一种复方阿胶浆中植物来源中药质量标准的检测方法与流程

1.本发明涉及中医药技术领域，具体是一种复方阿胶浆中植物来源中药质量标准的检测方法。


背景技术：

2.随着中医药学的飞速发展，中成药的普及性和应用性越来越广，其安全有效、质量可控是基本要求，质量标准的科学与完善是其发展的关键因素。当前，中药复方质量控制模式多局限为：对复方中部分药味鉴别、剂型检查和少数成分含量测定。中药复方制剂的传统鉴别研究中，不同药味需对应不同的供试品处理方法和薄层色谱条件。同时，为排除样品中杂质干扰，纯化样品，供试品的前处理往往使用多种分离、纯化手段，复杂且繁琐。此外，在多成分含量测定时，对照品的需求较高，分别检测成本高、操作繁琐，质量标准研究工作量大且困难重重。复方阿胶浆，原方出自明代《景岳全书》中“两仪膏”，按照“气血互生，气升血长”的中医理论加味而成，由阿胶、红参、熟地黄、党参、山楂组成。方中阿胶补血止血，滋阴润燥，重用为君药；人参大补元气，补脾益肺，熟地黄补血养阴，益精填髓，一补阳气，二滋阴血，两者共为臣药；党参补中益气，健脾益肺，助君药之疗效；山楂消食健胃，活血行气，协助各药消化吸收运转，与党参共为佐使药。诸药合用，具有补气养血、补肾健脾之功效，可“补气之中寓于消导，补血之中寓于活血，滋补而不滋腻，共奏健脾补肾，补气养血之效”。现代药理研究表明，复方阿胶浆通过补血造血、调节免疫功能、调节激素水平等作用对多种原因引起的贫血、癌症及不孕症等起到治疗作用。临床常用于气血两虚，头晕目眩，心悸失眠，食欲不振及白细胞减少症和贫血症等。复方阿胶浆为东阿阿胶股份有限公司的独家品种，属于国家保护品种，也属于非处方药，临床应用广泛且安全性好，因此，对其产品质量的有效控制和评价是非常必要的。2020版《中华人民共和国药典》简称《中国药典》)中对复方阿胶浆中阿胶的真伪开展了系列研究，包括阿胶中甘氨酸、l
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羟脯氨酸为对照品的薄层鉴别、阿胶对照药材为对照的特征肽段鉴别，并且采用总氮量控制复方阿胶浆中阿胶的含量。原标准重点关注复方阿胶浆中君药阿胶的研究，可见阿胶在组方中的重要地位。然而，复方阿胶浆并非阿胶一味中药，其补气养血也非一药之功，仅对阿胶进行研究和控制是远远不够的。对于植物来源的中药，复方阿胶浆质量标准中已有分别鉴别阿胶、红参、党参、山楂的方法，但无熟地黄的鉴别。标准中规定了红参仅用人参三醇对照品、无对照药材的鉴别方法和党参、山楂仅用对照药材、无对照品的鉴别方法。红参为人参的炮制品，其饮片也是按照人参药材的鉴别方法进行鉴别，使用人参对照药材和人参皂苷rb1、人参皂苷re、人参皂苷rf及人参皂苷rg1作为对照，专属性好，而复方阿胶浆中红参仅以人参三醇对照品作为对照，以环己烷
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丙酮(2：1)为展开剂进行鉴别，展开系统极性小。党参仅以党参对照药材为对照，以石油醚(30～60℃)
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甲酸乙酯
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甲酸(15：5：1)为展开剂进行鉴别，展开系统极性小且无对照品。山楂以山楂对照药材为对照，使
用聚酰胺富集黄酮类成分，在聚酰胺薄膜上，以丁酮
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乙酸乙酯
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甲酸
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水(4：4：2：1)为展开剂进行鉴别，展开系统极性大。以上药味采用不同方法制备供试品，展开系统极性差异大且使用的薄层板也不相同，因此难以在同一展开条件同时鉴别。目前，复方阿胶浆现行标准的含量测定项中并无植物来源中药的控制，无法全面反映和控制复方阿胶浆的整体情况，难以对复方阿胶浆整体进行质量控制。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明公开一种复方阿胶浆中植物来源中药质量标准的检测方法，该方法包括：(1)复方阿胶浆中红参、党参“一板多鉴”法薄层色谱鉴别。(2)复方阿胶浆中熟地黄、山楂“一板多鉴”法薄层色谱鉴别。(3)复方阿胶浆hplc
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dad指纹图谱。(4)复方阿胶浆多成分含量测定方法。本发明所述一种复方阿胶浆中植物来源中药质量标准的检测方法，包括以下内容：1.红参、党参“一板多鉴”法薄层色谱鉴别步骤如下：取本品20ml，用水饱和正丁醇振摇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇液。用氨试液30ml洗涤，弃去水液。再用正丁醇饱和水30ml洗涤，弃去水液。正丁醇液回收至干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取红参对照药材1g、党参对照药材1g，分别加水50ml，超声处理45分钟，滤过，水液浓缩至20ml，自“用水饱和正丁醇振摇萃取3次”，同法制成对照药材溶液；再取人参皂苷rg1、党参炔苷适量，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液各2μl、红参对照药材溶液1μl、党参对照药材溶液6μl、对照品溶液各1μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷
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乙酸乙酯
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甲醇
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水(15：40：22：10)的下层溶液为展开剂，连续展开3次，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。2.熟地黄、山楂“一板多鉴”法薄层色谱鉴别步骤如下：(1)取本品20ml，加甲醇50ml，离心，上清液蒸干，残渣加水20ml溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，回收至干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取熟地黄对照药材1g，加水50ml，超声处理45分钟，滤过，滤液浓缩至20ml，自“加甲醇50ml”，同法制成对照药材溶液；再取毛蕊花糖苷适量，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作对照品溶液。(2)取本品50ml，加聚酰胺(30～60目)6g，混匀，静置30分钟，用脱脂棉滤过，聚酰胺用水洗脱至近无色，加乙醇50ml，超声处理10分钟，滤过，回收至干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取山楂对照药材1g，加水50ml，超声处理45分钟，滤过，自“加聚酰胺(30～60目)6g”，同法制成对照药材溶液；再取牡荆素鼠李糖苷适量，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取(1)项下供试品溶液2μl、熟地黄对照药材溶液3μl、毛蕊花糖苷对照品1μl溶液，(2)项下供试品溶液8μl、山楂对照药材溶液8μl、牡荆素
鼠李糖苷对照品1μl溶液，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷
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甲醇
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甲酸(8：2：0.2)为展开剂，连续展开3次，取出，晾干，置紫外灯光(365nm)下检视。供试品色谱中，在与熟地黄对照药材和毛蕊花糖苷对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。再喷以三氯化铝试液，置紫外灯光(365nm)下检视，供试品色谱中，在与山楂对照药材和牡荆素鼠李糖苷对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。3.复方阿胶浆hplc
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dad指纹图谱内容如下：(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸乙腈为流动相a，以0.1％甲酸水为流动相b，梯度洗脱程序：0～20min 2％～5％a，20～35min 5％～12％a，35～45min 12％～14％a，45～55min 14％～20％a，55～65min 20％～23％a，65～80min 23％～35％a；检测波长为330nm；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml。理论板数按焦地黄苯乙醇苷a1峰计算应不低于10000。(2)测定步骤如下：1)对照品溶液的制备：取咖啡酸、绿原酸、洋地黄叶苷c、阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷a1、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷b1、异毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含咖啡酸20μg、绿原酸20μg、洋地黄叶苷c 50μg、阿魏酸20μg、焦地黄苯乙醇苷a
1 50μg、毛蕊花糖苷20μg、焦地黄苯乙醇苷b
1 50μg、异毛蕊花糖苷50μg的混合溶液，即得；2)供试品溶液的制备：精密量取本品2ml，加入乙腈6ml，涡旋至充分混匀，离心，取上清液，残渣加入乙腈6ml，涡旋至充分混匀，离心，合并上清液，蒸干，残渣加30％甲醇溶解，并转移至1ml量瓶中，加30％甲醇至刻度，摇匀，即得；3)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；4)通过对复方阿胶浆样品的分析方法进行考察，包括色谱条件、供试品制备方法、参照物制备方法等方面，建立复方阿胶浆指纹图谱。根据20批复方阿胶浆指纹图谱结果，选取与共有模式具有最高相似度的指纹图谱作为对照指纹图谱；5)方法学考察：进行精密度、重复性、稳定性、耐用性试验；6)采用相似度评价软件，对20批复方阿胶浆进行测定，并与复方阿胶浆对照指纹图谱进行相似度评价；7)选择适当的分析方法或联用技术对指纹图谱中主要色谱峰进行推测，或结合对照品对主要色谱峰进行确认。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，复方阿胶浆供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.9。4.复方阿胶浆多成分含量测定内容如下：(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸乙腈为流动相a，以0.1％甲酸水为流动相b，梯度洗脱程序：0～10min 2％～10％a，10～20min 10％～20％a，20～30min 20％～22％a，30～35min 22％～25％a；检测波长为270nm、330nm；柱温为30℃。理论板数按焦地黄苯乙醇苷a1峰计算应不低于10000。(2)测定步骤如下：
1)对照品溶液的制备：取焦地黄苯乙醇苷a1对照品、异毛蕊花糖苷对照品和党参炔苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含焦地黄苯乙醇苷a
1 25μg、异毛蕊花糖苷25μg、党参炔苷50μg的混合溶液，即得；2)供试品溶液的制备：精密量取本品2ml，加入乙腈6ml，涡旋至充分混匀，离心，取上清液，残渣加入乙腈6ml，涡旋至充分混匀，离心，合并上清液，蒸干，残渣加30％甲醇溶解，并转移至1ml量瓶中，加30％甲醇至刻度，摇匀，即得；3)阴性对照溶液的制备：取熟地黄阴性样品和党参阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成熟地黄阴性对照、党参阴性对照；4)测定法：分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；5)方法学考察：进行专属性试验、线性范围试验、准确度试验、精密度试验、重复性试验。6)样品含量测定：取15个批次的复方阿胶浆样品，每个批次平行制备3份供试品溶液，依次进样测定。复方阿胶浆样品每1ml含熟地黄以焦地黄苯乙醇苷a1(c
36
h
48
o
20
)计，不得少于6.60μg；以异毛蕊花糖苷(c
29
h
36
o
15
)计，不得少于7.96μg。含党参以党参炔苷(c
20
h
28
o8)计，不得少于18.3μg。与现有技术相比，本发明的有益效果是：
4.(1)本发明是针对复方阿胶浆中植物来源中药质量标准的检测方法。复方阿胶浆中植物来源的中药红参、熟地黄、党参、山楂各单味药不仅可对贫血症发挥一定作用，还可共同对君药阿胶起到增效作用。全面地对复方阿胶浆中植物来源的中药开展研究和质量控制，可以科学、合理、有效地控制复方阿胶浆产品质量。(2)一板多鉴法(identification of multi
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herbal medicines by a single
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thin layer chromatography,imms)是复方制剂中不同药味使用不同或相同的供试品溶液，在相同薄层色谱条件(吸附剂、展开剂)、使用相同/不同显色方法进行鉴别。该方法可实现在一块薄层板上同时鉴别多个药味，即称为“一板多鉴”法。选取极性近似的有效成分，在不同的检视条件下，呈现各自不同的颜色斑点，虽相互重叠，但又互不干扰，在同一块薄层板上同时检测数种药材，供多项鉴别应用，降低检测成本，提高检测效率。本发明突破了传统水提制剂的单一鉴别模式，采用一板多鉴的方法，建立了复方阿胶浆中植物来源中药鉴别的“4
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2”模式，即4味中药，使用3种供试品溶液、2种展开剂进行鉴别，且各药味均采用2种参照物(对照品和对照药材)进行对照，不仅大大提高鉴别效率，在鉴别的基础上增强其专属性，使结果更加准确、可靠。(3)在指标成分的选择中，复方阿胶浆中包括四味植物来源中药红参、党参、熟地黄、山楂，其制备工艺为水煎煮提取，所含有的成分极性大。通过前期对复方阿胶浆化学成分进行质谱解析，结果表明，复方阿胶浆含有人参皂苷类、苯乙醇苷类、环烯醚萜类、有机酸类等多种类型成分，化学成分众多且极性相似。在选择指标成分时，需要考虑到制剂工艺中可能存在的成分类型及其性质，如小极性成分熊果酸在水提液中较少体现，无法作为指标成分；大极性成分皂苷类人参皂苷rg1、苯乙醇苷类毛蕊花糖苷等可作为候选指标成分进行选择。
红参是人参的炮制品，其饮片也是按照人参药材的鉴别方法进行鉴别，使用人参对照药材和人参皂苷rb1、人参皂苷re、人参皂苷rf及人参皂苷rg1作为对照，专属性好。复方阿胶浆中红参仅以人参三醇对照品作为对照，极性较小。本研究沿用原药材的指标成分人参皂苷rg1，不仅能够体现药材到制剂的传递过程，且人参皂苷rg1具有良好的调控血管新生的作用，适用于复方阿胶浆中红参的鉴别。《中国药典》中党参饮片的鉴别方法是使用党参炔苷作为对照，而且前期研究表明，党参炔苷是复方阿胶浆治疗贫血症的活性成分。因此本研究将沿用党参药材的指标成分党参炔苷，结合党参对照药材进行对照，增强其鉴别的专属性。(4)在制备供试品时，对所鉴别的成分进行了全面的考虑。复方阿胶浆原标准中，红参使用极性较小的人参三醇进行对照，党参则使用党参对照药材进行对照，不仅分别制备供试品，操作复杂，浪费人力物力，且展开条件各不相同，无法同时检测。参阅《中国药典》，发现“参芪口服液”、“归脾合剂”等复方制剂在鉴别党参时，供试品及对照药材使用水饱和正丁醇溶液进行萃取，这与皂苷类成分的处理方法相似。现有鉴别方法中，对皂苷类成分如人参皂苷、黄芪甲苷等多用碱性试液处理，普遍使用1
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2％氢氧化钠溶液(ph 13.4)或浓氨试液(ph 11.12)多次洗涤。当溶液ph值大于10时，党参炔苷含量会受到影响；当溶液ph值大于12时，其含量明显降低。因此，党参炔苷不适用强碱性的氢氧化钠溶液或浓氨试液处理。本发明针对“红参中人参皂苷类成分需用碱性试液处理，党参中党参炔苷无法使用强碱溶液处理”的问题，在实验前期对不同浓度的氢氧化钠试液及氨试液进行考察，以期选择适宜两者同时处理的碱性试液，以达到红参、党参共同处理、鉴别的目的。经过实验摸索，最终确定使用1.5倍量的弱碱性氨试液洗涤1次，既能够达到皂苷类成分的除杂效果，又能使党参炔苷不被破坏。薄层色谱鉴别中需要针对与指标成分极性相似的干扰成分进行有效地分离、区别。尤其是在一板多鉴法中，既要对不同药味进行有效地鉴别，又要避免a药味中的成分干扰b药味中的成分。红参、党参的鉴别中，红参中存在某一成分与党参中党参炔苷的极性极为相似，党参阴性样品和党参炔苷对照品在同一rf值均存在斑点，无法准确判断党参的鉴别情况。薄层同向多次展开技术是薄层展开一定展距后，取出晾干，再进行展开。多次展开等于延长展开距离，从而提高了分离效果。本研究将展开后的薄层板晾干后继续在同一展开剂中展开，连续展开三次，有效区别了干扰斑点与鉴别斑点。不仅节约了展开剂，也保证了一板多鉴别方法的实施。该方法为其他中成药的质量控制的鉴别提供了借鉴。此外，如“参芪口服液”、“镇心痛口服液”、“舒心糖浆”等复方制剂在鉴别党参时，以三氯甲烷
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甲醇
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甲酸(5∶2∶0.5)或甲苯
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乙酸乙酯
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甲酸(20：4：0.5)为展开系统，其中三氯甲烷用量占比66.7％、甲苯的用量更是占比81.6％，毒性和刺激性的试剂用量大，极性小，难以适用于红参的检测。本发明中以三氯甲烷
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乙酸乙酯
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甲醇
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水(15：40：22：10)为展开剂，三氯甲烷用量仅占17.2％，在满足所检测成分人参皂苷rg1和党参炔苷极性较大的特点，使其有效展开且区别干扰的同时，降低了有毒试剂的比例，也避免了致癌物甲苯的使用问题。(5)复方阿胶浆原标准中无熟地黄的鉴别，文献报道熟地黄薄层鉴别多是用熟地黄对照药材作为对照，鉴别方法空白，参照物选择单一，无法对其进行控制。本发明填补了复方阿胶浆熟地黄鉴别的空白，采用熟地黄对照药材和毛蕊花糖苷对照品进行双对照，增
强其鉴别的专属性。研究过程中发现，熟地黄阴性样品中存在极性相似成分的干扰，采用同向多次展开技术，在同一展开剂中连续展开三次，可有效地将干扰斑点与毛蕊花糖苷分离，从而确保熟地黄鉴别的准确。复方阿胶浆中熟地黄鉴别方法为首次报道，具创新性和实用性。(6)原标准中山楂鉴别方法使用山楂对照药材进行对照，三氯化铝乙醇溶液显色，主要针对其中黄酮这一大类成分，专属性差。查阅2020版《中国药典》及相关文献，含有山楂的制剂多用熊果酸作为对照品，熊果酸为三萜类成分，极性小，而复方阿胶浆中植物药是使用水提取，溶出的成分极性大，难以使用熊果酸作为对照。本发明使用牡荆素鼠李糖苷作为对照品，该成分是主要存在于山楂中的成分，具有极强的专属性(山楂叶提取物以此作为指标性成分)，也是山楂中的活性成分。牡荆素鼠李糖苷属于黄酮类化合物，是一个二糖苷，极性较大，适用于检测。在选择适宜对照品的同时，沿用山楂对照药材，形成山楂对照药材和牡荆素鼠李糖苷对照品双对照的鉴别方法。该方法为含有山楂的水煎煮制剂提供了新的鉴别特征点，为首次报道，具创新性和实用性。(7)在显色剂的使用上，熟地黄和山楂是在同一展开条件下，在使用显色剂前后进行观察。显色前可观察到毛蕊花糖苷的蓝色荧光斑点；在喷以三氯化铝显色后，可观察到黄酮类成分牡荆素鼠李糖苷显示出绿色荧光斑点，且并无干扰，说明指标成分选择具有专属性和科学合理性。熟地黄、山楂使用的是两种供试品溶液、同一展开系统的“一板多鉴”法薄层色谱鉴别，对照品和对照药材双对照的模式(熟地黄使用毛蕊花糖苷对照品和熟地黄对照药材；山楂使用牡荆素鼠李糖苷对照品和山楂对照药材)，弥补了原标准中无熟地黄鉴别的缺陷，简化了山楂鉴别的方法，利用牡荆素鼠李糖苷这一新鉴别特征点，增强了其鉴别的专属性。该方法提供了高灵敏度、简便、快捷的薄层鉴别方法，为初次报道。(8)本发明与目前复方阿胶浆薄层鉴别方法相比，不但新增了熟地黄的薄层鉴别，填补了其中熟地黄鉴别的空白，而且“4
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2”模式所花费的时间和有机试剂更少，环境污染低，形成了一套简便、快捷、高效、低耗、低污染、多药味、多信息快速薄层鉴别方法。(9)针对药物来源广、成分复杂、物质基础不明确的中药复方制剂，指纹图谱可实现对中药内在质量的综合评价和对其整体物质的有效控制。为了更好的监控和评价本品质量，指导后续的规范化生产，本发明提供一种复方阿胶浆的液相指纹图谱的分析方法。复方阿胶浆具有补气养血之功效，研究表明，复方阿胶浆对多种类型的贫血症均有较好的治疗效果。曾有研究者对复方阿胶浆进行化学成分和指纹图谱研究，但是仍存在药效物质与指纹图谱相分离的问题，未能明确复方阿胶浆治疗贫血症的活性成分，以及针对活性成分建立质量控制方法。笔者在研究前期采用斑马鱼节间血管生成模型对复方阿胶浆中焦地黄苯乙醇苷a1、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷等成分的促血管生成活性进行研究，结果表明，焦地黄苯乙醇苷a1、异毛蕊花糖苷具有显著的促血管生成活性(p＜0.001)，毛蕊花糖苷具有明显的促血管生成活性(p＜0.01)，说明这些成分可作为复方阿胶浆治疗贫血症的活性成分。这些成分是源于复方阿胶浆中植物药的化学成分，是具有显著治疗贫血症的活性成分，也是可利用于质量控制的成分。见图13。本发明建立了复方阿胶浆指纹图谱，共标示了15个共有峰，归属了色谱峰的药材来源。利用指纹图谱技术全面控制其质量，融合已验证具有活性的成分焦地黄苯乙醇苷a1(参考峰)、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷等作为对照，指认了其中8个色谱峰的结构。这些成分
的存在，使得复方阿胶浆较单独的阿胶具有更好的药效，以及更好的质量控制效果，本发明也为利用药效活性成分建立指纹图谱提供思路与方法。复方阿胶浆质量控制研究中，多采用lc
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ms进行检测，然而质谱检测成本高、操作复杂，不适宜于常规检测。本发明建立了hplc
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dad检测方法，相较于已有现有技术中的指纹图谱，不仅缩短了检测时长，方法更简便，适宜于分析检测。本发明中，复方阿胶浆薄层色谱结合hplc
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dad指纹图谱，基本涵盖了红参的人参皂苷类成分、党参中的炔苷类成分、熟地黄中苯乙醇苷类成分和山楂中黄酮类、有机酸类成分，全面表征了复方阿胶浆中植物来源中药的成分，从而控制其整体质量，确保其内在质量的均一、稳定。(10)中药及其制剂有效成分繁多复杂，药理作用相辅相承，单一成分难以有效控制其质量稳定性和疗效一致性，故多指标成分测定已成为相关质量评价的发展趋势。复方阿胶浆，原方出自明代《景岳全书》中“两仪膏”，由阿胶、红参、熟地黄、党参、山楂组成。临床常用于气血两虚，头晕目眩，心悸失眠，食欲不振及白细胞减少症和贫血等症。《中国药典》中复方阿胶浆含量测定项仅有总氮量测定，无植物来源中药的含量测定方法。熟地黄为生地黄的炮制加工品，主要含有苯乙醇苷类、环烯醚萜类、还原糖等成分。焦地黄苯乙醇苷a1和异毛蕊花糖苷均为苯乙醇苷类成分，是地黄中主要活性成分之一，且在地黄的加工炮制过程中较为稳定。党参是复方阿胶浆中的佐使药，党参炔苷既是特征性成分(党参鉴别的指标成分)，也是药效活性成分。在60℃以下、ph 2
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10范围内，党参炔苷稳定性良好，能够较好体现药材到制剂的传递过程。这些成分是源于复方阿胶浆中植物药的化学成分，是具有显著治疗贫血症的活性成分，也是可利用于质量控制的成分。本发明针对复方阿胶浆中植物来源中药成分的专属性、有效性、可测性等特点，选用复方阿胶浆的质量标志物焦地黄苯乙醇苷a1、异毛蕊花糖苷、党参炔苷作为指标性成分，通过双波长检测同时测定3种成分，分别在270nm下检测党参炔苷，330nm下检测焦地黄苯乙醇苷a1和异毛蕊花糖苷，建立了复方阿胶浆多成分含量测定方法。该方法不仅将植物来源中药纳入质量控制中，所选用的成分作为复方阿胶浆质量标志物，专属性好、具有活性、含量可测，而且hplc
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dad检测稳定，准确度高，为实验结果提供保障。该方法的建立弥补了以总氮量为唯一标准的含量测定方法，克服了质谱检测成本高昂、操作复杂的局限性，建立了基于成分专属性、有效性、可测性的质量评价方法，为提升复方阿胶浆质量标准提供切实可行的科学方法。(11)本发明的鉴别方法简单、高效、快速，指纹图谱和含量测定方法精密度、重复性、稳定性等均达到国家药品标准研究制定技术要求。本发明目的是为了弥补已有质量标准的不足，提供一种复方阿胶浆中植物来源中药质量标准的检测方法。深化质量标准，精准控制指标，实现符合中医药特色的中成药复方阿胶浆质量评价体系，提升产品质量，稳定品质。
附图说明
5.为了更清楚地说明本技术的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为红参、党参的薄层鉴别图谱；
图2为熟地黄、山楂的薄层鉴别图谱；图3为精密度试验hplc指纹图谱；图4为重复性试验hplc指纹图谱；图5为稳定性试验hplc指纹图谱；图6为仪器耐用性试验hplc指纹图谱；图7为色谱柱耐用性试验hplc指纹图谱；图8为20批复方阿胶浆hplc指纹图谱(s1～s20)；图9为复方阿胶浆对照指纹图谱；图10为复方阿胶浆对照指纹图谱(s1)及混合对照品(s2)的hplc指纹图谱；图11为混合对照品溶液(a)、供试品溶液(b)和熟地黄阴性对照溶液(c)；图12为混合对照品溶液(a)、供试品溶液(b)和党参阴性对照溶液(c)；图13为斑马鱼促血管生成活血研究结果。
具体实施方式
6.为了更加详细地介绍本发明，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本技术相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本技术的一些方面相一致的系统和方法的示例。一种复方阿胶浆中植物来源中药质量标准的检测方法，该方法包括复方阿胶浆中植物来源中药红参、党参“一板多鉴”法薄层色谱鉴别；复方阿胶浆中熟地黄、山楂“一板多鉴”法薄层色谱鉴别；复方阿胶浆hplc
‑
dad指纹图谱；复方阿胶浆多成分含量测定方法。具体内容如下：1.红参、党参“一板多鉴”法薄层色谱鉴别步骤如下：(1)红参、党参供试品溶液的制备：取本品20ml，用水饱和正丁醇振摇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇液。用氨试液30ml洗涤，弃去水液。再用正丁醇饱和水30ml洗涤，弃去水液。正丁醇液回收至干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取红参对照药材1g、党参对照药材1g，分别加水50ml，超声处理45分钟，滤过，水液浓缩至20ml，自“用水饱和正丁醇振摇萃取3次”，同法制成对照药材溶液；再取人参皂苷rg1、党参炔苷适量，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的对照品溶液；(2)阴性对照溶液的制备：取红参阴性样品20ml、党参阴性样品20ml，自“用水饱和正丁醇振摇萃取3次”，同法分别制成红参阴性对照溶液、党参阴性对照溶液；(3)照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液各2μl、红参对照药材溶液1μl、党参对照药材溶液6μl、对照品溶液各1μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷
‑
乙酸乙酯
‑
甲醇
‑
水(15：40：22：10)的下层溶液为展开剂，连续展开3次，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照色谱相应的位置上，无斑点干扰，表明该方法专属性良好，见图1。点1～3为供试品1～3(批号1905075、1907011、1907012)、点4为红参对照药材、点5为人参皂苷rg1对照品、点6为红参阴性对照、点7为党参对照药材、点8为党参炔苷对照品、点9为党参阴性对照。2.熟地黄、山楂“一板多鉴”法薄层色谱鉴别步骤如下：
(1)熟地黄供试品溶液的制备：取本品20ml，加甲醇50ml，离心，上清液蒸干，残渣加水20ml溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，回收至干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取熟地黄对照药材1g，加水50ml，超声处理45分钟，滤过，滤液浓缩至20ml，自“加甲醇50ml”，同法制成对照药材溶液；再取毛蕊花糖苷适量，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作对照品溶液；(2)山楂供试品溶液的制备：取本品50ml，加聚酰胺(30～60目)6g，混匀，静置30分钟，用脱脂棉滤过，聚酰胺用水洗脱至近无色，加乙醇50ml，超声处理10分钟，滤过，回收至干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取山楂对照药材1g，加水50ml，超声处理45分钟，滤过，自“加聚酰胺(30～60目)6g”，同法制成对照药材溶液；再取牡荆素鼠李糖苷适量，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作对照品溶液；(3)阴性对照溶液的制备：取熟地黄阴性样品20ml，自“加甲醇50ml”，同法制成熟地黄阴性对照溶液。再取山楂阴性样品50ml，自“加聚酰胺(30～60目)6g”，同法制成山楂阴性对照溶液；(4)照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取(1)项下供试品溶液2μl、熟地黄对照药材溶液3μl、毛蕊花糖苷对照品1μl溶液，(2)项下供试品溶液8μl、山楂对照药材溶液8μl、牡荆素鼠李糖苷对照品1μl溶液，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷
‑
甲醇
‑
甲酸(8：2：0.2)为展开剂，连续展开3次，取出，晾干，置紫外灯光(365nm)下检视。供试品色谱中，在与熟地黄对照药材和毛蕊花糖苷对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照色谱相应的位置上，无斑点干扰，表明该方法专属性良好，见图2(a)。点1～3为熟地黄供试品1～3(批号1905075、1907011、1907012)、点4为熟地黄对照药材、点5为毛蕊花糖苷、点6为熟地黄阴性对照。再喷以三氯化铝试液，置紫外灯光(365nm)下检视，供试品色谱中，在与山楂对照药材和牡荆素鼠李糖苷对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照色谱相应的位置上，无斑点干扰，表明该方法专属性良好，见图2(b)。点7～9为山楂供试品1～3(批号1905075、1907011、1907012)、点10为山楂对照药材、点11为牡荆素鼠李糖苷、点12为山楂阴性对照。3.复方阿胶浆hplc
‑
dad指纹图谱内容如下：(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸乙腈为流动相a，以0.1％甲酸水为流动相b，梯度洗脱程序：0～20min 2％～5％a，20～35min 5％～12％a，35～45min 12％～14％a，45～55min 14％～20％a，55～65min 20％～23％a，65～80min 23％～35％a；检测波长为330nm；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml。理论板数按焦地黄苯乙醇苷a1峰计算应不低于10000。(2)测定步骤如下：1)对照品溶液的制备：取咖啡酸、绿原酸、洋地黄叶苷c、阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷a1、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷b1、异毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含咖啡酸20μg、绿原酸20μg、洋地黄叶苷c 50μg、阿魏酸20μg、焦地黄苯乙醇苷a
1 50μg、毛蕊花糖苷20μg、焦地黄苯乙醇苷b
1 50μg、异毛蕊花糖苷50μg的混合溶液，即得；2)供试品溶液的制备：精密量取本品2ml，加入乙腈6ml，涡旋至充分混匀，离心，取
上清液，残渣加入乙腈6ml，涡旋至充分混匀，离心，合并上清液，蒸干，残渣加30％甲醇溶解，并转移至1ml量瓶中，加30％甲醇至刻度，摇匀，即得；3)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；4)通过对复方阿胶浆样品的分析方法进行考察，包括液相条件(流动相、梯度、检测波长、流速、柱温等)、供试品制备方法、参照物制备方法等方面，建立复方阿胶浆指纹图谱。并根据20批复方阿胶浆指纹图谱结果，选取与共有模式具有最高相似度的指纹图谱作为对照指纹图谱，见图5；5)方法学考察：
①
精密度试验：取复方阿胶浆(批号1905075)制得供试品溶液，连续进样6次，记录峰面积。以焦地黄苯乙醇苷a1为参照峰，各共有峰的相对峰面积rsd均小于4.99％，相对保留时间rsd均小于0.18％，表明仪器精密度良好。见图3。
②
重复性试验：取复方阿胶浆(批号1905075)6份，制得供试品溶液分别进样，记录峰面积。以焦地黄苯乙醇苷a1为参照峰，各共有峰的相对峰面积rsd均小于4.62％，相对保留时间rsd均小于0.08％，表明方法重复性良好。见图4。
③
稳定性试验：取复方阿胶浆(批号1905075)，制得供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、16、24小时进样，记录峰面积。以焦地黄苯乙醇苷a1为参照峰，各共有峰的相对峰面积rsd均小于5.44％，相对保留时间rsd均小于0.36％，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。见图5。
④
耐用性试验：在不同仪器thermo ultimate 3000和waters e2695(s3)上进行耐用性实验，测定15种成分，结果实验条件下，相似度分别为0.933、0.924，均大于0.9，表明仪器耐用性良好。见图6。在acchorm仪器上，使用不同色谱柱thermo hypersil gold(s2)、waters t
‑
nature(s3)、agilent xdb
‑
c18(s4)、上进行耐用性实验，测定15种成分，结果实验条件下，相似度分别为0.911、0.941、0.944，均大于0.9，表明色谱柱耐用性良好。见图7。6)取20批复方阿胶浆制得供试品溶液(编号s1～s20)，分别进样，记录各个样品的色谱图。采用《中药指纹图谱相似度评价评价系统(2012a版)》对所记录图谱的aia文件进行分析。以s1为参照图谱，时间窗宽度设为0.2min，对色谱峰进行多点校正和全峰匹配，生成20批复方阿胶浆的指纹图谱匹配图以及对照指纹图谱。见图8
‑
9。计算s1～s20指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，结果分别为0.990、0.982、0.991、0.997、0.996、0.994、0.990、0.989、0.995、0.996、0.994、0.991、0.993、0.998、0.997、0.997、0.992、0.997、0.992、0.990，均大于0.9，表明各批次样品的化学成分稳定。7)根据对照品共指认出8个化合物，分别为咖啡酸、绿原酸、洋地黄叶苷c、阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷a1、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷b1、异毛蕊花糖苷。见图10。对复方阿胶浆指纹图谱进行规定：供试品指纹图谱中应出现15个共有峰，其中8号峰焦地黄苯乙醇苷a1相对应的峰为s峰；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.9。4.复方阿胶浆多成分含量测定内容如下：(1)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸乙腈为流动相a，0.1％甲酸水为
流动相b，梯度洗脱程序：0～10min 2％～10％a，10～20min 10％～20％a，20～30min 20％～22％a，30～35min 22％～25％a；检测波长为270nm、330nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min。理论板数按焦地黄苯乙醇苷a1峰计算应不低于10000。(2)测定步骤如下：1)对照品溶液的制备：取焦地黄苯乙醇苷a1对照品、异毛蕊花糖苷对照品和党参炔苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含焦地黄苯乙醇苷a
1 50μg、异毛蕊花糖苷45μg、党参炔苷80μg的混合溶液，即得；2)供试品溶液的制备：精密量取本品2ml，加入乙腈6ml，涡旋至充分混匀，离心，取上清液，残渣加入乙腈6ml，涡旋至充分混匀，离心，合并上清液，蒸干，残渣加30％甲醇溶解，并转移至1ml量瓶中，加30％甲醇至刻度，摇匀，即得；3)阴性对照溶液的制备：取熟地黄阴性样品和党参阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成熟地黄阴性对照、党参阴性对照；4)测定法：分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。分别在270nm和330nm下检测复方阿胶浆供试品、对照品及阴性样品，结果显示，供试品中焦地黄苯乙醇苷a1、异毛蕊花糖苷、党参炔苷色谱峰与对照品色谱峰保留时间一致，并与其它共存成分分离度大于1.5，达到基线分离，且阴性样品在相应的位置没有色谱峰干扰空白样品无影响，说明该方法的专属性良好，见图11
‑
12；5)方法学考察：
①
线性范围的考察：取焦地黄苯乙醇苷a1对照品、异毛蕊花糖苷对照品、党参炔苷对照品适量，精密称定，置于同一个5ml量瓶中，加甲醇制成每1ml分别含有焦地黄苯乙醇苷a10.214 mg、异毛蕊花糖苷0.208mg、党参炔苷0.510mg的混合对照品溶液。取混合对照品溶液，用甲醇分别稀释0、2、5、10、50倍，配制成系列浓度的混合对照品溶液，分别进样。以浓度(x)对色谱峰面积(y)绘制标准曲线，进行线性回归，得3种成分回归方程。结果表明，焦地黄苯乙醇苷a1在4.28～214μg/ml线性关系良好、异毛蕊花糖苷在4.16～208μg/ml线性关系良好、党参炔苷在10.2～510μg/ml线性关系良好，见表1。表1 3种成分线性关系结果
②
精密度试验：取复方阿胶浆供试品溶液，连续进样6次，测得峰面积，计算3种成分峰面积的rsd值。结果表明，供试品中3种待测成分rsd均小于3％，精密度限度(rsdr％)为6％，因此精密度满足要求，见表2。表2精密度试验结果
③
重复性试验：取复方阿胶浆供试品溶液6份，分别进样，测得峰面积，计算3种成分峰面积的rsd值。结果表明，供试品中3种待测成分rsd均小于3％，重复性限度(rsd
r
％)为6％，因此重复性满足要求，见表3。表3重复性试验结果
④
准确度试验：取已知含量的复方阿胶浆供试品6份，分别加入等量的对照品，进样，测得峰面积，计算回收率。结果表明，供试品中3种待测成分含量在0.001％，回收率限度为80％～115％，因此加样回收率满足要求，见表4。表4准确度试验结果
6)样品含量测定：取15个批次(编号s1
‑
s15)的复方阿胶浆样品，每个批次平行制备3份供试品溶液，依次进样测定，结果见表5。15批样品中焦地黄苯乙醇苷a1、异毛蕊花糖苷和党参炔苷的质量分数分别在6.58～10.5μg/ml、7.24～12.8μg/ml、17.7～29.0μg/ml。表5复方阿胶浆含量测定结果(n＝3)
7)对复方阿胶浆含量测定限度进行规定：本品1ml含熟地黄以焦地黄苯乙醇苷a1(c
36
h
48
o
20
)计，不得少于6.60μg；以异毛蕊花糖苷(c
29
h
36
o
15
)计，不得少于7.96μg；含党参以党参炔苷(c
20
h
28
o8)计，不得少于18.3μg。