一种犬胱抑素C荧光定量检测试剂及其检测方法与流程

一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂及其检测方法
技术领域
1.本发明涉及定量检测技术领域，尤其涉及一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂及其检测方法。


背景技术：

2.胱抑素c是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其产生速率稳定，且只通过肾脏代谢，是一种敏感性好、特异性高的肾小球滤过率内源性标志物；报道称，至少1/10的犬类会得肾脏疾病。传统指标肌酐因肌肉量减少会降低；在肌酐升高以前，已有75％的肾组织功能丧失，为时已晚；胱抑素c浓度主要由gfr(肾小球滤过率)决定，是反映肾小球滤过率变化的理想内源性标志物；不受性别、炎症状态、肿瘤等影响。25％以上肾衰就升高，敏感性强于肌酐，是肾功能评价最敏感的标志物；胱抑素c可由肾小球自由滤过，在肾脏被小管上皮细胞重新吸收，并在细胞内分解代谢，不返回血液循环当中，代谢速率稳定；胱抑素c在肾损伤早期可快速升高；当肾脏功能恢复后，胱抑素c水平会降低或恢复正常；对胱抑素c进行连续检测，可以监测疾病的发展；
3.但现有的犬类肾脏病检测方法检测过程复杂、检测结果的判定界限较为模糊，且现有检测方法大多是采用专用ect以及肾脏活检，对犬类身体会产生创伤。
4.因此，我们提出了一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂及其检测方法用于解决上述问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决目前现有的肾脏病检测方法检测过程复杂、检测结果的判定界限较为模糊，且现有检测方法大多是采用专用ect以及肾脏活检，对犬类身体会产生创伤等问题，而提出的一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂及其检测方法。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂，包括以下原料：用8
‑
12mm pbs(磷酸盐缓冲液)配以含1
‑
3％bsa(牛血清白蛋白)、2
‑
3％蔗糖、0
‑
1％pvp
‑
k30、0
‑
2％酪蛋白、0
‑
2％peg 20000、0
‑
1％triton x
‑
100和0
‑
0.1％nan3的溶液，并在室温下，浸泡玻纤10
‑
12h，在40
‑
50℃鼓风干燥机中干燥15
‑
18h；
8.优选的，包括以下原料：用10mm pbs(磷酸盐缓冲液)配以含3％bsa(牛血清白蛋白)、3％蔗糖、1％pvp
‑
k30、1％酪蛋白、1％peg 20000、0.1％triton x
‑
100和0.02％nan3的溶液，并在室温下，浸泡玻纤12h，在42℃鼓风干燥机中干燥16h；
9.一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂的检测方法，包括以下步骤：
10.s1：检测准备：做好检测前的准备工作，对所需结合垫进行预处理，并制备好所需的edta抗凝血；
11.s2：进行检测：将制备好的edta抗凝血进行离心，并使用试剂卡对上清液进行检测；
12.s3：检测完成：检测完成后对检测结果以及检测仪器进行处理；
13.优选的，所述s1中，先打开仪器开关，登录测试系统，再从试剂盒中取出1个试剂卡、1个管稀释液和1个edta抗凝管，并将取出的edta抗凝管进行洗涤、干燥和消毒，其中划膜条件中划线抗体(t线)为0.5mg/ml,3ul/cm,并在37℃下干燥16h，检测前需对结合垫进行预处理，采用划线羧基量子点荧光微球偶联方法，以0.1mg抗体标记量进行计算，其中采用微球缓冲体系调整，所述微球缓冲体系调整为0.25ml 20mmol/l ph6.0的mes缓冲液稀释和0.25ml 1μmol/l微球浓度至0.5ml 0.5μmol/l，最终形成缓冲体系为10mmol/l ph6.0mes，其中微球活化时加入5ul 20mg/ml edc
‑
hcl和5ul 20mg/ml nhs，并快速混匀，在37℃反应15min，离心标准为每10000g离心20min，舍弃上清液，用10mmol/l ph6.0 mes缓冲液重悬至0.25ml使微球浓度恢复为1μmol/l并混匀，有聚沉现象采用超声辅助混匀，微球活化后立即加入0.1mg待标记抗体，迅速混匀，在37℃时反应1h，有聚沉现象采用超声辅助混匀，并在室温下取所需检测的静脉血加入edta抗凝管中，并将edta抗凝管反复颠倒6
‑
8次进行样本稀释形成edta抗凝血；
14.优选的，所述s2中，将室温采集的edta抗凝血3000rpm离心5min，用移液器取50μl上层血浆加入到样本稀释液中，反复颠倒8
‑
12次进行混匀，将铝箔袋撕开取出试剂卡，用移液器取80μl所述稀释样本的上清液逐滴加入于试剂卡的加样孔中，加样完成后将试剂卡插入到仪器卡槽内，仪器孵化10分钟后进行自动检测，检测时采用双抗体夹心法检测犬类血浆中的ccyc(抗原)浓度，并将待测试样本加入到稀释液中混匀滴加到加样孔内，抗原会随着样本稀释液扩散到结合垫上，与荧光标记的抗体相结合形成复合物，该复合物会继续随着溶液扩散到nc膜的t线上，被固定在t线上的包被抗体所捕获，结合形成双抗体
‑
抗原复合物，t线上捕获的抗原越多，t线的荧光信号就越强，没有被捕获的荧光微球复合物将继续沿着nc膜扩散到c线，包被在c线上的抗体所捕获形成c线，最后利用xq
‑
1000荧光检测仪检测层析完成后的试剂条，根据荧光的强度可得出样本溶液中抗原的浓度；
15.优选的，所述s3中，测量完成后仪器会自动显示测量浓度值和打印检测结果，本产品完成一次检测后不可重复使用，且不可使用非本品随附的稀释液，同时需对结合垫进行洗涤和封闭，其中对结合垫进行洗涤和封闭时需加入25μl封闭剂混匀，并在37℃反应0.5h，且离心标准为每10000g离心15min，舍弃上清液，用2ml标记稀释液，重悬、分散，必要时超声分散，并用所述稀释标记物3ul/cm，在37℃鼓风干燥机中干燥4h，其中封闭剂为含1％bsa(牛血清白蛋白)，100mm甘氨酸和1％酪蛋白的10mm pbs(磷酸盐缓冲液)溶液，标记稀释液为含1％bsa(牛血清白蛋白)，100mm甘氨酸，1％酪蛋白和0.02％nan3的10mm pbs(磷酸盐缓冲液)溶液。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
17.1、采用试剂卡通过静脉血进行检测，降低了对犬类身体的创伤。
18.2、通过仪器进行检测节省了人力，使检测变得更为简便。
19.3、通过根据荧光的强度可得出样本溶液中抗原的浓度，可对肾脏病的严重程度进行判断。
20.本发明的目的是通过采用试剂卡通过静脉血进行检测，降低了对犬类身体的创伤，并通过仪器进行检测节省了人力，使检测变得更为简便，同时通过根据荧光的强度可得出样本溶液中抗原的浓度，可对肾脏病的严重程度进行判断。
附图说明
21.图1为本发明提出的一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂及其检测方法的流程图。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
23.实施例一
24.参照图1，一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂，包括以下原料：用10mm pbs(磷酸盐缓冲液)配以含3％bsa(牛血清白蛋白)、3％蔗糖、1％pvp
‑
k30、1％酪蛋白、1％peg 20000、0.1％triton x
‑
100和0.02％nan3的溶液，并在室温下，浸泡玻纤12h，在42℃鼓风干燥机中干燥16h；
25.一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂的检测方法，包括以下步骤：
26.s1：检测准备：先打开仪器开关，登录测试系统，再从试剂盒中取出1个试剂卡、1个管稀释液和1个edta抗凝管，并将取出的edta抗凝管进行洗涤、干燥和消毒，其中划膜条件中划线抗体(t线)为0.5mg/ml,3ul/cm,并在37℃下干燥16h，并在室温下取所需检测的静脉血加入edta抗凝管中，并将edta抗凝管反复颠倒6次进行样本稀释形成edta抗凝血；
27.s2：进行检测：将室温采集的edta抗凝血3000rpm离心5min，用移液器取50μl上层血浆加入到样本稀释液中，反复颠倒8次进行混匀，将铝箔袋撕开取出试剂卡，用移液器取80μl所述稀释样本的上清液逐滴加入于试剂卡的加样孔中，加样完成后将试剂卡插入到仪器卡槽内，仪器孵化10分钟后进行自动检测，检测时采用双抗体夹心法检测犬类血浆中的ccyc(抗原)浓度，并将待测试样本加入到稀释液中混匀滴加到加样孔内，抗原会随着样本稀释液扩散到结合垫上，与荧光标记的抗体相结合形成复合物，该复合物会继续随着溶液扩散到nc膜的t线上，被固定在t线上的包被抗体所捕获，结合形成双抗体
‑
抗原复合物，t线上捕获的抗原越多，t线的荧光信号就越强，没有被捕获的荧光微球复合物将继续沿着nc膜扩散到c线，包被在c线上的抗体所捕获形成c线，最后利用xq
‑
1000荧光检测仪检测层析完成后的试剂条，根据荧光的强度可得出样本溶液中抗原的浓度；
28.s3：检测完成：测量完成后仪器会自动显示测量浓度值和打印检测结果，本产品完成一次检测后不可重复使用，且不可使用非本品随附的稀释液，同时需对结合垫进行洗涤和封闭，其中对结合垫进行洗涤和封闭时需加入25μl封闭剂混匀，并在37℃反应0.5h，且离心标准为每10000g离心15min，舍弃上清液，用2ml标记稀释液，重悬、分散，必要时超声分散，并用所述稀释标记物3ul/cm，在37℃鼓风干燥机中干燥4h，其中封闭剂为含1％bsa(牛血清白蛋白)，100mm甘氨酸和1％酪蛋白的10mm pbs(磷酸盐缓冲液)溶液，标记稀释液为含1％bsa(牛血清白蛋白)，100mm甘氨酸，1％酪蛋白和0.02％nan3的10mm pbs(磷酸盐缓冲液)溶液。
29.实施例二
30.参照图1，一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂，包括以下原料：用10mm pbs(磷酸盐缓冲液)配以含3％bsa(牛血清白蛋白)、3％蔗糖、1％pvp
‑
k30、1％酪蛋白、1％peg 20000、0.1％triton x
‑
100和0.02％nan3的溶液，并在室温下，浸泡玻纤12h，在42℃鼓风干燥机中干燥16h；
31.一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂的检测方法，包括以下步骤：
32.s1：检测准备：先打开仪器开关，登录测试系统，再从试剂盒中取出1个试剂卡、1个管稀释液和1个edta抗凝管，并将取出的edta抗凝管进行洗涤、干燥和消毒，其中划膜条件中划线抗体(t线)为0.5mg/ml,3ul/cm,并在37℃下干燥16h，检测前需对结合垫进行预处理，采用划线羧基量子点荧光微球偶联方法，以0.1mg抗体标记量进行计算，其中采用微球缓冲体系调整，所述微球缓冲体系调整为0.25ml 20mmol/l ph6.0的mes缓冲液稀释和0.25ml 1μmol/l微球浓度至0.5ml 0.5μmol/l，最终形成缓冲体系为10mmol/l ph6.0 mes，其中微球活化时加入5ul 20mg/ml edc
‑
hcl和5ul 20mg/ml nhs，并快速混匀，在37℃反应15min，离心标准为每10000g离心20min，舍弃上清液，用10mmol/l ph6.0 mes缓冲液重悬至0.25ml使微球浓度恢复为1μmol/l并混匀，有聚沉现象采用超声辅助混匀，微球活化后立即加入0.1mg待标记抗体，迅速混匀，在37℃时反应1h，有聚沉现象采用超声辅助混匀，并在室温下取所需检测的静脉血加入edta抗凝管中，并将edta抗凝管反复颠倒7次进行样本稀释形成edta抗凝血；
33.s2：进行检测：将室温采集的edta抗凝血3000rpm离心5min，用移液器取50μl上层血浆加入到样本稀释液中，反复颠倒12次进行混匀，将铝箔袋撕开取出试剂卡，用移液器取80μl所述稀释样本的上清液逐滴加入于试剂卡的加样孔中，加样完成后将试剂卡插入到仪器卡槽内，仪器孵化10分钟后进行自动检测，根据荧光的强度可得出样本溶液中抗原的浓度；
34.s3：检测完成：测量完成后仪器会自动显示测量浓度值和打印检测结果，本产品完成一次检测后不可重复使用，且不可使用非本品随附的稀释液。
35.实施例三
36.参照图1，一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂，包括以下原料：用10mm pbs(磷酸盐缓冲液)配以含3％bsa(牛血清白蛋白)、3％蔗糖、1％pvp
‑
k30、1％酪蛋白、1％peg 20000、0.1％triton x
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100和0.02％nan3的溶液，并在室温下，浸泡玻纤12h，在42℃鼓风干燥机中干燥16h；
37.一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂的检测方法，包括以下步骤：
38.s1：检测准备：先打开仪器开关，登录测试系统，再从试剂盒中取出1个试剂卡、1个管稀释液和1个edta抗凝管，并将取出的edta抗凝管进行洗涤、干燥和消毒，其中划膜条件中划线抗体(t线)为0.5mg/ml,3ul/cm,并在37℃下干燥16h，检测前需对结合垫进行预处理，采用划线羧基量子点荧光微球偶联方法，以0.1mg抗体标记量进行计算，其中采用微球缓冲体系调整，所述微球缓冲体系调整为0.25ml 20mmol/l ph6.0的mes缓冲液稀释和0.25ml 1μmol/l微球浓度至0.5ml 0.5μmol/l，最终形成缓冲体系为10mmol/l ph6.0 mes，其中微球活化时加入5ul 20mg/ml edc
‑
hcl和5ul 20mg/ml nhs，并快速混匀，在37℃反应15min，离心标准为每10000g离心20min，舍弃上清液，用10mmol/l ph6.0 mes缓冲液重悬至0.25ml使微球浓度恢复为1μmol/l并混匀，有聚沉现象采用超声辅助混匀，微球活化后立即加入0.1mg待标记抗体，迅速混匀，在37℃时反应1h，有聚沉现象采用超声辅助混匀，并在室温下取所需检测的静脉血加入edta抗凝管中，并将edta抗凝管反复颠倒8次进行样本稀释形成edta抗凝血；
39.s2：进行检测：将室温采集的edta抗凝血3000rpm离心5min，用移液器取50μl上层
血浆加入到样本稀释液中，反复颠倒12次进行混匀，将铝箔袋撕开取出试剂卡，用移液器取80μl所述稀释样本的上清液逐滴加入于试剂卡的加样孔中，加样完成后将试剂卡插入到仪器卡槽内，仪器孵化10分钟后进行自动检测，检测时采用双抗体夹心法检测犬类血浆中的ccyc(抗原)浓度，并将待测试样本加入到稀释液中混匀滴加到加样孔内，抗原会随着样本稀释液扩散到结合垫上，与荧光标记的抗体相结合形成复合物，该复合物会继续随着溶液扩散到nc膜的t线上，被固定在t线上的包被抗体所捕获，结合形成双抗体
‑
抗原复合物，t线上捕获的抗原越多，t线的荧光信号就越强，没有被捕获的荧光微球复合物将继续沿着nc膜扩散到c线，包被在c线上的抗体所捕获形成c线，最后利用xq
‑
1000荧光检测仪检测层析完成后的试剂条，根据荧光的强度可得出样本溶液中抗原的浓度；
40.s3：检测完成：测量完成后仪器会自动显示测量浓度值和打印检测结果，本产品完成一次检测后不可重复使用，且不可使用非本品随附的稀释液，同时需对结合垫进行洗涤和封闭，其中对结合垫进行洗涤和封闭时需加入25μl封闭剂混匀，并在37℃反应0.5h，且离心标准为每10000g离心15min，舍弃上清液，用2ml标记稀释液，重悬、分散，必要时超声分散，并用所述稀释标记物3ul/cm，在37℃鼓风干燥机中干燥4h，其中封闭剂为含1％bsa(牛血清白蛋白)，100mm甘氨酸和1％酪蛋白的10mm pbs(磷酸盐缓冲液)溶液，标记稀释液为含1％bsa(牛血清白蛋白)，100mm甘氨酸，1％酪蛋白和0.02％nan3的10mm pbs(磷酸盐缓冲液)溶液。
41.实施例四
42.参照图1，一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂，包括以下原料：用10mm pbs(磷酸盐缓冲液)配以含3％bsa(牛血清白蛋白)、3％蔗糖、1％pvp
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k30、1％酪蛋白、1％peg 20000、0.1％triton x
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100和0.02％nan3的溶液，并在室温下，浸泡玻纤12h，在42℃鼓风干燥机中干燥16h；
43.一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂的检测方法，包括以下步骤：
44.s1：检测准备：先打开仪器开关，登录测试系统，再从试剂盒中取出1个试剂卡、1个管稀释液和1个edta抗凝管，其中划膜条件中划线抗体(t线)为0.5mg/ml,3ul/cm,并在37℃下干燥16h，检测前需对结合垫进行预处理，采用划线羧基量子点荧光微球偶联方法，以0.1mg抗体标记量进行计算，其中采用微球缓冲体系调整，所述微球缓冲体系调整为0.25ml 20mmol/l ph6.0的mes缓冲液稀释和0.25ml 1μmol/l微球浓度至0.5ml 0.5μmol/l，最终形成缓冲体系为10mmol/l ph6.0 mes，其中微球活化时加入5ul 20mg/ml edc
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hcl和5ul 20mg/ml nhs，并快速混匀，在37℃反应15min，离心标准为每10000g离心20min，舍弃上清液，用10mmol/l ph6.0 mes缓冲液重悬至0.25ml使微球浓度恢复为1μmol/l并混匀，有聚沉现象采用超声辅助混匀，微球活化后立即加入0.1mg待标记抗体，迅速混匀，在37℃时反应1h，有聚沉现象采用超声辅助混匀，并在室温下取所需检测的静脉血加入edta抗凝管中，并将edta抗凝管反复颠倒6次进行样本稀释形成edta抗凝血；
45.s2：进行检测：将室温采集的edta抗凝血3000rpm离心5min，用移液器取50μl上层血浆加入到样本稀释液中，反复颠倒10次进行混匀，将铝箔袋撕开取出试剂卡，用移液器取80μl所述稀释样本的上清液逐滴加入于试剂卡的加样孔中，加样完成后将试剂卡插入到仪器卡槽内，仪器孵化10分钟后进行自动检测，检测时采用双抗体夹心法检测犬类血浆中的ccyc(抗原)浓度，并将待测试样本加入到稀释液中混匀滴加到加样孔内，抗原会随着样本
稀释液扩散到结合垫上，与荧光标记的抗体相结合形成复合物，该复合物会继续随着溶液扩散到nc膜的t线上，被固定在t线上的包被抗体所捕获，结合形成双抗体
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抗原复合物，t线上捕获的抗原越多，t线的荧光信号就越强，没有被捕获的荧光微球复合物将继续沿着nc膜扩散到c线，包被在c线上的抗体所捕获形成c线，最后利用xq
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1000荧光检测仪检测层析完成后的试剂条，根据荧光的强度可得出样本溶液中抗原的浓度；
46.s3：检测完成：测量完成后仪器会自动显示测量浓度值和打印检测结果，本产品完成一次检测后不可重复使用，且不可使用非本品随附的稀释液。
47.实施例五
48.参照图1，一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂，包括以下原料：用10mm pbs(磷酸盐缓冲液)配以含3％bsa(牛血清白蛋白)、3％蔗糖、1％pvp
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k30、1％酪蛋白、1％peg 20000、0.1％triton x
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100和0.02％nan3的溶液，并在室温下，浸泡玻纤12h，在42℃鼓风干燥机中干燥16h；
49.一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂的检测方法，包括以下步骤：
50.s1：检测准备：先打开仪器开关，登录测试系统，再从试剂盒中取出1个试剂卡、1个管稀释液和1个edta抗凝管，并将取出的edta抗凝管进行洗涤、干燥和消毒，其中划膜条件中划线抗体(t线)为0.5mg/ml,3ul/cm,并在37℃下干燥16h，并在室温下取所需检测的静脉血加入edta抗凝管中，并将edta抗凝管反复颠倒7次进行样本稀释形成edta抗凝血；
51.s2：进行检测：将室温采集的edta抗凝血3000rpm离心5min，用移液器取50μl上层血浆加入到样本稀释液中，反复颠倒9次进行混匀，将铝箔袋撕开取出试剂卡，用移液器取80μl所述稀释样本的上清液逐滴加入于试剂卡的加样孔中，加样完成后将试剂卡插入到仪器卡槽内，仪器孵化10分钟后进行自动检测，检测时采用双抗体夹心法检测犬类血浆中的ccyc(抗原)浓度，最后利用xq
‑
1000荧光检测仪检测层析完成后的试剂条，根据荧光的强度可得出样本溶液中抗原的浓度；
52.s3：检测完成：测量完成后仪器会自动显示测量浓度值和打印检测结果，本产品完成一次检测后不可重复使用，且不可使用非本品随附的稀释液，同时需对结合垫进行洗涤和封闭，其中对结合垫进行洗涤和封闭时需加入25μl封闭剂混匀，并在37℃反应0.5h，且离心标准为每10000g离心15min，舍弃上清液，用2ml标记稀释液，重悬、分散，必要时超声分散，并用所述稀释标记物3ul/cm，在37℃鼓风干燥机中干燥4h，其中封闭剂为含1％bsa(牛血清白蛋白)，100mm甘氨酸和1％酪蛋白的10mm pbs(磷酸盐缓冲液)溶液，标记稀释液为含1％bsa(牛血清白蛋白)，100mm甘氨酸，1％酪蛋白和0.02％nan3的10mm pbs(磷酸盐缓冲液)溶液。
53.对实施例一、实施例二、实施例三、实施例四和实施例五中一种犬胱抑素c荧光定量检测试剂的检测方法进行测试，得出结果如下：
54.[0055][0056]
实施例一、实施例二、实施例三、实施例四和实施例五制得的犬胱抑素c荧光定量检测试剂的检测方法对比现有检测方法检测时间有了显著缩短、检测的判断边界线明显，且实施例三为最佳实施例。
[0057]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。