杨梅素在制备转化生长因子β受体1抑制剂中的应用的制作方法

杨梅素在制备转化生长因子
β
受体1抑制剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种杨梅素在制备转化生长因子β受体1抑制剂中的应用。


背景技术：

2.动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)是心脑血管相关疾病发病率、致残率和病死率不断上升的共同病理基础，as的发病机制主要包括脂质浸润学说、内皮损伤
‑
反应学说、血小板聚集和血栓形成假说、平滑肌细胞克隆学说等，其中，血管平滑肌细胞对氧化修饰的低密度脂蛋白胆固醇、游离胆固醇、微泡和凋亡细胞的吞噬作用在动脉粥样硬化的发展中起了关键作用。内膜中血管平滑肌细胞的迁移和增殖也参与了斑块的进展。
3.转化生长因子β(transforming growth factor
‑
β，tgf
‑
β)超家族信号转导在众多生物系统中对细胞生长、分化和发育的调节发挥重要作用。tgfbr1是转化生长因子β特异性受体，介导tgf
‑
β的病理生理功能。tgf
‑
β能激活tgfbr1，活化的tgfbr1继而磷酸化其下游信号分子smad2和smad3，形成的smad2/3二聚体与smad4结合成三聚体进入细胞核内，调控靶基因的转录，tgfbr1是tgf
‑
β信号转导的关键节点。近年来，tgf
‑
β/smad信号通路被认为参与了多种心血管疾病的发生发展，如再狭窄、血管生成和纤维化等。对动物和人类的遗传学研究表明，功能上扰乱tgf
‑
β的基因突变与特定的遗传性血管综合症有关，包括osler
‑
rendu
‑
weber病、马凡综合征等。tgf
‑
β信号的紊乱也会导致非遗传性疾病，如动脉粥样硬化和心肌纤维化。相关研究表明tgf
‑
β包括其超家族的三个亚型(tgf
‑
β1、tgf
‑
β2、tgf
‑
β3)在动脉粥样硬化发展中起着不可替代的作用。tgf
‑
β在内皮细胞和平滑肌细胞的增殖、分化、迁移起着关键作用。
4.目前他汀类药物是用于治疗as的主要药物，他汀类药物可降低冠心病的发病率和死亡率，延缓动脉粥样硬化斑块的发展，甚至消退斑块，但其临床应用存在许多不良反应，如肝损伤、肌痛、胃肠道刺激等，导致其临床应用受到限制，在这种情况下，天然、安全的化合物显得尤为宝贵。
5.杨梅素(杨梅黄酮，myricetin)天然的黄酮醇，是存在于许多的水果、蔬菜及中药材等植物中的天然多羟基黄酮类化合物。体外研究表明，杨梅素具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、镇痛、保肝、降血糖、降血脂、心脏保护和神经损伤抑制的作用。基于其天然、安全的特性，目前，杨梅素被广泛应用于医药、食品、保健品和化妆品。杨梅素的药理机制涉及面广泛，但其对转化生长因子β受体1(tgfbr1)的调控未见相关报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种杨梅素在制备转化生长因子β受体1抑制剂中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，能有效防治tgf
‑
β通路紊乱引起的特别是响应于tgfbr1相关的病症，防治动脉粥样硬化。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供杨梅素在制备转化生长因子β受体1抑制剂中的应用。
9.优选的是，所述杨梅素通过抑制转化生长因子β受体1及其下游smad2和smad3的磷酸化水平，调控所述转化生长因子β受体1下游信号基因的表达和转录，进而实现抑制所述转化生长因子β受体1的表达。
10.本发明还提供杨梅素在制备防治转化生长因子β信号通路紊乱引起的疾病的药物中的应用。
11.本发明还提供杨梅素在制备预防转化生长因子β信号通路紊乱引起的疾病的保健食品中的应用。
12.优选的是，所述疾病包括响应于转化生长因子β受体1的相关病症。
13.优选的是，所述相关病症包括转化生长因子β受体1表达异常引起的动脉粥样硬化。
14.优选的是，所述动脉粥样硬化还包括病理机制涉及动脉粥样硬化的高血压、冠心病、脑梗死以及外周血管病。
15.本发明公开了以下技术效果：
16.本发明公开了杨梅素在制备转化生长因子β受体1(tgfbr1)抑制剂上的应用，通过实验证实其在人血管平滑肌细胞(hasmc)中具有抑制tgfbr1及其下游信号分子smad2/3表达的作用，基于其天然、安全的特性，杨梅素为因tgf通路紊乱引起的疾病治疗提供了可能，特别是响应于tgfbr1相关的病症的药物中的应用。可见，本发明为临床上tgfbr1相关的病症，尤其是动脉粥样硬化及其引起的相关疾病的防治提供了数据依据。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为杨梅素myricetin对tgfbr1抑制作用的分子对接图；
19.图2为杨梅素myricetin与tgfbr1的体外结合亲和力的表面等离子共振成像图；
20.图3为杨梅素myricetin对tgfbr1体外酶活性的影响；其中，*与control相比，p＜0.05，有统计学差异；**与control相比，p＜0.01，有统计学差异；
21.图4为杨梅素myricetin显著抑制人血管平滑肌细胞tgbfbr1及其下游smad2、3的磷酸化水平；其中，*与control相比，p＜0.05，有统计学差异；**与control相比，p＜0.01，有统计学差异；
22.图5为杨梅素myricetin显著抑制在c57小鼠颈动脉的新生内膜增生；其中，a为不同组he染色病理形态学结果；b为不同组内膜增生情况柱形图分析结果；*与model相比，p＜0.05，有统计学差异；**与model相比，p＜0.01，有统计学差异。
具体实施方式
23.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
24.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
25.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
26.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
27.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
28.本发明所述杨梅素分子式为c
15
h
10
o8，分子量为318.24，结构式如下所示：
[0029][0030]
实施例1分子模拟虚拟筛选
[0031]
使用sybyl
‑
x2.1软件对myricetin与tgfbr1之间的相互结合进行模拟生成最优构象。这提示myricetin与tgfbr1之间具有较强的结合能力。如图1所示，myricetin可与tgfbr1的asp
‑
351、ile
‑
211、glu
‑
245、ser
‑
280、asp
‑
281、his
‑
283氨基酸残基发生氢键结合。
[0032]
实施例2表面等离子体共振成像(spri)分子互作实验分析myricetin与tgfbr1之间的体外结合能力
[0033]
选择3d dextran芯片进行点样固定。具体操作流程如下：
[0034]
(1)分别盛放0.765g edc(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐)及0.115gnhs(n
‑
n
‑
羟基琥珀酰亚胺)于两支50ml专用离心管中，随后向离心管中各加入10ml双蒸水使其充分溶解混匀，使用时将两种溶液倒入方形盒中，使溶液没过需要活化芯片的表面，接着置于摇床上反应15min。
[0035]
(2)tgfbr1蛋白点样，根据生物点样仪的操作流程将芯片放置于点样仪上设置好程序后即可进行点样操作，将点样完成的芯片贴上cover的同时标记好芯片编号后放置于生化试剂盒内(湿度应大于50％)4℃冰箱孵育过夜。
[0036]
(3)在spr仪器上装载孵育完成的芯片，准备流通小分子化合物。
[0037]
(4)将母液浓度为100mm的杨梅素用pbs分别配制成浓度为7.5mm，15mm，30mm的，体
积为各1ml的不同浓度梯度的流通相及将母液浓度为100mm的阳性对照sb431542用pbs分别配制成浓度为5mm、10mm、20mm、40mm，体积为各1ml的不同浓度梯度的流通相备用。
[0038]
(5)将固定好靶标蛋白tgfbr1样品的芯片，不同浓度梯度杨梅素及sb431542的流通样品及缓冲液、重生液在plexarray ht a100生物分子相互作用仪上加载安放好后，参照《plexarray ht高通量分子间相互作用筛选系统使用sop》操作流程，进行生物分子间相互作用实验。
[0039]
如图2所示，由tgfbr1和杨梅素、sb431542结合和解离过程可见，不同浓度杨梅素、sb431542均能与tgfbr1迅速结合。杨梅素与tgfbr1间相互作用的动力学参数，分别为ka＝1.03e
03
(1/ms)，kd＝0.0245(1/s)，kd＝2.38e
‑
05
(m)。sb431542与tgfbr1间相互作用的动力学参数，分别为ka＝1.26e
03
(1/ms)，kd＝0.0311(1/s)，kd＝2.47e
‑
05
(m)。分子间结合能力的大小由kd值表示，kd越小，表明结合力或亲和力越大。由kd值可看出，tgfbr1与杨梅素、sb431542均具有强的亲和力。
[0040]
实验例3tgfbr1体外酶活性实验
[0041]
参照tgfbr1 kinase assay说明书操作流程，tgfbr1激酶及atp滴定实验所示，25ng tgfbr1(alk5)、50μm atp、0.2μg/μl tgfbr1底物，室温孵育2h最佳。具体操作流程如下：
[0042]
(1)分别将1μl不同浓度的杨梅素(15，30，60μm)、1μl不同浓度的sb431542(15μm，30μm，60μm)和2μl tgfbr1激酶，2μl tgfbr1底物及atp混合物加入384孔板中。
[0043]
(2)室温孵育120min。
[0044]
(3)每孔分别加入5μl adp
‑
glo
tm
reagent，室温孵育40min。
[0045]
(4)每孔分别加入10μl kinase detection reagent，室温孵育30min。
[0046]
(5)采用多功能细胞成像微孔板检测仪进行检测。
[0047]
实验过程中tgfbr1激酶、tgfbr1底物、atp及不同浓度的myricetin均用kinase buffer稀释、配制。
[0048]
如图3所示，结果显示：杨梅素具有抑制tgfbr1体外酶活性的作用，其作用与其抑制剂作用相当(p＜0.05)，不同浓度组myricetin间及sb431542间差异无统计学意义(p＞0.05)。
[0049]
实验例4杨梅素显著抑制人血管平滑肌细胞tgbfbr1及其下游smad2、3的磷酸化水平
[0050]
4.1.材料和方法
[0051]
4.1.1实验原料
[0052]
myricetin购自成都曼思特生物科技有限公司，溶于无菌二甲基亚砜dmso中，配制成所需浓度。
[0053]
4.1.2细胞株
[0054]
人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cells，hasmc)，由中国科学院上海生命科学院细胞库提供。培养条件：含10％fbs(gibco)的dmem高糖型培养基(gibco公司)，37℃、5％co2饱和湿度培养箱。
[0055]
4.1.3 western blot
[0056]
用含有pmsf(碧云天生物技术有限公司)和磷酸酶抑制剂(碧云天生物技术有限公
司)的ripa裂解液(碧云天生物技术研究所)裂解细胞或组织后，提取总蛋白。细胞蛋白取15μg，经10％sds
‑
page胶电泳后，转移至pvdf膜，该膜与特异性抗体4℃孵育过夜。洗涤3遍，与过氧化物酶标记的二抗(anti
‑
rabbit igg 1:2000浓度)稀释，室温孵育1小时后，洗涤3遍，浸泡于hrp
‑
ecl化学发光液(美国millipore公司，将a液、b液以1：1比例充分混匀)后放入曝光仪中拍摄成像。
[0057]
所用一抗如下：
[0058]
rabbit anti
‑
p
‑
smad2 antibody(1:1000浓度稀释；美国abcam公司)；rabbit anti
‑
p
‑
smad3 antibody(1:1000浓度稀释；美国abcam公司)；rabbit anti
‑
p
‑
tgfbr1antibody(1:1000浓度稀释；美国cell signaling公司)；rabbit anti
‑
gapdh antibody(1:1000浓度稀释；美国affinity公司)；rabbit anti
‑
smad2 antibody(1:1000浓度稀释；美国cell signaling公司)；rabbit anti
‑
smad3 antibody(1:1000浓度稀释；美国cell signaling公司)；rabbit anti
‑
tgfbr1 antibody(1:1000浓度稀释；美国cell signaling公司)；rabbit anti
‑
gapdh antibody(1:1000浓度稀释；美国affinity公司)。
[0059]
4.1.4 image j图像分析软件分析
[0060]
用image j图像分析软件对曝光后条带的灰度值进行分析，分别计算phospho
‑
smad2、phospho
‑
smad3、phospho
‑
tgfbr1分别与相应的总蛋白smad2、smad3、tgfbr1进行灰度值比。
[0061]
4.1.5统计分析
[0062]
采用spss 22.0统计软件进行分析，结果均采用以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示。多组间比较使用单因素方差分析，方差齐时采用lsd法，方差不齐时采用welch稳健估计，再用tamhane t2法两两比较，以p＜0.05认为有统计学意义。
[0063]
如图4所示，结果显示：与对照组比，杨梅素能浓度依赖性地抑制tgfbr1及其下游smad2、smad3的磷酸化水平，而不会改变tgfbr1、smad2、smad3的总蛋白水平(p＜0.05)。
[0064]
通过上述的实验证明：杨梅素能显著地抑制转化生长因子β受体1(tgfbr1)，抑制tgfbr 1
‑
smad信号通路中smad2及smad3的磷酸化水平，进而调控其下游信号基因的表达及转录。
[0065]
实验例5杨梅素显著抑制c57小鼠颈动脉新生内膜增生
[0066]
小鼠左侧颈总动脉结扎动物模型：通过结扎小鼠左侧颈总动脉模拟血管内膜增生。造模前给予杨梅素(20mg/kg，40mg/kg)预灌胃3天，造模前一晚禁食，1％戊巴比妥钠(0.1ml/10g)腹腔麻醉，待小鼠麻醉后，将麻醉好的小鼠呈仰卧位固定于解剖台上，颈部去毛，碘伏消毒后沿颈部正中剪开皮肤，随后钝性逐层分离颈部组织，充分暴露左侧颈总动脉，小心分离动脉和伴行神经，在颈外动脉与颈内动脉的分叉点处即呈现如“y”形血管(颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉)处用6号无菌编织缝合线结扎(所有操作均在显微镜下进行)，随后缝合(5号无菌编织缝合线)、消毒切口后置于保温垫上，苏醒后于动物房继续饲养观察后续情况，腹腔注射青霉素预防感染。假手术组仅将6号无菌编织线置于分叉点而不结扎。造模结束后继续给予杨梅素(20mg/kg，40mg/kg)灌胃4周。
[0067]
分组如下：假手术组(sham)、左侧颈总动脉结扎模型组(model)、杨梅素低高剂量组(20mg/kg，40mg/kg)，每组5只，给药组每天分别灌胃0.2ml药物，假手术组及模型组：给予等量溶剂对照。
[0068]
4周后，将小鼠麻醉(1％戊巴比妥钠，0.1ml/10g，腹腔注射)呈仰卧位固定于解剖台上。剪开小鼠胸骨，打开胸腔，暴露心脏，打开longerpump蠕动泵，将longerpump蠕动泵灌注针插入心尖部位并固定，同时迅速于右心耳处剪一小口(便于血液流出)，通过心脏灌注将小鼠血管中的血液用pbs缓冲液排尽，避免多余残留血液残留于血管管腔中，然后充分暴露小鼠左侧颈部结扎血管，连带结扎线结取出左侧颈部血管，迅速浸泡于4％多聚甲醛溶液中固定，后续进行石蜡切片制作，行he染色观察病理形态学改变。
[0069]
结果提示：常规组与模型组对比，假手术组血管管壁光滑，无明显内膜增生。而与假手术组比，模型组血管内膜明显增生，管腔管径明显狭窄缩小，差异有统计学意义。此外，与模型组比，如图5a和b所示，杨梅素低剂量组(20mg/kg)、杨梅素高剂量组(40mg/kg)组均可减少内膜增生的程度，差异有统计学意义。
[0070]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。