生物材料侦测微颗粒和使用其的生物材料侦测方法与流程

1.本公开涉及用于侦测生物材料的微颗粒和使用其的用于侦测生物材料的方法。更具体地，本公开涉及基于免疫诊断用于低成本且具有高灵敏度的针对所关注生物材料的快速多重侦测的新颖微颗粒和方法。


背景技术：

2.体外诊断(in vitro diagnostics,ivd)是一种用于分析从人类(例如，血液、尿液和细胞)收集的样品以诊断人类健康的技术。这种体外诊断方法包含免疫诊断、自身血液葡萄糖监测和分子诊断。特别地，通过基于抗原
‑
抗体反应来确定特定致病性蛋白的存在或不存在，免疫诊断技术可被用于诊断和追踪许多种疾病。然而，目标蛋白的浓度超过侦测极限是使用免疫诊断技术的前提条件。由于这个缺点，已经开发了各种技术来放大由低浓度蛋白产生的信号。
3.特别地，随着合成化学和生物科学的近期进展，各种目标分析物已出现在包括新药开发和诊断的各个领域。数种高度灵敏的方法已经被报导可使用其确保信号产生的磁性颗粒来侦测微量目标(modern magnetic immunoassay:biophysical and biochemical aspects(2017)regul.mech.biosyst.,9(1),47
‑
55)。
4.常规的免疫诊断技术使用以二氧化硅改性的纳米尺寸的磁性颗粒表面。然而，这种二氧化硅改性的磁性颗粒不能从发生免疫反应的孔中有效地被提取或释放出来。即，小尺寸的磁性颗粒通常以悬浮形式存在于溶液中，从而难以分离。为了这个原因，将小尺寸的磁性颗粒用于定性分析，而不是定量分析。进一步，因为它们一次只能测试一个磁性颗粒，常规分析方法需要很长的测试时间，并且涉及到复杂的测试流程。


技术实现要素：

5.本发明要解决的问题
6.本公开的一个方面提供了用于侦测生物材料的多个微颗粒，各个微颗粒包括：核壳结构微颗粒，其由包括磁响应性金属的内核和包围内核并且具有均匀厚度的壳层所组成；和被放到壳层上以捕获生物材料的捕获探针。
7.本公开的进一步方面提供了一种用于制备侦测生物材料的微颗粒的方法，所述方法包括：提供多个核壳结构微颗粒，各个核壳结构微颗粒由包括磁响应性金属的内核和包围内核并且具有均匀厚度的壳层所组成；并且将用于捕获生物材料的捕获探针放到壳层上。
8.本公开的另一方面提供了一种用于侦测生物材料的方法，包括：(a)提供用于侦测生物材料的多个微颗粒；以及(b)提供能够特异地结合到生物材料并与响应外部刺激而发光的发光材料缀合的多个侦测探针；(c)使多个捕获探针、生物材料和多个侦测探针彼此反应以形成微颗粒、生物材料和侦测探针的复合物；和(d)响应于外部刺激，测量从存在于复合物中的发光材料发射的发光信号，以侦测生物材料。
附图说明
9.图1示出了用于侦测生物材料的微颗粒的一个实施方案。
10.图2示出了根据本公开的一个示例性实施方案的玻璃涂覆的微颗粒的表面的扫描电子显微镜图像(左)和使用根据现有技术的teos制备的二氧化硅涂覆的磁性颗粒(右)。
11.图3示出了根据本公开的一个示例性实施方案的用于侦测生物材料的微棒状微颗粒的图像。
12.图4是示出了用于通过elisa(顶)和荧光测量(底)来侦测目标蛋白的抗原
‑
抗体反应的示意图。
13.图5示出了将目标抗原滴到免疫反应材料上时的反应。具体地，图5示出了用于免疫诊断的捕获抗体结合微棒、样品溶液中的目标抗原和其中磷光体被缀合到侦测抗体的磷光体缀合物的结构和作用原理。
14.图6示出了以磁棒和加热块混合和加热以促进免疫反应的过程。
15.图7示出了清洗微棒和磁棒以去除非特异性材料的过程。
16.图8是示出了对微棒的表面进行氨基硅烷化并通过fitc确认氨基硅烷化的结果的实验的示意图。
17.图9示出了固定在微棒上的抗体的均匀性和密度(数量)。具体地，图9示出了在将侦测抗体
‑
磷光体缀合物结合到其中捕获抗体被固定在微棒表面上的微棒复合物之后的明场显微镜图像(左)和荧光显微镜图像(右)。
18.图10示出了在将tsh抗体固定在磁性颗粒表面上之后所拍摄的明场显微镜图像和荧光显微镜图像。
19.图11示出了在不同tsh浓度下的荧光强度。
20.图12示出了在将人γ
‑
干扰素抗体固定在磁性颗粒表面上之后所拍摄的明场显微镜图像和荧光显微镜图像。
21.图13示出了在不同γ
‑
干扰素浓度下的明场显微镜图像和荧光显微镜图像，其是以1
×
透镜持续200ms的曝光时间所拍摄的，并且示出了所测量的荧光强度。
22.图14示出了在不同γ
‑
干扰素浓度下的明场显微镜图像和荧光显微镜图像，其是以1
×
透镜持续300ms的曝光时间所拍摄的，并且示出了所测量的荧光强度。
23.图15示出了实验结果，以确认固定在磁性颗粒上的ifn
‑
γ和il
‑
10细胞因子是否可以被用于多重免疫诊断。
具体实施方式
24.实施发明的方式
25.现在将参考附图详细描述本公开。除非另外提及，否则通过“包含...一个”或“包括...一个”来进行的元件并不排除存在一个或更多个另外元件。术语“上”和“在...上方”被用于指出相对位置，并且是指直接在所述层上存在另外的元件或层，以及在它们之间存在一个或更多个中间层或元件。与此类似，还将理解的是，术语“下方”、“在...下方”、“低于”和“在...之间”被用于指出相对位置。
26.本公开的一个方面提供了用于侦测生物材料的多个微颗粒。图1示出了用于侦测生物材料的一个微颗粒的一个实施方案。
27.用于侦测生物材料的微颗粒100包括：核壳结构微颗粒130，其由包括磁响应性金属的内核110和包围内核并且具有均匀厚度的壳层120所组成；和被放到壳层120上以捕获生物材料的捕获探针140。
28.存在于核壳结构微颗粒130的内核110中的磁响应性金属可以是顺磁性材料。例如，磁响应性金属可以是铁(fe)、镍(ni)、钴(co)或锰(mn)合金。磁响应性金属实质上可以包括至少一种过渡金属，诸如铁、镍、钴或锰，并且可选地可以包括至少一种稀土金属，诸如钆(gd)、铽(tb)或钐(sm)。磁响应性金属可选地可以进一步包括一种或更多种其他元素，诸如硼(b)、硅(si)和碳(c)。磁响应性金属典型为铁合金或钴合金。具体地，铁合金为fe
70
b
15
si
10
c5，并且钴合金为co
68
mn7si
10
b
15
。
29.优选地，核壳结构微颗粒130具有使得其不会悬浮在水中的尺寸和比重。由于这些物理性质，核壳结构微颗粒130可以被诸如永磁体或电磁体的外部磁体快速收集或分离。内核110可以占核壳结构微颗粒130的总体积的60％或更多。例如，内核110可以占核壳结构微颗粒130的总体积的60至99％，优选为75至99％。优选地，核壳结构微颗粒130具有约数十至数百微米(μm)的尺寸(例如直径或长度)和至少5(5或更大)的比重。如果核壳结构微颗粒130的尺寸小于1微米，则尽管其比重高(例如，铁纳米颗粒为7.876)，它也可以悬浮在水中。在这种情况下，在使用受施加磁场影响的核壳结构微颗粒130用于在孔中侦测生物材料的生物测定期间，因为微颗粒的低磁性造成控制微颗粒的磁性性质上的困难，因此难以分离生物材料。当磁棒在孔中上下移动以促进免疫反应时，微颗粒会附接到磁棒上或从磁棒上脱落。即使在去除磁场后，由于微颗粒的重量小，因此在磁棒向上和向下移动期间，附接到磁棒上的微颗粒不会掉落在孔底上，并且维持与磁棒的非特异性结合，导致当在孔中侦测到生物材料存在时，定量分析的重现性不佳。
30.根据本公开的一个实施方案，微颗粒的尺寸远大于用于本领域生物测定的二氧化硅珠。磁响应性金属(磁性内核)占据了微颗粒的大部分体积，不像是现有的其中含有磁性颗粒的二氧化硅珠。由此，磁响应性金属对磁性灵敏，确保定量分析的高重现性。
31.微颗粒100具有核壳结构，其中中心的磁响应性金属被壳层120包围。壳层120使用有机或无机材料形成，优选为玻璃。被固定在壳层表面上的捕获探针是抗体或蛋白。为了固定捕获探针，可以在壳层的表面放上诸如羟基、氨基或羧基的官能团。
32.壳层120可以实质上完全包围核壳结构微颗粒130。替代地，核壳结构微颗粒130的表面可以不被壳层完全覆盖，并且可以在微颗粒的制造期间部分地暴露。
33.壳层120的厚度可以为1至100μm，优选为1至50μm，更优选为1至10μm，并且甚至更优选为4至8μm。如果壳层120的厚度小于下限，则壳层120的表面趋向变脆或易于破裂。同时，如果壳层120的厚度超过上限，则可能在玻璃切割期间由激光的特性和波长引起问题。
34.核壳结构可通过将液体的壳组分施加到内核金属或将内核金属组分填充在中空框架中而形成。
35.壳层120可以通过有机或无机涂覆溶液的固化来形成。更具体地，可以通过在高温下熔融有机或无机壳组分以使壳组分可流动来形成壳层120。替代地，可以通过将壳组分溶解在溶剂中以制备涂覆液体并将涂覆液体施加到内核金属来形成壳层120。有机材料通常是聚合物，无机材料可以是金属或陶瓷材料，尤其是玻璃。例如，可以通过将塑料材料溶解在溶剂或熔融玻璃中以获得涂覆溶液，并通过诸如浸涂或喷涂的合适涂覆制程而将涂覆溶
液施加到核壳结构微颗粒130上来形成壳层120。
36.玻璃管可以被用作中空框架。在此情况下，将金属粉末被放入玻璃管后，当金属粉末在高温下熔融时，玻璃管被抽出。替代地，可以在抽出玻璃管时将熔融金属注入玻璃管中。替代地，可以将在uv可固化材料中的金属粉末分散体填充在玻璃管中，并且其通过紫外线幅射被固化。在这些方法中，中空框架可以构成壳层。
37.核壳结构微颗粒130的表面非常均匀。在用于生物测定的颗粒的情况下，通过在内核颗粒的表面上生长诸如teos的二氧化硅前体来形成壳层。在此情况下，壳层具有非常粗糙的表面，并且结果为，大多数的颗粒会非特异地结合到目标材料上。此种非特异性结合可能会导致不必要的背景噪声。
38.用于壳层120的玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃)呈现微小的非特异性结合，这是由通过化学反应与反应样品吸附在一起所引起的。特别地，因为壳层120具有源自液体组分的涂层，所以核壳结构微颗粒130的表面非常均匀。壳层120的平均表面粗糙度(ra)可以为15nm或更小，优选为10nm或更小，更优选为5nm或更小，更优选为2nm或更小，特别为1.5nm或更小。ra可以是例如3nm或更大，2nm或更大，或是1nm或更大。在此范围内，可以使反应样品对壳层120的表面的非特异性吸附最小化。
39.图2示出了根据本公开的一个示例性实施方案的玻璃涂覆的微颗粒的表面的扫描电子显微镜图像(左)和使用根据现有技术的teos制备的二氧化硅涂覆的磁性颗粒(右)。参考图2，与现有技术的二氧化硅涂覆的磁性颗粒相比，玻璃涂覆的微颗粒的表面均匀度更高。
40.考虑其强度和透明度，核壳结构微颗粒130的壳层优选由玻璃制成。玻璃可以实质上由选自碱石灰(soda lime)、硼硅酸盐、铝硅酸盐、二氧化硅、碱金属硅酸盐、硼硅酸玻璃(pyrex)和石英所组成的组的至少一种化合物所构成。优选地，玻璃是硼硅酸盐玻璃，其适用于需要耐热性、耐酸性和耐水性的实验。
41.核壳结构微颗粒130可以是未成形的或成形的形式。当成形时，核壳结构微颗粒130为棒体、片体或球体的形式。片状的微颗粒130可以具有各种横截面形状，诸如星形、多边形和圆形，但不特别限于此。微颗粒为微棒、微盘或微珠的形式，这优选地从制造便利性和易于观察的方面考量。微颗粒特别优选为微棒的形式。微棒形式的核壳结构微颗粒130由于它们的重迭而易于区分彼此。当放置在孔中时，微棒形式的核壳结构微颗粒130易于集中。由于微棒形式的个别微颗粒130占据很小的区域，因此可以在单一屏幕上显示大量的微颗粒。微颗粒可以具有复杂的横截面形状，诸如星形。然而，在此情况下，当微颗粒在孔中移动时，微颗粒趋向彼此碰撞或与孔的壁碰撞，导致边缘破裂。因此，微颗粒具有诸如微棒的简单形状是有利的。
42.微棒的长度可以为10至1,000μm。如果微棒的长度小于下限，则微棒不易区分彼此。同时，如果微棒的长度超过上限，则颗粒可能重迭，使得难以观察它们。微棒的长度与直径的比(即长宽比)可以为至少2(2或更大)、至少5(5或更大)或至少10(10或更大)。如果长宽比小于下限，则微棒接近球形微颗粒，使得难以区分彼此。同时，如果长宽比超过上限，则微棒可能会弯曲。
43.在一个优选的实施方案中，核壳结构微颗粒130可以通过切割玻璃涂覆的金属微丝而获得。在此实施方案中，通过激光将玻璃涂覆的金属微丝简单地切割成不同的长度。
44.核壳结构微颗粒130可以适用于体外诊断，用以侦测源自活生物体的样品溶液中的生物材料。样品溶液可以是组织提取物、细胞裂解物、全血、血浆，血清、唾液、眼液、脑脊髓液、汗水、尿液、乳汁、腹水液体、滑液和腹膜液。为了快速诊断，样品溶液的预处理可以被简化或者甚至可以被省略。
45.生物材料可以是生物标志物、血液、血浆、血清、体液、蛋白质、肽、核酸、细菌、病毒、内质网、mirna、外泌体和循环肿瘤细胞。优选地，生物材料是生物标志物。特别地，由于本公开的微颗粒在单次测试中侦测各种类型的生物材料以快速诊断疾病的能力，因此其对于生物标志物侦测非常有用。生物标志物不受限制，只要它们在一般的科学或医学应用中用于生物治疗、致病原因和药理治疗过程的测量或评估。生物标志物可以是例如多肽、肽、核酸、蛋白质或代谢物，这些可以在诸如血液、唾液和尿液的生物流体中侦测到。具体地，生物标志物可以选自由甲状腺刺激激素(thyroid
‑
stimulating hormone,tsh)、游离t4、糖尿病特异性抗原(hba1c)、前列腺特异性抗原(prostate
‑
specific antigen,psa)、宫颈癌标志物和乳腺癌标志物所组成的组。
46.在本公开的一个实施方案中，捕获探针140可以被放到壳层120上以捕获样品溶液中的生物材料。由于捕获探针140其特异地结合到生物材料的能力，因此捕获探针140使生物材料被核壳结构微颗粒130捕获。捕获探针140可以是抗体、蛋白质、核酸或适体。例如，捕获探针可以是能够特异性结合以捕获生物标志物的捕获抗体。捕获探针140可以通过吸附或化学键合而被固定在核壳结构微颗粒130的表面上。优选地，捕获探针140被连接至壳层120的表面官能团。例如，通过将生物素放到捕获探针140的表面上并且将能够结合到抗生物素的亲和素、中性亲和素或链霉亲和素放到核壳结构微颗粒130上，可以将捕获探针140附接到核壳结构微颗粒130。替代地，经由核壳结构微颗粒130表面上的羟基、氨基或羧基，捕获探针140可以被连接到核壳结构微颗粒130。
47.微颗粒的使用能够以高灵敏度快速分析样品溶液中所需的生物材料。图3示出了根据本公开的一个示例性实施方案的用于侦测生物材料的微棒状微颗粒的图像。
48.本公开的进一步方面提供一种用于制备侦测生物材料的微颗粒的方法。
49.根据本公开的一个实施方案，所述方法包括：(a)提供多个核壳结构微颗粒，各个核壳结构微颗粒由包括磁响应性金属的内核和包围内核并且具有均匀厚度的壳层所组成；并且(b)将用于捕获生物材料的捕获探针放到壳层上。在一个实施方案中，微颗粒可以是其表面涂覆有玻璃的微棒。为了放上捕获探针，微颗粒的表面可以被适当地改性。例如，i)通过依次以有机溶剂、碱性溶液和食人鱼溶液清洗，以si
‑
oh(硅烷醇)对涂覆有玻璃的微棒表面进行改性。接着，ii)通过硅烷化和固化，表面的si
‑
oh被氨基硅烷化。通过以在作为溶剂的丙酮或甲苯中的3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷(3
‑
aminopropyltriethoxysilane,aptes)溶液处理来进行硅烷化。此后，还可以通过与γ
‑
丁内酯或琥珀酸酐反应以用羧基取代氨基来对微棒的表面进行改性。
50.本公开的另一方面提供了一种用于侦测生物材料的方法，包括：(a)提供用于侦测生物材料的多个微颗粒；以及(b)提供能够特异地结合到生物材料并与响应外部刺激而发光的发光材料缀合的多个侦测探针；(c)使多个捕获探针、生物材料和多个侦测探针彼此反应以形成微颗粒、生物材料和侦测探针的复合物；和(d)响应于外部刺激，测量从存在于复合物中的发光材料发射的发光信号，以侦测生物材料。
51.类似捕获探针，侦测探针可以是能够特异地结合到生物材料的抗体、蛋白质、核酸或适体。例如，侦测探针可以是特异地结合到生物标志物并含有发光材料的侦测抗体。
52.侦测抗体和捕获抗体可以是针对被用于一般免疫诊断的抗原的抗体。例如，抗原可以是甲状腺刺激激素(tsh)、游离t4、糖尿病特异性抗原(hba1c)、前列腺特异性抗原(psa)、宫颈癌抗原和乳腺癌抗原。
53.发光材料结合到侦测探针，并响应外部刺激产生光以侦测生物材料的存在。外部刺激选自由紫外线、电子束、化学反应和酶
‑
底物反应。合适的发光材料的例子包括荧光分子、量子点、金属纳米颗粒、磁性纳米颗粒、酶和酶底物。特别地，因为荧光分子易于购买以及便于应用，所以它们是优选的。荧光分子可以选自由异硫氰酸荧光素(luorescein isothiocyanate,fitc)、荧光素、荧光素酰胺(fluorescein amidite,fam)、藻红蛋白(phycoerythrin,pe)、异硫氰酸四甲基罗丹明(tetramethyl
‑
rhodamine isothiocyanate,tritc)、花青3(cy3)、花青5(cy5)、花青7(cy7)、alexa fluor染料和罗丹明所组成的组。
54.可以通过免疫诊断测定来执行用于侦测生物材料的方法。可以通过在反应管中将固定有捕获抗体的微颗粒、特异地结合到生物材料的侦测抗体和含有生物材料的样品溶液混合来制备微颗粒、生物材料和侦测探针的复合物。可以通过在反应管中同时诱导生物材料与微颗粒之间的第一免疫反应以及生物材料与侦测抗体之间的第二免疫反应来制备复合物。
55.复合物的形成可以包括在外部磁力的存在下促进反应。例如，可以通过在加热块上将反应管加热到适当的温度并且允许磁棒在反应管中连续上下移动以快速将免疫反应材料混合来促进免疫反应。
56.用于侦测生物材料的方法可以进一步包括在外部磁力存在下清洗复合物。即，所述方法可以进一步包括在第一免疫反应和第二免疫反应完成后，在两个或更多个清洗管中连续清洗微颗粒、生物材料和侦测探针和磁棒的复合物。在前述清洗后，侦测来自复合物的发光信号以精准识别生物材料的类型和数量。
57.可以通过合适的技术例如elisa或荧光测量来侦测发光信号。
58.图4是示出了用于通过elisa(顶)和荧光测量(底)来侦测目标蛋白的抗原
‑
抗体反应的示意图。
59.更具体地，通过将样品中目标材料结合到固定在磁性大颗粒上的捕获抗体并且处理侦测抗体来执行elisa技术。侦测抗体结合到与目标材料其与捕获抗体结合的一侧相反的相反侧。被称为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,hrp)的酶缀合到侦测抗体。所述酶使用过氧化氢降解tmb底物，从而呈现颜色。颜色的色度由od值确定。即，所述方法基于以下原理：大量定量的捕获抗体和侦测抗体成比例地附接到一定数量的样品中的目标物质，其结果为，缀合到侦测抗体的hrp的量增加，使得酶反应相对快速地进行，导致tmb底物颜色的快速改变。样品中目标材料的量可以通过下列步骤确定：先以各种浓度的目标材料处理以获得od值，由前述od值绘制标准曲线，以实际样品处理来获得od值，并且将实际od值与标准曲线比较。此时，可以使用分析仪的自动分析程序来计算所有od值和浓度。
60.荧光测量技术基于与elisa技术相同的原理(捕获抗体和侦测抗体被用于夹心测定)，除了生物素是缀合到侦测抗体而不是hrp酶，并且生物素以与链霉亲和素缀合的荧光材料来测量荧光值。首先，tsh蛋白与捕获抗体反应并附接到捕获抗体，随后以与生物素缀
合的侦测抗体处理，以将侦测抗体附接到与tsh其上附接有捕获抗体的一侧相反的相反侧。此后，在以其作为与链霉亲和素缀合的荧光材料的e
‑
flour处理后，测量来自微颗粒的荧光信号。基于以下原则：目标诊断标志物的浓度越高，会导致来自磁性颗粒的荧光信号越强，以明场显微镜识别反应孔中微颗粒的位置，并以像素为单位测量来自相应位置的荧光信号，并且自动分析来自大约10个微颗粒的荧光信号图像。在与各种浓度的目标物质反应后，以相同的方式测量荧光值，由所测量的荧光值绘制标准曲线，并且将来自测试侦测的荧光值应用到标准曲线以计算最终样品中的相应目标蛋白的浓度。以分析仪的自动分析程序分析所有图像并且计算所有荧光值。图5示出了使用不同tsh浓度的微颗粒的荧光分析结果。在图5中，(a)示出了不同浓度的明场显微镜图像和荧光显微镜图像，(b)是示出了使用10个微颗粒在不同tsh浓度下所测量的荧光值(中)和荧光cv值(％)的表，并且(c)示出了不同的tsh浓度的荧光值。参考图5，荧光强度随着tsh浓度的增加而增加。
61.基于各别步骤，将更具体地描述使用作为微颗粒的微棒来侦测生物材料的方法的一个实施方案。
62.步骤1：微棒的制备和表面处理
63.通过根据由本发明人提交的韩国专利公开第10
‑
2018
‑
0130436号的公开内容制造玻璃涂覆的微丝，并将微丝切割成适当的尺寸，获得作为用于侦测生物材料的微颗粒的微棒。例如，将微丝切割成100至500μm的长度，金属内核的直径为50μm，并且包围内核的玻璃涂层的厚度为5μm。据此，所得的微棒的直径为60μm，长度为100至500μm。
64.能够结合到目标抗原的捕获抗体被结合到微棒。为此目的，微棒的玻璃表面被适当地改性。可以通过以氨基或羧基取代来进行表面改性。为了以氨基取代，可以用si
‑
oh(硅烷醇)对棒体的表面玻璃进行改性。此后，可以通过硅烷化和固化以氨基硅烷对玻璃表面进行改性。
65.捕获抗体可以被固定在以氨基硅烷表面改性的微棒上。优选地，微棒被羧基取代用以与捕获抗体固定。在1.5ml的e
‑
试管中可以处理大约10,000个微棒。为了有效地以羧基取代，使用γ
‑
丁内酯或琥珀酸酐，优选为γ
‑
丁内酯。以下示例提供了更多详细信息。
66.步骤2：制备固定有捕获抗体的微棒复合物
67.将样品溶液中与目标生物标志物抗原特异性结合的捕获抗体固定在表面改性的微棒上(优选为以羧基改性的微棒)以制备微棒复合物。所需的抗体可以非特异地结合到微棒的玻璃涂层。捕获抗体是指特异地结合到样品溶液中的目标抗原的抗体。
68.步骤3：制备免疫反应材料
69.制备特异地结合到样品溶液中的抗原的侦测抗体
‑
荧光材料缀合物。当意图侦测样品溶液中的多种标志物抗原时，使用具有不同形状(例如，不同长度)的微棒。固定在微棒上的捕获抗体特异地结合到样品溶液中的特异性标志物并捕获样品溶液中的特异性标志物。
70.可以使用酶而不是荧光材料。
71.步骤4：滴入样本
72.将含有目标物质(目标)的样品溶液滴入含有微棒复合物的反应管中，微棒复合物固定有特异地结合到作为生物标志物的抗原的捕获抗体，并且侦测抗体
‑
荧光材料缀合物特异地结合到抗原。当作为生物标志物的抗原存在于样品溶液中时，将会诱导与微棒的第
一免疫反应和与侦测抗体的第二免疫反应产生。
73.图5示出了当目标抗原被滴到免疫反应材料上时的反应。具体地，图5示出了用于免疫诊断的捕获抗体结合微棒、样品溶液中的目标抗原和其中磷光体被缀合到侦测抗体的磷光体缀合物的结构和作用原理
74.步骤5：混合/加热
75.将反应管放置在加热块上并加热到适当控制的温度。一般的免疫反应在大约35℃下主动发生。当磁棒在反应管中连续上下移动时，免疫反应材料被快速混合。此混合缩短了免疫反应时间。
76.图6示出了与磁棒混合并以加热块加热以促进免疫反应的过程。
77.步骤6：清洗
78.在反应完成后，在两个或更多个的清洗管中相继地清洗微棒和磁棒，并将反应溶液稀释至适当浓度。所述清洗除去非特异性材料并且能够清洗/回收微棒。
79.图7示出了清洗微棒和磁棒以除去非特异性材料的过程。
80.步骤7：侦测信号的测量
81.在反应完成后，通过图像分析执行代码识别以测量侦测信号。能够仅以一种荧光材料进行多重侦测。可以通过侦测来自缀合到侦测抗体的荧光材料的荧光信号来测量侦测信号。当酶结合到侦测抗体时，可以通过侦测由酶
‑
底物反应呈现的颜色来测量侦测信号，如同在elisa技术中一样。执行上述所有步骤需要大约30分钟，侦测极限大约是数pg/ml至10,000pg/ml。
82.所述方法旨在使用两种或更多种类型的微颗粒对两种或更多种类型的生物材料进行多重侦测。可以用诸如长度、直径、厚度、形状、颜色或识别代码的不同代码来标记微颗粒，以便区分彼此。多重侦测可以包括读取由不同代码标记的微颗粒。例如，样品溶液可以含有多个抗原，并且微颗粒可以具有多种形状，其数量与抗原的数量相应。在此情况下，将特异地结合到存在于样品溶液中的特异性目标抗原并且捕获存在于样品溶液中的特异性目标抗原的抗体固定在具有不同形状的微颗粒上。这使得能够同时侦测多个目标。例如，具有不同长度的微棒可以用作用于多重侦测的微颗粒。
83.优选为以自动方式执行加热块的温度控制、微颗粒
‑
生物材料
‑
侦测探针复合物的混合和清洗以及磁棒的清洗。受控制的反应时间和温度允许免疫反应充分发生，结果为可以最大化复合物的形成速率，实现高度灵敏的分析。
84.使用微颗粒的生物测定具有以下优点。使用包括其表面非常均匀的壳层的微颗粒可以防止目标的非特异性结合，实现低噪声和最大的信号放大。另外，磁力可以大程度作用在尺寸为数十至数百微米的微颗粒，而不是纳米级的微颗粒。微颗粒趋向聚集而不悬浮在水溶液中，并且从而可以容易地被磁力控制。
85.此外，在使用微颗粒的生物测定期间，可以通过与磁棒混合并以加热块加热来促进免疫反应，促使反应时间显著缩短。可以将微颗粒从磁棒快速分离，然后可以清洗微颗粒和磁棒。从而可以以与elisa的精准度相当的精准度侦测目标，并且可以将测试时间缩短到少于30分钟。
86.特别地，可以大规模制造微颗粒，并且可以在三个维度上发射强荧光。另外，可以容易地制造具有各种长度、形状或颜色以便区分彼此的微颗粒，从而适合用于多重侦测。例
如，当将通过切割玻璃涂覆的微丝成不同长度来制造的微棒被用作微颗粒时，能够仅以一种荧光材料进行多重侦测。当通过图像分析对编码有长度信息的微颗粒进行分析时，能够在一个时间点进行多次侦测，同时保持高灵敏度。
87.由于其中存在金属内核，当在明场显微镜下观察时，微颗粒显得非常暗，并且颗粒与背景之间的对比度很明显，使得可以清楚地在颗粒中区分彼此。由于微颗粒的大尺寸，使得可以通过荧光成像清楚地观察到微颗粒。由于微颗粒的尺寸比常规生物测定中使用的颗粒的尺寸大数十到数百微米，因此可以用低倍率的透镜，例如1x的放大倍率，观察一个孔中的微颗粒。因此，可以在非常大的面积上观察到微颗粒，使得能够进行快速分析。另外，由于微颗粒的焦距很大，因此微颗粒对成像所需的z轴平台的误差较不灵敏，这有利于图像聚焦。
88.参考以下示例将更具体地解释本公开。对于本领域技术人员将显而易见的是，这些示例仅用于说明性目的，并且本公开的范围不应解释为受限于此。
89.[示例]
[0090]
示例1.微棒的制备
[0091]
由通过韩国专利公开第10
‑
2018
‑
0130436号中描述的方法制造的玻璃涂覆微丝制备微棒。首先，将微丝切割成100
‑
500μm的尺寸。每个微棒具有磁性金属内核和包围内核的玻璃涂层。磁性金属内核的直径为50μm，并且玻璃涂层的厚度为5μm。即，微棒的外径为60μm，长度为100～500μm。
[0092]
示例2.微棒的表面处理
[0093]
微棒的玻璃表面被适当地改性。通过以氨基或羧基取代来执行表面改性。
[0094]2‑
1.以氨基硅烷改性
[0095]
首先，将氨基结合到微棒的玻璃表面用以进行表面处理。具体地，通过依次以诸如乙醇和丙酮的有机溶剂、含有10％naoh的碱性溶液和食人鱼溶液清洗，以硅烷醇(si
‑
oh)对微棒的表面玻璃进行改性。通过使用作为溶剂的丙酮或甲苯和作为溶质的3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)进行硅烷化作用，再次以氨基硅烷对玻璃表面进行改性，随后进行固化。
[0096]
最后，以异硫氰酸荧光素异构体(fitc)涂覆氨基硅烷，并测量荧光以确定氨基硅烷改性的均匀性和程度。图8是示出了对微棒的表面进行氨基硅烷化并通过fitc确认氨基硅烷化的结果的实验的示意图。
[0097]2‑
2.以羧基取代
[0098]
其表面被氨基硅烷化的微棒的氨基被cooh取代。cooh取代的微棒被称为羧基珠。可以在1.5ml的e
‑
试管中处理10,000个微棒(500
×
75μm)。以下两种方法被用于cooh的取代。
[0099]2‑2‑
1.γ
‑
丁内酯的使用
[0100]
此方法被认定比其他方法(2
‑2‑
2)更有效。具体地，使用以下材料：胺microdisk、(无胺)二甲基甲酰胺(dmf)、γ
‑
丁内酯：dmf(60μl：1ml)、三乙胺(tea)、超纯去离子水(deionized water,dw)。
[0101]
此方法通过以下流程执行：
[0102]
1.以99％乙醇将微棒清洗2
‑
3次。
[0103]
2.在95℃下烘烤≥5分钟以完全除去乙醇。
[0104]
3.以dmf清洗一次。
[0105]
4.在15ml的试管中混合γ
‑
丁内酯和dmf(60μl：1ml)。
[0106]
5.将以下组分加入到试管中：
[0107]
γ
‑
丁内酯：dmf(60μl：1ml)100μl
[0108]
三乙胺(tea)8μl；
[0109]
dmf(游离态)500μl；
[0110]
总共608μl
[0111]
6.在室温下反应2小时，同时将试管上下翻转(或以900rpm摇晃2小时)。
[0112]
7.以1)dmf(1ml，2x)、2)乙醇(1ml，2x)和3)dw(1ml，2x)的顺序清洗。
[0113]
8.重复步骤3
‑
7一次。
[0114]
9.除去dw并在4℃下保存在mes缓冲液(0.1m mes ph 5.0，thermo fisher scientific，28390)或pbs缓冲液中(mes缓冲液被认定为能更有效地将抗体固定在微棒上)。
[0115]2‑2‑
2.琥珀酸酐的使用
[0116]
使用以下材料：胺microdisk、(无胺)二甲基甲酰胺(dmf)、琥珀酸酐、三乙胺(tea)和超纯水(dw)。
[0117]
1.以99％乙醇将微棒清洗2
‑
3次。
[0118]
2.在95℃下烘烤≥5分钟以完全除去乙醇。
[0119]
3.以dmf清洗一次。
[0120]
4.将以下组分加入试管中：
[0121]
琥珀酸酐(sa)0.12g/ml(溶于dmf)100μl
[0122]
三乙胺(tea)16μl
[0123]
dmf(游离态)600μl
[0124]
总共716μl
[0125]
5.在室温下反应2小时，同时将试管上下翻转(或以900rpm摇晃2小时)。
[0126]
6.以1)dmf(1ml，2x)、2)乙醇(1ml，2x)和3)dw(1ml，2x)的顺序清洗。
[0127]
7.重复步骤3
‑
6一次。
[0128]
8.除去dw并在4℃下保存在mes缓冲液(0.1m mes ph 5.0，thermo fisher scientific，28390)或pbs缓冲液中(mes缓冲液被认定为能更有效地将抗体固定在微棒上)。
[0129]
示例3.捕获抗体的固定和捕获抗体的固定程度的确定
[0130]3‑
1.
‑
cooh活化
[0131]
1.少于20,000个微棒(～12,000)被转移到新的e
‑
试管中。
[0132]
2.在使用磁棒将微棒放置在壁的一侧后，以500μl的mes缓冲液(ph 5.0)清洗微棒一次。在此，优选为同时执行涡旋和离心。
[0133]
3.将表1中所示的组份(总共200μl)加入1.5ml的e
‑
试管中。
[0134]
[表1]
[0135][0136]
4.在室温下将e
‑
试管缓慢摇晃30分钟(在旋转机器中以30rpm摇晃)。
[0137]
5.在使用磁棒将微棒放在壁的一侧后，以500μl的mes缓冲液清洗微棒两次。在此，优选为同时执行涡旋和离心。
[0138]3‑
2.捕获抗体的固定
[0139]
1.在清洗完成后，从e
‑
试管中完全除去mes缓冲液。
[0140]
2.加入300μl的mes缓冲液和10μg的cab，随后在室温下缓慢摇晃2小时(在旋转机器中以30rpm摇晃)。
[0141]
3.在使用磁棒将微棒放在壁的一侧后，以0.1％的bsa/pbs(具有0.1％的tween20、0.05％的迭氮化钠)(每次500μl)清洗微棒两次。在此，优选为同时执行涡旋和离心。
[0142]3‑
3.封闭
[0143]
1.在清洗完成后，从e
‑
试管中完全除去0.1％的bsa/pbs(具有0.1％的tween20、0.05％的迭氮化钠)。
[0144]
2.加入500μl的1％bsa/pbs(具有0.1％的tween20、0.05％的迭氮化钠)，随后在室温下缓慢摇晃1小时(在旋转机器中以30rpm摇晃)。
[0145]
3.在使用磁棒将微棒放在壁的一侧后，以0.1％的bsa/pbs缓冲液(每次500μl)清洗微棒两次。在此，优选为同时执行涡旋和离心。
[0146]
※
加入300μl的1％bsa/pbs(具有0.1％的tween20、0.05％的迭氮化钠)并在4℃下保存。
[0147]3‑
4.侦测抗体的结合和识别
[0148]
1.在封闭后，将微棒放在两个新的1.5ml的e
‑
试管中(每个～120个微棒)，抛弃上清液。
[0149]
2.加入100μl的0.1％bsa/pbs缓冲液，充分混合微棒，并完全除去0.1％的bsa/pbs缓冲液。
[0150]
3.使用0.1％的bsa/pbs缓冲液制备总共1ml的2μg/ml的生物素缀合的侦测抗体。
[0151]
4.将100μl的侦测抗体
‑
标志物溶液加入已在步骤2中除去0.1％的bsa/pbs缓冲液的两个试管中的每一个中，随后在室温下缓慢摇晃1小时(在旋转机器中以30rpm摇晃)。
[0152]
5.在使用磁棒将微棒放在壁的一侧后，以0.1％的bsa/pbs溶液(每次300μl)清洗
微棒两次。
[0153]
6.以0.1％的bsa/pbs缓冲液将e
‑
fluor磷光体的浓度调整到2μg/ml，将100μl的e
‑
fluor磷光体溶液加入每个试管中，随后缓慢摇晃30分钟。
[0154]
7.在以300μl的0.1％bsa/pbs缓冲液清洗两次后，仅将每孔～20个微棒放在条带中。
[0155]
8.在测量设备中以51的亮度和
‑
1的曝光度测量条带。通过荧光测量以便确定抗体是否很好地被放到磁珠上。
[0156]
图9示出了固定在微棒上的抗体的均匀性和密度(数量)。具体地，图9示出了在将侦测抗体
‑
磷光体缀合物结合到其中捕获抗体被固定在微棒表面上的微棒复合物之后的明场显微镜图像(左)和荧光显微镜图像(右)。
[0157]
由示例1
‑
3中获得的结果得出结论，由于所促进的反应和以高精准度进行的多重侦测，因此使用本发明的微棒能够快速测试。
[0158]
从而本发明的微棒被用于测试以下类型的抗原。
[0159]
实验例1.甲状腺刺激激素的测试
[0160]1‑
1.确认甲状腺刺激激素(tsh)抗体在磁性颗粒上的表面固定
[0161]
甲状腺刺激激素抗体购自aviva(capture(cat.no.02927))并且被用于tsh侦测。依据示例1
‑
3的流程，将抗体固定在2,500个磁性颗粒上，并且识别被固定的抗体(quality control，qc)。磁性颗粒的平均荧光值为84/140，如同使用nikon荧光显微镜所测量到的(透镜放大倍率：4x，曝光值：200ms，增益值：5.1和11.4)，这表示免疫反应所需要的一定量抗体已经被固定。磁性颗粒之间的标准偏差低至10/11，这表示抗体已经被均匀固定在颗粒上。
[0162]
图10示出了在将tsh抗体固定在磁性颗粒表面上之后所拍摄的明场显微镜图像和荧光显微镜图像。
[0163]1‑
2.不同浓度的甲状腺刺激激素(tsh)的反应
[0164]
以无tsh血清(biospacific,ca.p11000)将tsh((lee biosolution,cat.no.996
‑
51)蛋白稀释至0、0.1、0.5、1、2.5、5、10和20μiu/ml的浓度。制备浓度已知的c1(1μiu/ml)和c2(10μiu/ml)作为对照。
[0165]
将固定抗体磁性颗粒加入e
‑
试管中的500μl的tsh血清溶液中，于室温中在摇床上以30rpm搅拌并孵育1小时，并且以500μl的清洗溶液(含有0.1％的tween20、0.05％的迭氮化钠的0.1％bsa/pbs缓冲液)清洗两次。将2μg/ml的缀合有生物素的tsh二抗(aviva，ca00724)加入反应溶液(0.1％的bsa/pbs缓冲液)中，在室温下以200rpm搅拌并孵育1小时，并且如上述清洗两次。最后，将作为荧光溶液的500μl的2μg/ml的sape thermofisher scientific.cat.no s866)放入已反应的磁性颗粒中，并在室温下以200rpm搅拌30分钟，用于与二抗缀合的生物素与sape的萤光反应。此后，使用荧光显微镜拍摄明场显微镜图像和荧光显微镜图像，以获得不同浓度的磁性颗粒的荧光值，并由此计算tsh浓度。
[0166]
基于目标诊断标志物的较高浓度会导致来自磁性颗粒的较强荧光信号的原则，识别反应孔中磁性大颗粒的位置，同时以像素为单位测量来自相应位置的明场显微镜和荧光信号。所测量的荧光信号被平均。计算30个或更多个磁性颗粒的平均值，并且获得30个磁珠的荧光值的中间值。使不同浓度的目标材料反应。以与上述相同的方式测量荧光值。由所测量的荧光值绘制标准曲线。将来自测试侦测的荧光值应用到标准曲线以计算最终样品中的
相应目标蛋白的侦测浓度。在此，使用相关趋势线计算浓度，使用荧光强度和tsh浓度绘制相关趋势线。分析所有图像，并使用分析仪的自动图像分析程序计算荧光值。结果为，可以基于所开发的磁珠的性能通过荧光测量来定量0
‑
20μiu/ml的tsh，并且可以将0
‑
20μiu/ml的tsh与c1/c2中已知浓度的tsh进行比较。图11示出了在不同tsh浓度下的荧光强度。
[0167]
图11中示出的实验数据揭露，实验浓度与荧光强度高度相关(r2：0.9979)，并且在0.1μiu/ml的tsh下的荧光值与在0μiu/ml的tsh下的荧光值不同。使用磁性颗粒的tsh实验结果得出结论，侦测极限(limit of detection,lod)为0.1μiu/ml。
[0168]
考虑到正常tsh浓度范围是0.5
‑
5.0μiu/ml，在此浓度下获得的合理实验数据增加了磁性颗粒商业化成功的可能性。作为参考，将tsh水平低于0.5μiu/ml的受试者诊断为tsh缺乏，将tsh水平高于5μiu/ml的受试者诊断为tsh过量。
[0169]
使用磁珠系统测试含有tsh的外部血清对照c1(1μiu/ml)和c2(10μiu/ml)。结果为，计算出c1和c2的tsh浓度分别为1.07μiu/ml和10.89μiu/ml，证实精准侦测了血清tsh水平。
[0170]
实验例2.人γ
‑
干扰素
[0171]2‑
1.确认人γ干扰素抗体在磁性颗粒上的表面固定
[0172]
人γ
‑
干扰素抗体购自thermofisher scientific(cat.no.m700a)并且被用于人γ
‑
干扰素侦测。依据示例1
‑
3的流程，将抗体固定在2,500个磁性颗粒上，并且识别被固定的抗体(quality control，qc)。磁性颗粒的平均荧光值为82.33/145.18，如同使用nikon荧光显微镜所测量到的(透镜放大倍率：4x，曝光值：200ms，增益值：5.1和11.4)，这表示免疫反应所需要的一定量抗体已经被固定。磁性颗粒之间的标准偏差低至9.50/10.11，这表示抗体已经被均匀固定在颗粒上。
[0173]
图12示出了在将人γ
‑
干扰素抗体固定在磁性颗粒表面上之后所拍摄的明场显微镜图像和荧光显微镜图像。
[0174]2‑
2.人γ干扰素的反应
[0175]
以含有0.1％tween20的0.1％bsa/pbs缓冲液将人ifn
‑
γ(thermofisher scientific/cat.no.rifng100)蛋白稀释至0、10、25、50、100、500和1000pg/ml的浓度。
[0176]
将固定抗体磁性颗粒加入e
‑
试管中的500μl的人ifn
‑
γtsh溶液中，于室温中在摇床上以30rpm搅拌并孵育1小时，并且以500μl的清洗溶液(含有0.1％的tween20、0.05％的迭氮化钠的0.1％bsa/pbs缓冲液)清洗两次。将2μg/ml的缀合有生物素的tsh二抗(aviva，ca00724)加入反应溶液(0.1％的bsa/pbs缓冲液)中，在室温下以200rpm搅拌并孵育1小时，并且如上述清洗两次。最后，将作为荧光溶液的500μl的2μg/ml的sape thermofisher scientific.cat.no s866)放入已反应的磁性颗粒中，并在室温下以200rpm搅拌30分钟，用于与二抗缀合的生物素与sape的萤光反应。此后，使用荧光显微镜拍摄明场显微镜图像和荧光显微镜图像，以获得不同浓度的磁性颗粒的荧光值，并由此计算tsh浓度。
[0177]
基于目标诊断标志物的较高浓度会导致来自磁性颗粒的较强荧光信号的原则，识别反应孔中磁性大颗粒的位置，同时以像素为单位测量来自相应位置的明场显微镜和荧光信号。所测量的荧光信号被平均。在那时，荧光成像条件为1
×
透镜/曝光时间：200ms/增益值：31。计算30个或更多个磁性颗粒的平均值，并且获得30个磁珠的荧光值的中间值。使不同浓度的目标材料反应。以与上述相同的方式测量荧光值。由所测量的荧光值绘制标准曲
线。将来自测试侦测的荧光值应用到标准曲线以计算最终样品中的相应目标蛋白的侦测浓度。在此，使用相关趋势线计算浓度，使用荧光强度和tsh浓度绘制相关趋势线。分析所有图像，并使用分析仪的自动图像分析程序计算荧光值。结果为，可以基于所开发的磁珠的性能通过荧光测量来定量0
‑
1000pg/ml的人γ
‑
干扰素。图13示出了在不同γ
‑
干扰素浓度下的明场显微镜图像和荧光显微镜图像，其是以1
×
透镜持续200ms的曝光时间所拍摄的，并且图13示出了所测量的荧光强度。
[0178]
图13中示出的实验数据揭露，实验浓度与荧光强度高度相关(r2：0.9934)。从这些结果，可以相信动态范围为3
‑
5logs或更大，证实在大多数浓度下可以实现精确的免疫诊断。
[0179]
另外，在10pg/ml的人γ
‑
干扰素下的荧光值与在0pg/ml的人γ
‑
干扰素下的荧光值不同。使用磁性颗粒的人γ
‑
干扰素实验结果得出结论，侦测极限(lod)为10pg/ml或更小。
[0180]2‑
3.人类γ干扰素的侦测极限(lod)
[0181]
考虑到实验例2
‑
2的结果，针对人γ
‑
干扰素的磁性颗粒的侦测极限(lod)为10pg/ml或更小，在低浓度(0、0.625、1.25和2.5pg/ml)的人γ
‑
干扰素下进行了lod测试。重复实验例2
‑
2的流程，除了将曝光时间从200ms改变为300ms以侦测荧光值。图14示出了以1
×
透镜持续300ms的曝光时间所拍摄的明场显微镜图像和荧光显微镜图像，并且图14示出了所测量的荧光强度。
[0182]
参考图14，人γ
‑
干扰素的r2值为0.9958，即使在0
‑
2.5pg/ml的低浓度范围中也观察到高相关值，并且在0pg/ml的人γ
‑
干扰素下的荧光值与在0.625pg/ml的人γ干扰素下的荧光值不同。使用磁性颗粒的人γ
‑
干扰素实验结果得出结论，侦测极限(lod)为0.625pg/ml，这被认为是优于使用磁性颗粒的一般免疫诊断系统的灵敏度(lod 20pg/ml)大约40倍。
[0183]2‑
4.多重免疫诊断
[0184]
由于多重免疫诊断可以在一个时间点测量许多标志物，因此具有时间短、成本低和高诊断精准度的优点(multiplex immunoassays utilizing differential affinity using aptamers generated by maras(2017),7:6397)。可以将本发明的磁性颗粒制成具不同长度(200μm、300μm和400μm)，并且从而可以被用于多重免疫诊断。将具有三种不同长度的磁性颗粒固定在三种不同类型的细胞因子上，以测试多重免疫诊断是否可能。将200μm长的磁性颗粒用于tnfα免疫诊断(重组人tnfα，thermofisher scientific,cat.no.rtnfai/捕获抗体:ebioscience,cat.no.14
‑
7348
‑
81//侦测抗体:与生物素缀合,ebioscience,cat.no.13
‑
7349
‑
81)，将300μm长的磁性颗粒用于ifn
‑
γ免疫诊断(如实验例2
‑
2)，将400μm长的磁性颗粒用于il
‑
10免疫诊断(重组人il
‑
10，thermofisher scientific,cat no.ril1025/捕获抗体:thermofisher scientific,cat.no.m010/侦测抗体:thermofisher scientific,cat.no.m011b)。重复与针对人γ
‑
干扰素的实验例2
‑
2相同的程序。在仅加入一种类型的ifn
‑
γ或il
‑
10细胞因子后，进行测试以确定磁性颗粒是否被固定并与所加入的细胞因子反应。结果为，只有300μm长的磁性颗粒与ifn
‑
γ(50pg/ml，500pg/ml)反应而给出浓度依赖信号。只有400μm长的磁性颗粒与il
‑
10(50pg/ml，500pg/ml)反应而给出浓度依赖信号。图15示出了实验结果，以确认固定在磁性颗粒上的ifn
‑
γ和
il
‑
10细胞因子是否可以被用于多重免疫诊断。
[0185]
结论为，使用磁性颗粒的免疫诊断系统适用于多重诊断。