1.本公开涉及病毒疫苗制造的领域，更具体地，涉及减毒活流感疫苗组合物和制备其的方法。本公开涉及用于生产通过细胞培养产生的病毒或病毒抗原的方法、通过该方法获得的病毒或病毒抗原以及包含这种病毒或病毒抗原的疫苗。
背景技术：
：：2.下面本文的背景信息与本公开有关，但不一定是现有技术。3.由传染性病原体引起的流行病和大流行病已经发生了几个世纪，造成重大破坏，发病率和死亡率各不相同。流感病毒已经成为大流行历史的主要参与者之一。上个世纪发生了四次流感大流行，并且迄今为止至少记录了15次流感大流行，估计仅在1918至1919年就有5000万人死亡。4.疫苗在病毒传播的控制中发挥重要的作用，并且灭活流感疫苗(iiv)以及减毒活流感疫苗(laiv)已使用了许多年。当循环毒株与疫苗抗原性地匹配时，广泛使用的肠胃外施用的灭活流感疫苗诱导血清抗体反应，有效预防流感疾病。相比之下，减毒活流感疫苗(laiv)是鼻内给药，模仿自然感染，诱导局部和全身体液和细胞免疫反应，为匹配的毒株以及漂移的毒株提供保护。另外，laiv的无针施加可降低接受门槛，并且从而提高流感疫苗的覆盖率。5.迄今为止，laiv已在美国(自从2003年)、欧洲(自从2010年)、俄罗斯(自从1980年代)和印度(自从2010年)获得许可。laiv基于20世纪60年代美国和俄罗斯独立但以基本相同的方式开发的减毒甲型流感和乙型流感主供体病毒(mdv)。med免疫季节性和流行性laiv病毒目前是通过反向遗传学(rg)产生的。相比之下，俄罗斯laiv是通过在鸡胚中传统的基因重组产生的。俄罗斯laiv最近正在中国和泰国注册使用。6.俄罗斯laiv由重组病毒组成，重组病毒在来自(mdv)的剩余6个内部蛋白基因(pb1、pb2、pa、np、m和ns)的骨架上含有来自感兴趣的循环野生型(wt)病毒的血凝素(ha)基因区段和大多数情况下神经氨酸酶(na)基因区段。a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)(len‑mdv)和b/ussr/60/69mdv目前在俄罗斯用作laiv的mdv。mdv在多个基因区段中含有突变，使得它们为为冷适应的(ca)、温度敏感的(ts)并且减毒的(att)。当代毒株的表面糖蛋白血凝素(ha)和神经氨酸苷酶(na)通过重排并入这些mdv中。它们的ca、ts和att表型指示laiv在低温下复制，并且在较高温度(>38℃)下停止复制，限制了对上呼吸道的复制。与在美国使用的mdv相比，俄罗斯mdv含有更少的在基因区段的不同位点存在的突变，提示它们可被不同地减毒。在动物和人中的直接比较提示俄罗斯mdv和其衍生的单个毒株重排体比等效物更具免疫原性。7.多年来，俄罗斯laiv已被安全施用至7500多万人，并且已经证明在减毒(遗传稳定性)和传播方面是安全的。毒性的逆转(减毒表型的丢失)从未被观察到，并且极不可能发生，因为它需要在多个基因区段中的多个突变的逆转。俄罗斯laiv病毒的神经毒性从未被报道过，并且mdv和其衍生的重排体二者都显示不具有神经毒性特性。在施用laiv之后，除了在少数病例中报告的自限性流感样症状(流鼻涕、鼻塞、喉咙痛、咳嗽、头痛和低烧)外，没有与免疫相关的严重不良事件的报告。除了安全外，laiv已经显示在预防流感病毒感染引起的疾病方面是有效的。laiv诱导的免疫是广泛的，并且已经显示针对漂移毒株的保护。特别是在儿童中，laiv在临床保护和/或对培养确认的流感的保护方面比灭活流感疫苗更有效，也已经显示具有群体免疫作用。8.与灭活流感疫苗一样，俄罗斯laiv使用鸡胚生产，其自身固有的缺点限制了疫苗质量供应商，并且不含特定病原体的蛋需要提前至少4个月提前订购，然后这些蛋才能用于大规模疫苗生产。蛋孵育、收获等的专业设施又限制了快速扩大规模的能力。生产依赖蛋的疫苗所需的时间延长，可能导致用于应对大流行情况(例如2009年发生的情况)或阻止源自高致病性流感病毒的大流行的可用剂量太少。因此，目前的疫苗生产系统不足以应对流感大流行，为此需要一种新型的快速应急疫苗生产工艺。从理论上讲，在细胞培养中生产流感疫苗在大流行的情况下提供了重要的优势。使用其他病毒疫苗的预先存在的组织培养制造单位可以轻松实现疫苗的大规模生产。9.控制底物一致性和生产灵活性的可用性，快速扩大规模，这在大流行的情况下尤为重要，不依赖蛋供应和鸡群的维护是组织培养方法的主要优点。蛋壳是多孔结构，蛋外面不是无菌的。在蛋中培养流感病毒的制造过程需要刺破蛋壳进行接种和开放式处理以进行收获，这具有固有的污染风险。此外，细胞培养是一个更受控制的系统，具有确定的细胞培养基和符合良好生产规范(gmp)的经过验证的细胞库，因此，已经尝试将生产从蛋转移到细胞培养。10.目前正在研究几种细胞系，以用于基于细胞培养生产流感病毒，并且已经报道了mrc‑5细胞(参考：deona等(1995)jclinmicrobiol33：1948‑49)、hepg2细胞(参考：ollier等(2004)jclinmicrobiol42(12):5861‑5)、llc‑mk2细胞(参考：schepetiuk和kok(1993)jvirolmethods42(2‑3):241‑50)、马丁达比狗肾(mdck)细胞(参考：tobita等(1975)medmicrobiolimmunol(berl).162(1):9‑14和23‑27)、非洲绿猴vero细胞(参考：monto等(1981)jclinmicrobiol13(1)：233‑235和govorkova等(1995)jinfectdis.172(1):250‑3)和per.c6细胞(参考：cox，r.j.等；vaccine2009，27，1889‑1897)的使用。以前，对于mrc‑5、wi‑38和frhl细胞，已经报道了具有等于或低于5.0log10tcid50/ml的低等至中等滴度的病毒，而对于mdck细胞，已经报道了高达6.7log10tcid50/ml的病毒滴度。尽管细胞培养衍生的流感疫苗(适应/优化细胞培养生长的蛋分离流感病毒)在欧洲(optaflunovartis；2007)和美国(flucelvaxnovartis；2012)获得了许可，但是市场上只有很小一部分流感疫苗是细胞培养衍生的。这可能是由于使用细胞培养生产系统结合常规的纯化方法和繁琐的稳定实践，流感疫苗的产量不一致。与使用连续细胞系(如mdck细胞)相关的理论上的安全性问题已被提出，这与它们在疫苗生产中的使用有关(vrbpac，2008)。这些问题主要与疫苗药物产品中残留的细胞组分(dna和蛋白质)有关，尤其是与传统的灭活流感疫苗一样既没有灭活也没有经过广泛生化纯化的减毒活流感疫苗(laiv)产品疫苗。已经采取两种策略来将这些风险最小化：细胞系表征和疫苗纯化处理步骤。纯化过程的一个特定方面是减少疫苗产品中残留宿主细胞dna的数量和大小。optaflunovartis(2007)的制造包括消除残留宿主细胞dna的多个步骤。这些包括结合流感病毒并且允许dna通过的硫酸纤维素离子交换色谱和随后的ctab沉淀步骤，尤其是沉淀dna。11.先前报道的纯化过程成本高并且耗时，因为它们采用一种或多种来自羟基磷灰石、亲和、阴离子交换和尺寸排阻的色谱法。据报道，对于使用色谱方法进行的常规疫苗生产而言，病毒的总体回收率并不理想。此外，由于在该病毒中观察到的抗原漂移(antigenicdrift)和抗原漂变(antigenicshift)，循环流感病毒会发生病毒颗粒的抗原特性的变化。这些变化影响病毒的理化特性，并且进而影响病毒与色谱基质的结合能力。这可导致漂移或漂变毒株的产率出现高度变化，从而使色谱法不适用于常规生产。另一种方法用于去除/减少宿主细胞dna。12.使用更高浓度的苯甲酸酶(例如50u/ml、100u/ml)，其是昂贵的。13.药物制剂中使用的典型非离子表面活性剂包括tritontmx‑100、f‑68、f‑88和f‑127(泊洛沙姆)、brij35(聚氧乙烯烷基醚)、聚氧乙烯硬脂酸酯40、35(聚氧乙烯烷基醚)、聚氧乙烯硬脂酸酯40、el和α‑生育酚tpgs。这些表面活性剂中的每一种都有一个共同的事实，即它们都含有聚氧乙烯部分，并且因此或多或少地表现出类似的问题，即聚氧乙烯部分会自动氧化产生反应性过氧化物，这会导致不需要的蛋白质免疫原性增加(参见edwardt.maggio等；polysorbates，peroxides，proteinaggregation，immunogenicity‑agrowingconcern；journalofexcipientsandfoodchemicals3(2):46‑53；2012)。14.各种稳定剂用于稳定疫苗制剂以实现期望的保质期。稳定剂，比如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、海藻糖和山梨糖醇也用于病毒制剂。然而，据报道，pvp破坏减毒活病毒制剂的稳定性。(参考：jawhite等；developmentofastableliquidformulationofliveattenuatedinfluenzavaccine；vaccinevolume34，issue32，12july2016，pages3676‑3683；2016)。15.海藻糖成本高；它必须与其他糖类和蛋白质添加剂(明胶)结合才能达到稳定性。而且，其他稳定剂在提高冻干疫苗的保质期稳定性方面优于海藻糖。16.山梨糖醇的玻璃化转变温度(tg)(‑1.6℃)较低，因此不能用作主要配方组分。山梨糖醇的低tg限制了其使用。山梨糖醇必须与其他糖类和蛋白质添加剂(明胶)结合才能实现稳定性。17.有人建议，对于疫苗给药途径，应考虑宿主残留dna对产品安全性的理论影响，因为组织分布和清除率可基于施用方式而不同。研究表明，mdckdna从组织中的吸收和清除取决于施用途径而不同。与肌肉注射相比，鼻内施用dna时，可检测的dna水平在所有时间点均较低。因此，疫苗的鼻内施用途径似乎降低与细胞培养生产的最终疫苗产品中可能存在的残留宿主细胞dna相关的潜在风险。(参考：d.e.tabor等；biologicals41(2013)247‑253)。18.本公开的目的是克服上述限制，并且同样提供用于制造基于鼻内递送的流感病毒减毒活疫苗(laiv)的mdck(马丁达比狗肾)细胞的组合物和方法，以预防流感病毒。本公开进一步提供了改进的制造方法，该方法利用低浓度的核酸内切酶，更具体地是苯甲酸酶，并且没有适合大规模细胞培养生产的色谱步骤。更进一步，本公开提供了不含聚合物和表面活性剂的laiv制剂，其包括一种或多种减毒活流感疫苗病毒。技术实现要素：19.本公开提供基于mdck细胞的鼻内递送减毒活流感疫苗(laiv)组合物，其包括：20.a)一种或多种减毒活流感疫苗病毒；21.其中，减毒活流感疫苗毒株是通过重排的“典型”或“反向遗传学”方法衍生的，基本上由来自野生型大流行性或季节性流感病毒的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因以及表达pb1、pb2、pa、np、m和ns蛋白的基因组成，并且在某些情况下，na蛋白衍生自主供体病毒(mdv)a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)和/或b/ussr/60/69毒株，22.b)一种或多种氨基酸，23.c)一种或多种碳水化合物，和24.d)明胶。25.本公开进一步提供了用于制造这种疫苗组合物/制剂的方法。26.目的27.本文的至少一种实施方式满足的本公开的一些目的如下：28.本公开的目的是缓解现有技术的一个或多个问题或至少提供一种有用的可选方案。29.本公开的另一目的是提供疫苗组合物和制造可鼻内递送的减毒活流感疫苗(laiv)的方法。30.本公开的又一目的是提供基于马丁达比狗肾(mdck)细胞的减毒活流感疫苗(laiv)组合物，其中完全避免使用蛋。31.本公开的又一目的是提供包括一种或多种减毒活流感疫苗病毒并且不含聚合物和表面活性剂的laiv组合物。32.本公开的又一目的是提供包括一种或多种减毒活流感疫苗病毒的laiv组合物，其中laiv毒株基于主供体病毒(mdv)的冷适应、温度敏感和减毒的表型，所述主供体病毒(mdv)包含一个或两个野生型大流行性或季节性流感毒株的表面糖蛋白。33.本公开的又一目的是提供基于mdck细胞的鼻内递送的减毒活流感疫苗(laiv)组合物，其中组合物保留了病毒的期望特征，包括免疫原性和稳定性。34.本公开的又一目的是提供基于mdck细胞的鼻内递送的减毒活流感疫苗(laiv)组合物/制剂，其适用于治疗或预防流感病毒感染，或预防、缓解或延迟其临床表现的发作或进展。35.本公开的又一目的是在基于mdck细胞的减毒活流感疫苗生产领域中提供适于大规模细胞培养生产的改进方法。36.本公开的其他目的和优点将在不旨在限制本公开的范围的以下描述中更显而易见。附图说明37.现在将在以下所列出的附图的帮助下描述本公开：38.图1阐释了野生型大流行性或季节性流感病毒和减毒mdv的重排产生重排疫苗毒株的示意图，其中(a)代表野生型病毒传染性病原体，(b)代表包括温度敏感(ts)、冷适应(ca)和减毒(at)表型基因区段的主供体病毒，并且(c)代表重排疫苗毒株。39.图2：图表阐释了甲型流感毒株(a/17/土耳其/土耳其/05/133‑a/h5n2)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3b中公开的稳定剂组合物1在37℃下的稳定性。40.图3：图表阐释了甲型流感毒株(a/17/土耳其/土耳其/05/133‑a/h5n2和a/17/安徽/2013/61‑a/h7n9)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3a中公开的稳定剂组合物1在2℃至8℃下的稳定性。41.图4：图表阐释了甲型流感毒株(a/17/加利福尼亚/2009/38‑a/h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3b中公开的稳定剂组合物3在37℃下的稳定性。42.图5：图表阐释了甲型流感毒株(a/17/加利福尼亚/2009/38‑a/h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3a中公开的稳定剂组合物3在2℃至8℃下的稳定性。43.图6：图表阐释了甲型流感毒株(a/17/加利福尼亚/2009/38‑a/h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3b中公开的稳定剂组合物4在37℃下的稳定性。44.图7：图表阐释了甲型流感毒株(a/17/加利福尼亚/2009/38‑a/h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3a中公开的稳定剂组合物4在2℃至8℃下的稳定性。45.图8：图表阐释了甲型流感毒株(a/南非/3626/13‑h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3b中公开的稳定剂组合物2在37℃下的稳定性。46.图9：图表阐释了甲型流感毒株(a/南非/3626/13‑h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3a中公开的稳定剂组合物2在2℃至8℃下的稳定性。47.图10：图表阐释了甲型流感毒株(a/南非/3626/13‑h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3b中公开的稳定剂组合物1在37℃下的稳定性。48.图11：图表阐释了甲型流感毒株(a/南非/3626/13‑h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3a中公开的稳定剂组合物1在2℃至8℃下的稳定性。49.图12：鼻甲和肺样本中的感染病毒测试。动物接种一个或两个剂量的h5laiv、h7laiv或安慰剂。第1至第4组用h5/tk/tk挑战，第5和第6组用h5/vt挑战，第7至第10组用h7/an挑战。滴定感染后第4天收集的鼻甲样本(a)和肺样本(b)，以确定是否存在可复制的病毒颗粒。单个滴度以黑实线指示的组平均值显示。50.图13：免疫后的hi和vn抗体反应。在最终免疫后第28天(一剂方案研究第28天，两剂方案研究第56天)，针对h5laiv免疫动物的同源挑战病毒h5/tk/tk和h7laiv免疫动物的h7/an的几何平均抗体反应。(a)hi抗体滴度，(b)vn抗体滴度。每组n＝6，误差条代表平均值的标准误差。统计显著性由mann‑whitney的u检验确定。*p<0.05和**p<0.01。具体实施方式51.尽管本公开可具体不同的实施方式，但是在附图和以下的详细描述中显示了某些实施方式，应当理解，本公开可认为是本公开的原理的示例，并且不旨在将公开的范围限制在本说明书中阐释和公开的范围。52.现在将参考附图描述本公开的实施方式。53.提供实施方式，以向本领域技术人员重复和完整地传达本公开的范围。阐述了与特定组分和方法相关的大量细节，以提供对本公开的实施方式的完整理解。对本领域技术人员而言显而易见的是，实施方式中提供的细节不应被解释为限制本公开的范围。在一些实施方式中，未详细描述公知的工艺、公知的装置结构和公知的技术。54.本公开中使用的术语仅用于解释特定实施方式的目的，并且这种术语不应认为限制本公开的范围。除非上下文另外明确地指出，否则如在本公开中使用的，形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述”也可旨在包括复数形式。55.术语第一、第二、第三等不应解释为限制本公开的范围，因为前述术语可仅用于将一个元件、组分、区域、层或部分与另一组分、区域、层或部分区分开来。除非本公开明确地指出，否则当在本文中使用时，术语，比如第一、第二、第三等不表示特定的序列或顺序。56.如本文使用的，术语“流感病毒”指包括代表正粘病毒科的甲型、乙型、丙型和丁型流感病毒的rna病毒。流感病毒可为活的野生型大流行性或季节性流感病毒、活的减毒流感疫苗病毒、灭活流感病毒、嵌合流感病毒或重组流感病毒。57.本公开提供了包括减毒活流感疫苗(laiv)病毒的组合物，用于保护免受流感病毒感染。本公开进一步提供了用于制造包括一种或多种流感疫苗病毒的组合物的方法。58.根据本公开的第一实施方式，laiv组合物可包括一种或多种减毒活流感疫苗病毒、一种或多种氨基酸、一种或多种碳水化合物和明胶。59.术语“活的”以其常规含义使用，活病毒是未被灭活的病毒，即能够在允许的细胞上复制的病毒。减毒活流感疫苗病毒是不在动物或人中诱发由相应野生型病毒引起的疾病并且能够诱发特异性免疫反应的病毒。60.根据本公开的第二实施方式，一种或多种减毒活流感疫苗病毒可通过包括来自一种或多种流感毒株的基因区段的“典型”或“反向遗传学”重排方法衍生。61.根据第二实施方式的第一方面，重排减毒活流感疫苗病毒是重排laiv病毒，其以1:7、2:6、3:5、4:4、5:3、6:2或7:1的比例包括主供体病毒(mdv)毒株的冷适应、温度敏感和/或减毒表型基因区段(pb1、pb2、pa、np、m和/或ns蛋白)和野生型大流行性或季节性甲型流感病毒或乙型流感病毒或丙型流感病毒毒株的血凝素(ha)基因区段和/或神经氨酸酶(na)基因区段。62.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒可以6:2的比例包括来自主供体病毒(mdv)毒株的基因区段和所述野生型大流行性或季节性流感病毒毒株(如图1中阐释)。63.根据第二实施方式的第二方面，重排减毒活流感疫苗病毒可包括衍生自任何亚型的甲型流感病毒或可衍生自任何亚型的乙型流感病毒的主供体病毒(mdv)的基因区段。64.重排减毒活流感疫苗病毒可能包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)选自包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感毒株、b/ussr/60/69乙型流感毒株的组中。65.仍优选地，重排减毒甲型流感疫苗病毒可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感毒株。66.仍优选地，重排减毒活流感疫苗甲型毒株a/17/加利福尼亚/2009/38可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感毒株。67.仍优选地，重排减毒活流感疫苗甲型毒株a/17/土耳其/土耳其/05/133可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感。68.仍优选地，重排减毒活流感疫苗甲型毒株a/17/安徽/2013/61可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感。69.仍优选地，重排减毒活流感疫苗甲型毒株a/17/纽约/15/5364可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感。70.仍优选地，重排减毒活流感疫苗甲型毒株a/17/香港/2014/8296可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感。71.仍优选地，重排减毒活流感疫苗甲型毒株a/南非/3626/2013‑cdc‑lv14a可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感。72.仍优选地，重排减毒乙型流感疫苗病毒可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括b/ussr/60/69b型流感毒株。73.仍优选地，重排减毒活疫苗乙型流感毒株b/德克萨斯/02/2013‑cdc‑lv8b可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括b/ussr/60/69b型流感毒株。74.仍优选地，重排减毒活疫苗乙型流感毒株b/普吉岛/3073/2013可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括b/ussr/60/69b型流感毒株。75.仍优选地，重排减毒活疫苗乙型流感毒株b/56/布里斯班/60/08可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括b/ussr/60/69b型流感毒株。76.根据第二实施方式的第三方面，重排减毒活流感疫苗病毒可包括来自甲型流感病毒或乙型流感病毒或丙型流感病毒的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。77.仍优选地，重排减毒活流感甲型疫苗毒株可包括来自甲型流感病毒ha亚型h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、h17或h18任何其他报告的ha亚型的血凝素(ha)基因和/或来自甲型流感病毒na亚型n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、n10或n11或任何其他报告的na亚型的神经氨酸酶(na)基因。78.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒可包括来自大流行性流感毒株或潜在大流行性流感毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。79.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒可包括来自季节性流感毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。80.仍优选地，重排减毒活流感疫苗毒株可包含来自甲型流感病毒亚型h1n1、h2n2、h3n2、h5n1、h5n2、h9n2、h7n1、h7n3、h7n7、h6n1、h7n9和h10n8或任何其他先前报告的或新检测到的毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。81.仍优选地，重排减毒活流感疫苗毒株可包含来自甲型流感病毒pdmh1n1毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。82.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒株可包含来自甲型流感病毒a/加利福尼亚/07/2009(称为a/cal)样毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。83.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒株可包含来自甲型流感病毒a/密歇根/45/2015样毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。84.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒株可包含来自甲型流感病毒株a/南非/3626/2013样毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。85.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒株可包含来自甲型流感病毒h3n2‑a/香港/4801/2014样毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。86.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒株可包含来自属于两个不同谱系yamagata样或维多利亚样的乙型流感病毒的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。87.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒株可包含来自乙型流感病毒维多利亚谱系b/布里斯班/60/2008样毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。88.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒株可包含来自乙型流感病毒yamagata谱系b/普吉岛/3073/2013样毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。89.产生重排体有两种方法90.1.典型的重排方法91.重排体毒株的野生型大流行性或季节性流感疫苗病毒和减毒mdv的重排过程包括用mdv毒株和野生型病毒毒株共同感染培养宿主(通常是蛋)。通过添加对mdv的ha和/或na蛋白具有特异性的抗体来选择重排病毒，以便选择包含野生型病毒株的ha和/或na蛋白的重排病毒。经过几代这样的处理，可选择包含野生型大流行性或季节性流感疫苗病毒株ha和/或na片段以及mdv的内部基因的快速生长的重排病毒。92.2.重排的反向遗传方法93.反向遗传是从dna复制产生传染性病毒颗粒的方法。mdv的六个内部基因以及来自推荐用于包括在疫苗中的野生型毒株的ha和na基因被克隆在质粒中，当在培养细胞中转染时，质粒可产生全长病毒rna。这些质粒与四个表达病毒聚合酶亚基的质粒一起被转染到培养细胞中。聚合酶亚基的表达和全长病毒rna的产生导致病毒组装和上清液中传染性病毒颗粒的释放。这种恢复的病毒表现出推荐的毒株的抗原特征以及mdv的ca、ts、att表型。94.重排laiv毒株采购自俄罗斯圣彼得堡实验医学研究所(iem)或who合作中心，比如亚特兰大疾病控制和预防中心(cdc)。95.根据本公开的第三实施方式，laiv组合物可包括一种或多种碳水化合物，碳水化合物选自但不限于下述的组中：天然碳水化合物、合成碳水化合物、多元醇、玻璃转变促进剂、单糖、二糖、三糖、低聚糖及它们相应的糖醇、多羟基化合物，比如碳水化合物衍生物和化学改性的碳水化合物、羟乙基淀粉和糖共聚物。天然碳水化合物和合成碳水化合物二者都适合使用。合成碳水化合物包括但不限于糖苷键被硫醇键或碳键取代的那些。可以使用d形式和l形式的碳水化合物。碳水化合物可为非还原性的或还原性的。当使用还原性碳水化合物时，优选添加美拉德反应抑制剂。适用于组合物中使用的还原性碳水化合物是本领域已知的那些并且包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麦芽酮糖和乳果糖。非还原性碳水化合物包括但不限于选自糖醇和其他直链多元醇的多羟基化合物的非还原性糖苷。其他有用的碳水化合物包括棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、纤维二糖、甘露二糖和糖醇。糖醇糖苷优选为单糖苷，特别是通过还原二糖，比如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖获得的化合物。玻璃形成剂选自由下述组成的组中：蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、甘露糖、棉子糖、乳糖醇、乳糖醛酸、葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、麦芽糖、乳糖山梨糖醇、葡萄糖、果糖、甘油或其组合。96.然而，根据第三实施方式的优选方面，laiv组合物可包括范围在1％和20％重量/体积之间，优选在1％‑10％之间，更优选在3％‑6％之间，最优选等于4％(w/v)的蔗糖作为合适的碳水化合物稳定剂。97.根据本公开的第四实施方式，laiv组合物可包括一种或多种氨基酸选自但不限于下述的组中：三(羟甲基)甲基甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、丙氨酸、肽、水解蛋白质或蛋白质，比如血清白蛋白。98.仍根据第四实施方式的优选方面，laiv组合物可单独或组合包括三(羟甲基)甲基甘氨酸、精氨酸、组氨酸和丙氨酸作为合适的氨基酸。99.仍根据第四实施方式的优选方面，一种或多种氨基酸可包括范围在0.1％和2％重量/体积(w/v)之间，优选地在0.1％‑1％之间，更优选地在0.1％‑0.5％之间，最优选地等于0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸。100.仍根据第四实施方式的优选方面，一种或多种氨基酸可包括范围在0.1％至2％(w/v)之间，优选地在0.1％‑1％之间，更优选地在0.1％‑0.5％之间，最优选地等于0.21％(w/v)的组氨酸。101.仍根据第四实施方式的优选方面，一种或多种氨基酸可包括范围在0.01％和1％重量/体积之间，优选地在0.05％‑0.5％之间，更优选地在0.08％‑0.2％之间，最优选地等于0.1％(w/v)的丙氨酸。102.并且，根据第四实施方式的优选方面，所述一种或多种氨基酸可包括范围在0.1％和10％重量/体积之间，优选地在0.1‑5％之间，更优选地在0.1‑3％之间，最优选地等于2.1％(w/v)的精氨酸。103.根据本公开的第五实施方式，laiv组合物可包括范围在0.1％至10％重量/体积之间，优选地在0.1％‑5％之间，更优选地在0.1％‑3％之间，最优选地等于0.85％(w/v)的明胶。104.如本文使用的，术语“明胶”是指通过动物胶原的部分酸水解(a型明胶)或部分碱水解(b型明胶)产生的无菌无热原蛋白质制剂(例如，级分)，最常见的来源是牛、猪和鱼。可以获得不同分子量范围的明胶。也可使用重组明胶来源。105.根据本公开的第六实施方式，laiv组合物可另外包括选自由下述组成的组中的缓冲剂：hepes、柠檬酸盐‑磷酸盐、碳酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐和酒石酸盐缓冲剂，以及包括磷酸盐缓冲剂的更复杂的有机缓冲剂，磷酸盐缓冲剂以选择的比例含有磷酸钠和/或磷酸钾，以实现期望的ph值。在另一实施例中，缓冲剂包含三(羟甲基)氨基甲烷或“tris”，其被配制为实现期望的ph值。仍在另一实施例中，缓冲剂可为具有汉克斯盐的最低限度基本培养基。106.根据本公开的第七实施方式，其中单剂量组合物不含防腐剂，并且多剂量组合物可另外包括选自包括下述的组中的防腐剂：2‑苯氧乙醇、苄索氯铵(phemerol)、苯酚、间甲酚、硫柳汞、甲醛、对羟基苯甲酸酯(例如，甲基‑、乙基‑、丙基‑或丁基对羟基苯甲酸酯)、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对氯‑间甲酚或苯甲醇或其组合。疫苗组合物可包括用于单次免疫的材料，或可包括用于多次免疫的材料(即“多剂量”试剂盒)。在多剂量布置中优选包括防腐剂。作为在多剂量组合物中包括防腐剂(或除了防腐剂)的可选方案，组合物可包含在具有用于去除材料的无菌适配器的容器中。107.根据本公开的第八实施方式，laiv组合物可另外包括药学上可接受的转运蛋白、赋形剂、粘结剂、载体、等渗剂、乳化剂或湿润剂，其中药学上可接受的赋形剂选自由下述组成的组中：表面活性剂、聚合物和盐。表面活性剂的示例可包括非离子表面活性剂，比如聚山梨酯20、聚山梨酯80等。聚合物的示例可包括葡聚糖、羧甲基纤维素、透明质酸、环糊精等。盐的示例可包括nacl、kcl、kh2po4、na2hpo4.2h2o、cacl2、mgcl2等。108.根据本公开的第九实施方式，laiv组合物可另外包括选自下述的组中的佐剂：氢氧化铝、磷酸铝、羟基磷酸铝和硫酸钾铝或其混合物。109.根据本公开的第十实施方式，laiv组合物另外包括选自由下述组成的组中的免疫刺激组分：油水乳液、mf‑59、脂质体、脂多糖、皂苷、脂质a、脂质a衍生物、单磷酰脂质a、3‑脱酰单磷酰脂质a、as01、as03、寡核苷酸、包括至少一种未甲基化的cpg和/或脂质体的寡核苷酸、弗氏佐剂、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、聚合物、共聚物，比如聚氧乙烯‑聚氧丙烯共聚物，包括嵌段共聚物、聚合物p1005、crl‑8300佐剂、胞壁酰二肽、tlr‑4激动剂、鞭毛蛋白、源自革兰氏阴性细菌的鞭毛蛋白、tlr‑5激动剂、能够结合tlr‑5受体的鞭毛蛋白的片段、α‑c‑半乳糖基神经酰胺、脱乙酰甲壳质、白细胞介素‑2、qs‑21、iscoms、皂苷与甾醇和脂质的组合。110.根据本公开的第十一实施方式，制备基于mdck细胞培养物的laiv组合物的方法可包括以下步骤的任何子集或全部：111.a)将laiv候选疫苗病毒最初在spf鸡胚中传代，产生基于蛋的主种子病毒(msv)。112.b)基于蛋的主种子病毒适于在细胞培养宿主上生长，以制备基于细胞的工作种子病毒(wsv)。该基于细胞的wsv在不同的细胞培养容器/系统，比如表面积为175cm2的组织培养瓶(tcfs)、表面积为850cm2的滚瓶(rbs)、表面积为6320cm2的细胞设施(cfs)和固定床生物反应器(例如，来自生命科学公司(华盛顿港，纽约)的生物反应器，比如nano生物反应器和500/100生物反应器)中培养和繁殖。113.c)收获培养的病毒。114.d)通过至少一个澄清过滤器，通过直流过滤(dff)来过滤病毒收获物，以获得澄清病毒库(cvp)。115.e)用非特异性核酸内切酶处理cvp，以降解细胞dna。116.f)将处理的核酸内切酶处理的cvp进行切向流过滤。117.g)用包括一种或多种碳水化合物、一种或多种氨基酸和明胶的稳定剂组合物稳定tff浓缩物，以形成稳定的病毒收获物。118.h)经过至少一个灭菌级过滤器通过dff将稳定的tff浓缩物灭菌，以获得灭菌的澄清单价病毒库(cmvp)。119.i)将灭菌的cmvp在‑60℃或更低下储存在聚碳酸酯瓶中。120.j)将灭菌的制剂装入小瓶中并且在2℃至8℃下储存。121.根据第十一实施方式的第一方面，适于在细胞培养宿主中生长的基于蛋的laiv病毒候选物可为任何真核细胞。仍优选地，细胞培养宿主可为哺乳动物或鸟类细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于仓鼠、牛、灵长类动物(包括人和猴)和狗细胞。各种细胞类型包括但不限于肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞和肺细胞。合适的仓鼠细胞的示例是名称为bhk21或hkcc的细胞系。合适的猴细胞是例如非洲绿猴细胞，比如vero细胞系中的肾细胞。合适的狗细胞是例如cldk和mdck细胞系中的肾细胞。122.进一步合适的细胞包括但不限于：cho；293t；bhk；mrc5；per.c6；frhl.2；wi‑38等。合适的细胞广泛地从例如美国典型细胞培养物(atcc)保藏中心、coriell细胞库或欧洲细胞培养物保藏中心(ecacc)获得。例如，atcc提供目录号为ccl81、ccl81.2、crl1586和crl‑1587的各种不同的vero细胞，并且其提供目录号为ccl34的mdck细胞。per.c6可从ecacc获得，保藏号为96022940。123.仍优选地，细胞培养宿主可为马丁达比狗肾(mdck)细胞，选自但不限于atccccl‑34、mdck33016细胞系(dsmacc2219)、mdck(atccccl34mdck(nbl2))、mdck33016(dsmacc2219)、dsmacc3309、atcccrl‑12042、atccpta‑7909、atccpta‑7910、atccpta‑6500、atccpta‑6501、atccpta‑6502、atccpta‑6503、“mdck‑s”、“mdck‑sf101”、“mdck‑sf102”、“mdck‑sf103”和fermbp‑7449。124.仍优选地，细胞培养宿主可为马丁达比狗肾(mdck)细胞atccccl34(nbl2)。125.根据第十一实施方式的第二方面，mdck细胞可在包括10％胎牛血清(fbs)的最低必需培养基(mem)中培养。细胞的培养可在37℃±1℃下进行。感染前细胞的增殖期间培养基的ph值可在ph6.8和ph7.6的范围内，并且更优选地在ph7.0和ph7.4的值之间。126.仍然，mdck细胞可在无血清或无蛋白质的培养基中培养。127.根据第十一实施方式的第三方面，在感染之前，mdck细胞可用mem冲洗，并且随后用含有范围为5u/ml至25u/ml的蛋白酶的mem冲洗。128.然而，蛋白酶可选自但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、真菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶。129.仍优选地，蛋白酶可为从猪来源或牛来源或真菌来源或细菌来源获得的胰蛋白酶。130.仍优选地，蛋白酶可为在酵母或植物或细菌的宿主细胞中表达的重组胰蛋白酶，宿主细胞选自但不限于曲霉属、灰色链霉菌、玉米、大肠杆菌、毕赤酵母。优选地，所述重组胰蛋白酶选自biogenomics(大肠杆菌作为宿主)、d.k.biopharmapvt.ltd(大肠杆菌作为宿主)、richcore(毕赤酵母作为宿主)和gibco(真菌)。131.仍然，优选的胰蛋白酶浓度是12.5u/ml。132.根据第十一实施方式的第四方面，在感染之前，工作种子病毒可通过用含有范围为5u/ml至25u/ml的蛋白酶的mem稀释病毒，并且在31℃至33℃的温度下孵育10分钟至60分钟。133.蛋白酶可选自但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、真菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶。134.仍优选地，蛋白酶可为从猪来源或牛来源或真菌来源或细菌来源获得的胰蛋白酶。135.仍优选地，蛋白酶可为在酵母或植物或细菌的宿主细胞中表达的重组胰蛋白酶，宿主细胞选自但不限于曲霉属、灰色链霉菌、玉米、大肠杆菌、毕赤酵母。优选地，所述重组胰蛋白酶选自biogenomics(大肠杆菌作为宿主)、d.k.biopharmapvt.ltd(大肠杆菌作为宿主)、richcore(毕赤酵母作为宿主)和gibco(真菌)。136.仍然，优选的胰蛋白酶浓度是12.5u/ml。137.仍然，优选的胰蛋白酶浓度是每个滚瓶2000单位至3000单位的胰蛋白酶。138.根据第十一实施方式的第五方面，用laiv候选病毒感染mdck细胞可以发生在用于生物反应器(4m2)的优选tcf为约40‑60×106/tcf，rb约150‑180×106/rb，和7000‑10000×106/br(4m2)的mdck细胞密度下。139.根据第十一实施方式的第六方面，laiv候选病毒可以以贴壁培养或悬浮培养模式在mdck细胞上生长。140.根据第十一实施方式的第七方面，用基于蛋的laiv候选病毒感染mdck细胞可以以1:100至1:10000之间的moi发生。141.根据第十一实施方式的第八方面，感染后mdck细胞可以在含有范围为5u/ml至25u/ml的胰蛋白酶的最低必需培养基(mem)中并且在32℃±1℃的温度下培养。感染后培养基的ph值可以在ph6.8和ph7.6的范围内，并且最优选在7.2至7.6的范围内。142.根据第十一实施方式的第九方面，感染后可在40至70小时；更优选地可在54±8小时的孵育期后收获细胞上清液。143.仍然可选地，在丢弃输入材料并单独处理以获得澄清单价病毒库(cmvp)之前，可以以适当的时间间隔进行多次收获约4次至5次。144.收获后，可实现至少7.0至9.2logeid50/0.5ml的病毒产量。145.根据第十一实施方式的第十方面，可澄清含有病毒的培养基，通常通过减小孔径(例如，6μ、5μ、0.8μ、0.65μ、0.45μ、0.2μ)的过滤器。合适的市售过滤器和过滤装置是本领域公知的并且可由技术人员选择。示例性过滤装置可由聚丙烯或乙酸纤维素或聚醚砜制成，并且市售过滤器可为millipak(millipore)、kleenpak(pall)和sartobran(sartorius)过滤装置。146.根据第十一实施方式的第十一方面，过滤的收获物可用浓度在0.5单位/ml至2单位/ml之间变化的非特异性核酸内切酶，最优选苯甲酸酶，在范围为30℃至34℃之间的温度下处理2小时至6小时，并且然后在2℃至8℃的温度下5小时至15小时。147.仍可选地，过滤的收获物可在存在量在0.1mm至100mm之间的二价阳离子的情况下，用非特异性核酸内切酶，最优选地苯甲酸酶处理，所述二价阳离子选自由ca2 、mg2 、mn2 和cu2 组成的组中。148.仍可选地，可存在浓度为1mm至3mm的二价阳离子mg2 盐的情况下，用非特异性核酸内切酶，最优选地苯甲酸酶处理过滤的收获物。149.根据第十一实施方式的第十二方面，苯甲酸酶处理的收获物可进一步进行切向流过滤(tff)，通常通过截留分子量(mwco)在100kda至500kda之间的过滤器进行，从而获得2倍至10倍浓缩的病毒收获物，并且进一步去除残留的杂质。150.仍优选地，残留杂质可包括残留dna、残留牛血清白蛋白(bsa)和残留宿主细胞蛋白。151.根据第十一实施方式的第十三方面，上述方法可产生包括痕量残留细胞dna(<10ng/剂量)、残留bsa(<50ng/剂量)和残留细胞蛋白质的纯化和浓缩的laiv病毒收获物。此外，根据上述方法，纯化的病毒的总回收率可为至少40％。152.根据第十一实施方式的第十四方面，浓缩的单价病毒原液(tff浓缩物)可用稳定剂组合物来稳定，以获得包括一种或多种碳水化合物、一种或多种氨基酸和明胶的最终laiv组合物。153.仍优选地，浓缩的病毒原液(tff浓缩物)可用稳定剂组合物来稳定，稳定剂组合物包括蔗糖、组氨酸、丙氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、精氨酸和明胶的任意组合。154.仍优选地，浓缩的病毒原液(tff浓缩物)可用稳定剂组合物来稳定，稳定剂组合物包括浓度为1％至10％(w/v)的蔗糖、浓度为0.1％至2％(w/v)的组氨酸、浓度为0.01％至1％(w/v)的丙氨酸、浓度为0.1％至1％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、浓度为0.1％至5％(w/v)的精氨酸、浓度为0.1％至5％(w/v)的明胶。155.仍优选地，浓缩的病毒原液(tff浓缩物)可用稳定剂组合物来稳定，稳定剂组合物包括浓度为3至6％(w/v)的蔗糖、浓度为0.1％至1％(w/v)的组氨酸、浓度为0.05％至0.5％(w/v)的丙氨酸、浓度为0.1％至0.5％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、浓度为0.1％至3％(w/v)的精氨酸和浓度0.1％至3％(w/v)的明胶。156.仍优选地，浓缩的病毒原液(tff浓缩物)可用稳定剂组合物来稳定，稳定剂组合物包含4％(w/v)的蔗糖、0.21％(w/v)的组氨酸、0.1％(w/v)的丙氨酸、0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、2.1％(w/v)的精氨酸和0.85％(w/v)的明胶。157.根据第十一实施例的第十五方面，稳定的病毒收获物可通过至少一个优选为0.2μ的灭菌级过滤器的直流过滤(dff)灭菌。合适的市售过滤器和过滤装置是本领域公知的并且可由技术人员选择。示例性过滤装置可由聚丙烯或乙酸纤维素或聚醚砜或聚偏二氟乙烯制成，并且市售过滤器可为millipak(millipore)、kleenpak(pall)和sartobrantmp(sartorius)过滤装置。158.根据第十一实施方式的第十六方面，laiv组合物可为多价的，包括多于一种如在稍前的实施方式中公开的laiv病毒株或亚型。laiv组合物可为二价的或三价的或四价的。159.仍可选地，laiv组合物可为单价的，包括如在稍前的实施方式中公开的任何一种laiv病毒株或亚型。160.根据第十一实施方式的第十七方面，laiv组合物可包含剂量为6至7logeid50/0.5ml的流感病毒。161.仍优选地，laiv组合物可包括甲型流感病毒或任何亚型，剂量为6至7logeid50/0.5ml；更优选不小于7logeid50/0.5ml。162.仍优选地，laiv组合物可包含乙型流感病毒或任何亚型，剂量为6至7logeid50/0.5ml；更优选不小于6.5logeid50/0.5ml。163.根据第十二实施例，制备免疫原性组合物的方法可包括以下步骤：164.a)使用流感病毒以1:100至1:10000之间的moi感染mdck细胞培养宿主；165.b)在含有范围为5u/ml至25u/ml的胰蛋白酶的mem中孵育40小时至70小时后收获包括流感病毒的上清液；166.c)通过至少一个孔径在约6微米至约0.45微米之间的澄清过滤器，通过直流过滤(dff)来过滤病毒收获物；167.d)用非特异性核酸内切酶在30℃至34℃范围内的温度下处理cvp2小时至6小时，并且然后在2℃至8℃的温度下处理5小时至15小时；168.e)使用截留分子量(mwco)为100kda至500kda的膜，通过切向流过滤(tff)浓缩核酸内切酶处理的cvp；169.f)用包括一种或多种碳水化合物、一种或多种氨基酸和明胶的稳定剂组合物来稳定tff浓缩物，以形成稳定的病毒收获物；170.g)通过至少一个孔径在约0.8微米至约0.2微米之间的灭菌级过滤器，通过dff将稳定的tff浓缩物灭菌，以形成灭菌的cmvp；171.其中纯化的病毒的总回收率大于或等于40％。172.根据第十二实施方式的第一方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(d)可包括在存在选自由ca2 、mg2 、mn2 和cu2 组成的组中并且量在0.1mm和100mm之间的二价阳离子的情况下，用浓度范围为0.5单位/ml至5单位/ml的非特异性核酸内切酶，更尤其苯甲酸酶处理病毒收获物。173.根据第十二实施方式的第二个方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(d)可包括在存在浓度为1mm至3mm的二价阳离子mg2 盐的情况下，用浓度范围为0.5单位/ml至5单位/ml的非特异性核酸内切酶，更尤其苯甲酸酶处理病毒收获物。174.根据第十二实施方式的第三方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(e)可包括通过切向流过滤(tff)浓缩病毒收获物，得到至少4倍浓缩的病毒收获物。175.根据第十二实施方式的第四方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(f)可包括用稳定剂组合物来稳定病毒收获物，稳定剂组合物包括浓度为1％(w/v)的蔗糖、浓度为0.1％至2％(w/v)的组氨酸、浓度为0.01％至1％(w/v)的丙氨酸、浓度为0.1％至2％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、浓度为0.1％至5％(w/v)的精氨酸和浓度为0.11％至5％(w/v)的明胶。176.根据第十二实施方式的第五方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(f)可包括用稳定剂组合物来稳定病毒收获物，稳定剂组合物包括浓度为3％至6％(w/v)的蔗糖、浓度为0.1％至1％(w/v)的组氨酸、浓度为0.05％至0.5％(w/v)的丙氨酸、浓度为0.1％至0.5％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、浓度为0.1％至3％(w/v)的精氨酸和浓度为0.1％至3％(w/v)的明胶。177.根据第十二实施方式的第六方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(f)可包括用稳定剂组合物来稳定病毒收获物，稳定剂组合物包括4％(w/v)的蔗糖、0.21％(w/v)的组氨酸、0.1％(w/v)的丙氨酸、0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、2.1％(w/v)的精氨酸和0.85％(w/v)的明胶。178.根据第十二实施方式的第六方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(f)可包括用稳定剂组合物来稳定病毒收获物，稳定剂组合物包含4％(w/v)的蔗糖、0.21％(w/v)的组氨酸、0.1％(w/v)的丙氨酸、0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、2.1％(w/v)的精氨酸和1.0％(w/v)的明胶。179.根据第十二实施方式的第七方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(f)可包括用稳定剂组合物来稳定病毒收获物，稳定剂组合物包括4％(w/v)的蔗糖、0.21％(w/v)的组氨酸、0.1％(w/v)的丙氨酸、0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、1.6％(w/v)的精氨酸和1.0％(w/v)的明胶。180.根据本公开的第十三实施方式，免疫原性组合物可包括a)一种或多种减毒活流感疫苗(laiv)病毒，剂量为6至7logeid50/0.5ml；b)1％至10％(w/v)的蔗糖；c)0.1％至2％(w/v)的组氨酸；d)0.01％至1％(w/v)的丙氨酸；e)0.1％至2％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸；f)0.1％至5％(w/v)的精氨酸；g)0.1％至5％(w/v)的明胶。181.仍优选地，所述免疫原性组合物可包括a)一种或多种减毒活流感疫苗(laiv)病毒，剂量为6至7logeid50/0.5ml；b)3％至6％(w/v)的蔗糖；c)0.1％至1％(w/v)的组氨酸；d)0.05％至0.5％(w/v)的丙氨酸；e)0.1％至0.5％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸；f)0.1％至3％(w/v)的精氨酸；g)0.1％至3％(w/v)的明胶。182.仍优选地，免疫原性组合物可包括a)一种或多种减毒活流感疫苗(laiv)病毒，剂量为6至7logeid50/0.5ml；b)4％(w/v)的蔗糖；c)0.21％(w/v)的组氨酸；d)0.1％(w/v)的丙氨酸；e)0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸；f)2.1％(w/v)的精氨酸；g)0.85％(w/v)的明胶。183.仍优选地，免疫原性组合物可包括a)一种或多种减毒活流感疫苗(laiv)病毒，剂量不小于6至7logeid50/0.5ml；b)4％(w/v)的蔗糖；c)0.21％(w/v)的组氨酸；d)0.1％(w/v)的丙氨酸；e)0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸；f)2.1％(w/v)的精氨酸；g)1％(w/v)的明胶。184.仍优选地，所述免疫原性组合物可包括a)一种或多种减毒活流感疫苗(laiv)病毒，剂量为6至7logeid50/0.5ml；b)4％(w/v)的蔗糖；c)0.21％(w/v)的组氨酸；d)0.1％(w/v)的丙氨酸；e)0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸；f)1.6％(w/v)的精氨酸；g)1％(w/v)的明胶。185.根据本公开的第十四实施方式，laiv组合物可为全液体的。186.仍可选地，laiv组合物可为冻干或冷冻干燥的组合物。187.如本文使用的，术语“冷冻干燥”或“冻干(lyophilize)”或“冻干(lyophilization)”涉及冻干并且指悬浮液被冷冻，之后通过在低压升华除去水的过程。如本文使用的，术语“升华”是指组合物的物理性质的变化，其中组合物直接从固态变为气态而不变成液体。188.根据本公开的第十五实施方式，可将laiv组合物配制成用于减少健康状况的发作或预防健康状况的方法，包括通过鼻内或其他途径向人受试者施用有效量的laiv组合物的免疫。189.根据实施方式的优选方面，laiv组合物可以经鼻内途径施用至人受试者。在一个实施方式中，其为鼻内分散装置，比如气雾剂(鼻内喷雾)或液滴递送系统形式的装置。液体鼻腔制剂可经鼻腔喷雾、滴注和鼻导管、压缩空气雾化器、挤压瓶、计量泵喷雾(如多剂量计量喷雾泵或单/双剂量喷雾泵、连接到注射器的喷雾装置)递送。其他剂型可选自鼻粉剂(吹入器、干粉吸入器)、鼻凝胶剂、滴鼻剂、溶液、悬浮液、共溶剂系统、微球、纳米颗粒、微乳剂、鼻插入物。190.鼻内递送装置可选自但不限于bectondickinson(bd)accuspraytm递送装置、bi‑directionaloptinose鼻装置、teleflex的mad鼻内粘膜雾化装置、aerolifetm和aerovax(aerovectrx，inc.，atlanta，ga)、喷射注射器‑无针注射器；munjis多用途喷嘴喷射注射器：aquapuncture装置、用途喷嘴喷射注射器：aquapuncture装置、一次性注射器喷射注射器：vitajettm、lectrajeths、zetajettm、aktiv‑drypuffhalertm和鼻喷流感疫苗设备。191.根据本发明的第十六实施方式，laiv组合物可配制为用于减少下述健康状况的发作或预防下述健康状况的方法，该健康状况包括如本公开的稍前实施方式中公开的甲型流感病毒感染或其亚型、本公开的稍前实施方式中公开的乙型流感病毒感染或其亚型或本公开的稍前实施方式中公开的丙型流感病毒感染或其亚型。192.根据本公开的第十七实施方式，可以以有效保护的剂量鼻内施用上述laiv组合物。疫苗以与剂型相容的方式施用，并且以预防有效的量施用。本公开的免疫原性组合物可在有感染风险的成人或儿童中作为主要预防剂施用。例如，本文公开的减毒活流感疫苗组合物可用于有感染流感病毒风险的成人或儿童。193.更优选地，可以以约0.1ml至0.5ml的剂量体积鼻内施用laiv组合物。194.根据本公开的第十八实施方式，laiv组合物可配制成单剂量小瓶或多剂量小瓶或多剂量试剂盒或预装注射器或鼻腔喷雾剂，其中所述laiv组合物可按单剂量方案施用，或优选多剂量方案，其中在疫苗接种的主要过程之后是在维持和/或加强免疫反应所需的后续时间间隔施用1至2个单独剂量，例如，如果需要的话在1‑4个月内接种第二剂，在几个月或几年或每年接种疫苗后进行后续接种。该剂量方案也将至少部分取决于赋予保护性免疫所需的加强剂量的需要。195.根据本公开的第十九实施方式，免疫原性组合物的最终ph值可包括6.5至8。196.本文公开的其他实施方式还包括疫苗试剂盒，其包括含有冻干(冷冻干燥)免疫原性组合物的第一容器和含有水溶液的第二容器，所述水溶液任选地为盐水或wfi(注射用水)，用于重构冻干(冷冻干燥)的laiv组合物。197.遍及说明书，词语“包括”或比如“包含”或“含有”的变体将被理解为表示包括叙述的要素、整数或步骤、或要素、整数或步骤的组，但不是排除任何其他要素、整数或步骤、或要素、整数或步骤的组的任何其他要素，可意思是“包括”、“包含”，术语是开放式的，允许存在比所列举的更多，只要叙述的基本特征特性或新特性不因存在叙述的更多而改变，但不排除现有技术实施方式。198.遍及本说明书，词语“免疫原性组合物”涵盖针对从载体表达的感兴趣的抗原或免疫原引发免疫应答的任何组合物；例如，在施用至受试者之后，引发针对感兴趣的靶向免疫原或抗原的免疫应答。术语“疫苗组合物”和“疫苗”涵盖诱导针对感兴趣的抗原的保护性免疫应答或有效地针对抗原提供保护的任何组合物；例如，在向受试者施用或注射之后，引发针对靶向抗原或免疫原的保护性免疫应答或提供针对从载体表达的抗原或免疫原的有效保护。199.表述“一种或多种”或“至少一种”的使用提示使用一种或多种要素或成分或数量，因为该使用可在本发明的实施方式中，以实现一种或多种期望的目的或结果。尽管已经描述了本发明的某些实施方式，但是这些实施方式仅通过实施例的方式呈现，并且不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员在阅读本文的公开之后可想到在本发明范围内对本发明组合物的改变或修饰。这种改变或修饰也在本公开的精神内。200.除非说明书中有相反的叙述，否则对各种物理参数、尺寸和数量给出的数值仅为近似值，并且可设想高于为物理参数、尺寸和数量指定的数值的值落入本发明的范围内。201.类似地，纯化中使用的组分，例如过滤器、色谱柱，决不旨在是限制性的或排他性的，并且可根据从业者的判断替换为其他组分以达到相同的目的。202.尽管本文相当强调优选实施方式的具体特征，但是应当理解，在不背离本公开的原理的情况下，可添加许多另外的特征，并且可在优选实施方式中进行许多改变。本公开的优选实施方式中的这些改变和其他改变对于本领域技术人员而言，从本文的公开中将是显而易见的，由此应清楚地理解，前述描述内容仅被解释为对本公开的阐释而不是作为限制。203.技术优势204.1.目前几乎所有生产的流感疫苗都使用蛋作为宿主来制备病毒库。使用蛋制造laiv存在某些缺点，可以使用细胞培养作为底物来克服这些缺点。使用蛋作为底物的局限性是：205.·疫苗质量蛋和无特定病原体蛋的供应商有限。206.·在蛋可用之前至少需要提前4个月订购。207.·一些候选大流行性毒株会导致家禽遭到致命感染，导致无法获得用于疫苗生产的底物(蛋)。208.·基于蛋的制造需要专门的蛋孵育、收获等设施，从而限制了快速扩大规模的能力。209.2.基于组织培养的制造具有完全受控系统的优势，易于扩大规模。210.3.在大流行的情况下，可以使用其他病毒疫苗的预先存在的组织培养生产单位轻松实现疫苗的大规模生产。211.4.细胞培养获得的病毒与循环毒株的相似性更高，而蛋中产生的病毒可具有抗原修饰。212.5.参与疫苗组合物的组分最少。213.6.不含防腐剂、聚合物和表面活性剂。214.7.纯化过程使用低浓度的核酸内切酶(苯甲酸酶)。215.8.没有昂贵和繁琐的色谱步骤的纯化过程。216.9.改进了生产这种稳定组合物/制剂的方法，从而提高了产量。217.10.鼻内给药是最简单的免疫途径，因为它不需要高水平的专业知识，适合多剂量给药，218.11.未报告与格林巴利(guillainbarre)综合征相关，并且因在感染部位递送而提供更好的保护。219.12.不易呈现液态疫苗，有助于克服冻干能力有限、需要供应稀释剂以进行重构以及疫苗交付前所需的额外重构步骤的问题。220.13.用于生成laiv重组的mdv主链具有完善的安全性特点，并且据报道可提供高水平的保护。221.实施例222.包括以下实施例以说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的组合物和技术代表了发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以被认为构成其实践的优选方式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可对公开的具体实施方式进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。223.重排laiv毒株采购自俄罗斯圣彼得堡实验医学研究所(iem)或who合作中心，比如亚特兰大疾病控制和预防中心(cdc)。224.实施例1：重排laiv病毒免疫原性组合物稳定性数据225.组分1‑减毒活流感疫苗病毒(laiv)226.流感疫苗病毒是通过典型的重排方法衍生的重排laiv病毒，其以6:2或7:1的比例包括主供体病毒(mdv)的冷适应、温度敏感和/或减毒表型基因区段和野生型大流行性或季节性甲型流感或乙型流感或丙型流感病毒株的血凝素(ha)基因区段和/或神经氨酸酶(na)基因区段。[0227][0228][0229]对于laiv免疫原性组合物：[0230]在6至7logeid50/0.5ml剂量范围内；更优选7logeid50/0.5ml剂量的甲型病毒[0231]在6至7logeid50/0.5ml剂量范围内；更优选6.5logeid50/0.5ml剂量的乙型病毒[0232]就在表1中以任何组合公开的免疫原性组合物中使用的重排laiv病毒株而言，laiv组合物为单价或多价(二价；三价；四价)。[0233][0234][0235][0236][0237]解释：[0238]稳定剂组合物3(1％w/v明胶 5％w/v山梨糖醇 0.1％w/vl‑丙氨酸 0.21％w/vl‑组氨酸 0.3％w/v三(羟甲基)甲基甘氨酸 1.6％w/vl‑精氨酸盐酸盐)：[0239]对于甲型/h1n1和乙型流感疫苗毒株，在37℃下的应激稳定性和在2℃至8℃温度下的实时稳定性都观察到了不可接受的降解率。(参考图4和图5)[0240]稳定剂组合物4(1％w/v明胶 5％w/v山梨糖醇 0.1％w/vl‑丙氨酸 0.21％w/vl‑组氨酸 0.9％w/v三(羟甲基)甲基甘氨酸 1.6％w/vl‑精氨酸盐酸盐)：[0241]对于甲型/h1n1和乙型流感疫苗毒株，在37℃下的应激稳定性和在2℃至8℃温度下的实时稳定性都观察到了不可接受的降解率。(参考图6和图7)[0242]稳定剂组合物2(0.85％w/v明胶 3％w/v蔗糖 0.1％w/vl‑丙氨酸 0.21％w/vl‑组氨酸 0.3％w/v三(羟甲基)甲基甘氨酸 2.1％w/vl‑精氨酸盐酸盐)：[0243]在37℃下的应激稳定性和在2℃至8℃温度下的实时稳定性都观察到了不可接受的降解率。(参考图8和图9)[0244]稳定剂组合物1(0.85％w/v明胶 4％w/v蔗糖 0.1％w/vl‑丙氨酸 0.21％w/vl‑组氨酸 0.3％w/v三(羟甲基)甲基甘氨酸 2.1％w/vl‑精氨酸盐酸盐)：[0245]对于在37℃下的应激稳定性和在2℃至8℃温度下的实时稳定性，都观察到了可接受的降解率(值在可接受的范围内)。(参考图2、3、10和11)[0246]实施例2：基于mdck细胞的laiv病毒制造过程[0247]制备基于mdck细胞培养物的laiv组合物的方法可包括以下步骤的任何子集或全部：[0248]k)将laiv候选疫苗病毒最初在产生基于蛋的主种子病毒(msv)的spf鸡胚中传代。[0249]l)基于蛋的主种子病毒在mdck细胞培养(atccccl‑34)宿主上生长，以制备基于细胞的工作种子病毒(wsv)。这种基于细胞的wsv用于在不同的细胞培养容器/系统(如表面积为175cm2的组织培养瓶(tcfs)、表面积为850cm2的滚瓶(rbs)、表面积为6320cm2的细胞工厂(cfs)和固定床生物反应器(例如，来自生命科学公司(华盛顿港，纽约)的生物反应器，如nano生物反应器和500/100生物反应器))中以1:100至1:10000的moi感染mdck细胞培养物。(mdck细胞使用含fbs的mem培养；接种前用含5u/ml至25u/ml的胰蛋白酶的mem冲洗；将wsv以1:10至1:10000的moi接种至细胞中，在31℃至33℃下孵育48小时至72小时)[0250]m)收获培养的病毒。[0251]n)将病毒收获物通过直流过滤(dff)经过至少一个澄清过滤器进行过滤，以获得澄清病毒库(cvp)。[0252]o)用非特异性核酸内切酶(例如苯甲酸酶)在30℃至34℃范围的温度下处理cvp2小时至6小时，并且然后在2℃至8℃的温度下处理5小时至15小时；[0253]p)使用截留分子量(mwco)为100kda至500kda的膜，通过切向流过滤(tff)来浓缩核酸内切酶处理的cvp；[0254]q)用包括一种或多种碳水化合物、一种或多种氨基酸和明胶的稳定剂组合物来稳定tff浓缩物，以形成稳定的病毒收获物。[0255]r)通过至少一个孔径为约0.2微米的灭菌级过滤器通过dff对稳定化的tff浓缩物进行灭菌，以获得灭菌的cmvp(澄清单价病毒库)。[0256]s)将灭菌的cmvp在‑60℃或更低的温度下储存在聚碳酸酯瓶中。[0257]t)将灭菌的制剂装入小瓶中并且储存在2℃至8℃下。[0258][0259][0260]细胞培养基：具有10％fbs的mem(用1nhcl将ph调节至7.0至7.4)[0261](另外的谷氨酰胺350mg/l)[0262]病毒培养基：没有fbs的mem(用1nhcl将ph调节至7.2至7.6)[0263](另外的葡萄糖500mg/l，谷氨酰胺350mg/l)[0264]在用于生物反应器系统的cm和vm中添加另外的0.4％葡萄糖[0265][0266][0267][0268][0269][0270]实施例3：病毒输入(moi)和接种后孵育期对产率的影响[0271][0272][0273]感染：[0274]a.感染时间：[0275]在优化研究的基础上，选择mdck细胞源流感工作种子病毒感染的细胞数量上限为每个滚瓶1.2至1.8亿细胞和生物反应器系统70至100亿细胞。在感染程序之前对具有mdck细胞的滚瓶进行单层汇合的显微观察。[0276]b.moi和接种后孵育期：[0277]根据moi优化研究的所有观察结果，甲型(h1n1)、甲型(h3n2)和乙型流感病毒的moi选择范围在1:100至1:10000之间，并且接种后孵育期在48至72小时之间。[0278]实施例4：不同浓度胰蛋白酶对产率的影响[0279][0280]推论：需要胰蛋白酶来激活流感病毒以接种mdck细胞。从以上结果可以看出，每个滚瓶使用2000单位至3000单位的胰蛋白酶产生最大的病毒效力。[0281]实施例5：苯甲酸酶的浓度和温度对细胞dna含量和病毒滴度的影响[0282]测试了不同浓度的苯甲酸酶在不同温度下降解宿主细胞dna。澄清病毒库(cvp)以500(含2mmmgcl2)、500、1000、2500和5000u/l的浓度进行苯甲酸酶处理，并且处理的cvp在32℃下保持3小时，并且进一步在2℃至8℃下继续处理过夜。在每个阶段进行取样，以下是每个阶段的dna含量结果。[0283][0284][0285]推论：从结果可以看出，与用不存在2mmmgcl2的浓度为500u/l的苯甲酸酶处理的cvp相比，在存在2mmmgcl2的情况下，用浓度为500u/l的苯甲酸酶处理的cvp显示出更高的dna降解。还可以看出，较高的苯甲酸酶浓度1000u/l、2500u/l和5000u/l显示出与500u/l(具有2mmmgcl2)的苯甲酸酶浓度相当的dna降解程度。[0286]实施例6：不同制造阶段的病毒产量[0287][0288]1.cvp：澄清病毒库(过滤后收获)，[0289]2.bcvp：用苯甲酸酶处理的cvp，[0290]3.cmvp：澄清单价病毒库(tff后，添加稳定剂和0.2μ过滤后)[0291]推论：检查每个甲型(h1n1)、甲型(h3n2)和乙型季节性流感病毒的阶段性病毒浓度，并且观察到收获水平的初始病毒浓度在整个过程中一直保持到最后阶段，即疫苗批量(cmvp)的制备。[0292][0293]推论：病毒回收率可以计算为制造过程中的病毒保留百分比，其中收获是起点，cmvp是制造的终点。从结果可以得出结论，平均病毒回收率为44.67％，这相当于0.34logeid50/0.5ml的滴度损失。还观察到cmvp水平的最终病毒回收率(病毒滴度)在可接受的范围内，并且cmvp可用于生产基于mdck的laiv病毒的最终产品批次。[0294]实施例7：cmvp制造过程中阶段性宿主细胞dna浓度的比较数据[0295]对不同毒株的澄清病毒库(cvp)进行苯甲酸酶处理，并且对dna含量进行分阶段取样。以下是各阶段dna含量的结果。[0296][0297]推论：[0298]从结果可以看出，cvp在用苯甲酸酶处理时显示出dna的显著减少。并且进一步观察到，在tff过程(渗滤/浓缩)和cmvp制备过程中，残留的dna再次被有效去除。最终cmvp水平的dna含量在期望的和可接受的限度内。[0299]实施例8：tff实验的各种尝试[0300]考虑参数，比如用于tff过程的稀释介质(病毒培养基和pbs)、渗滤和浓缩程序，进行了各种tff实验。测试tff浓缩物样品的病毒浓度。[0301][0302]a/cal：a/17/加利福尼亚/2009/38；[0303]b/tex＝b/德克萨斯/02/2013‑cdc‑lv8b；[0304]a/hk＝a/17/香港/2014/8296；[0305]vm：病毒培养基[0306]解释：[0307]从上一组实验中，tff过程得到发展，并且接着选择2xdf和4x浓缩阶段，以获得具有最佳病毒产量的期望tff浓缩物。与vm相比，pbs对病毒具有更好的稳定性。[0308]实施例9：免疫原性结果[0309]进行研究，以评估基于蛋和mdck细胞培养的三价和四价季节性流感疫苗在雪貂模型中的免疫反应和疫苗效力。所有动物在第0天使用基于蛋和mdck细胞培养物的三价或四价制剂进行鼻内免疫，该制剂包含类似于a/密歇根/45/2015(h1n1)、a/香港/4801/2015(h3n2)、b/布里斯班/60/2008和b/普吉岛/3073/2013的毒株，并在四个星期后(第28天)进行挑战。[0310]表19：第28天收集的血清的几何平均血凝抑制(hai)和中和效价(nt)[0311][0312][0313]推论：(参考图12和图13)[0314]得出的结论是，用含有甲型‑h1n1的基于蛋和基于mdck的三价和四价疫苗可保护动物在受到同源甲型‑h1n1病毒挑战时免受甲型‑h1n1感染。[0315]另一项研究旨在评估基于蛋和mdck细胞的单价laiv(甲型‑h5n2和甲型‑h7n9)在雪貂模型中的免疫反应和功效。不同组的动物用基于甲型‑h5n1和甲型‑h7n9单价laiv的蛋和mdck细胞培养物免疫，并且分别用同源甲型‑h5n1和甲型‑h7n9病毒挑战。结果显示，用单价h5n2laiv免疫的动物免受甲型‑h5n1病毒的同源挑战。用单价甲型‑h7n9laiv免疫的动物免受甲型‑h7n9病毒的同源挑战。当前第1页12当前第1页12
背景技术：
：：2.下面本文的背景信息与本公开有关，但不一定是现有技术。3.由传染性病原体引起的流行病和大流行病已经发生了几个世纪，造成重大破坏，发病率和死亡率各不相同。流感病毒已经成为大流行历史的主要参与者之一。上个世纪发生了四次流感大流行，并且迄今为止至少记录了15次流感大流行，估计仅在1918至1919年就有5000万人死亡。4.疫苗在病毒传播的控制中发挥重要的作用，并且灭活流感疫苗(iiv)以及减毒活流感疫苗(laiv)已使用了许多年。当循环毒株与疫苗抗原性地匹配时，广泛使用的肠胃外施用的灭活流感疫苗诱导血清抗体反应，有效预防流感疾病。相比之下，减毒活流感疫苗(laiv)是鼻内给药，模仿自然感染，诱导局部和全身体液和细胞免疫反应，为匹配的毒株以及漂移的毒株提供保护。另外，laiv的无针施加可降低接受门槛，并且从而提高流感疫苗的覆盖率。5.迄今为止，laiv已在美国(自从2003年)、欧洲(自从2010年)、俄罗斯(自从1980年代)和印度(自从2010年)获得许可。laiv基于20世纪60年代美国和俄罗斯独立但以基本相同的方式开发的减毒甲型流感和乙型流感主供体病毒(mdv)。med免疫季节性和流行性laiv病毒目前是通过反向遗传学(rg)产生的。相比之下，俄罗斯laiv是通过在鸡胚中传统的基因重组产生的。俄罗斯laiv最近正在中国和泰国注册使用。6.俄罗斯laiv由重组病毒组成，重组病毒在来自(mdv)的剩余6个内部蛋白基因(pb1、pb2、pa、np、m和ns)的骨架上含有来自感兴趣的循环野生型(wt)病毒的血凝素(ha)基因区段和大多数情况下神经氨酸酶(na)基因区段。a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)(len‑mdv)和b/ussr/60/69mdv目前在俄罗斯用作laiv的mdv。mdv在多个基因区段中含有突变，使得它们为为冷适应的(ca)、温度敏感的(ts)并且减毒的(att)。当代毒株的表面糖蛋白血凝素(ha)和神经氨酸苷酶(na)通过重排并入这些mdv中。它们的ca、ts和att表型指示laiv在低温下复制，并且在较高温度(>38℃)下停止复制，限制了对上呼吸道的复制。与在美国使用的mdv相比，俄罗斯mdv含有更少的在基因区段的不同位点存在的突变，提示它们可被不同地减毒。在动物和人中的直接比较提示俄罗斯mdv和其衍生的单个毒株重排体比等效物更具免疫原性。7.多年来，俄罗斯laiv已被安全施用至7500多万人，并且已经证明在减毒(遗传稳定性)和传播方面是安全的。毒性的逆转(减毒表型的丢失)从未被观察到，并且极不可能发生，因为它需要在多个基因区段中的多个突变的逆转。俄罗斯laiv病毒的神经毒性从未被报道过，并且mdv和其衍生的重排体二者都显示不具有神经毒性特性。在施用laiv之后，除了在少数病例中报告的自限性流感样症状(流鼻涕、鼻塞、喉咙痛、咳嗽、头痛和低烧)外，没有与免疫相关的严重不良事件的报告。除了安全外，laiv已经显示在预防流感病毒感染引起的疾病方面是有效的。laiv诱导的免疫是广泛的，并且已经显示针对漂移毒株的保护。特别是在儿童中，laiv在临床保护和/或对培养确认的流感的保护方面比灭活流感疫苗更有效，也已经显示具有群体免疫作用。8.与灭活流感疫苗一样，俄罗斯laiv使用鸡胚生产，其自身固有的缺点限制了疫苗质量供应商，并且不含特定病原体的蛋需要提前至少4个月提前订购，然后这些蛋才能用于大规模疫苗生产。蛋孵育、收获等的专业设施又限制了快速扩大规模的能力。生产依赖蛋的疫苗所需的时间延长，可能导致用于应对大流行情况(例如2009年发生的情况)或阻止源自高致病性流感病毒的大流行的可用剂量太少。因此，目前的疫苗生产系统不足以应对流感大流行，为此需要一种新型的快速应急疫苗生产工艺。从理论上讲，在细胞培养中生产流感疫苗在大流行的情况下提供了重要的优势。使用其他病毒疫苗的预先存在的组织培养制造单位可以轻松实现疫苗的大规模生产。9.控制底物一致性和生产灵活性的可用性，快速扩大规模，这在大流行的情况下尤为重要，不依赖蛋供应和鸡群的维护是组织培养方法的主要优点。蛋壳是多孔结构，蛋外面不是无菌的。在蛋中培养流感病毒的制造过程需要刺破蛋壳进行接种和开放式处理以进行收获，这具有固有的污染风险。此外，细胞培养是一个更受控制的系统，具有确定的细胞培养基和符合良好生产规范(gmp)的经过验证的细胞库，因此，已经尝试将生产从蛋转移到细胞培养。10.目前正在研究几种细胞系，以用于基于细胞培养生产流感病毒，并且已经报道了mrc‑5细胞(参考：deona等(1995)jclinmicrobiol33：1948‑49)、hepg2细胞(参考：ollier等(2004)jclinmicrobiol42(12):5861‑5)、llc‑mk2细胞(参考：schepetiuk和kok(1993)jvirolmethods42(2‑3):241‑50)、马丁达比狗肾(mdck)细胞(参考：tobita等(1975)medmicrobiolimmunol(berl).162(1):9‑14和23‑27)、非洲绿猴vero细胞(参考：monto等(1981)jclinmicrobiol13(1)：233‑235和govorkova等(1995)jinfectdis.172(1):250‑3)和per.c6细胞(参考：cox，r.j.等；vaccine2009，27，1889‑1897)的使用。以前，对于mrc‑5、wi‑38和frhl细胞，已经报道了具有等于或低于5.0log10tcid50/ml的低等至中等滴度的病毒，而对于mdck细胞，已经报道了高达6.7log10tcid50/ml的病毒滴度。尽管细胞培养衍生的流感疫苗(适应/优化细胞培养生长的蛋分离流感病毒)在欧洲(optaflunovartis；2007)和美国(flucelvaxnovartis；2012)获得了许可，但是市场上只有很小一部分流感疫苗是细胞培养衍生的。这可能是由于使用细胞培养生产系统结合常规的纯化方法和繁琐的稳定实践，流感疫苗的产量不一致。与使用连续细胞系(如mdck细胞)相关的理论上的安全性问题已被提出，这与它们在疫苗生产中的使用有关(vrbpac，2008)。这些问题主要与疫苗药物产品中残留的细胞组分(dna和蛋白质)有关，尤其是与传统的灭活流感疫苗一样既没有灭活也没有经过广泛生化纯化的减毒活流感疫苗(laiv)产品疫苗。已经采取两种策略来将这些风险最小化：细胞系表征和疫苗纯化处理步骤。纯化过程的一个特定方面是减少疫苗产品中残留宿主细胞dna的数量和大小。optaflunovartis(2007)的制造包括消除残留宿主细胞dna的多个步骤。这些包括结合流感病毒并且允许dna通过的硫酸纤维素离子交换色谱和随后的ctab沉淀步骤，尤其是沉淀dna。11.先前报道的纯化过程成本高并且耗时，因为它们采用一种或多种来自羟基磷灰石、亲和、阴离子交换和尺寸排阻的色谱法。据报道，对于使用色谱方法进行的常规疫苗生产而言，病毒的总体回收率并不理想。此外，由于在该病毒中观察到的抗原漂移(antigenicdrift)和抗原漂变(antigenicshift)，循环流感病毒会发生病毒颗粒的抗原特性的变化。这些变化影响病毒的理化特性，并且进而影响病毒与色谱基质的结合能力。这可导致漂移或漂变毒株的产率出现高度变化，从而使色谱法不适用于常规生产。另一种方法用于去除/减少宿主细胞dna。12.使用更高浓度的苯甲酸酶(例如50u/ml、100u/ml)，其是昂贵的。13.药物制剂中使用的典型非离子表面活性剂包括tritontmx‑100、f‑68、f‑88和f‑127(泊洛沙姆)、brij35(聚氧乙烯烷基醚)、聚氧乙烯硬脂酸酯40、35(聚氧乙烯烷基醚)、聚氧乙烯硬脂酸酯40、el和α‑生育酚tpgs。这些表面活性剂中的每一种都有一个共同的事实，即它们都含有聚氧乙烯部分，并且因此或多或少地表现出类似的问题，即聚氧乙烯部分会自动氧化产生反应性过氧化物，这会导致不需要的蛋白质免疫原性增加(参见edwardt.maggio等；polysorbates，peroxides，proteinaggregation，immunogenicity‑agrowingconcern；journalofexcipientsandfoodchemicals3(2):46‑53；2012)。14.各种稳定剂用于稳定疫苗制剂以实现期望的保质期。稳定剂，比如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、海藻糖和山梨糖醇也用于病毒制剂。然而，据报道，pvp破坏减毒活病毒制剂的稳定性。(参考：jawhite等；developmentofastableliquidformulationofliveattenuatedinfluenzavaccine；vaccinevolume34，issue32，12july2016，pages3676‑3683；2016)。15.海藻糖成本高；它必须与其他糖类和蛋白质添加剂(明胶)结合才能达到稳定性。而且，其他稳定剂在提高冻干疫苗的保质期稳定性方面优于海藻糖。16.山梨糖醇的玻璃化转变温度(tg)(‑1.6℃)较低，因此不能用作主要配方组分。山梨糖醇的低tg限制了其使用。山梨糖醇必须与其他糖类和蛋白质添加剂(明胶)结合才能实现稳定性。17.有人建议，对于疫苗给药途径，应考虑宿主残留dna对产品安全性的理论影响，因为组织分布和清除率可基于施用方式而不同。研究表明，mdckdna从组织中的吸收和清除取决于施用途径而不同。与肌肉注射相比，鼻内施用dna时，可检测的dna水平在所有时间点均较低。因此，疫苗的鼻内施用途径似乎降低与细胞培养生产的最终疫苗产品中可能存在的残留宿主细胞dna相关的潜在风险。(参考：d.e.tabor等；biologicals41(2013)247‑253)。18.本公开的目的是克服上述限制，并且同样提供用于制造基于鼻内递送的流感病毒减毒活疫苗(laiv)的mdck(马丁达比狗肾)细胞的组合物和方法，以预防流感病毒。本公开进一步提供了改进的制造方法，该方法利用低浓度的核酸内切酶，更具体地是苯甲酸酶，并且没有适合大规模细胞培养生产的色谱步骤。更进一步，本公开提供了不含聚合物和表面活性剂的laiv制剂，其包括一种或多种减毒活流感疫苗病毒。技术实现要素：19.本公开提供基于mdck细胞的鼻内递送减毒活流感疫苗(laiv)组合物，其包括：20.a)一种或多种减毒活流感疫苗病毒；21.其中，减毒活流感疫苗毒株是通过重排的“典型”或“反向遗传学”方法衍生的，基本上由来自野生型大流行性或季节性流感病毒的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因以及表达pb1、pb2、pa、np、m和ns蛋白的基因组成，并且在某些情况下，na蛋白衍生自主供体病毒(mdv)a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)和/或b/ussr/60/69毒株，22.b)一种或多种氨基酸，23.c)一种或多种碳水化合物，和24.d)明胶。25.本公开进一步提供了用于制造这种疫苗组合物/制剂的方法。26.目的27.本文的至少一种实施方式满足的本公开的一些目的如下：28.本公开的目的是缓解现有技术的一个或多个问题或至少提供一种有用的可选方案。29.本公开的另一目的是提供疫苗组合物和制造可鼻内递送的减毒活流感疫苗(laiv)的方法。30.本公开的又一目的是提供基于马丁达比狗肾(mdck)细胞的减毒活流感疫苗(laiv)组合物，其中完全避免使用蛋。31.本公开的又一目的是提供包括一种或多种减毒活流感疫苗病毒并且不含聚合物和表面活性剂的laiv组合物。32.本公开的又一目的是提供包括一种或多种减毒活流感疫苗病毒的laiv组合物，其中laiv毒株基于主供体病毒(mdv)的冷适应、温度敏感和减毒的表型，所述主供体病毒(mdv)包含一个或两个野生型大流行性或季节性流感毒株的表面糖蛋白。33.本公开的又一目的是提供基于mdck细胞的鼻内递送的减毒活流感疫苗(laiv)组合物，其中组合物保留了病毒的期望特征，包括免疫原性和稳定性。34.本公开的又一目的是提供基于mdck细胞的鼻内递送的减毒活流感疫苗(laiv)组合物/制剂，其适用于治疗或预防流感病毒感染，或预防、缓解或延迟其临床表现的发作或进展。35.本公开的又一目的是在基于mdck细胞的减毒活流感疫苗生产领域中提供适于大规模细胞培养生产的改进方法。36.本公开的其他目的和优点将在不旨在限制本公开的范围的以下描述中更显而易见。附图说明37.现在将在以下所列出的附图的帮助下描述本公开：38.图1阐释了野生型大流行性或季节性流感病毒和减毒mdv的重排产生重排疫苗毒株的示意图，其中(a)代表野生型病毒传染性病原体，(b)代表包括温度敏感(ts)、冷适应(ca)和减毒(at)表型基因区段的主供体病毒，并且(c)代表重排疫苗毒株。39.图2：图表阐释了甲型流感毒株(a/17/土耳其/土耳其/05/133‑a/h5n2)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3b中公开的稳定剂组合物1在37℃下的稳定性。40.图3：图表阐释了甲型流感毒株(a/17/土耳其/土耳其/05/133‑a/h5n2和a/17/安徽/2013/61‑a/h7n9)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3a中公开的稳定剂组合物1在2℃至8℃下的稳定性。41.图4：图表阐释了甲型流感毒株(a/17/加利福尼亚/2009/38‑a/h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3b中公开的稳定剂组合物3在37℃下的稳定性。42.图5：图表阐释了甲型流感毒株(a/17/加利福尼亚/2009/38‑a/h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3a中公开的稳定剂组合物3在2℃至8℃下的稳定性。43.图6：图表阐释了甲型流感毒株(a/17/加利福尼亚/2009/38‑a/h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3b中公开的稳定剂组合物4在37℃下的稳定性。44.图7：图表阐释了甲型流感毒株(a/17/加利福尼亚/2009/38‑a/h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3a中公开的稳定剂组合物4在2℃至8℃下的稳定性。45.图8：图表阐释了甲型流感毒株(a/南非/3626/13‑h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3b中公开的稳定剂组合物2在37℃下的稳定性。46.图9：图表阐释了甲型流感毒株(a/南非/3626/13‑h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3a中公开的稳定剂组合物2在2℃至8℃下的稳定性。47.图10：图表阐释了甲型流感毒株(a/南非/3626/13‑h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3b中公开的稳定剂组合物1在37℃下的稳定性。48.图11：图表阐释了甲型流感毒株(a/南非/3626/13‑h1n1)和乙型流感毒株(b/德克萨斯/02/13‑cdc)病毒对数产率滴度(eid50/0.5ml)与表3a中公开的稳定剂组合物1在2℃至8℃下的稳定性。49.图12：鼻甲和肺样本中的感染病毒测试。动物接种一个或两个剂量的h5laiv、h7laiv或安慰剂。第1至第4组用h5/tk/tk挑战，第5和第6组用h5/vt挑战，第7至第10组用h7/an挑战。滴定感染后第4天收集的鼻甲样本(a)和肺样本(b)，以确定是否存在可复制的病毒颗粒。单个滴度以黑实线指示的组平均值显示。50.图13：免疫后的hi和vn抗体反应。在最终免疫后第28天(一剂方案研究第28天，两剂方案研究第56天)，针对h5laiv免疫动物的同源挑战病毒h5/tk/tk和h7laiv免疫动物的h7/an的几何平均抗体反应。(a)hi抗体滴度，(b)vn抗体滴度。每组n＝6，误差条代表平均值的标准误差。统计显著性由mann‑whitney的u检验确定。*p<0.05和**p<0.01。具体实施方式51.尽管本公开可具体不同的实施方式，但是在附图和以下的详细描述中显示了某些实施方式，应当理解，本公开可认为是本公开的原理的示例，并且不旨在将公开的范围限制在本说明书中阐释和公开的范围。52.现在将参考附图描述本公开的实施方式。53.提供实施方式，以向本领域技术人员重复和完整地传达本公开的范围。阐述了与特定组分和方法相关的大量细节，以提供对本公开的实施方式的完整理解。对本领域技术人员而言显而易见的是，实施方式中提供的细节不应被解释为限制本公开的范围。在一些实施方式中，未详细描述公知的工艺、公知的装置结构和公知的技术。54.本公开中使用的术语仅用于解释特定实施方式的目的，并且这种术语不应认为限制本公开的范围。除非上下文另外明确地指出，否则如在本公开中使用的，形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述”也可旨在包括复数形式。55.术语第一、第二、第三等不应解释为限制本公开的范围，因为前述术语可仅用于将一个元件、组分、区域、层或部分与另一组分、区域、层或部分区分开来。除非本公开明确地指出，否则当在本文中使用时，术语，比如第一、第二、第三等不表示特定的序列或顺序。56.如本文使用的，术语“流感病毒”指包括代表正粘病毒科的甲型、乙型、丙型和丁型流感病毒的rna病毒。流感病毒可为活的野生型大流行性或季节性流感病毒、活的减毒流感疫苗病毒、灭活流感病毒、嵌合流感病毒或重组流感病毒。57.本公开提供了包括减毒活流感疫苗(laiv)病毒的组合物，用于保护免受流感病毒感染。本公开进一步提供了用于制造包括一种或多种流感疫苗病毒的组合物的方法。58.根据本公开的第一实施方式，laiv组合物可包括一种或多种减毒活流感疫苗病毒、一种或多种氨基酸、一种或多种碳水化合物和明胶。59.术语“活的”以其常规含义使用，活病毒是未被灭活的病毒，即能够在允许的细胞上复制的病毒。减毒活流感疫苗病毒是不在动物或人中诱发由相应野生型病毒引起的疾病并且能够诱发特异性免疫反应的病毒。60.根据本公开的第二实施方式，一种或多种减毒活流感疫苗病毒可通过包括来自一种或多种流感毒株的基因区段的“典型”或“反向遗传学”重排方法衍生。61.根据第二实施方式的第一方面，重排减毒活流感疫苗病毒是重排laiv病毒，其以1:7、2:6、3:5、4:4、5:3、6:2或7:1的比例包括主供体病毒(mdv)毒株的冷适应、温度敏感和/或减毒表型基因区段(pb1、pb2、pa、np、m和/或ns蛋白)和野生型大流行性或季节性甲型流感病毒或乙型流感病毒或丙型流感病毒毒株的血凝素(ha)基因区段和/或神经氨酸酶(na)基因区段。62.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒可以6:2的比例包括来自主供体病毒(mdv)毒株的基因区段和所述野生型大流行性或季节性流感病毒毒株(如图1中阐释)。63.根据第二实施方式的第二方面，重排减毒活流感疫苗病毒可包括衍生自任何亚型的甲型流感病毒或可衍生自任何亚型的乙型流感病毒的主供体病毒(mdv)的基因区段。64.重排减毒活流感疫苗病毒可能包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)选自包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感毒株、b/ussr/60/69乙型流感毒株的组中。65.仍优选地，重排减毒甲型流感疫苗病毒可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感毒株。66.仍优选地，重排减毒活流感疫苗甲型毒株a/17/加利福尼亚/2009/38可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感毒株。67.仍优选地，重排减毒活流感疫苗甲型毒株a/17/土耳其/土耳其/05/133可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感。68.仍优选地，重排减毒活流感疫苗甲型毒株a/17/安徽/2013/61可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感。69.仍优选地，重排减毒活流感疫苗甲型毒株a/17/纽约/15/5364可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感。70.仍优选地，重排减毒活流感疫苗甲型毒株a/17/香港/2014/8296可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感。71.仍优选地，重排减毒活流感疫苗甲型毒株a/南非/3626/2013‑cdc‑lv14a可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括a/列宁格勒/134/17/57(h2n2)甲型流感。72.仍优选地，重排减毒乙型流感疫苗病毒可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括b/ussr/60/69b型流感毒株。73.仍优选地，重排减毒活疫苗乙型流感毒株b/德克萨斯/02/2013‑cdc‑lv8b可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括b/ussr/60/69b型流感毒株。74.仍优选地，重排减毒活疫苗乙型流感毒株b/普吉岛/3073/2013可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括b/ussr/60/69b型流感毒株。75.仍优选地，重排减毒活疫苗乙型流感毒株b/56/布里斯班/60/08可包括来自主供体病毒(mdv)的基因区段，主供体病毒(mdv)包括b/ussr/60/69b型流感毒株。76.根据第二实施方式的第三方面，重排减毒活流感疫苗病毒可包括来自甲型流感病毒或乙型流感病毒或丙型流感病毒的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。77.仍优选地，重排减毒活流感甲型疫苗毒株可包括来自甲型流感病毒ha亚型h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、h17或h18任何其他报告的ha亚型的血凝素(ha)基因和/或来自甲型流感病毒na亚型n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、n10或n11或任何其他报告的na亚型的神经氨酸酶(na)基因。78.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒可包括来自大流行性流感毒株或潜在大流行性流感毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。79.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒可包括来自季节性流感毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。80.仍优选地，重排减毒活流感疫苗毒株可包含来自甲型流感病毒亚型h1n1、h2n2、h3n2、h5n1、h5n2、h9n2、h7n1、h7n3、h7n7、h6n1、h7n9和h10n8或任何其他先前报告的或新检测到的毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。81.仍优选地，重排减毒活流感疫苗毒株可包含来自甲型流感病毒pdmh1n1毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。82.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒株可包含来自甲型流感病毒a/加利福尼亚/07/2009(称为a/cal)样毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。83.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒株可包含来自甲型流感病毒a/密歇根/45/2015样毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。84.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒株可包含来自甲型流感病毒株a/南非/3626/2013样毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。85.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒株可包含来自甲型流感病毒h3n2‑a/香港/4801/2014样毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。86.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒株可包含来自属于两个不同谱系yamagata样或维多利亚样的乙型流感病毒的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。87.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒株可包含来自乙型流感病毒维多利亚谱系b/布里斯班/60/2008样毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。88.仍优选地，重排减毒活流感疫苗病毒株可包含来自乙型流感病毒yamagata谱系b/普吉岛/3073/2013样毒株的血凝素(ha)基因和/或神经氨酸酶(na)基因。89.产生重排体有两种方法90.1.典型的重排方法91.重排体毒株的野生型大流行性或季节性流感疫苗病毒和减毒mdv的重排过程包括用mdv毒株和野生型病毒毒株共同感染培养宿主(通常是蛋)。通过添加对mdv的ha和/或na蛋白具有特异性的抗体来选择重排病毒，以便选择包含野生型病毒株的ha和/或na蛋白的重排病毒。经过几代这样的处理，可选择包含野生型大流行性或季节性流感疫苗病毒株ha和/或na片段以及mdv的内部基因的快速生长的重排病毒。92.2.重排的反向遗传方法93.反向遗传是从dna复制产生传染性病毒颗粒的方法。mdv的六个内部基因以及来自推荐用于包括在疫苗中的野生型毒株的ha和na基因被克隆在质粒中，当在培养细胞中转染时，质粒可产生全长病毒rna。这些质粒与四个表达病毒聚合酶亚基的质粒一起被转染到培养细胞中。聚合酶亚基的表达和全长病毒rna的产生导致病毒组装和上清液中传染性病毒颗粒的释放。这种恢复的病毒表现出推荐的毒株的抗原特征以及mdv的ca、ts、att表型。94.重排laiv毒株采购自俄罗斯圣彼得堡实验医学研究所(iem)或who合作中心，比如亚特兰大疾病控制和预防中心(cdc)。95.根据本公开的第三实施方式，laiv组合物可包括一种或多种碳水化合物，碳水化合物选自但不限于下述的组中：天然碳水化合物、合成碳水化合物、多元醇、玻璃转变促进剂、单糖、二糖、三糖、低聚糖及它们相应的糖醇、多羟基化合物，比如碳水化合物衍生物和化学改性的碳水化合物、羟乙基淀粉和糖共聚物。天然碳水化合物和合成碳水化合物二者都适合使用。合成碳水化合物包括但不限于糖苷键被硫醇键或碳键取代的那些。可以使用d形式和l形式的碳水化合物。碳水化合物可为非还原性的或还原性的。当使用还原性碳水化合物时，优选添加美拉德反应抑制剂。适用于组合物中使用的还原性碳水化合物是本领域已知的那些并且包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麦芽酮糖和乳果糖。非还原性碳水化合物包括但不限于选自糖醇和其他直链多元醇的多羟基化合物的非还原性糖苷。其他有用的碳水化合物包括棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、纤维二糖、甘露二糖和糖醇。糖醇糖苷优选为单糖苷，特别是通过还原二糖，比如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖获得的化合物。玻璃形成剂选自由下述组成的组中：蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、甘露糖、棉子糖、乳糖醇、乳糖醛酸、葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、麦芽糖、乳糖山梨糖醇、葡萄糖、果糖、甘油或其组合。96.然而，根据第三实施方式的优选方面，laiv组合物可包括范围在1％和20％重量/体积之间，优选在1％‑10％之间，更优选在3％‑6％之间，最优选等于4％(w/v)的蔗糖作为合适的碳水化合物稳定剂。97.根据本公开的第四实施方式，laiv组合物可包括一种或多种氨基酸选自但不限于下述的组中：三(羟甲基)甲基甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、丙氨酸、肽、水解蛋白质或蛋白质，比如血清白蛋白。98.仍根据第四实施方式的优选方面，laiv组合物可单独或组合包括三(羟甲基)甲基甘氨酸、精氨酸、组氨酸和丙氨酸作为合适的氨基酸。99.仍根据第四实施方式的优选方面，一种或多种氨基酸可包括范围在0.1％和2％重量/体积(w/v)之间，优选地在0.1％‑1％之间，更优选地在0.1％‑0.5％之间，最优选地等于0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸。100.仍根据第四实施方式的优选方面，一种或多种氨基酸可包括范围在0.1％至2％(w/v)之间，优选地在0.1％‑1％之间，更优选地在0.1％‑0.5％之间，最优选地等于0.21％(w/v)的组氨酸。101.仍根据第四实施方式的优选方面，一种或多种氨基酸可包括范围在0.01％和1％重量/体积之间，优选地在0.05％‑0.5％之间，更优选地在0.08％‑0.2％之间，最优选地等于0.1％(w/v)的丙氨酸。102.并且，根据第四实施方式的优选方面，所述一种或多种氨基酸可包括范围在0.1％和10％重量/体积之间，优选地在0.1‑5％之间，更优选地在0.1‑3％之间，最优选地等于2.1％(w/v)的精氨酸。103.根据本公开的第五实施方式，laiv组合物可包括范围在0.1％至10％重量/体积之间，优选地在0.1％‑5％之间，更优选地在0.1％‑3％之间，最优选地等于0.85％(w/v)的明胶。104.如本文使用的，术语“明胶”是指通过动物胶原的部分酸水解(a型明胶)或部分碱水解(b型明胶)产生的无菌无热原蛋白质制剂(例如，级分)，最常见的来源是牛、猪和鱼。可以获得不同分子量范围的明胶。也可使用重组明胶来源。105.根据本公开的第六实施方式，laiv组合物可另外包括选自由下述组成的组中的缓冲剂：hepes、柠檬酸盐‑磷酸盐、碳酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐和酒石酸盐缓冲剂，以及包括磷酸盐缓冲剂的更复杂的有机缓冲剂，磷酸盐缓冲剂以选择的比例含有磷酸钠和/或磷酸钾，以实现期望的ph值。在另一实施例中，缓冲剂包含三(羟甲基)氨基甲烷或“tris”，其被配制为实现期望的ph值。仍在另一实施例中，缓冲剂可为具有汉克斯盐的最低限度基本培养基。106.根据本公开的第七实施方式，其中单剂量组合物不含防腐剂，并且多剂量组合物可另外包括选自包括下述的组中的防腐剂：2‑苯氧乙醇、苄索氯铵(phemerol)、苯酚、间甲酚、硫柳汞、甲醛、对羟基苯甲酸酯(例如，甲基‑、乙基‑、丙基‑或丁基对羟基苯甲酸酯)、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对氯‑间甲酚或苯甲醇或其组合。疫苗组合物可包括用于单次免疫的材料，或可包括用于多次免疫的材料(即“多剂量”试剂盒)。在多剂量布置中优选包括防腐剂。作为在多剂量组合物中包括防腐剂(或除了防腐剂)的可选方案，组合物可包含在具有用于去除材料的无菌适配器的容器中。107.根据本公开的第八实施方式，laiv组合物可另外包括药学上可接受的转运蛋白、赋形剂、粘结剂、载体、等渗剂、乳化剂或湿润剂，其中药学上可接受的赋形剂选自由下述组成的组中：表面活性剂、聚合物和盐。表面活性剂的示例可包括非离子表面活性剂，比如聚山梨酯20、聚山梨酯80等。聚合物的示例可包括葡聚糖、羧甲基纤维素、透明质酸、环糊精等。盐的示例可包括nacl、kcl、kh2po4、na2hpo4.2h2o、cacl2、mgcl2等。108.根据本公开的第九实施方式，laiv组合物可另外包括选自下述的组中的佐剂：氢氧化铝、磷酸铝、羟基磷酸铝和硫酸钾铝或其混合物。109.根据本公开的第十实施方式，laiv组合物另外包括选自由下述组成的组中的免疫刺激组分：油水乳液、mf‑59、脂质体、脂多糖、皂苷、脂质a、脂质a衍生物、单磷酰脂质a、3‑脱酰单磷酰脂质a、as01、as03、寡核苷酸、包括至少一种未甲基化的cpg和/或脂质体的寡核苷酸、弗氏佐剂、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、聚合物、共聚物，比如聚氧乙烯‑聚氧丙烯共聚物，包括嵌段共聚物、聚合物p1005、crl‑8300佐剂、胞壁酰二肽、tlr‑4激动剂、鞭毛蛋白、源自革兰氏阴性细菌的鞭毛蛋白、tlr‑5激动剂、能够结合tlr‑5受体的鞭毛蛋白的片段、α‑c‑半乳糖基神经酰胺、脱乙酰甲壳质、白细胞介素‑2、qs‑21、iscoms、皂苷与甾醇和脂质的组合。110.根据本公开的第十一实施方式，制备基于mdck细胞培养物的laiv组合物的方法可包括以下步骤的任何子集或全部：111.a)将laiv候选疫苗病毒最初在spf鸡胚中传代，产生基于蛋的主种子病毒(msv)。112.b)基于蛋的主种子病毒适于在细胞培养宿主上生长，以制备基于细胞的工作种子病毒(wsv)。该基于细胞的wsv在不同的细胞培养容器/系统，比如表面积为175cm2的组织培养瓶(tcfs)、表面积为850cm2的滚瓶(rbs)、表面积为6320cm2的细胞设施(cfs)和固定床生物反应器(例如，来自生命科学公司(华盛顿港，纽约)的生物反应器，比如nano生物反应器和500/100生物反应器)中培养和繁殖。113.c)收获培养的病毒。114.d)通过至少一个澄清过滤器，通过直流过滤(dff)来过滤病毒收获物，以获得澄清病毒库(cvp)。115.e)用非特异性核酸内切酶处理cvp，以降解细胞dna。116.f)将处理的核酸内切酶处理的cvp进行切向流过滤。117.g)用包括一种或多种碳水化合物、一种或多种氨基酸和明胶的稳定剂组合物稳定tff浓缩物，以形成稳定的病毒收获物。118.h)经过至少一个灭菌级过滤器通过dff将稳定的tff浓缩物灭菌，以获得灭菌的澄清单价病毒库(cmvp)。119.i)将灭菌的cmvp在‑60℃或更低下储存在聚碳酸酯瓶中。120.j)将灭菌的制剂装入小瓶中并且在2℃至8℃下储存。121.根据第十一实施方式的第一方面，适于在细胞培养宿主中生长的基于蛋的laiv病毒候选物可为任何真核细胞。仍优选地，细胞培养宿主可为哺乳动物或鸟类细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于仓鼠、牛、灵长类动物(包括人和猴)和狗细胞。各种细胞类型包括但不限于肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞和肺细胞。合适的仓鼠细胞的示例是名称为bhk21或hkcc的细胞系。合适的猴细胞是例如非洲绿猴细胞，比如vero细胞系中的肾细胞。合适的狗细胞是例如cldk和mdck细胞系中的肾细胞。122.进一步合适的细胞包括但不限于：cho；293t；bhk；mrc5；per.c6；frhl.2；wi‑38等。合适的细胞广泛地从例如美国典型细胞培养物(atcc)保藏中心、coriell细胞库或欧洲细胞培养物保藏中心(ecacc)获得。例如，atcc提供目录号为ccl81、ccl81.2、crl1586和crl‑1587的各种不同的vero细胞，并且其提供目录号为ccl34的mdck细胞。per.c6可从ecacc获得，保藏号为96022940。123.仍优选地，细胞培养宿主可为马丁达比狗肾(mdck)细胞，选自但不限于atccccl‑34、mdck33016细胞系(dsmacc2219)、mdck(atccccl34mdck(nbl2))、mdck33016(dsmacc2219)、dsmacc3309、atcccrl‑12042、atccpta‑7909、atccpta‑7910、atccpta‑6500、atccpta‑6501、atccpta‑6502、atccpta‑6503、“mdck‑s”、“mdck‑sf101”、“mdck‑sf102”、“mdck‑sf103”和fermbp‑7449。124.仍优选地，细胞培养宿主可为马丁达比狗肾(mdck)细胞atccccl34(nbl2)。125.根据第十一实施方式的第二方面，mdck细胞可在包括10％胎牛血清(fbs)的最低必需培养基(mem)中培养。细胞的培养可在37℃±1℃下进行。感染前细胞的增殖期间培养基的ph值可在ph6.8和ph7.6的范围内，并且更优选地在ph7.0和ph7.4的值之间。126.仍然，mdck细胞可在无血清或无蛋白质的培养基中培养。127.根据第十一实施方式的第三方面，在感染之前，mdck细胞可用mem冲洗，并且随后用含有范围为5u/ml至25u/ml的蛋白酶的mem冲洗。128.然而，蛋白酶可选自但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、真菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶。129.仍优选地，蛋白酶可为从猪来源或牛来源或真菌来源或细菌来源获得的胰蛋白酶。130.仍优选地，蛋白酶可为在酵母或植物或细菌的宿主细胞中表达的重组胰蛋白酶，宿主细胞选自但不限于曲霉属、灰色链霉菌、玉米、大肠杆菌、毕赤酵母。优选地，所述重组胰蛋白酶选自biogenomics(大肠杆菌作为宿主)、d.k.biopharmapvt.ltd(大肠杆菌作为宿主)、richcore(毕赤酵母作为宿主)和gibco(真菌)。131.仍然，优选的胰蛋白酶浓度是12.5u/ml。132.根据第十一实施方式的第四方面，在感染之前，工作种子病毒可通过用含有范围为5u/ml至25u/ml的蛋白酶的mem稀释病毒，并且在31℃至33℃的温度下孵育10分钟至60分钟。133.蛋白酶可选自但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、真菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶。134.仍优选地，蛋白酶可为从猪来源或牛来源或真菌来源或细菌来源获得的胰蛋白酶。135.仍优选地，蛋白酶可为在酵母或植物或细菌的宿主细胞中表达的重组胰蛋白酶，宿主细胞选自但不限于曲霉属、灰色链霉菌、玉米、大肠杆菌、毕赤酵母。优选地，所述重组胰蛋白酶选自biogenomics(大肠杆菌作为宿主)、d.k.biopharmapvt.ltd(大肠杆菌作为宿主)、richcore(毕赤酵母作为宿主)和gibco(真菌)。136.仍然，优选的胰蛋白酶浓度是12.5u/ml。137.仍然，优选的胰蛋白酶浓度是每个滚瓶2000单位至3000单位的胰蛋白酶。138.根据第十一实施方式的第五方面，用laiv候选病毒感染mdck细胞可以发生在用于生物反应器(4m2)的优选tcf为约40‑60×106/tcf，rb约150‑180×106/rb，和7000‑10000×106/br(4m2)的mdck细胞密度下。139.根据第十一实施方式的第六方面，laiv候选病毒可以以贴壁培养或悬浮培养模式在mdck细胞上生长。140.根据第十一实施方式的第七方面，用基于蛋的laiv候选病毒感染mdck细胞可以以1:100至1:10000之间的moi发生。141.根据第十一实施方式的第八方面，感染后mdck细胞可以在含有范围为5u/ml至25u/ml的胰蛋白酶的最低必需培养基(mem)中并且在32℃±1℃的温度下培养。感染后培养基的ph值可以在ph6.8和ph7.6的范围内，并且最优选在7.2至7.6的范围内。142.根据第十一实施方式的第九方面，感染后可在40至70小时；更优选地可在54±8小时的孵育期后收获细胞上清液。143.仍然可选地，在丢弃输入材料并单独处理以获得澄清单价病毒库(cmvp)之前，可以以适当的时间间隔进行多次收获约4次至5次。144.收获后，可实现至少7.0至9.2logeid50/0.5ml的病毒产量。145.根据第十一实施方式的第十方面，可澄清含有病毒的培养基，通常通过减小孔径(例如，6μ、5μ、0.8μ、0.65μ、0.45μ、0.2μ)的过滤器。合适的市售过滤器和过滤装置是本领域公知的并且可由技术人员选择。示例性过滤装置可由聚丙烯或乙酸纤维素或聚醚砜制成，并且市售过滤器可为millipak(millipore)、kleenpak(pall)和sartobran(sartorius)过滤装置。146.根据第十一实施方式的第十一方面，过滤的收获物可用浓度在0.5单位/ml至2单位/ml之间变化的非特异性核酸内切酶，最优选苯甲酸酶，在范围为30℃至34℃之间的温度下处理2小时至6小时，并且然后在2℃至8℃的温度下5小时至15小时。147.仍可选地，过滤的收获物可在存在量在0.1mm至100mm之间的二价阳离子的情况下，用非特异性核酸内切酶，最优选地苯甲酸酶处理，所述二价阳离子选自由ca2 、mg2 、mn2 和cu2 组成的组中。148.仍可选地，可存在浓度为1mm至3mm的二价阳离子mg2 盐的情况下，用非特异性核酸内切酶，最优选地苯甲酸酶处理过滤的收获物。149.根据第十一实施方式的第十二方面，苯甲酸酶处理的收获物可进一步进行切向流过滤(tff)，通常通过截留分子量(mwco)在100kda至500kda之间的过滤器进行，从而获得2倍至10倍浓缩的病毒收获物，并且进一步去除残留的杂质。150.仍优选地，残留杂质可包括残留dna、残留牛血清白蛋白(bsa)和残留宿主细胞蛋白。151.根据第十一实施方式的第十三方面，上述方法可产生包括痕量残留细胞dna(<10ng/剂量)、残留bsa(<50ng/剂量)和残留细胞蛋白质的纯化和浓缩的laiv病毒收获物。此外，根据上述方法，纯化的病毒的总回收率可为至少40％。152.根据第十一实施方式的第十四方面，浓缩的单价病毒原液(tff浓缩物)可用稳定剂组合物来稳定，以获得包括一种或多种碳水化合物、一种或多种氨基酸和明胶的最终laiv组合物。153.仍优选地，浓缩的病毒原液(tff浓缩物)可用稳定剂组合物来稳定，稳定剂组合物包括蔗糖、组氨酸、丙氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、精氨酸和明胶的任意组合。154.仍优选地，浓缩的病毒原液(tff浓缩物)可用稳定剂组合物来稳定，稳定剂组合物包括浓度为1％至10％(w/v)的蔗糖、浓度为0.1％至2％(w/v)的组氨酸、浓度为0.01％至1％(w/v)的丙氨酸、浓度为0.1％至1％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、浓度为0.1％至5％(w/v)的精氨酸、浓度为0.1％至5％(w/v)的明胶。155.仍优选地，浓缩的病毒原液(tff浓缩物)可用稳定剂组合物来稳定，稳定剂组合物包括浓度为3至6％(w/v)的蔗糖、浓度为0.1％至1％(w/v)的组氨酸、浓度为0.05％至0.5％(w/v)的丙氨酸、浓度为0.1％至0.5％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、浓度为0.1％至3％(w/v)的精氨酸和浓度0.1％至3％(w/v)的明胶。156.仍优选地，浓缩的病毒原液(tff浓缩物)可用稳定剂组合物来稳定，稳定剂组合物包含4％(w/v)的蔗糖、0.21％(w/v)的组氨酸、0.1％(w/v)的丙氨酸、0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、2.1％(w/v)的精氨酸和0.85％(w/v)的明胶。157.根据第十一实施例的第十五方面，稳定的病毒收获物可通过至少一个优选为0.2μ的灭菌级过滤器的直流过滤(dff)灭菌。合适的市售过滤器和过滤装置是本领域公知的并且可由技术人员选择。示例性过滤装置可由聚丙烯或乙酸纤维素或聚醚砜或聚偏二氟乙烯制成，并且市售过滤器可为millipak(millipore)、kleenpak(pall)和sartobrantmp(sartorius)过滤装置。158.根据第十一实施方式的第十六方面，laiv组合物可为多价的，包括多于一种如在稍前的实施方式中公开的laiv病毒株或亚型。laiv组合物可为二价的或三价的或四价的。159.仍可选地，laiv组合物可为单价的，包括如在稍前的实施方式中公开的任何一种laiv病毒株或亚型。160.根据第十一实施方式的第十七方面，laiv组合物可包含剂量为6至7logeid50/0.5ml的流感病毒。161.仍优选地，laiv组合物可包括甲型流感病毒或任何亚型，剂量为6至7logeid50/0.5ml；更优选不小于7logeid50/0.5ml。162.仍优选地，laiv组合物可包含乙型流感病毒或任何亚型，剂量为6至7logeid50/0.5ml；更优选不小于6.5logeid50/0.5ml。163.根据第十二实施例，制备免疫原性组合物的方法可包括以下步骤：164.a)使用流感病毒以1:100至1:10000之间的moi感染mdck细胞培养宿主；165.b)在含有范围为5u/ml至25u/ml的胰蛋白酶的mem中孵育40小时至70小时后收获包括流感病毒的上清液；166.c)通过至少一个孔径在约6微米至约0.45微米之间的澄清过滤器，通过直流过滤(dff)来过滤病毒收获物；167.d)用非特异性核酸内切酶在30℃至34℃范围内的温度下处理cvp2小时至6小时，并且然后在2℃至8℃的温度下处理5小时至15小时；168.e)使用截留分子量(mwco)为100kda至500kda的膜，通过切向流过滤(tff)浓缩核酸内切酶处理的cvp；169.f)用包括一种或多种碳水化合物、一种或多种氨基酸和明胶的稳定剂组合物来稳定tff浓缩物，以形成稳定的病毒收获物；170.g)通过至少一个孔径在约0.8微米至约0.2微米之间的灭菌级过滤器，通过dff将稳定的tff浓缩物灭菌，以形成灭菌的cmvp；171.其中纯化的病毒的总回收率大于或等于40％。172.根据第十二实施方式的第一方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(d)可包括在存在选自由ca2 、mg2 、mn2 和cu2 组成的组中并且量在0.1mm和100mm之间的二价阳离子的情况下，用浓度范围为0.5单位/ml至5单位/ml的非特异性核酸内切酶，更尤其苯甲酸酶处理病毒收获物。173.根据第十二实施方式的第二个方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(d)可包括在存在浓度为1mm至3mm的二价阳离子mg2 盐的情况下，用浓度范围为0.5单位/ml至5单位/ml的非特异性核酸内切酶，更尤其苯甲酸酶处理病毒收获物。174.根据第十二实施方式的第三方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(e)可包括通过切向流过滤(tff)浓缩病毒收获物，得到至少4倍浓缩的病毒收获物。175.根据第十二实施方式的第四方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(f)可包括用稳定剂组合物来稳定病毒收获物，稳定剂组合物包括浓度为1％(w/v)的蔗糖、浓度为0.1％至2％(w/v)的组氨酸、浓度为0.01％至1％(w/v)的丙氨酸、浓度为0.1％至2％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、浓度为0.1％至5％(w/v)的精氨酸和浓度为0.11％至5％(w/v)的明胶。176.根据第十二实施方式的第五方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(f)可包括用稳定剂组合物来稳定病毒收获物，稳定剂组合物包括浓度为3％至6％(w/v)的蔗糖、浓度为0.1％至1％(w/v)的组氨酸、浓度为0.05％至0.5％(w/v)的丙氨酸、浓度为0.1％至0.5％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、浓度为0.1％至3％(w/v)的精氨酸和浓度为0.1％至3％(w/v)的明胶。177.根据第十二实施方式的第六方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(f)可包括用稳定剂组合物来稳定病毒收获物，稳定剂组合物包括4％(w/v)的蔗糖、0.21％(w/v)的组氨酸、0.1％(w/v)的丙氨酸、0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、2.1％(w/v)的精氨酸和0.85％(w/v)的明胶。178.根据第十二实施方式的第六方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(f)可包括用稳定剂组合物来稳定病毒收获物，稳定剂组合物包含4％(w/v)的蔗糖、0.21％(w/v)的组氨酸、0.1％(w/v)的丙氨酸、0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、2.1％(w/v)的精氨酸和1.0％(w/v)的明胶。179.根据第十二实施方式的第七方面，制备免疫原性组合物的方法，其中步骤(f)可包括用稳定剂组合物来稳定病毒收获物，稳定剂组合物包括4％(w/v)的蔗糖、0.21％(w/v)的组氨酸、0.1％(w/v)的丙氨酸、0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸、1.6％(w/v)的精氨酸和1.0％(w/v)的明胶。180.根据本公开的第十三实施方式，免疫原性组合物可包括a)一种或多种减毒活流感疫苗(laiv)病毒，剂量为6至7logeid50/0.5ml；b)1％至10％(w/v)的蔗糖；c)0.1％至2％(w/v)的组氨酸；d)0.01％至1％(w/v)的丙氨酸；e)0.1％至2％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸；f)0.1％至5％(w/v)的精氨酸；g)0.1％至5％(w/v)的明胶。181.仍优选地，所述免疫原性组合物可包括a)一种或多种减毒活流感疫苗(laiv)病毒，剂量为6至7logeid50/0.5ml；b)3％至6％(w/v)的蔗糖；c)0.1％至1％(w/v)的组氨酸；d)0.05％至0.5％(w/v)的丙氨酸；e)0.1％至0.5％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸；f)0.1％至3％(w/v)的精氨酸；g)0.1％至3％(w/v)的明胶。182.仍优选地，免疫原性组合物可包括a)一种或多种减毒活流感疫苗(laiv)病毒，剂量为6至7logeid50/0.5ml；b)4％(w/v)的蔗糖；c)0.21％(w/v)的组氨酸；d)0.1％(w/v)的丙氨酸；e)0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸；f)2.1％(w/v)的精氨酸；g)0.85％(w/v)的明胶。183.仍优选地，免疫原性组合物可包括a)一种或多种减毒活流感疫苗(laiv)病毒，剂量不小于6至7logeid50/0.5ml；b)4％(w/v)的蔗糖；c)0.21％(w/v)的组氨酸；d)0.1％(w/v)的丙氨酸；e)0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸；f)2.1％(w/v)的精氨酸；g)1％(w/v)的明胶。184.仍优选地，所述免疫原性组合物可包括a)一种或多种减毒活流感疫苗(laiv)病毒，剂量为6至7logeid50/0.5ml；b)4％(w/v)的蔗糖；c)0.21％(w/v)的组氨酸；d)0.1％(w/v)的丙氨酸；e)0.3％(w/v)的三(羟甲基)甲基甘氨酸；f)1.6％(w/v)的精氨酸；g)1％(w/v)的明胶。185.根据本公开的第十四实施方式，laiv组合物可为全液体的。186.仍可选地，laiv组合物可为冻干或冷冻干燥的组合物。187.如本文使用的，术语“冷冻干燥”或“冻干(lyophilize)”或“冻干(lyophilization)”涉及冻干并且指悬浮液被冷冻，之后通过在低压升华除去水的过程。如本文使用的，术语“升华”是指组合物的物理性质的变化，其中组合物直接从固态变为气态而不变成液体。188.根据本公开的第十五实施方式，可将laiv组合物配制成用于减少健康状况的发作或预防健康状况的方法，包括通过鼻内或其他途径向人受试者施用有效量的laiv组合物的免疫。189.根据实施方式的优选方面，laiv组合物可以经鼻内途径施用至人受试者。在一个实施方式中，其为鼻内分散装置，比如气雾剂(鼻内喷雾)或液滴递送系统形式的装置。液体鼻腔制剂可经鼻腔喷雾、滴注和鼻导管、压缩空气雾化器、挤压瓶、计量泵喷雾(如多剂量计量喷雾泵或单/双剂量喷雾泵、连接到注射器的喷雾装置)递送。其他剂型可选自鼻粉剂(吹入器、干粉吸入器)、鼻凝胶剂、滴鼻剂、溶液、悬浮液、共溶剂系统、微球、纳米颗粒、微乳剂、鼻插入物。190.鼻内递送装置可选自但不限于bectondickinson(bd)accuspraytm递送装置、bi‑directionaloptinose鼻装置、teleflex的mad鼻内粘膜雾化装置、aerolifetm和aerovax(aerovectrx，inc.，atlanta，ga)、喷射注射器‑无针注射器；munjis多用途喷嘴喷射注射器：aquapuncture装置、用途喷嘴喷射注射器：aquapuncture装置、一次性注射器喷射注射器：vitajettm、lectrajeths、zetajettm、aktiv‑drypuffhalertm和鼻喷流感疫苗设备。191.根据本发明的第十六实施方式，laiv组合物可配制为用于减少下述健康状况的发作或预防下述健康状况的方法，该健康状况包括如本公开的稍前实施方式中公开的甲型流感病毒感染或其亚型、本公开的稍前实施方式中公开的乙型流感病毒感染或其亚型或本公开的稍前实施方式中公开的丙型流感病毒感染或其亚型。192.根据本公开的第十七实施方式，可以以有效保护的剂量鼻内施用上述laiv组合物。疫苗以与剂型相容的方式施用，并且以预防有效的量施用。本公开的免疫原性组合物可在有感染风险的成人或儿童中作为主要预防剂施用。例如，本文公开的减毒活流感疫苗组合物可用于有感染流感病毒风险的成人或儿童。193.更优选地，可以以约0.1ml至0.5ml的剂量体积鼻内施用laiv组合物。194.根据本公开的第十八实施方式，laiv组合物可配制成单剂量小瓶或多剂量小瓶或多剂量试剂盒或预装注射器或鼻腔喷雾剂，其中所述laiv组合物可按单剂量方案施用，或优选多剂量方案，其中在疫苗接种的主要过程之后是在维持和/或加强免疫反应所需的后续时间间隔施用1至2个单独剂量，例如，如果需要的话在1‑4个月内接种第二剂，在几个月或几年或每年接种疫苗后进行后续接种。该剂量方案也将至少部分取决于赋予保护性免疫所需的加强剂量的需要。195.根据本公开的第十九实施方式，免疫原性组合物的最终ph值可包括6.5至8。196.本文公开的其他实施方式还包括疫苗试剂盒，其包括含有冻干(冷冻干燥)免疫原性组合物的第一容器和含有水溶液的第二容器，所述水溶液任选地为盐水或wfi(注射用水)，用于重构冻干(冷冻干燥)的laiv组合物。197.遍及说明书，词语“包括”或比如“包含”或“含有”的变体将被理解为表示包括叙述的要素、整数或步骤、或要素、整数或步骤的组，但不是排除任何其他要素、整数或步骤、或要素、整数或步骤的组的任何其他要素，可意思是“包括”、“包含”，术语是开放式的，允许存在比所列举的更多，只要叙述的基本特征特性或新特性不因存在叙述的更多而改变，但不排除现有技术实施方式。198.遍及本说明书，词语“免疫原性组合物”涵盖针对从载体表达的感兴趣的抗原或免疫原引发免疫应答的任何组合物；例如，在施用至受试者之后，引发针对感兴趣的靶向免疫原或抗原的免疫应答。术语“疫苗组合物”和“疫苗”涵盖诱导针对感兴趣的抗原的保护性免疫应答或有效地针对抗原提供保护的任何组合物；例如，在向受试者施用或注射之后，引发针对靶向抗原或免疫原的保护性免疫应答或提供针对从载体表达的抗原或免疫原的有效保护。199.表述“一种或多种”或“至少一种”的使用提示使用一种或多种要素或成分或数量，因为该使用可在本发明的实施方式中，以实现一种或多种期望的目的或结果。尽管已经描述了本发明的某些实施方式，但是这些实施方式仅通过实施例的方式呈现，并且不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员在阅读本文的公开之后可想到在本发明范围内对本发明组合物的改变或修饰。这种改变或修饰也在本公开的精神内。200.除非说明书中有相反的叙述，否则对各种物理参数、尺寸和数量给出的数值仅为近似值，并且可设想高于为物理参数、尺寸和数量指定的数值的值落入本发明的范围内。201.类似地，纯化中使用的组分，例如过滤器、色谱柱，决不旨在是限制性的或排他性的，并且可根据从业者的判断替换为其他组分以达到相同的目的。202.尽管本文相当强调优选实施方式的具体特征，但是应当理解，在不背离本公开的原理的情况下，可添加许多另外的特征，并且可在优选实施方式中进行许多改变。本公开的优选实施方式中的这些改变和其他改变对于本领域技术人员而言，从本文的公开中将是显而易见的，由此应清楚地理解，前述描述内容仅被解释为对本公开的阐释而不是作为限制。203.技术优势204.1.目前几乎所有生产的流感疫苗都使用蛋作为宿主来制备病毒库。使用蛋制造laiv存在某些缺点，可以使用细胞培养作为底物来克服这些缺点。使用蛋作为底物的局限性是：205.·疫苗质量蛋和无特定病原体蛋的供应商有限。206.·在蛋可用之前至少需要提前4个月订购。207.·一些候选大流行性毒株会导致家禽遭到致命感染，导致无法获得用于疫苗生产的底物(蛋)。208.·基于蛋的制造需要专门的蛋孵育、收获等设施，从而限制了快速扩大规模的能力。209.2.基于组织培养的制造具有完全受控系统的优势，易于扩大规模。210.3.在大流行的情况下，可以使用其他病毒疫苗的预先存在的组织培养生产单位轻松实现疫苗的大规模生产。211.4.细胞培养获得的病毒与循环毒株的相似性更高，而蛋中产生的病毒可具有抗原修饰。212.5.参与疫苗组合物的组分最少。213.6.不含防腐剂、聚合物和表面活性剂。214.7.纯化过程使用低浓度的核酸内切酶(苯甲酸酶)。215.8.没有昂贵和繁琐的色谱步骤的纯化过程。216.9.改进了生产这种稳定组合物/制剂的方法，从而提高了产量。217.10.鼻内给药是最简单的免疫途径，因为它不需要高水平的专业知识，适合多剂量给药，218.11.未报告与格林巴利(guillainbarre)综合征相关，并且因在感染部位递送而提供更好的保护。219.12.不易呈现液态疫苗，有助于克服冻干能力有限、需要供应稀释剂以进行重构以及疫苗交付前所需的额外重构步骤的问题。220.13.用于生成laiv重组的mdv主链具有完善的安全性特点，并且据报道可提供高水平的保护。221.实施例222.包括以下实施例以说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的组合物和技术代表了发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以被认为构成其实践的优选方式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可对公开的具体实施方式进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。223.重排laiv毒株采购自俄罗斯圣彼得堡实验医学研究所(iem)或who合作中心，比如亚特兰大疾病控制和预防中心(cdc)。224.实施例1：重排laiv病毒免疫原性组合物稳定性数据225.组分1‑减毒活流感疫苗病毒(laiv)226.流感疫苗病毒是通过典型的重排方法衍生的重排laiv病毒，其以6:2或7:1的比例包括主供体病毒(mdv)的冷适应、温度敏感和/或减毒表型基因区段和野生型大流行性或季节性甲型流感或乙型流感或丙型流感病毒株的血凝素(ha)基因区段和/或神经氨酸酶(na)基因区段。[0227][0228][0229]对于laiv免疫原性组合物：[0230]在6至7logeid50/0.5ml剂量范围内；更优选7logeid50/0.5ml剂量的甲型病毒[0231]在6至7logeid50/0.5ml剂量范围内；更优选6.5logeid50/0.5ml剂量的乙型病毒[0232]就在表1中以任何组合公开的免疫原性组合物中使用的重排laiv病毒株而言，laiv组合物为单价或多价(二价；三价；四价)。[0233][0234][0235][0236][0237]解释：[0238]稳定剂组合物3(1％w/v明胶 5％w/v山梨糖醇 0.1％w/vl‑丙氨酸 0.21％w/vl‑组氨酸 0.3％w/v三(羟甲基)甲基甘氨酸 1.6％w/vl‑精氨酸盐酸盐)：[0239]对于甲型/h1n1和乙型流感疫苗毒株，在37℃下的应激稳定性和在2℃至8℃温度下的实时稳定性都观察到了不可接受的降解率。(参考图4和图5)[0240]稳定剂组合物4(1％w/v明胶 5％w/v山梨糖醇 0.1％w/vl‑丙氨酸 0.21％w/vl‑组氨酸 0.9％w/v三(羟甲基)甲基甘氨酸 1.6％w/vl‑精氨酸盐酸盐)：[0241]对于甲型/h1n1和乙型流感疫苗毒株，在37℃下的应激稳定性和在2℃至8℃温度下的实时稳定性都观察到了不可接受的降解率。(参考图6和图7)[0242]稳定剂组合物2(0.85％w/v明胶 3％w/v蔗糖 0.1％w/vl‑丙氨酸 0.21％w/vl‑组氨酸 0.3％w/v三(羟甲基)甲基甘氨酸 2.1％w/vl‑精氨酸盐酸盐)：[0243]在37℃下的应激稳定性和在2℃至8℃温度下的实时稳定性都观察到了不可接受的降解率。(参考图8和图9)[0244]稳定剂组合物1(0.85％w/v明胶 4％w/v蔗糖 0.1％w/vl‑丙氨酸 0.21％w/vl‑组氨酸 0.3％w/v三(羟甲基)甲基甘氨酸 2.1％w/vl‑精氨酸盐酸盐)：[0245]对于在37℃下的应激稳定性和在2℃至8℃温度下的实时稳定性，都观察到了可接受的降解率(值在可接受的范围内)。(参考图2、3、10和11)[0246]实施例2：基于mdck细胞的laiv病毒制造过程[0247]制备基于mdck细胞培养物的laiv组合物的方法可包括以下步骤的任何子集或全部：[0248]k)将laiv候选疫苗病毒最初在产生基于蛋的主种子病毒(msv)的spf鸡胚中传代。[0249]l)基于蛋的主种子病毒在mdck细胞培养(atccccl‑34)宿主上生长，以制备基于细胞的工作种子病毒(wsv)。这种基于细胞的wsv用于在不同的细胞培养容器/系统(如表面积为175cm2的组织培养瓶(tcfs)、表面积为850cm2的滚瓶(rbs)、表面积为6320cm2的细胞工厂(cfs)和固定床生物反应器(例如，来自生命科学公司(华盛顿港，纽约)的生物反应器，如nano生物反应器和500/100生物反应器))中以1:100至1:10000的moi感染mdck细胞培养物。(mdck细胞使用含fbs的mem培养；接种前用含5u/ml至25u/ml的胰蛋白酶的mem冲洗；将wsv以1:10至1:10000的moi接种至细胞中，在31℃至33℃下孵育48小时至72小时)[0250]m)收获培养的病毒。[0251]n)将病毒收获物通过直流过滤(dff)经过至少一个澄清过滤器进行过滤，以获得澄清病毒库(cvp)。[0252]o)用非特异性核酸内切酶(例如苯甲酸酶)在30℃至34℃范围的温度下处理cvp2小时至6小时，并且然后在2℃至8℃的温度下处理5小时至15小时；[0253]p)使用截留分子量(mwco)为100kda至500kda的膜，通过切向流过滤(tff)来浓缩核酸内切酶处理的cvp；[0254]q)用包括一种或多种碳水化合物、一种或多种氨基酸和明胶的稳定剂组合物来稳定tff浓缩物，以形成稳定的病毒收获物。[0255]r)通过至少一个孔径为约0.2微米的灭菌级过滤器通过dff对稳定化的tff浓缩物进行灭菌，以获得灭菌的cmvp(澄清单价病毒库)。[0256]s)将灭菌的cmvp在‑60℃或更低的温度下储存在聚碳酸酯瓶中。[0257]t)将灭菌的制剂装入小瓶中并且储存在2℃至8℃下。[0258][0259][0260]细胞培养基：具有10％fbs的mem(用1nhcl将ph调节至7.0至7.4)[0261](另外的谷氨酰胺350mg/l)[0262]病毒培养基：没有fbs的mem(用1nhcl将ph调节至7.2至7.6)[0263](另外的葡萄糖500mg/l，谷氨酰胺350mg/l)[0264]在用于生物反应器系统的cm和vm中添加另外的0.4％葡萄糖[0265][0266][0267][0268][0269][0270]实施例3：病毒输入(moi)和接种后孵育期对产率的影响[0271][0272][0273]感染：[0274]a.感染时间：[0275]在优化研究的基础上，选择mdck细胞源流感工作种子病毒感染的细胞数量上限为每个滚瓶1.2至1.8亿细胞和生物反应器系统70至100亿细胞。在感染程序之前对具有mdck细胞的滚瓶进行单层汇合的显微观察。[0276]b.moi和接种后孵育期：[0277]根据moi优化研究的所有观察结果，甲型(h1n1)、甲型(h3n2)和乙型流感病毒的moi选择范围在1:100至1:10000之间，并且接种后孵育期在48至72小时之间。[0278]实施例4：不同浓度胰蛋白酶对产率的影响[0279][0280]推论：需要胰蛋白酶来激活流感病毒以接种mdck细胞。从以上结果可以看出，每个滚瓶使用2000单位至3000单位的胰蛋白酶产生最大的病毒效力。[0281]实施例5：苯甲酸酶的浓度和温度对细胞dna含量和病毒滴度的影响[0282]测试了不同浓度的苯甲酸酶在不同温度下降解宿主细胞dna。澄清病毒库(cvp)以500(含2mmmgcl2)、500、1000、2500和5000u/l的浓度进行苯甲酸酶处理，并且处理的cvp在32℃下保持3小时，并且进一步在2℃至8℃下继续处理过夜。在每个阶段进行取样，以下是每个阶段的dna含量结果。[0283][0284][0285]推论：从结果可以看出，与用不存在2mmmgcl2的浓度为500u/l的苯甲酸酶处理的cvp相比，在存在2mmmgcl2的情况下，用浓度为500u/l的苯甲酸酶处理的cvp显示出更高的dna降解。还可以看出，较高的苯甲酸酶浓度1000u/l、2500u/l和5000u/l显示出与500u/l(具有2mmmgcl2)的苯甲酸酶浓度相当的dna降解程度。[0286]实施例6：不同制造阶段的病毒产量[0287][0288]1.cvp：澄清病毒库(过滤后收获)，[0289]2.bcvp：用苯甲酸酶处理的cvp，[0290]3.cmvp：澄清单价病毒库(tff后，添加稳定剂和0.2μ过滤后)[0291]推论：检查每个甲型(h1n1)、甲型(h3n2)和乙型季节性流感病毒的阶段性病毒浓度，并且观察到收获水平的初始病毒浓度在整个过程中一直保持到最后阶段，即疫苗批量(cmvp)的制备。[0292][0293]推论：病毒回收率可以计算为制造过程中的病毒保留百分比，其中收获是起点，cmvp是制造的终点。从结果可以得出结论，平均病毒回收率为44.67％，这相当于0.34logeid50/0.5ml的滴度损失。还观察到cmvp水平的最终病毒回收率(病毒滴度)在可接受的范围内，并且cmvp可用于生产基于mdck的laiv病毒的最终产品批次。[0294]实施例7：cmvp制造过程中阶段性宿主细胞dna浓度的比较数据[0295]对不同毒株的澄清病毒库(cvp)进行苯甲酸酶处理，并且对dna含量进行分阶段取样。以下是各阶段dna含量的结果。[0296][0297]推论：[0298]从结果可以看出，cvp在用苯甲酸酶处理时显示出dna的显著减少。并且进一步观察到，在tff过程(渗滤/浓缩)和cmvp制备过程中，残留的dna再次被有效去除。最终cmvp水平的dna含量在期望的和可接受的限度内。[0299]实施例8：tff实验的各种尝试[0300]考虑参数，比如用于tff过程的稀释介质(病毒培养基和pbs)、渗滤和浓缩程序，进行了各种tff实验。测试tff浓缩物样品的病毒浓度。[0301][0302]a/cal：a/17/加利福尼亚/2009/38；[0303]b/tex＝b/德克萨斯/02/2013‑cdc‑lv8b；[0304]a/hk＝a/17/香港/2014/8296；[0305]vm：病毒培养基[0306]解释：[0307]从上一组实验中，tff过程得到发展，并且接着选择2xdf和4x浓缩阶段，以获得具有最佳病毒产量的期望tff浓缩物。与vm相比，pbs对病毒具有更好的稳定性。[0308]实施例9：免疫原性结果[0309]进行研究，以评估基于蛋和mdck细胞培养的三价和四价季节性流感疫苗在雪貂模型中的免疫反应和疫苗效力。所有动物在第0天使用基于蛋和mdck细胞培养物的三价或四价制剂进行鼻内免疫，该制剂包含类似于a/密歇根/45/2015(h1n1)、a/香港/4801/2015(h3n2)、b/布里斯班/60/2008和b/普吉岛/3073/2013的毒株，并在四个星期后(第28天)进行挑战。[0310]表19：第28天收集的血清的几何平均血凝抑制(hai)和中和效价(nt)[0311][0312][0313]推论：(参考图12和图13)[0314]得出的结论是，用含有甲型‑h1n1的基于蛋和基于mdck的三价和四价疫苗可保护动物在受到同源甲型‑h1n1病毒挑战时免受甲型‑h1n1感染。[0315]另一项研究旨在评估基于蛋和mdck细胞的单价laiv(甲型‑h5n2和甲型‑h7n9)在雪貂模型中的免疫反应和功效。不同组的动物用基于甲型‑h5n1和甲型‑h7n9单价laiv的蛋和mdck细胞培养物免疫，并且分别用同源甲型‑h5n1和甲型‑h7n9病毒挑战。结果显示，用单价h5n2laiv免疫的动物免受甲型‑h5n1病毒的同源挑战。用单价甲型‑h7n9laiv免疫的动物免受甲型‑h7n9病毒的同源挑战。当前第1页12当前第1页12
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