一种降低污泥堆肥过程中抗生素抗性基因丰度的方法与流程

1.本发明属于有机固体废物处理领域，具体涉及一种降低污泥堆肥过程中抗生素抗性基因丰度的方法。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.抗生素抗性基因的出现已经成为重要的全球性健康问题。研究发现在河水、农田土壤、污泥、蔬菜甚至空气中均有检测出抗性基因，这些抗性基因可能会污染人类的饮用水和食物，对人类的健康造成严重的威胁。抗生素抗性基因可通过施肥的方式传播给土壤土著细菌。与传统污染物不同，args可通过基因遗传元件在不同物种之间转移和传播，具有遗传性，并且抗生素抗性基因可以进行自我复制，通过各种途径在环境中传播，污染水体、大气以及土壤环境，对环境造成很大的危害，最终通过食物链危害人类健康。
4.污泥是研究args、mges和耐抗生素细菌(arb)的热点，污水处理厂又被称为抗性基因的储存库。城市污泥是一座巨大的资源“宝库”，城市污水处理厂产生的污泥中含有大量植物所需的营养元素和微量元素，其经过无害化处理后施加到土壤中可以有效的改良土壤结构，还可以充当土壤肥料，促进植物更好的生长。因此，将城市污泥无害化后转化为可利用的资源，更好的实现污泥的资源化利用，是现在需要解决的又一环境难题。好氧堆肥法是对污泥处理和资源化的有效方法，其实质是污泥中微生物在有氧条件下快速分解污泥中有机物使其转化为腐殖质的过程，是城市污泥实现减量化、无害化和资源化一种有效技术。传统堆肥在消除抗生素残留和抗生素耐药基因(args)方面已经显示出一定的效果，如通过采用超高温好氧菌进行发酵来消减有机固体废物中抗性基因，依靠嗜热微生物自身代谢产能达到发酵高温，能杀灭90％的携带args的微生物。但是，超高温好氧菌来降低args的过程中，基于菌株的特殊性，其生长附着点较少，且生长空间小，抗性基因丰度降低效果比较有限，因此，目前迫切需要改进堆肥技术来进一步有效控制抗生素耐药性。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术的不足，本发明提供一种添加超嗜热菌和生物碳降低污泥堆肥过程中多种抗生素抗性基因丰度的方法，将超嗜热菌剂和生物碳一同加入到污泥堆肥原料中，生物碳的加入能够为微生物代谢提供碳源，同时其多孔、疏水性和低密度特性能改善堆肥通气状况，多孔性和巨大的比表面积能够为微生物生存提供附着位点和较大生存空间，进而显著降低污泥中各类抗性基因丰度。
6.本发明第一方面提供一种降低污泥堆肥过程中抗生素抗性基因丰度的方法，包括如下步骤：
7.(1)将未消化污泥、堆肥返混料和调理剂花生壳混合，添加超嗜热菌剂和生物碳，
得到好氧转化原料；
8.(2)将好氧转化原料堆入好氧生物转化装置中发酵，直到好氧转化原料腐熟，得到黑褐色的疏松团粒结构产品。
9.本发明第二方面提供一种好氧生物转化装置，该装置由水浴箱和堆肥装置组成，堆肥装置放置在水浴箱中，对堆体起到保温作用，原料顶部铺设一层塑料膜以保温保湿，堆肥装置上设置测温点、取样点和排气口。
10.本发明的一个或多个实施方式具有以下有益效果：
11.(1)本发明将超嗜热菌剂和生物碳复合添加到污泥中进行堆肥，能够强化堆肥效果，显著降低污泥中各类抗性基因丰度，解决市政污泥中抗生素抗性基因难以去除的问题，为去除抗性基因保障人类公共健康提供支持，堆肥产品还可以用于农业生产和园林绿化替代部分化肥，为污泥等固废的资源化利用提供可靠的方法。
12.(2)生物碳的加入，不仅能够提高原料的碳氮比，为微生物代谢提供碳源，同时其多孔、疏水性和低密度特性能改善堆肥通气状况，而且多孔性和巨大的比表面积能够为微生物生存提供附着位点和较大生存空间，影响和调控堆肥微环境内微生物菌群结构和酶活力，提升抗性基因丰度降低效果。与不加生物碳和嗜热菌剂的对照相比，加入生物碳处理抗生素抗性基因丰度去除率提高了1.57％，添加超嗜热菌抗生素抗性基因去除率提高了2.86％，而添加超嗜热菌和生物碳后抗性基因丰度去除率提高了4.9％，显著优于单独添加超嗜热菌或生物碳的实验组。
附图说明
13.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
14.图1为堆肥过程中堆体温度变化规律；
15.图2为堆肥过程中发芽指数的变化规律；
16.图3为堆肥过程中抗生素抗性基因变化规律。
具体实施方式
17.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
18.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
19.正如背景技术所介绍的，超高温好氧菌来降低args的过程中，存在生长附着点较少，且生长空间小的问题，抗性基因丰度降低效果比较有限。
20.为了解决如上的技术问题，本发明提供一种降低污泥堆肥过程中抗生素抗性基因丰度的方法，包括如下步骤：
21.(1)将未消化污泥、堆肥返混料和调理剂花生壳混合，添加超嗜热菌剂和生物碳，
得到好氧转化原料；
22.(2)将好氧转化原料堆入好氧生物转化装置中发酵，直到好氧转化原料腐熟，得到黑褐色的疏松团粒结构产品。
23.所述抗生素抗性基因包括四环素抗性基因(tet a、tet c、tetg、tetm、teto、tetq、tetw、tet t)、磺酰胺抗性基因(sul1、sul2、sul3、sula、dfra1和dfra7)、大环内酯类抗性基因(erm q、ermt、erm b、erm x、erm f、erm e)。
24.其中，采用超嗜热菌剂在加热条件下进行好氧堆肥，利用“好氧分解”和“高温”的双重作用，不仅可以快速消减args，还可以改变污泥堆肥中整个微生物群落结构，杀灭90％携带args的微生物，降低非宿主微生物多样性从而减少args发生基因转移的风险，从源头上控制其扩散，保证了args不会出现反弹。
25.但发明人发现，单纯采用超嗜热菌剂进行降低污泥堆肥过程中抗生素抗性基因丰度时，由于超嗜热菌生长附着点较少，且生长空间小，抗性基因丰度降低效果比较有限。
26.基于此，本发明以生物碳作为外源添加剂，辅助超嗜热菌剂发挥作用。生物碳既可以提高原料的碳氮比，为微生物代谢提供碳源，同时其多孔、疏水性和低密度特性能改善堆肥通气状况，而且多孔性和巨大的比表面积能够为微生物生存提供附着位点和较大生存空间，影响和调控堆肥微环境内微生物菌群结构和酶活力；另外，生物碳对物料中氨态氮、硝态氮及气态氨等有很强的吸附作用，可降低氮素损失。
27.在生物碳的辅助下，超嗜热菌可以使堆体快速达到最高温90℃以上，实现有机固体废弃物快速降解，该技术比普通堆肥的最高温高20
‑
30℃，对病原微生物的灭活效果达99％，极大缩短了堆肥周期，提高有机固废的资源利用率，降低运行成本。
28.超嗜热菌剂和生物碳联合使用可以显著提高抗生素抗性基因丰度的去除率，与不加生物碳和嗜热菌剂的对照相比，加入生物碳处理抗生素抗性基因丰度去除率提高了1.57％，添加超嗜热菌抗生素抗性基因去除率提高了2.86％，而添加超嗜热菌和生物碳后抗性基因丰度去除率提高了4.9％，可见，超嗜热菌剂和生物碳二者间存在一定的协同作用，共同提高了抗生素抗性基因的去除效果。
29.堆肥返混料作用是提供堆肥发酵的接种物，调理剂花生壳的添加可以增加堆体的孔隙，也可以提供碳源。
30.在本发明的一个或多个实施方式中，所述未消化污泥、堆肥返混料和调理剂花生壳按照3:1:1比例混合。
31.研究发现，55
‑
65％为好氧生物转化最适含水率，可以加速堆肥腐熟进程，保证混合物处于最佳好氧生物转化状态。因此，作为优选的实施方式，好氧转化原料的初始含水率保持在55
‑
65％，且通过添加蒸馏水使含水率保持在55
‑
65％。
32.为了使得调理剂花生壳与其他原料充分混合，步骤(1)还包括预处理步骤：利用粉碎机对花生壳进行粉碎处理并过2
‑
3mm筛。
33.进一步的，所述超嗜热菌剂主要成分为枯草芽孢杆菌等，超嗜热菌剂添加比例量0.2
‑
1％(超嗜热菌剂量/堆体干物质量)。
34.所述生物碳原料主要为农林废弃物(秸秆等)和园林废弃物树枝树叶等，高温热解制备而成，生物碳添加比例为2
‑
10％(生物碳量/堆体干物质量)。
35.本发明第二方面提供一种好氧生物转化装置，所述的好氧生物转化装置由水浴箱
和堆肥装置组成，堆肥装置放置在水浴箱中，对堆体起到保温作用，原料顶部铺设一层塑料膜以保温保湿，堆肥装置上设置测温点、取样点和排气口。
36.生物转化过程中，温度会对抗生素抗性基因丰度产生影响，在30℃
‑
70℃下，超嗜热菌能够发挥出最大的作用，低于或高于该温度区间，会影响超嗜热菌的活性。因此，采用好氧生物转化装置进行发酵时，发酵过程的温度为30℃
‑
70℃；优选为50
‑
70℃。
37.进一步的，所述发酵过程中，每隔3
‑
4天翻堆一次，定期补充水分使含水率保持在55
‑
65％左右以保证发酵正常进行；
38.进一步的，通过喷洒方式向所述堆体混合物中添加蒸馏水，使好氧生物转化过程中含水率保持在55
‑
65％。
39.进一步的，好氧转化原料在好氧生物转化装置中发酵65
‑
70天。
40.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
41.实施例1：
42.1、原料说明
43.好氧生物转化原料：
44.1)污泥、返混料获取：采自青岛某污水处理厂脱水污泥。
45.2)花生壳获取：采自某农场，花生壳经粉碎机粉碎后过2mm筛备用。
46.好氧生物转化装置：该装置为具有保温功能的箱体，尺寸：长
×
宽
×
高＝1.2m
×
0.6m
×
1.2m，原料顶部铺设一层塑料膜以保温保湿，箱体侧面设置测温、通风和采样点。
47.污泥、返混料组分如表1所示：
48.表1返混料和污泥的部分基本性质
[0049][0050]
2、降低污泥生物转化过程中多种抗性基因丰度的效果实验
[0051]
将污泥、返混料和花生壳按3:1:1比例进行混合，添加0.5％超嗜热菌、2％和5％的生物碳。调节初始含水率60％左右。将堆料充分混匀后装入好氧生物转化装置中，各样品混料重量为90kg；每隔3天进行翻堆一次，以保证氧气充足，同时分别对堆料进行补水至含水率达到60％，堆至66天。堆肥实验分为4组，分别为ct(普通堆肥)、ht(添加0.5％超嗜热菌剂)、ht2c(添加0.5％超嗜热菌剂和2％生物碳)和ht5c(添加0.5％超嗜热菌剂和5％生物碳)，其中，将普通的自然堆肥设为对照组(ct)，总共设三次重复。堆肥期间每天中午分别于堆体上、中、下部测温，取平均值作为堆温。
[0052]
本发明采用荧光定量pcr方法检测污泥中各类抗性基因丰度：qpcr反应混合物包含1μldna模板，每种引物(赛默飞)0.6μl，2
×
superreal premix plus预混液(中国.天根)10μl和7.8μlddh2o。每个qpcr运行过程均包括：在95℃下进行15分钟的预变性，然后在95℃下进行10秒钟的变性，在基因特定的退火温度下进行20s的退火，然后在72℃下进行32s的延伸。
[0053]
每天对好氧生物转化过程进行温度监测，监测结果如图1所示，ct、ht、ht2c和ht5c堆体温度变化都有升温阶段、高温阶段、降温阶段和腐熟阶段。ct堆体温度从开始缓慢上升，在堆肥第16天时达到最高温60.18℃，ht、ht2c和ht5c堆体温度变化趋势类似，但在第二天就达到最高温度，ht5c处理组最高温达76.03℃，高于ht处理组70.12℃和ht2c堆肥组73.03℃。添加超嗜热菌剂和生物碳的堆肥处理提高了堆体温度，且添加的生物碳的比例越大堆体温度越高。
[0054]
在堆肥过程中，四种堆肥处理发芽指数的变化趋势类似，都是先下降后上升(图2)。发芽指数是判断堆肥产品腐熟程度的重要指标，当gi>55％时，则可认为堆肥产品的植物毒性在植物可接受范围内，堆体达到腐熟标准。ct在堆肥第9天gi值降到最低，堆肥第66天才达到最高70.9％，ht在堆肥第2天发芽指数降到最低13.98％，之后gi值开始上升，堆肥第24天可达57.99％，开始进入腐熟状态，第50天达到最高73.5％；ht2c在堆肥第2天发芽指数降到最低15.98％，之后gi值开始上升，堆肥第24天可达59.99％，开始进入腐熟状态，第50天达到最高76.90％；ht5c在堆肥第2天发芽指数降到最低15.99％，之后gi值开始上升，堆肥第24天可达61.21％，开始进入腐熟状态，第50天达到最高80.6％。整个堆肥发酵期间，ht5c的gi值高于ht2和ht两组堆肥，添加生物碳可以增加堆肥产品的腐熟程度。
[0055]
图3显示了添加嗜热细菌和生物碳的堆肥中args和mges相对丰度随时间的变化。sul1、sul2、sul3和ermf堆肥开始时均具有较高的相对丰度。在第2天，嗜热和生物碳添加使ermb和tetm的相对丰度高于对照。总args丰度随堆肥时间的延长而降低。在堆肥结束时，ct、ht、ht2c和ht5c总args的平均丰度显著降低至0.139、0.063、0.049和0.041copies/16s rrna基因。堆肥可以有效去除堆肥中的args。同时，在堆肥中后期(第36天和66天)，嗜热菌和生物碳进一步降低了args的丰度。ⅰ类整合子整合酶基因(inti1)在args的转移中起关键作用，mges如质粒、整合子和转座子通常与args及其水平转移相关。各处理第1天inti1的相对丰度均为0.03～0.10copies/16s rrna基因，其中ht处理的相对丰度最高。在堆肥66天后，ht、ht2c和ht5c中inti1的丰度显著低于ct。嗜热菌剂和生物碳的添加对inti1丰度有抑制作用，从而抑制细菌间的转移，降低堆肥过程中args扩散的风险。堆肥可以有效降低inti1基因的相对丰度，好氧堆肥有利于减少第1类整合子，降低污泥堆肥中args扩散的风险。
[0056]
为了进一步探究生物碳及超嗜热菌剂降低抗生素抗性基因丰度的效果，本发明又增加了一组只添加生物碳的实验组进行对比，结果表明：对照组抗生素抗性基因去除率为92.3％，添加生物碳处理抗生素抗性基因去除率为93.87％，添加0.5％超嗜热菌处理抗生素抗性基因去除率为95.16％，添加2％生物碳和0.5％超嗜热菌联合处理抗生素抗性基因去除率为97.2％。可见，与不加生物碳和嗜热菌剂的对照相比，加入生物碳处理抗生素抗性基因丰度去除率提高了1.57％，添加超嗜热菌抗生素抗性基因去除率提高了2.86％，而添加超嗜热菌和生物碳抗性基因丰度去除率提高了4.9％，这表明超嗜热菌剂和生物碳联合使用可以协同提高抗生素抗性基因丰度的去除率。
[0057]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。