浸润1
‑
3小时；水浴，温度为40
‑
50℃时加入纤维素酶，所加入的酶总质量占原料总质量的10％
‑
20％，搅拌20分钟，升温至40
‑
60℃微波处理5
‑
15分钟，超声水浴回流提取1
‑
3小时，重复2
‑
3次，得到红景天溶液、雏菊溶液和兰撒果叶溶液；
15.(3)向红景天溶液、雏菊溶液和兰撒果叶溶液中分别加入1
‑
3倍量85
‑
95％的乙醇溶液，低温静置8
‑
10小时，经旋转蒸发仪浓缩，得红景天浓缩液、雏菊浓缩液、兰撒果叶浓缩液；
16.(4)向红景天浓缩液中加入3
‑
5倍量去离子水、0.5
‑
1.5倍量ph7
‑
8且浓度为0.35mmol/l的磷酸盐缓冲溶液、1
‑
3倍量的浓度为30
‑
50wt％的葡萄糖水溶液，得发酵底物；用酵母菌发酵后，离心取上清液；
17.(5)将步骤(4)所得上清液用阳离子交换树脂吸附，洗脱至无色，得红景天发酵产物提取物；
18.(6)向雏菊浓缩液、兰撒果叶浓缩液加入3
‑
5倍量去离子水，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，用力振摇静止2
‑
4h后，分离有机层，继续萃取2
‑
3次，直至无色，合并乙
酸乙酯层；浓缩乙酸乙酯有机层，分别得雏菊提取物流浸膏和兰撒果叶提取物流浸膏；
19.(7)用1
‑
3倍量的去离子水分别溶解步骤(6)所得浸膏，加入澄清剂，静置后离心30
‑
60分钟，用微滤膜过滤，加入3倍量麦芽糊精充分溶解；过滤，减压浓缩，分别得雏菊提取物粗提液、兰撒果叶提取物粗提液；
20.(8)将步骤(7)得到的粗提液分别用超滤膜进行过滤，收集滤液，得到雏菊提取物以及兰撒果叶提取物；
21.(9)将步骤(5)以及步骤(8)得到的提取物按照比例进行组合，得到所述的美白组合物。
22.进一步优选：
23.所述步骤(3)中的浓缩是指浓缩至原重量的1/2
‑
1/5；
24.所述步骤(7)中的浓缩是指浓缩至原重量的1/3；
25.所述步骤(7)中的微滤膜孔径为0.1
‑
1.0μm；
26.所述步骤(8)中的超滤膜孔径为0.01
‑
0.05μm。
27.进一步优选，所述纤维素酶加入的量占原料总质量的10％
‑
20％。
28.进一步优选，所述酵母菌的加入量为发酵底物质量的1
‑
2％，发酵温度为25
‑
37℃，发酵时间为5
‑
10天。
29.本发明另一方面还提供了一种化妆品，包括所述组合物以及化妆品可使用的助剂。
30.作为优选，所述组合物占化妆品的质量百分比为0.5
‑
5％。
31.作为优选，所述化妆品为水剂、乳剂、喷雾、膏霜、凝胶剂或面膜。
32.本发明针对黑色素产生及转移的多种途径，将酵母菌发酵红景天产物提取物、兰撒果叶提取物、雏菊提取物进行科学配比，一方面通过阻断蛋白质的转录来影响酪氨酸酶的产生过程，另一方面能通过竞争性和非竞争性两种方式阻断酪氨酸酶与底物结合，抑制酪氨酸酶活性，阻断黑色素在角质形成细胞中的转移，从而达到有效美白的效果。
附图说明
33.图1是实验例4中不同组合物对黑色素转移影响的对比图；
34.图2是实验例6中不同组合物对色斑淡化影响的对比图；
35.图3是实验例6中不同组合物对肤色影响的对比图。
具体实施方式
36.以下，参照实施例对本发明进行更详细和具体地描述，但下述实施例并不意在限制本发明。在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化和替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
37.实施例1：一种多方式作用的美白组合物的制备
38.在本发明下述的实施例及对比例中，一种多方式作用的美白组合物采用以下工艺
制备。
39.(1)将红景天、雏菊和兰撒果叶原料分别粉碎；
40.(2)向粉碎后的红景天、雏菊、兰撒果叶粉末中分别加入5倍量的去离子水，浸润3小时。水浴，温度为48℃时加入纤维素酶，所加入的酶总质量占原料总质量的10％，搅拌20分钟，升温至54℃微波处理5
‑
15分钟，超声水浴回流提取3小时，重复3次，得到溶液a(红景天)、溶液b(雏菊)和溶液c(兰撒果叶)；
41.(3)向溶液a/b/c中分别2倍量加入90％的乙醇溶液，低温静置10小时，经旋转蒸发仪浓缩至原重量的1/2，得浓缩液d(红景天)、e(雏菊)、f(兰撒果叶)；
42.(4)向浓缩液d中依次加入3倍量去离子水、1倍量ph7
‑
8且浓度为0.35mmol/l的磷酸盐缓冲溶液、1
‑
3倍量的浓度为50wt％的葡萄糖水溶液，得发酵底物。向所述发酵底物中加入2％质量的酵母菌，在室温条件下培养10天，离心取上清液；
43.(5)将步骤(4)中上清液采用阳离子交换树脂进行吸附，洗脱至无色，得红景天发酵产物提取物；
44.(6)向浓缩液e/f中加入3倍量去离子水，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，用力振摇静止2h后，分离有机层，继续萃取3次，直至无色，合并乙酸乙酯层，置于旋转蒸发仪中减压浓缩，回收乙酸乙酯，温度为室温，分别得雏菊提取物流浸膏和兰撒果叶提取物流浸膏；
45.(7)用3倍量的去离子水分别溶解步骤(6)所得浸膏，加入澄清剂，静置后离心60分钟，用1.0μm微滤膜过滤，加入3倍量麦芽糊精充分溶解。过滤，减压浓缩至原重量的1/3，得雏菊提取物粗提液、兰撒果叶提取物粗提液；
46.(8)将步骤(7)得到的溶液分别用0.05μm超滤膜进行过滤，收集滤液，得到雏菊提取物以及兰撒果叶提取物；
47.(9)将步骤(5)以及步骤(8)得到的提取物按照比例进行组合，得到一系列能够多方式作用的美白组合物。
48.按照下表1比例进行复配，得到组合物1
‑
15，对比例1
‑
3。
49.表1
50.[0051][0052]
注：为保证添加时的浓度相等，此处各组合物制备时的添加总量是相同的。
[0053]
实施例2：小鼠黑色素瘤细胞黑色素生成的抑制试验
[0054]
在本发明上述的组合物及对比例中，提取组合物对黑色素生成的抑制试验测试方法和结果如下：
[0055]
取对数生长期的小鼠黑色素瘤b16细胞，接种于t25细胞培养瓶，培养过夜。分别加入体积分数为1％的受试样品(用去离子水稀释)，以未处理组(不添加任何样品)作为细胞对照组。培养48h后用pbs洗涤1次，加入1ml 1mol/l naoh溶液，刮取收集细胞，放入80℃水浴中30min，取上清液加入96孔板，m3读板仪于475nm处读取吸光度值。对照组的黑色素含量为100％。
[0056]
相对黑色素含量(％)＝(测定孔吸光度值
‑
空白对照组吸光度值)/(细胞对照组吸光度值
‑
空白对照组吸光度值)
×
100％。
[0057]
实验结果：结果如表2，将组合物1
‑
15与对比例1
‑
3比较后，发现：
[0058]
1)3种原料复配组合后对黑色素生成的抑制优于单一组分；
[0059]
2)在3种原料复配组合的不同比例对应的黑色素生成抑制率不同，优选为红景天发酵产物提取物、雏菊提取物、兰撒果叶提取物＝(5
‑
15):(2
‑
5):(0.1
‑
0.5)，更优选为红景天发酵产物提取物：雏菊提取物：兰撒果叶提取物＝10:2:0.5或5：3:0.5或10:2：0.3。
[0060]
表2
[0061][0062][0063]
上述试验结果表明，测试例1
‑
15组合物，都具有减少小鼠黑色素瘤细胞黑色素的效果，但相同条件下组合物比例不同，对黑色素的减少量也会有影响，其中组合物4、8、9的黑色素减少效果相对较好。
[0064]
实施例3：小鼠黑色素瘤细胞酪氨酸酶活性的抑制试验
[0065]
取对数生长期的小鼠黑色素瘤b16细胞，接种于t25细胞培养瓶，培养过夜。分别加入体积分数为1％(去离子水稀释)的受试样品，以未处理组(不添加任何样品)作为细胞对照组。培养48h后用pbs洗涤1次，加入1ml 1mol/l naoh溶液，刮取收集细胞，放入80℃水浴中30min，取上清液加入96孔板，m3读板仪于475nm处读取吸光度值。其中对照组的酪氨酸酶活性为100％。
[0066]
相对酪氨酸酶活性(％)＝(测定孔吸光度值
‑
空白对照组吸光度值)/(细胞对照组吸光度值
‑
空白对照组吸光度值)
×
100％。检测结果如表3：
[0067]
表3
[0068][0069][0070]
上述试验结果表明，测试例1
‑
15组合物，都具有抑制酪氨酸酶活性的效果，但相同条件下组合物比例不同，对酪氨酸酶活性的抑制能力也会有影响，其中组合物4、8、9的抑制
相对较好。因此可以判断红景天发酵产物提取物：雏菊提取物：兰撒果叶提取物三者组合能够有效抑制酪氨酸酶活性，达到美白的效果。
[0071]
实施例4：角质细胞黑色素转移测试
[0072]
将表皮角质形成细胞接种于含dk－sfm培养液的培养瓶中，置于37℃的co2(co2体积分数为5％)恒温培养箱中培养6d。将细胞培养瓶取出，在其中加入胰蛋白酶消化4min，然后将细胞接种于96孔板，孵育24h，对照组每孔加200μl细胞培养液，加药组每孔加200μl质量浓度1％(去离子水稀释)的不同植物组合物提取液，培养箱中培养48～72h。采用了(molecular probes)微珠模型。用紫外线刺激角质形成细胞，来模拟胞吞对黑素体的吸收。以100％吸收的培养体作为对照组。
[0073]
图1所示结果表明，与作为对照物(不添加任何样品)的培养体(100％吸收)相比，各组合物能够有效减少的吸收，减少黑素体的转移。
[0074]
实施例5：人体功效测试
[0075]
在具体实施方式中，本发明提供了一种含有多方式作用的美白提取物组合物的面膜肌底液的配方工艺，具体配方如表4：
[0076]
表4
[0077][0078][0079]
添加权利要求所述提取物，将组合物4、8、9加入下表面膜肌底液配方中，添加量为1％，制得面膜肌底液样品1
‑
3。
[0080]
组合物4组合物8组合物9样品1样品2样品3
[0081]
实施例6
[0082]
1、mtt细胞毒性测试
[0083]
在96well multi plate(corning)中按照1x104cells/well的密度接种含有10％牛血清的dmem培养基和角质形成细胞(hacat)各100μl，培养24小时后换成无血清培养基。在无血清培养基中分别加入上述实施例中组合物4、8、9(用去离子水稀释)进行处理后培养24小时。之后去除培养基，用20μl的mtt溶液进行处理，在37℃下使其反应2小时。在去除mtt溶液的细胞中加入200μl异丙醇，轻轻地震荡30min，完全溶解结晶甲臜，在570nm处测定吸光度，根据如下公式计算细胞存活率。
[0084][0085]
对照组不加入组合物进行试验。细胞毒性相关结果见下表5：
[0086]
表5
[0087][0088][0089]
2、安全性测试(人体皮肤斑贴试验)
[0090]
选取15名年龄为20
‑
50岁之间的无皮肤病过敏史的健康受试者，斑贴方法：选用合格的斑试器，以封闭式斑贴试验方式，取约15μl样品1
‑
3的样品滴于斑试器内，外用专用胶带贴覆于受试者背部，每个受试者贴20个斑试器，分别贴试样品1
‑
3的肌底液样品，24小时后除去受试物，去除后分别于0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，按照《护肤品卫生规范》中皮肤反应等级标准记录其结果。
[0091]
试验结果：人体皮肤斑贴试验结果显示所有受试者通过斑贴试验，在0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，其中0例出现皮肤红斑、丘疹、水疱等不良反应，说明本发明的产品安全，无刺激。
[0092]
3、色斑淡化测试
[0093]
测试样品：样品1/2/3
[0094]
测试仪器：mexameter mx18皮肤色素仪
[0095]
测定环境：测试环境温度(21
±
1℃,湿度(50
±
5)％
[0096]
测试方法：选取45名18
‑
60周岁女性志愿者，分为三组，在使用测试样品前和连续使用化妆品28天后测定其面部皮肤色斑的黑色素含量。受试对象在选定部位每天使用2次精华液，清洁面部皮肤后，擦干，用手将精华液涂抹在面部皮肤上，连续使用四周。
[0097]
受试对象在测试期间不使用其他美白产品。测量数值越高，说明皮肤中黑色素含量越高。黑色素降低率＝(使用精华液前的黑色素含量
‑
连续使用精华液28天后黑色素含量)/使用精华液前的黑色素含量
×
100％。黑色素降低率越高，说明色斑淡化效果越明显。数据取平均值，并如图2所示。
[0098]
由图2可知，红景天发酵产物提取物/雏菊提取物/兰撒果叶提取物三者组合可以淡化色斑黑色素，发挥更好的均匀肤色美白作用。
[0099]
4、肤色提亮测试
[0100]
测试仪器：皮肤光泽度测试仪skinglossmeter
[0101]
测试方法：测试环境温度：21
±
1℃，相对湿度：50
±
5％
[0102]
选取45名18
‑
60周岁女性志愿者，分为三组，采用皮肤光泽度测试仪skinglossmeter测试受试者在面部肌肤使用本发明制备的精华液前、后肌肤光泽度变化。肌肤表面光泽度是由照射到肌肤表面的光的直接反射和散反射来反映的，此值越高表征肌肤越具有光泽。数据取平均值。该实验结果记载于图3中。
[0103]
从图3可以看出，受试者使用样品1/2/3后，肌肤光泽度相比使用前呈升高趋势，因此可判断三者组合具有改善皮肤光泽度的功效。
[0104]
本技术说明书中未作详细描述的内容属于本领域技术人员的公知常识。
[0105]
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。
[0106]
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
[0107]
上述说明示出并描述了本技术的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本技术并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本技术的精神和范围，则都应在本技术所附权利要求的保护范围内。