用于生产aav颗粒的方法和系统
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求以下权益:2019年1月18日提交的名称为“用于生产aav颗粒的方法和系统”的美国临时专利申请第62/794,199号;2019年1月18日提交的名称为“用于生产aav颗粒的方法和系统”的美国临时专利申请第62/794,204号;2019年1月18日提交的名称为“用于生产aav颗粒的方法和系统”的美国临时专利申请第62/794,208号;2019年1月18日提交的名称为“生产aav颗粒的biic组合物”的美国临时专利申请第62/794,216号;2019年11月07日提交的名称为“用于生产aav颗粒的方法和系统”的美国临时专利申请第62/931,848号;所述临时专利申请的内容各自通过引用整体并入本文。
3.序列表的引用
4.本技术与电子格式的序列表一起提交。序列表以创建于2020年1月17日的名称为20571526pctsl.txt的文件形式提供,其大小为6,478,295个字节。电子格式的序列表中的信息通过引用整体并入本文。
技术领域
5.本公开描述了用于生产包含重组腺相关病毒(raav)的腺相关病毒(aav)颗粒、组合物和制剂的方法和系统。在某些实施方案中,本公开提供了用于设计、生产、澄清、纯化、配制、过滤和处理raav和raav制剂的方法和系统。在某些实施方案中,生产工艺和系统使用草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)昆虫细胞(例如sf9或sf21)作为病毒生产细胞。在某些实施方案中,生产工艺和系统在raav生产中使用杆状病毒表达载体(bev)和/或杆状病毒感染的昆虫细胞(biic)。
背景技术:
6.aav已成为用于基因转移至哺乳动物细胞的最广泛研究和利用的病毒载体之一。参见例如tratschin等人,mol.cell biol.,5(11):3251
‑
3260(1985)和grimm等人,hum.gene ther.,10(15):2445
‑
2450(1999),其内容各自通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。腺相关病毒(aav)载体是治疗性基因递送的有前景的候选物并且已在临床试验中被证实为安全且有效的。出于这个目的,改进aav颗粒的设计和生产是热门研究领域。
7.仍需要用于生产aav衣壳蛋白、aav衣壳和相应aav载体(例如aav颗粒)的改进系统和方法。
技术实现要素:
8.本公开提供了用于生产重组腺病毒相关病毒(raav)的方法和系统。
9.在某些实施方案中,用于生产重组腺相关病毒(raav)的方法包括以下步骤中的一者或多者:(a)将至少一个病毒生产细胞(vpc)引入生物反应器中并且在所述生物反应器中扩增vpc数量至目标vpc细胞密度;(b)将至少一个包含aav病毒表达构建体的表达杆状病毒
感染的昆虫细胞(biic)和至少一个包含aav有效负载构建体的有效负载biic引入所述生物反应器中;(c)在使得在一个或多个所述vpc内生产一个或多个raav的条件下,在所述生物反应器中温育vpc、表达biic和有效负载biic的混合物;(d)从所述生物反应器收获病毒生产池,其中所述病毒生产池包含液体培养基和含有所述一个或多个raav的所述一个或多个vpc;(e)在化学溶胞条件下使用化学溶胞溶液使所述病毒生产池内的所述一个或多个vpc暴露于化学性溶胞,其中所述化学性溶胞将来自所述vpc的所述一个或多个raav释放到所述病毒生产池的液体培养基中;(f)经由一个或多个澄清过滤步骤处理病毒生产池,其中所述病毒生产池经由一个或多个澄清过滤系统处理;(g)经由一个或多个亲和色谱步骤处理所述病毒生产池,其中所述病毒生产池经由一个或多个亲和色谱系统处理;(h)经由一个或多个离子交换色谱步骤处理所述病毒生产池,其中所述病毒生产池经由一个或多个离子交换色谱系统处理;(i)经由一个或多个切向流过滤(tff)步骤处理所述病毒生产池,其中所述病毒生产池经由一个或多个切向流过滤(tff)系统处理;以及(h)经由一个或多个病毒截留性过滤(vrf)步骤处理所述病毒生产池,其中所述病毒生产池经由一个或多个病毒截留性过滤(vrf)系统处理。
10.在某些实施方案中,在生物反应器内的病毒生产细胞(vpc)中生产raav。在某些实施方案中,生物反应器的体积为至少5l、10l、20l、50l、100l或200l。在某些实施方案中,vpc包含昆虫细胞。在某些实施方案中,vpc包含sf9昆虫细胞。在某些实施方案中,使用杆状病毒生产系统生产raav。
11.在某些实施方案中,biic引入时所述目标vpc细胞密度为2.0
‑
4.0
×
106个细胞/毫升、2.5
‑
3.5
×
106个细胞/毫升或约3.0
×
106个细胞/毫升。在某些实施方案中,biic引入时vpc细胞相对于引入所述生物反应器中的表达biic数目的比率在1:2.0
×
105‑
1:4.0
×
105v/v之间、在1:2.5
×
105‑
1:3.5
×
105v/v之间,约1:2.5
×
105v/v、约1:3.0
×
105v/v、约1:3.5
×
105v/v或约1:4.0
×
105v/v。在某些实施方案中,biic引入时vpc细胞相对于引入所述生物反应器中的有效负载biic数目的比率在1:5.0
×
104‑
2.0
×
105v/v之间、在1:8.0
×
104‑
1:1.5
×
105v/v之间,约1:8.0
×
104v/v、约1:1.0
×
105v/v或约1:1.5
×
105v/v。在某些实施方案中,引入所述生物反应器中的表达biic相对于引入所述生物反应器中的有效负载biic的比率在1:1
‑
5:1之间、在2:1
‑
4:1之间、在2.5:1
‑
3.5:1之间或为约3:1。
12.在某些实施方案中,所述方法包括一个或多个化学溶胞步骤,其中使病毒生产池暴露于化学性溶胞。在某些实施方案中,所述方法包括:从所述生物反应器收获所述病毒生产池,其中所述病毒生产池包含液体培养基和含有所述一个或多个raav的所述一个或多个vpc;以及在化学溶胞条件下使用化学溶胞溶液使所述病毒生产池内的所述一个或多个vpc暴露于化学性溶胞,其中所述化学性溶胞将来自所述vpc的所述一个或多个raav释放到所述病毒生产池的液体培养基中。在某些实施方案中,化学溶胞溶液包含选自精氨酸和其盐的稳定化添加剂。
13.在某些实施方案中,所述方法包括一个或多个澄清过滤步骤,其中经由一个或多个澄清过滤系统处理所述病毒生产池。在某些实施方案中,所述一个或多个澄清过滤步骤包括经由深层过滤系统、0.2μm微滤系统或其组合处理所述病毒生产池。在某些实施方案中,所述一个或多个澄清过滤步骤包括依次经由深层过滤系统和0.2μm微滤系统处理所述病毒生产池。在某些实施方案中,所述一个或多个澄清过滤步骤包括依次经由第一深层过
滤系统、第二深层过滤系统和0.2μm微滤系统处理所述病毒生产池。
14.在某些实施方案中,所述方法包括一个或多个亲和色谱步骤,其中经由一个或多个亲和色谱系统处理所述病毒生产池。在某些实施方案中,所述方法包括在结合
‑
洗脱模式中经由一个或多个免疫亲和色谱系统处理所述病毒生产池。在某些实施方案中,所述免疫亲和色谱系统包含能够结合至一个或多个aav衣壳变体的一个或多个重组单链抗体。在某些实施方案中,所述亲和色谱系统包含avb柱树脂、aav9柱树脂或aavx柱树脂。
15.在某些实施方案中,所述方法包括一个或多个离子交换色谱步骤,其中经由一个或多个离子交换色谱系统处理所述病毒生产池。在某些实施方案中,所述方法包括在穿流模式中经由一个或多个阴离子交换色谱系统处理所述病毒生产池。在某些实施方案中,所述阴离子交换色谱系统包含结合非病毒杂质、非aav病毒颗粒或其组合的固定相。在某些实施方案中,所述阴离子交换色谱系统包含不结合至病毒生产池中的一个或多个raav的固定相。在某些实施方案中,所述阴离子交换色谱系统的固定相包含季胺官能团。在某些实施方案中,所述阴离子交换色谱系统包含三甲基铵乙基(tmae)官能团。
16.在某些实施方案中,所述方法包括一个或多个切向流过滤(tff)步骤,其中经由一个或多个tff系统处理所述病毒生产池。在某些实施方案中,在一个或多个tff步骤之前,将50%蔗糖混合物添加至所述病毒生产池中。在某些实施方案中,在一个或多个tff步骤之前,将50%蔗糖混合物以9
‑
13%v/v之间的浓度添加至所述病毒生产池。在某些实施方案中,在一个或多个tff步骤之前,将50%蔗糖混合物以10
‑
12%v/v之间的浓度添加至所述病毒生产池。在某些实施方案中,在一个或多个tff步骤之前,将50%蔗糖混合物以11%v/v的浓度添加至所述病毒生产池。
17.在某些实施方案中,一个或多个tff步骤包括第一渗滤步骤,其中用低蔗糖渗滤缓冲液替换所述病毒生产池的至少一部分所述液体培养基。在某些实施方案中,所述低蔗糖渗滤缓冲液包含4
‑
6%w/v糖或糖替代物和150
‑
250mm之间的碱氯化物盐。在某些实施方案中,所述低蔗糖渗滤缓冲液包含在4.5
‑
5.5%w/v之间的蔗糖和210
‑
230mm之间的氯化钠。在某些实施方案中,所述低蔗糖渗滤缓冲液包含5%w/v蔗糖和220mm氯化钠。
18.在某些实施方案中,一个或多个tff步骤包括超滤浓缩步骤,其中使所述病毒生产池中的aav颗粒浓缩至目标颗粒浓度。在某些实施方案中,使所述病毒生产池中的aav颗粒浓缩至1.0
×
10
12
‑
5.0
×
10
13
vg/ml之间。在某些实施方案中,使所述病毒生产池中的aav颗粒浓缩至2.0
×
10
12
‑
5.0
×
10
12
vg/ml之间。在某些实施方案中,使所述病毒生产池中的aav颗粒浓缩至1.0
×
10
13
‑
5.0
×
10
13
vg/ml之间。在某些实施方案中,使所述病毒生产池中的aav颗粒浓缩至2.0
×
10
13
‑
3.0
×
10
13
vg/ml之间。在某些实施方案中,使所述病毒生产池中的aav颗粒浓缩至2.7
×
10
13
vg/ml。
19.在某些实施方案中,一个或多个tff步骤包括配制渗滤步骤,其中用高蔗糖配制缓冲液替换所述病毒生产池的至少一部分所述液体培养基。在某些实施方案中,所述高蔗糖配制缓冲液包含6
‑
8%w/v糖或糖替代物和90
‑
100mm之间的碱氯化物盐。在某些实施方案中,高蔗糖配制缓冲液包含7%w/v蔗糖和90
‑
100mm之间的氯化钠。在某些实施方案中,高蔗糖配制缓冲液包含7%w/v蔗糖、10mm磷酸钠、95
‑
100mm之间的氯化钠和0.001%(w/v)泊洛沙姆188。在某些实施方案中,配制渗滤步骤是一个或多个tff步骤中的最终渗滤步骤。在某些实施方案中,配制渗滤步骤是一个或多个tff步骤中的唯一渗滤步骤。
20.在某些实施方案中,所述方法包括一个或多个病毒截留性过滤(vrf)步骤,其中经由一个或多个vrf系统处理所述病毒生产池。在某些实施方案中,vrf系统包含截留50nm或更大的颗粒的过滤介质。在某些实施方案中,vrf系统包含截留35nm或更大的颗粒的过滤介质。在某些实施方案中,vrf系统包含截留20nm或更大的颗粒的过滤介质。
21.本公开提供了用于通过以下生产药物制剂的方法和系统:(i)提供通过本公开的方法或系统生产的一个或多个raav;以及(ii)将一个或多个raav与一种或多种药物赋形剂组合。本公开提供了通过本公开的方法或系统生产的药物制剂。
22.本公开提供了用于通过以下生产基因疗法产物的方法和系统:(i)提供包含本公开的raav的药物制剂,其中通过本公开的方法或系统生产所述药物制剂和/或raav;以及(ii)将所述药物制剂适当地等分到制剂容器中。
23.本公开提供了适用于基因疗法模态的药物制剂。在某些实施方案中,药物制剂包含本公开的raav。在某些实施方案中,药物制剂包含浓度低于5
×
10
13
vg/ml的raav。在某些实施方案中,药物制剂包含浓度在1.0
×
10
12
‑
5.0
×
10
13
vg/ml之间的raav。在某些实施方案中,药物制剂包含浓度在1.0
×
10
12
‑
5.0
×
10
12
vg/ml之间的raav。在某些实施方案中,药物制剂包含浓度在1.0
×
10
13
‑
5.0
×
10
13
vg/ml之间的raav。在某些实施方案中,药物制剂包含浓度为2.7
×
10
13
vg/ml的raav。
附图说明
24.前述和其他目标、特征和优点将从如附图中所说明的本公开特定实施方案的以下描述中显而易见。附图不一定按比例或全面,替代地强调了说明本公开的各种实施方案的原理。
25.图1显示使用病毒生产细胞(vpc)和质粒构建体来生产杆状病毒感染的昆虫细胞(biic)的系统的一个实施方案的示意图,和工艺的一个实施方案的流程图。
26.图2显示使用病毒生产细胞(vpc)和杆状病毒感染的昆虫细胞(biic)来生产aav颗粒的系统的一个实施方案的示意图,和工艺的一个实施方案的流程图。
27.图3显示通过处理、澄清和纯化aav颗粒和病毒生产细胞的批量收获物(bulk harvest)来生产原料药的系统的一个实施方案的示意图,和工艺的一个实施方案的流程图。
28.图4a和图4b显示了病毒生产细胞(vpc)的biic转染中biic
rep/cap
细胞计数(y轴)相对于biic
rep/cap
与biic
有效负载
v/v比率(x轴)的计算机建模结果。图4a显示了使用ddpcr的aav滴度(vg/ml),并且图4b显示了衣壳完全%。
29.图5a和图5b显示了病毒生产细胞(vpc)的biic转染中biic
rep/cap
细胞计数(y轴)相对于vpc细胞/毫升(x轴,
×
106)的计算机建模结果。图5a显示了使用ddpcr的aav滴度(vg/ml),并且图5b显示了衣壳完全%。
30.图6a和图6b显示了病毒生产细胞(vpc)的biic转染中biic
rep/cap
与biic
有效负载
v/v比率(y轴)相对于vpc细胞/毫升(x轴,
×
106)的计算机建模结果。图6a显示了使用ddpcr的aav滴度(vg/ml),并且图6b显示了衣壳完全%。
具体实施方式
31.i.腺相关病毒(aav)
32.概述
33.腺相关病毒(aav)是由单链dna病毒基因组表征的细小病毒科的小型无包膜二十面体衣壳病毒。细小病毒科病毒由两种亚科组成:感染脊椎动物的细小病毒亚科(parvovirinae),和感染无脊椎动物的浓核病毒亚科(densovirinae)。细小病毒科包含依赖病毒属,其包含aav,能够在包括但不限于人类、灵长类动物、牛类动物、犬类动物、马类动物和绵羊类动物物种的脊椎动物宿主中复制。
34.细小病毒和细小病毒科的其他成员通常描述于kenneth i.berns,“parvoviridae:the viruses and their replication”,fields virology中的第69章(第3版1996)中,其关于细小病毒的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
35.已证明aav由于其相对简单的结构、其在不整合至宿主基因组和不复制的情况下感染大范围的细胞(包含休眠细胞和分裂细胞)的能力及其相对良性的免疫原性概况而适用作生物工具。病毒的基因组可被操纵以含有用于组装功能性重组病毒或病毒颗粒的最少组分,所述病毒或病毒颗粒负载有或被工程化以靶向特定组织并表达或递送所需有效负载。
36.aav病毒基因组
37.野生型aav病毒基因组是长度为约5,000个核苷酸(nt)的线性单链dna(ssdna)分子。反向末端重复序列(itr)传统上在5'端和3'端处对病毒基因组封端,为病毒基因组提供复制起点。虽然不希望被理论束缚,但aav病毒基因组典型地包含两个itr序列。这些itr在ssdna的5'端和3'端处具有由自互补区(145nt于野生型aav中)定义的特征性t形发夹结构,形成能量上稳定的双链区。所述双链发夹结构包含多种功能,包括但不限于通过充当宿主病毒复制细胞的内源dna聚合酶复合物的引物来充当dna复制的起点。
38.野生型aav病毒基因组还包含用于两个开放阅读框的核苷酸序列,一个用于四种非结构rep蛋白质(rep78、rep68、rep52、rep40,由rep基因编码),并且一个用于三种衣壳蛋白或结构蛋白质(vp1、vp2、vp3,由衣壳基因或cap基因编码)。rep蛋白质对于复制和包装是重要的,而衣壳蛋白被组装以产生aav的蛋白质壳或aav衣壳。替代性剪接和交替的起始密码子和启动子致使自单一开放阅读框产生四种不同rep蛋白质以及从单一开放阅读框产生三种衣壳蛋白。尽管其根据aav血清型变化,但作为一个非限制性实例,对于aav9/hu.14(us 7,906,111的seq id no:123,其关于aav9/hu.14的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可),vp1是指氨基酸1
‑
736,vp2是指氨基酸138
‑
736,并且vp3是指氨基酸203
‑
736。换句话说,vp1是全长衣壳序列,而vp2和vp3是整体的较短组分。因此,vp3区中的序列的变化也是vp1和vp2的变化,然而,vp3相较于亲本序列的差异百分比将最大,因为它是三者中的最短序列。尽管关于氨基酸序列在本文进行描述,但可类似地描述编码这些蛋白质的核酸序列。共同地,三种衣壳蛋白组装产生aav衣壳蛋白。虽然不希望受理论束缚,但aav衣壳蛋白通常包含vp1:vp2:vp3为1:1:10的摩尔比。如本文所用,“aav血清型”主要由aav衣壳定义。在一些情况下,itr也由aav血清型(例如aav2/9)特定描述。
39.为了用作生物工具,可对野生型aav病毒基因组进行修饰,以用包含具有至少一个
2005072364号,其中每一者关于生产和/或修饰aav颗粒的内容各自通过引用整体并入本文,只要它们不与本公开相冲突即可)。
50.aav颗粒可被修饰以增强递送效率。此类修饰aav颗粒可被有效包装并用于成功地以高频率和最小毒性感染目标细胞。在某些实施方案中,根据美国公开第us 20130195801号中所述方法对aav颗粒的衣壳进行工程化,其关于修饰aav颗粒以增强递送效率的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
51.在某些实施方案中,aav颗粒包含编码本公开的多肽或蛋白质的有效负载区,并且可被引入哺乳动物细胞中。
52.反向末端重复序列(itr)
53.本公开的aav颗粒包含具有至少一个itr区和有效负载区的病毒基因组。在某些实施方案中,病毒基因组具有两个itr。这两个itr在5'端和3'端侧接有效负载区。itr充当复制起点,其包含用于复制的识别位点。itr包含可互补和对称地布置的序列区域。并入本公开的病毒基因组中的itr可包含天然存在的多核苷酸序列或以重组方式衍生的多核苷酸序列。
54.itr可来源于与衣壳相同的血清型或其衍生物。itr可具有与衣壳不同的血清型。在某些实施方案中,aav颗粒具有超过一个itr。在一个非限制性实例中,aav颗粒具有包含两个itr的病毒基因组。在某些实施方案中,itr具有彼此相同的血清型。在另一个实施方案中,itr具有不同血清型。非限制性实例包括具有与衣壳相同的血清型的itr的零个、一个或两个。在某些实施方案中,aav颗粒的病毒基因组的两个itr都是aav2 itr。
55.独立地,每个itr的长度可为约100至约150个核苷酸。itr的长度可为约100
‑
105个核苷酸,长度可为约106
‑
110个核苷酸,长度可为约111
‑
115个核苷酸,长度可为约116
‑
120个核苷酸,长度可为约121
‑
125个核苷酸,长度可为约126
‑
130个核苷酸,长度可为约131
‑
135个核苷酸,长度可为约136
‑
140个核苷酸,长度可为约141
‑
145个核苷酸或者长度可为约146
‑
150个核苷酸。在某些实施方案中,itr的长度为140
‑
142个核苷酸。itr长度的非限制性实例为长度102、130、140、141、142、145个核苷酸,以及与其具有至少95%同一性的那些核苷酸。
56.在某些实施方案中,每个itr的长度可为141个核苷酸。在某些实施方案中,每个itr的长度可为130个核苷酸。在某些实施方案中,每个itr的长度可为119个核苷酸。
57.在某些实施方案中,aav颗粒包含两个itr,一个itr的长度为141个核苷酸并且另一个itr的长度为130个核苷酸。在某些实施方案中,aav颗粒包含两个itr并且两个itr的长度为141个核苷酸。
58.独立地,每个itr的长度可为约75至约175个核苷酸。itr的长度可独立地为例如但不限于75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174和175个核苷酸。病毒基因组的itr的长度可为75
‑
80、75
‑
85、75
‑
100、80
‑
85、80
‑
90、80
‑
105、85
‑
90、85
‑
95、85
‑
110、90
‑
95、90
‑
100、90
‑
115、95
‑
100、95
‑
105、95
‑
120、100
‑
105、100
‑
110、100
‑
125、105
‑
110、105
‑
115、105
‑
130、110
‑
115、110
‑
120、110
‑
135、115
‑
120、115
‑
125、115
‑
140、120
‑
125、120
‑
130、120
‑
145、125
‑
130、125
‑
135、125
‑
150、130
‑
135、130
‑
140、130
‑
155、135
‑
140、135
‑
145、135
‑
160、140
‑
145、140
‑
150、140
‑
165、145
‑
150、145
‑
155、145
‑
170、150
‑
155、150
‑
160、150
‑
175、155
‑
160、155
‑
165、160
‑
165、160
‑
170、165
‑
170、165
‑
175和170
‑
175个核苷酸。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约105个核苷酸的itr。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约141个核苷酸的itr。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约130个核苷酸的itr。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约105个核苷酸的itr和长度为约141个核苷酸的itr。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约105个核苷酸的itr和长度为约130个核苷酸的itr。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约130个核苷酸的itr和长度为约141个核苷酸的itr。作为一个非限制性实例,病毒基因组可包含两个itr,其中每一者的长度为约141个核苷酸。
59.启动子
60.在某些实施方案中,病毒基因组的有效负载区包含增强转基因靶特异性和表达的至少一个元件(参见例如powell等人,viral expression cassette elements to enhance transgene target specificity and expression in gene therapy,2015;其关于有效负载/转基因增强子元件的内容通过引用整体并入本文,只有其不与本公开相冲突即可)。增强转基因靶特异性和表达的元件的非限制性实例包括启动子、内源mirna、转录后调控元件(pre)、多聚腺苷酸化(polya)信号序列和上游增强子(use)、cmv增强子和内含子。
61.本领域技术人员可认识到,本公开的多肽在目标细胞中的表达可能需要特定启动子,其包括但不限于具有物种特异性、诱导型、组织特异性或细胞周期特异性的启动子(参见parr等人,nat.med.3:1145
‑
9(1997);其关于多肽表达启动子的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
62.在某些实施方案中,当启动子驱动在aav颗粒的病毒基因组的有效负载区中编码的多肽的表达时,其被视为有效的。在某些实施方案中,当启动子驱动所靶向的细胞中的表达时,其被视为有效的。在某些实施方案中,启动子对所靶向的细胞具有趋向性。在某些实施方案中,启动子对病毒生产细胞具有趋向性。
63.在某些实施方案中,启动子持续一段时间驱动有效负载在所靶向细胞或组织中的表达。由启动子驱动的表达可持续1
‑
31天(或其中的任何值或范围)、1
‑
23个月(或其中的任何值或范围)、2
‑
10年(或其中的任何值或范围)或超过10年的时段。表达可持续1
‑
5小时、1
‑
12小时、1
‑
2天、1
‑
5天、1
‑
2周、1
‑
3周、1
‑
4周、1
‑
2个月、1
‑
4个月、1
‑
6个月、2
‑
6个月、3
‑
6个月、3
‑
9个月、4
‑
8个月、6
‑
12个月、1
‑
2年、1
‑
5年、2
‑
5年、3
‑
6年、3
‑
8年、4
‑
8年或5
‑
10年。作为一个非限制性实例,启动子可为用于在神经(例如cns)细胞或组织中持续表达有效负载的弱启动子。
64.在某些实施方案中,启动子持续至少1
‑
11个月(或其中的任何个别值)、2
‑
65年(或其中的任何个别值)或超过65年驱动本公开的多肽的表达。
65.启动子可为天然存在的或非天然存在的。启动子的非限制性实例包括病毒启动子、植物启动子和哺乳动物启动子。在某些实施方案中,启动子可为人类启动子。在某些实施方案中,启动子可为截短或突变启动子。
66.驱动或促进大部分组织中的表达的启动子包括但不限于人类延长因子1α亚基
(ef1α)、巨细胞病毒(cmv)立即早期增强子和/或启动子、鸡β
‑
肌动蛋白(cba)和其衍生物cag、β葡糖醛酸酶(gusb)或泛素c(ubc)。组织特异性表达元件可用于将表达限制在某些细胞类型,例如但不限于肌肉特异性启动子、b细胞启动子、单核细胞启动子、白血球启动子、巨噬细胞启动子、胰脏腺泡细胞启动子、内皮细胞启动子、肺组织启动子、星形胶质细胞启动子,或者可用于将表达限制在神经元或神经元亚型、星形胶质细胞或少突神经胶质细胞的神经系统启动子。
67.肌肉特异性启动子的非限制性实例包括哺乳动物肌肉肌酸激酶(mck)启动子、哺乳动物肌间线蛋白(des)启动子、哺乳动物肌钙蛋白i(tnni2)启动子和哺乳动物骨骼α
‑
肌动蛋白(aska)启动子(参见例如美国专利公开us 20110212529,其关于肌肉特异性启动子的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)。
68.神经元的组织特异性表达元件的非限制性实例包括神经元特异性烯醇酶(nse)、血小板衍生生长因子(pdgf)、血小板衍生生长因子b链(pdgf
‑
β)、突触蛋白(syn)、甲基
‑
cpg结合蛋白2(mecp2)、ca
2
/钙调蛋白依赖性蛋白质激酶ii(camkii)、促代谢型谷氨酸受体2(mglur2)、神经丝轻链(nfl)或神经丝重链(nfh)、β
‑
珠蛋白小基因nβ2、前脑啡肽原(ppe)、脑啡肽(enk)和激动性氨基酸转运体2(eaat2)启动子。用于星形胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括胶质原纤维酸性蛋白质(gfap)和eaat2启动子。用于少突神经胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括髓磷脂碱性蛋白质(mbp)启动子。
69.在某些实施方案中,启动子可小于1kb。启动子的长度可为200
‑
800个核苷酸(或其中的任何值或范围),或超过800个核苷酸。启动子的长度可在200
‑
300、200
‑
400、200
‑
500、200
‑
600、200
‑
700、200
‑
800、300
‑
400、300
‑
500、300
‑
600、300
‑
700、300
‑
800、400
‑
500、400
‑
600、400
‑
700、400
‑
800、500
‑
600、500
‑
700、500
‑
800、600
‑
700、600
‑
800或700
‑
800之间。
70.本公开的aav颗粒包含具有至少一个启动子区的病毒基因组。一个或多个启动子区的长度可独立地为例如但不限于:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、
344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599和600个核苷酸。病毒基因组的启动子区的长度可为4
‑
10、10
‑
20、10
‑
50、20
‑
30、30
‑
40、40
‑
50、50
‑
60、50
‑
100、60
‑
70、70
‑
80、80
‑
90、90
‑
100、100
‑
110、100
‑
150、110
‑
120、120
‑
130、130
‑
140、140
‑
150、150
‑
160、150
‑
200、160
‑
170、170
‑
180、180
‑
190、190
‑
200、200
‑
210、200
‑
250、210
‑
220、220
‑
230、230
‑
240、240
‑
250、250
‑
260、250
‑
300、260
‑
270、270
‑
280、280
‑
290、290
‑
300、300
‑
310、300
‑
350、310
‑
320、320
‑
330、330
‑
340、340
‑
350、350
‑
360、350
‑
400、360
‑
370、370
‑
380、380
‑
390、390
‑
400、400
‑
410、400
‑
450、410
‑
420、420
‑
430、430
‑
440、440
‑
450、450
‑
460、450
‑
500、460
‑
470、470
‑
480、480
‑
490、490
‑
500、500
‑
510、500
‑
550、510
‑
520、520
‑
530、530
‑
540、540
‑
550、550
‑
560、550
‑
600、560
‑
570、570
‑
580、580
‑
590和590
‑
600个核苷酸。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约4个核苷酸的启动子区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约17个核苷酸的启动子区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约204个核苷酸的启动子区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约219个核苷酸的启动子区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约260个核苷酸的启动子区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约303个核苷酸的启动子区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约382个核苷酸的启动子区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约588个核苷酸的启动子区。
71.在某些实施方案中,启动子可为相同或不同起始或亲本启动子(例如但不限于cmv和cba)的两种或更多种组分的组合。每个组分的长度可为200
‑
800个核苷酸(或其中的任何值或范围),或超过800个核苷酸。每个组分的长度可在200
‑
300、200
‑
400、200
‑
500、200
‑
600、200
‑
700、200
‑
800、300
‑
400、300
‑
500、300
‑
600、300
‑
700、300
‑
800、400
‑
500、400
‑
600、400
‑
700、400
‑
800、500
‑
600、500
‑
700、500
‑
800、600
‑
700、600
‑
800或700
‑
800之间。在某些实施方案中,启动子是382个核苷酸的cmv
‑
增强子序列与260个核苷酸的cba
‑
启动子序列的组合。
72.在某些实施方案中,病毒基因组包含普遍存在的启动子。普遍存在的启动子的非限制性实例包括cmv、cba(包含衍生物cag、cbh等)、ef
‑
1α、pgk、ubc、gusb(hgbp)和ucoe(hnrpa2b1
‑
cbx3的启动子)。在某些实施方案中,启动子区来源于cba启动子序列。作为一个
非限制性实例,启动子的长度为260个核苷酸。
73.yu等人(molecular pain 2011,7:63;其内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)使用慢病毒载体评估大鼠drg细胞和初级drg细胞中egfp在cag、efiα、pgk和ubc启动子下的表达,并且发现ubc显示比其他3种启动子弱的表达并且对于所有启动子仅见到10
‑
12%神经胶质表达。soderblom等人(e.neuro 2015;其内容各自通过引用整体并入本文)评估在运动皮质中注射之后,egfp在具有cmv和ubc启动子的aav8中和具有cmv启动子的aav2中的表达。鼻内施用含有ubc或efiα启动子的质粒显示出大于cmv启动子表达的持续气道表达(参见例如gill等人,gene therapy 2001,第8卷,1539
‑
1546;其内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)。husain等人(gene therapy 2009;其内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)评估具有hgusb启动子、hsv
‑
1lat启动子和nse启动子的hβh构建体并且发现hβh构建体的表达比小鼠脑中的nse弱。passini和wolfe(j.virol.2001,12382
‑
12392,其内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)评估hβh载体在新生小鼠的心室内注射后的长期作用,并且发现持续表达持续至少1年。xu等人(gene therapy 2001,8,1323
‑
1332;其内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)发现相较于cmv
‑
lacz、cmv
‑
luc、ef、gfap、henk、nachr、ppe、ppe wpre、nse(0.3kb)、nse(1.8kb)和nse(1.8kb wpre),使用nfl和nfh启动子时所有脑区域中的表达较低。xu等人发现启动子活性按照递减的顺序为nse(1.8kb)、ef、nse(0.3kb)、gfap、cmv、henk、ppe、nfl和nfh。nfl启动子是650个核苷酸的启动子并且nfh是920个核苷酸的启动子,这两种启动子在肝脏中均不存在,但nfh启动子在感觉性本体感受性神经元、脑和脊髓中是丰富的并且nfh启动子存在于心脏中。scn8a启动子是表达于整个drg、脊髓和脑中的470个核苷酸的启动子,其中海马体神经元和小脑浦肯野细胞(purkinje cell)、皮质、丘脑和下丘脑的表达特别高(参见例如drews等人,identification of evolutionary conserved,functional noncoding elements in the promoter region of the sodium channel gene scn8a,mamm genome(2007)18:723
‑
731;以及raymond等人,expression of alternatively spliced sodium channelα
‑
subunit genes,journal of biological chemistry(2004)279(44)46234
‑
46241;其各者的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)。
74.前述yu、soderblom、gill、husain、passini、xu、drews或raymond所教导的启动子中的任一者均可用于本公开中。
75.在某些实施方案中,启动子并非细胞特异性的。
76.在某些实施方案中,启动子是泛素c(ubc)启动子。ubc启动子的大小可为300
‑
350个核苷酸。作为一个非限制性实例,ubc启动子为332个核苷酸。在某些实施方案中,启动子为β
‑
葡萄糖醛酸苷酶(gusb)启动子。gusb启动子的大小可为350
‑
400个核苷酸。作为一个非限制性实例,gusb启动子为378个核苷酸。在某些实施方案中,启动子为神经丝轻链(nfl)启动子。nfl启动子的大小可为600
‑
700个核苷酸。作为一个非限制性实例,nfl启动子为650个核苷酸。在某些实施方案中,启动子为神经丝重链(nfh)启动子。nfh启动子的大小可为900
‑
950个核苷酸。作为一个非限制性实例,nfh启动子为920个核苷酸。在某些实施方案中,启动子为scn8a启动子。scn8a启动子的大小可为450
‑
500个核苷酸。作为一个非限制性实例,scn8a启动子为470个核苷酸。
77.在某些实施方案中,启动子为共济蛋白(fxn)启动子。在某些实施方案中,启动子为磷酸甘油酸激酶1(pgk)启动子。在某些实施方案中,启动子为鸡β
‑
肌动蛋白(cba)启动子或其变体。在某些实施方案中,启动子为cb6启动子。在某些实施方案中,启动子为最小cb启动子。在某些实施方案中,启动子为巨细胞病毒(cmv)启动子。在某些实施方案中,启动子为h1启动子。在某些实施方案中,启动子为cag启动子。在某些实施方案中,启动子为gfap启动子。在某些实施方案中,启动子为突触蛋白启动子。在某些实施方案中,启动子为工程化启动子。在某些实施方案中,启动子为肝脏或骨胳肌启动子。肝脏启动子的非限制性实例包括人类α
‑1‑
抗胰蛋白酶(haat)和甲状腺素结合球蛋白(tbg)。骨骼肌启动子的非限制性实例包括肌间线蛋白、mck或合成c5
‑
12。在某些实施方案中,启动子为rna pol iii启动子。作为一个非限制性实例,rna pol iii启动子为u6。作为一个非限制性实例,rna pol iii启动子为h1。在某些实施方案中,启动子为心肌细胞特异性启动子。心肌细胞特异性启动子的非限制性实例包括αmhc、ctnt和cmv
‑
mlc2k。在某些实施方案中,病毒基因组包含两个启动子。作为一个非限制性实例,启动子为ef1α启动子和cmv启动子。
78.在某些实施方案中,病毒基因组包含增强子元件、启动子和/或5'utr内含子。增强子元件在本文中也称为“增强子”,可为但不限于cmv增强子,启动子可为但不限于cmv、cba、ubc、gusb、nse、突触蛋白、mecp2和gfap启动子并且5'utr/内含子可为但不限于sv40和cba
‑
mvm。作为一个非限制性实例,组合使用的增强子、启动子和/或内含子可为:(1)cmv增强子、cmv启动子、sv40 5'utr内含子;(2)cmv增强子、cba启动子、sv
‑
40 5'utr内含子;(3)cmv增强子、cba启动子、cba
‑
mvm 5'utr内含子;(4)ubc启动子;(5)gusb启动子;(6)nse启动子;(7)突触蛋白启动子;(8)mecp2启动子和(9)gfap启动子。
79.在某些实施方案中,病毒基因组包含工程化启动子。
80.在另一个实施方案中,病毒基因组包含来自天然表达蛋白质的启动子。
81.在某些实施方案中,本公开的aav颗粒包含具有至少一个增强子区的病毒基因组。增强子区的长度可独立地为例如但不限于:300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399和400个核苷酸。病毒基因组的增强子区的长度可为300
‑
310、300
‑
325、305
‑
315、310
‑
320、315
‑
325、320
‑
330、325
‑
335、325
‑
350、330
‑
340、335
‑
345、340
‑
350、345
‑
355、350
‑
360、350
‑
375、355
‑
365、360
‑
370、365
‑
375、370
‑
380、375
‑
385、375
‑
400、380
‑
390、385
‑
395和390
‑
400个核苷酸。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约303个核苷酸的增强子区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约382个核苷酸的增强子区。
82.在某些实施方案中,增强子区来源于cmv增强子序列。作为一个非限制性实例,cmv增强子的长度为382个核苷酸。
83.非翻译区(utr)
84.根据定义,对基因的野生型非翻译区(utr)进行转录,但不翻译。一般来说,5'utr起始于转录起始位点并结束于起始密码子,而3'utr紧随终止密码子之后起始并持续直至
转录终止信号。
85.通常发现于充分表达的特定目标器官的基因中的特征可被工程化到utr中,以增强稳定性和蛋白质产量。作为一个非限制性实例,来自通常表达于肝脏中的mrna(例如白蛋白、血清淀粉样蛋白a、载脂蛋白a/b/e、转铁蛋白、α胎蛋白、红细胞生成素或因子viii)的5'utr可用于本公开的aav颗粒的病毒基因组中,以增强肝细胞系或肝脏的表达。
86.虽然不希望受理论束缚,野生型5'非翻译区(utr)包含在翻译起始中起作用的特征。通常在5'utr中包含kozak序列,通常已知kozak序列参与核糖体引发许多基因的翻译的过程。kozak序列具有共同ccr(a/g)ccaugg,其中r是起始密码子上游的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)三碱基(atg),接着是另一个
‘
g’。在某些实施方案中,病毒基因组中的5'utr包含kozak序列。在某些实施方案中,病毒基因组中的5'utr不包含kozak序列。
87.虽然不希望受理论束缚,但已知野生型3'utr中具有其中嵌入的腺苷和尿苷的延伸。这些富au签名在具有高转换率的基因中特别普遍。基于其序列特征和功能特性,富au元件(are)可分成三类(chen等人,1995,其关于富au元件的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可):i类are(例如但不限于c
‑
myc和myod),其在富u区内含有auuua基序的若干个分散的拷贝。ii类are,例如但不限于gm
‑
csf和tnf
‑
a,其具有两个或更多个重叠的uuauuua(u/a)(u/a)九聚体。iii类ares,例如但不限于c
‑
jun和成肌素,定义不太明确。这些富u区不含auuua基序。已知结合至are的大部分蛋白质使信使去稳定化,而elav家族成员(最显著地,hur)已记录到可增强mrna稳定性。hur结合至所有三类are。将hur特异性结合位点工程化至核酸分子的3'utr中将引起hur结合,并因此稳定体内信息。
88.3'utr富au元件(are)的引入、去除或修饰可用于调节多核苷酸的稳定性。当对特定多核苷酸(例如病毒基因组的有效负载区)进行工程化时,可引入are的一个或多个拷贝以使得多核苷酸较不稳定,从而减少翻译和降低所得蛋白质的产量。同样,可鉴定出are并且将其去除或使其突变以增加细胞内稳定性,并因此增加所得蛋白质的翻译和产量。
89.在某些实施方案中,病毒基因组的3'utr可包含用于模板化添加poly
‑
a尾的寡(dt)序列。
90.在某些实施方案中,病毒基因组可包含至少一个mirna种子、结合位点或完整序列。微rna(或mirna或mir)是19
‑
25个核苷酸的非编码rna,其结合至核酸目标位点并通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。微rna序列包含“种子”区,即成熟微rna的位置2
‑
8区域中的序列,所述序列相对于核酸的mirna目标序列具有完美沃森
‑
克里克互补性(watson
‑
crick complementarity)。
91.在某些实施方案中,病毒基因组可被工程化以包含、改变或去除至少一个mirna结合位点、序列或种子区。
92.来自本领域中已知的任何基因的任何utr可并入aav颗粒的病毒基因组中。这些utr或其部分的置放取向可与在其所选自的基因中相同,或其取向或位置可变化。在某些实施方案中,用于aav颗粒的病毒基因组的utr可被反转、缩短、延长、被制成具有本领域中已知的一个或多个其他5'utr或3'utr。如本文所用,术语“改变”在与utr相关时意指utr已以某种方式相对于参考序列发生变化。举例来说,3'或5'utr可如上文所教导根据取向或位置的变化而相对于野生型或原生utr发生改变,或者可通过包括额外核苷酸、核苷酸缺失、核苷酸交换或转位而发生改变。
93.在某些实施方案中,aav颗粒的病毒基因组包含至少一个人工utr,其不为野生型utr的变体。
94.在某些实施方案中,aav颗粒的病毒基因组包含utr,其选自其蛋白质具有共同功能、结构、特征或特性的转录物家族。
95.多聚腺苷酸化序列
96.在某些实施方案中,本公开的aav颗粒的病毒基因组包含至少一个多聚腺苷酸化序列。aav颗粒的病毒基因组可包含在有效负载编码序列的3'端与3'itr的5'端之间的多腺苷酸化序列。
97.在某些实施方案中,多聚腺苷酸化序列或“polya序列”的长度可在零个至约500个核苷酸的范围内。多聚腺苷酸化序列的长度可为但不限于1
‑
500个核苷酸(或其中的任何值或范围)。
98.在某些实施方案中,多聚腺苷酸化序列的长度为127个核苷酸。在某些实施方案中,多聚腺苷酸化序列的长度为477个核苷酸。在某些实施方案中,多聚腺苷酸化序列的长度为552个核苷酸。
99.接头
100.本公开的病毒基因组可被一个或多个间隔子区或接头区工程化以分离编码区或非编码区。
101.在某些实施方案中,aav颗粒的有效负载区可任选地编码一个或多个接头序列。在一些情况下,接头可为肽接头,其可用于连接由有效负载区编码的多肽。一些肽接头可在表达之后切割以分离多肽域,允许成熟蛋白质片段的组装。接头切割可为酶促的。在一些情况下,接头包含酶切割位点,以促进细胞内或细胞外切割。一些有效负载区编码在从mrna转录物翻译接头序列期间中断多肽合成的接头。此类接头可促进从单一转录物翻译独立蛋白质域(例如重链和轻链抗体域)。在一些情况下,两个或更多个接头由病毒基因组的有效负载区编码。
102.在某些实施方案中,有效负载区编码包含弗林蛋白酶(furin)切割位点的接头。弗林蛋白酶是仅在碱性氨基酸目标序列下游切割蛋白质的钙依赖性丝氨酸内蛋白酶(arg
‑
x
‑
(arg/lys)
‑
arg)(thomas,g.,2002.nature reviews molecular cell biology 3(10):753
‑
66;其关于接头分子或序列的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)。弗林蛋白酶富集于反式高尔基体网中,在其中参与处理细胞前体蛋白。弗林蛋白酶也在激活多种病原体中起作用。可利用这种活性来表达本公开的多肽。
103.在某些实施方案中,有效负载区编码包含2a肽的接头。2a肽是小“自切割”肽(18
‑
22个氨基酸),其来源于例如口蹄疫病毒(f2a)、猪捷申病毒
‑
1(p2a)、明脉扁刺蛾(thoseaasigna)病毒(t2a)或马a型鼻炎病毒(e2a)的病毒。2a标示特别是指在2a肽的c末端中的甘氨酰基
‑
脯氨酰基键处引起核糖体跳跃的小rna病毒多蛋白质区域(kim,j.h.等人,2011.plos one 6(4):e18556;其关于2a肽接头的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)。这种跳跃引起2a肽与其紧邻的下游肽之间的切割。与ires接头相反,2a肽产生侧接2a肽的蛋白质的化学计量表达,并且其较短长度可在产生病毒表达载体中有利。
104.在某些实施方案中,有效负载区编码包含ires的接头。内部核糖体进入位点
(ires)是允许在mrna序列的中部起始翻译的核苷酸序列(>500个核苷酸)(kim,j.h.等人,2011.plos one 6(4):e18556;其关于ires区和接头的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)。使用ires序列确保ires之前和之后的基因的共表达,尽管ires之后的序列可比ires序列之前的序列以更低的水平转录和翻译。
105.在某些实施方案中,有效负载区可编码一个或多个接头,其包含组织蛋白酶、基质金属蛋白酶或豆荚蛋白切割位点。此类接头描述于例如cizeau和macdonald的国际公开第wo2008052322号中,其关于接头分子和序列的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。组织蛋白酶是对切割特定蛋白质具有独特机制的蛋白酶家族。组织蛋白酶b是半胱氨酸蛋白酶并且组织蛋白酶d是天冬氨酰蛋白酶。基质金属蛋白酶是钙依赖性和含锌内肽酶家族。豆荚蛋白是催化蛋白质和小分子底物的(
‑
asn
‑
xaa
‑
)键水解的酶。
106.在某些实施方案中,有效负载区可编码未切割的接头。此类接头可包含简单氨基酸序列,例如富甘氨酸序列。在一些情况下,接头可包含柔性肽接头,其包含甘氨酸和丝氨酸残基。这些柔性接头较小并且无侧链,因此它们倾向于不影响二级蛋白质结构,同时在抗体区段之间提供柔性接头(george,r.a.等人,2002.protein engineering 15(11):871
‑
9;huston,j.s.等人,1988.pnas 85:5879
‑
83;以及shan,d.等人,1999.journal of immunology.162(11):6589
‑
95;其关于接头分子和序列的内容各自通过引用整体并入本文,只要它们不与本公开相冲突即可)。此外,丝氨酸残基的极性改善溶解性并防止聚集问题。
107.在某些实施方案中,本公开的有效负载区可编码较小和未分支富丝氨酸肽接头,例如由huston等人在美国专利第us5525491号中所述,其关于接头分子和序列的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。由本公开的有效负载区编码,由富丝氨酸接头连接的多肽的溶解性增加。
108.在某些实施方案中,本公开的有效负载区可编码人工接头,例如由whitlow和filpula在美国专利第us5856456号和由ladner在美国专利第us 4946778号中所述,所述美国专利关于接头分子和序列的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
109.在某些实施方案中,接头区的长度可为1
‑
50、1
‑
100、50
‑
100、50
‑
150、100
‑
150、100
‑
200、150
‑
200、150
‑
250、200
‑
250、200
‑
300、250
‑
300、250
‑
350、300
‑
350、300
‑
400、350
‑
400、350
‑
450、400
‑
450、400
‑
500、450
‑
500、450
‑
550、500
‑
550、500
‑
600、550
‑
600、550
‑
650或600
‑
650个核苷酸。接头区的长度可为1
‑
650个核苷酸(或其中的任何值或范围)或大于650个核苷酸。在某些实施方案中,接头区的长度可为12个核苷酸。在某些实施方案中,接头区的长度为可为18个核苷酸。在某些实施方案中,接头区的长度可为45个核苷酸。在某些实施方案中,接头区的长度可为54个核苷酸。在某些实施方案中,接头区的长度可为66个核苷酸。在某些实施方案中,接头区的长度可为75个核苷酸。在某些实施方案中,接头区的长度可为78个核苷酸。在某些实施方案中,接头区的长度可为87个核苷酸。在某些实施方案中,接头区的长度为可为108个核苷酸。在某些实施方案中,接头区的长度为可为153个核苷酸。在某些实施方案中,接头区的长度为可为198个核苷酸。在某些实施方案中,接头区的长度可为623个核苷酸。
110.内含子和外显子
111.在某些实施方案中,载体基因组包含增强转基因目标特异性和表达的至少一个元件(参见例如powell等人,viral expression cassette elements to enhance transgene target specificity and expression in gene therapy,2015;其关于转基因靶向增强子的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可),例如内含子。内含子的非限制性实例包括mvm(67
‑
97bps)、f.ix截短的内含子1(300bps)、β
‑
珠蛋白sd/免疫球蛋白重链剪接受体(250bps)、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体(500bps)、sv40晚期剪接供体/剪接受体(19s/16s)(180bps)和杂合腺病毒剪接供体/igg剪接受体(230bps)。
112.在某些实施方案中,内含子或内含子部分的长度可为100
‑
500个核苷酸。内含子的长度可为80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500。内含子的长度可在80
‑
100、80
‑
120、80
‑
140、80
‑
160、80
‑
180、80
‑
200、80
‑
250、80
‑
300、80
‑
350、80
‑
400、80
‑
450、80
‑
500、200
‑
300、200
‑
400、200
‑
500、300
‑
400、300
‑
500或400
‑
500之间。
113.在某些实施方案中,内含子区的长度可独立地为例如但不限于:25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349和350个核苷酸。病毒基因组的内含子区的长度可为25
‑
35、25
‑
50、35
‑
45、45
‑
55、50
‑
75、55
‑
65、65
‑
75、75
‑
85、75
‑
100、85
‑
95、95
‑
105、100
‑
125、105
‑
115、115
‑
125、125
‑
135、125
‑
150、135
‑
145、145
‑
155、150
‑
175、155
‑
165、165
‑
175、175
‑
185、175
‑
200、185
‑
195、195
‑
205、200
‑
225、205
‑
215、215
‑
225、225
‑
235、225
‑
250、235
‑
245、245
‑
255、250
‑
275、255
‑
265、265
‑
275、275
‑
285、275
‑
300、285
‑
295、295
‑
305、300
‑
325、305
‑
315、315
‑
325、325
‑
335、325
‑
350和335
‑
345个核苷酸。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约32个核苷酸的内含子区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约172个核苷酸的内含子区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约201个核苷酸的内含子区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约347个核苷酸的内含子区。
114.在某些实施方案中,内含子区来源于sv40内含子序列。作为一个非限制性实例,内含子的长度为172个核苷酸。
115.在某些实施方案中,本公开的aav颗粒可包含具有至少一个外显子区的病毒基因组。外显子区的长度可独立地为例如但不限于:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149和150个核苷酸。病毒基因组的外显子区的长度可为2
‑
10、5
‑
10、5
‑
15、10
‑
20、10
‑
30、10
‑
40、15
‑
20、15
‑
25、20
‑
30、20
‑
40、20
‑
50、25
‑
30、25
‑
35、30
‑
40、30
‑
50、30
‑
60、35
‑
40、35
‑
45、40
‑
50、40
‑
60、40
‑
70、45
‑
50、45
‑
55、50
‑
60、50
‑
70、50
‑
80、55
‑
60、55
‑
65、60
‑
70、60
‑
80、60
‑
90、65
‑
70、65
‑
75、70
‑
80、70
‑
90、70
‑
100、75
‑
80、75
‑
85、80
‑
90、80
‑
100、80
‑
110、85
‑
90、85
‑
95、90
‑
100、90
‑
110、90
‑
120、95
‑
100、95
‑
105、100
‑
110、100
‑
120、100
‑
130、105
‑
110、105
‑
115、110
‑
120、110
‑
130、110
‑
140、115
‑
120、115
‑
125、120
‑
130、120
‑
140、120
‑
150、125
‑
130、125
‑
135、130
‑
140、130
‑
150、135
‑
140、135
‑
145、140
‑
150和145
‑
150个核苷酸。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约53个核苷酸的外显子区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约134个核苷酸的外显子区。
116.填充序列
117.在某些实施方案中,病毒基因组包含至少一个改善包装效率和表达的元件,例如填充序列(stuffer/filler sequence)。填充序列的非限制性实例包括白蛋白和/或α
‑
1抗胰蛋白酶。可操纵任何已知的病毒序列、哺乳动物序列或植物序列,使其适用作填充序列。
118.在某些实施方案中,填充序列的长度可为约100
‑
3500个核苷酸。填充序列的长度可为约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000。
119.在某些实施方案中,填充区的长度可独立地为例如但不限于:50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、
294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024、1025、1026、1027、
1028、1029、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1036、1037、1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1071、1072、1073、1074、1075、1076、1077、1078、1079、1080、1081、1082、1083、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096、1097、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110、1111、1112、1113、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1121、1122、1123、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134、1135、1136、1137、1138、1139、1140、1141、1142、1143、1144、1145、1146、1147、1148、1149、1150、1151、1152、1153、1154、1155、1156、1157、1158、1159、1160、1161、1162、1163、1164、1165、1166、1167、1168、1169、1170、1171、1172、1173、1174、1175、1176、1177、1178、1179、1180、1181、1182、1183、1184、1185、1186、1187、1188、1189、1190、1191、1192、1193、1194、1195、1196、1197、1198、1199、1200、1201、1202、1203、1204、1205、1206、1207、1208、1209、1210、1211、1212、1213、1214、1215、1216、1217、1218、1219、1220、1221、1222、1223、1224、1225、1226、1227、1228、1229、1230、1231、1232、1233、1234、1235、1236、1237、1238、1239、1240、1241、1242、1243、1244、1245、1246、1247、1248、1249、1250、1251、1252、1253、1254、1255、1256、1257、1258、1259、1260、1261、1262、1263、1264、1265、1266、1267、1268、1269、1270、1271、1272、1273、1274、1275、1276、1277、1278、1279、1280、1281、1282、1283、1284、1285、1286、1287、1288、1289、1290、1291、1292、1293、1294、1295、1296、1297、1298、1299、1300、1301、1302、1303、1304、1305、1306、1307、1308、1309、1310、1311、1312、1313、1314、1315、1316、1317、1318、1319、1320、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335、1336、1337、1338、1339、1340、1341、1342、1343、1344、1345、1346、1347、1348、1349、1350、1351、1352、1353、1354、1355、1356、1357、1358、1359、1360、1361、1362、1363、1364、1365、1366、1367、1368、1369、1370、1371、1372、1373、1374、1375、1376、1377、1378、1379、1380、1381、1382、1383、1384、1385、1386、1387、1388、1389、1390、1391、1392、1393、1394、1395、1396、1397、1398、1399、1400、1401、1402、1403、1404、1405、1406、1407、1408、1409、1410、1411、1412、1413、1414、1415、1416、1417、1418、1419、1420、1421、1422、1423、1424、1425、1426、1427、1428、1429、1430、1431、1432、1433、1434、1435、1436、1437、1438、1439、1440、1441、1442、1443、1444、1445、1446、1447、1448、1449、1450、1451、1452、1453、1454、1455、1456、1457、1458、1459、1460、1461、1462、1463、1464、1465、1466、1467、1468、1469、1470、1471、1472、1473、1474、1475、1476、1477、1478、1479、1480、1481、1482、1483、1484、1485、1486、1487、1488、1489、1490、1491、1492、1493、1494、1495、1496、1497、1498、1499、1500、1501、1502、1503、1504、1505、1506、1507、1508、1509、1510、1511、1512、1513、1514、1515、1516、1517、1518、1519、1520、1521、1522、1523、1524、1525、1526、1527、1528、1529、1530、1531、1532、1533、1534、1535、1536、1537、1538、1539、1540、1541、1542、1543、1544、1545、1546、1547、1548、1549、1550、1551、1552、1553、1554、1555、1556、1557、1558、1559、1560、1561、1562、1563、1564、1565、1566、1567、1568、1569、1570、1571、1572、1573、1574、1575、1576、1577、1578、1579、1580、1581、1582、1583、1584、1585、1586、1587、1588、1589、1590、1591、1592、1593、1594、1595、1596、1597、1598、1599、1600、1601、1602、1603、1604、1605、1606、1607、1608、1609、1610、1611、1612、
1613、1614、1615、1616、1617、1618、1619、1620、1621、1622、1623、1624、1625、1626、1627、1628、1629、1630、1631、1632、1633、1634、1635、1636、1637、1638、1639、1640、1641、1642、1643、1644、1645、1646、1647、1648、1649、1650、1651、1652、1653、1654、1655、1656、1657、1658、1659、1660、1661、1662、1663、1664、1665、1666、1667、1668、1669、1670、1671、1672、1673、1674、1675、1676、1677、1678、1679、1680、1681、1682、1683、1684、1685、1686、1687、1688、1689、1690、1691、1692、1693、1694、1695、1696、1697、1698、1699、1700、1701、1702、1703、1704、1705、1706、1707、1708、1709、1710、1711、1712、1713、1714、1715、1716、1717、1718、1719、1720、1721、1722、1723、1724、1725、1726、1727、1728、1729、1730、1731、1732、1733、1734、1735、1736、1737、1738、1739、1740、1741、1742、1743、1744、1745、1746、1747、1748、1749、1750、1751、1752、1753、1754、1755、1756、1757、1758、1759、1760、1761、1762、1763、1764、1765、1766、1767、1768、1769、1770、1771、1772、1773、1774、1775、1776、1777、1778、1779、1780、1781、1782、1783、1784、1785、1786、1787、1788、1789、1790、1791、1792、1793、1794、1795、1796、1797、1798、1799、1800、1801、1802、1803、1804、1805、1806、1807、1808、1809、1810、1811、1812、1813、1814、1815、1816、1817、1818、1819、1820、1821、1822、1823、1824、1825、1826、1827、1828、1829、1830、1831、1832、1833、1834、1835、1836、1837、1838、1839、1840、1841、1842、1843、1844、1845、1846、1847、1848、1849、1850、1851、1852、1853、1854、1855、1856、1857、1858、1859、1860、1861、1862、1863、1864、1865、1866、1867、1868、1869、1870、1871、1872、1873、1874、1875、1876、1877、1878、1879、1880、1881、1882、1883、1884、1885、1886、1887、1888、1889、1890、1891、1892、1893、1894、1895、1896、1897、1898、1899、1900、1901、1902、1903、1904、1905、1906、1907、1908、1909、1910、1911、1912、1913、1914、1915、1916、1917、1918、1919、1920、1921、1922、1923、1924、1925、1926、1927、1928、1929、1930、1931、1932、1933、1934、1935、1936、1937、1938、1939、1940、1941、1942、1943、1944、1945、1946、1947、1948、1949、1950、1951、1952、1953、1954、1955、1956、1957、1958、1959、1960、1961、1962、1963、1964、1965、1966、1967、1968、1969、1970、1971、1972、1973、1974、1975、1976、1977、1978、1979、1980、1981、1982、1983、1984、1985、1986、1987、1988、1989、1990、1991、1992、1993、1994、1995、1996、1997、1998、1999、2000、2001、2002、2003、2004、2005、2006、2007、2008、2009、2010、2011、2012、2013、2014、2015、2016、2017、2018、2019、2020、2021、2022、2023、2024、2025、2026、2027、2028、2029、2030、2031、2032、2033、2034、2035、2036、2037、2038、2039、2040、2041、2042、2043、2044、2045、2046、2047、2048、2049、2050、2051、2052、2053、2054、2055、2056、2057、2058、2059、2060、2061、2062、2063、2064、2065、2066、2067、2068、2069、2070、2071、2072、2073、2074、2075、2076、2077、2078、2079、2080、2081、2082、2083、2084、2085、2086、2087、2088、2089、2090、2091、2092、2093、2094、2095、2096、2097、2098、2099、2100、2101、2102、2103、2104、2105、2106、2107、2108、2109、2110、2111、2112、2113、2114、2115、2116、2117、2118、2119、2120、2121、2122、2123、2124、2125、2126、2127、2128、2129、2130、2131、2132、2133、2134、2135、2136、2137、2138、2139、2140、2141、2142、2143、2144、2145、2146、2147、2148、2149、2150、2151、2152、2153、2154、2155、2156、2157、2158、2159、2160、2161、2162、2163、2164、2165、2166、2167、2168、2169、2170、2171、2172、2173、2174、2175、2176、2177、2178、2179、2180、2181、2182、2183、2184、2185、2186、2187、2188、2189、2190、2191、2192、2193、2194、2195、2196、2197、
2198、2199、2200、2201、2202、2203、2204、2205、2206、2207、2208、2209、2210、2211、2212、2213、2214、2215、2216、2217、2218、2219、2220、2221、2222、2223、2224、2225、2226、2227、2228、2229、2230、2231、2232、2233、2234、2235、2236、2237、2238、2239、2240、2241、2242、2243、2244、2245、2246、2247、2248、2249、2250、2251、2252、2253、2254、2255、2256、2257、2258、2259、2260、2261、2262、2263、2264、2265、2266、2267、2268、2269、2270、2271、2272、2273、2274、2275、2276、2277、2278、2279、2280、2281、2282、2283、2284、2285、2286、2287、2288、2289、2290、2291、2292、2293、2294、2295、2296、2297、2298、2299、2300、2301、2302、2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2310、2311、2312、2313、2314、2315、2316、2317、2318、2319、2320、2321、2322、2323、2324、2325、2326、2327、2328、2329、2330、2331、2332、2333、2334、2335、2336、2337、2338、2339、2340、2341、2342、2343、2344、2345、2346、2347、2348、2349、2350、2351、2352、2353、2354、2355、2356、2357、2358、2359、2360、2361、2362、2363、2364、2365、2366、2367、2368、2369、2370、2371、2372、2373、2374、2375、2376、2377、2378、2379、2380、2381、2382、2383、2384、2385、2386、2387、2388、2389、2390、2391、2392、2393、2394、2395、2396、2397、2398、2399、2400、2401、2402、2403、2404、2405、2406、2407、2408、2409、2410、2411、2412、2413、2414、2415、2416、2417、2418、2419、2420、2421、2422、2423、2424、2425、2426、2427、2428、2429、2430、2431、2432、2433、2434、2435、2436、2437、2438、2439、2440、2441、2442、2443、2444、2445、2446、2447、2448、2449、2450、2451、2452、2453、2454、2455、2456、2457、2458、2459、2460、2461、2462、2463、2464、2465、2466、2467、2468、2469、2470、2471、2472、2473、2474、2475、2476、2477、2478、2479、2480、2481、2482、2483、2484、2485、2486、2487、2488、2489、2490、2491、2492、2493、2494、2495、2496、2497、2498、2499、2500、2501、2502、2503、2504、2505、2506、2507、2508、2509、2510、2511、2512、2513、2514、2515、2516、2517、2518、2519、2520、2521、2522、2523、2524、2525、2526、2527、2528、2529、2530、2531、2532、2533、2534、2535、2536、2537、2538、2539、2540、2541、2542、2543、2544、2545、2546、2547、2548、2549、2550、2551、2552、2553、2554、2555、2556、2557、2558、2559、2560、2561、2562、2563、2564、2565、2566、2567、2568、2569、2570、2571、2572、2573、2574、2575、2576、2577、2578、2579、2580、2581、2582、2583、2584、2585、2586、2587、2588、2589、2590、2591、2592、2593、2594、2595、2596、2597、2598、2599、2600、2601、2602、2603、2604、2605、2606、2607、2608、2609、2610、2611、2612、2613、2614、2615、2616、2617、2618、2619、2620、2621、2622、2623、2624、2625、2626、2627、2628、2629、2630、2631、2632、2633、2634、2635、2636、2637、2638、2639、2640、2641、2642、2643、2644、2645、2646、2647、2648、2649、2650、2651、2652、2653、2654、2655、2656、2657、2658、2659、2660、2661、2662、2663、2664、2665、2666、2667、2668、2669、2670、2671、2672、2673、2674、2675、2676、2677、2678、2679、2680、2681、2682、2683、2684、2685、2686、2687、2688、2689、2690、2691、2692、2693、2694、2695、2696、2697、2698、2699、2700、2701、2702、2703、2704、2705、2706、2707、2708、2709、2710、2711、2712、2713、2714、2715、2716、2717、2718、2719、2720、2721、2722、2723、2724、2725、2726、2727、2728、2729、2730、2731、2732、2733、2734、2735、2736、2737、2738、2739、2740、2741、2742、2743、2744、2745、2746、2747、2748、2749、2750、2751、2752、2753、2754、2755、2756、2757、2758、2759、2760、2761、2762、2763、2764、2765、2766、2767、2768、2769、2770、2771、2772、2773、2774、2775、2776、2777、2778、2779、2780、2781、2782、
2783、2784、2785、2786、2787、2788、2789、2790、2791、2792、2793、2794、2795、2796、2797、2798、2799、2800、2801、2802、2803、2804、2805、2806、2807、2808、2809、2810、2811、2812、2813、2814、2815、2816、2817、2818、2819、2820、2821、2822、2823、2824、2825、2826、2827、2828、2829、2830、2831、2832、2833、2834、2835、2836、2837、2838、2839、2840、2841、2842、2843、2844、2845、2846、2847、2848、2849、2850、2851、2852、2853、2854、2855、2856、2857、2858、2859、2860、2861、2862、2863、2864、2865、2866、2867、2868、2869、2870、2871、2872、2873、2874、2875、2876、2877、2878、2879、2880、2881、2882、2883、2884、2885、2886、2887、2888、2889、2890、2891、2892、2893、2894、2895、2896、2897、2898、2899、2900、2901、2902、2903、2904、2905、2906、2907、2908、2909、2910、2911、2912、2913、2914、2915、2916、2917、2918、2919、2920、2921、2922、2923、2924、2925、2926、2927、2928、2929、2930、2931、2932、2933、2934、2935、2936、2937、2938、2939、2940、2941、2942、2943、2944、2945、2946、2947、2948、2949、2950、2951、2952、2953、2954、2955、2956、2957、2958、2959、2960、2961、2962、2963、2964、2965、2966、2967、2968、2969、2970、2971、2972、2973、2974、2975、2976、2977、2978、2979、2980、2981、2982、2983、2984、2985、2986、2987、2988、2989、2990、2991、2992、2993、2994、2995、2996、2997、2998、2999、3000、3001、3002、3003、3004、3005、3006、3007、3008、3009、3010、3011、3012、3013、3014、3015、3016、3017、3018、3019、3020、3021、3022、3023、3024、3025、3026、3027、3028、3029、3030、3031、3032、3033、3034、3035、3036、3037、3038、3039、3040、3041、3042、3043、3044、3045、3046、3047、3048、3049、3050、3051、3052、3053、3054、3055、3056、3057、3058、3059、3060、3061、3062、3063、3064、3065、3066、3067、3068、3069、3070、3071、3072、3073、3074、3075、3076、3077、3078、3079、3080、3081、3082、3083、3084、3085、3086、3087、3088、3089、3090、3091、3092、3093、3094、3095、3096、3097、3098、3099、3100、3101、3102、3103、3104、3105、3106、3107、3108、3109、3110、3111、3112、3113、3114、3115、3116、3117、3118、3119、3120、3121、3122、3123、3124、3125、3126、3127、3128、3129、3130、3131、3132、3133、3134、3135、3136、3137、3138、3139、3140、3141、3142、3143、3144、3145、3146、3147、3148、3149、3150、3151、3152、3153、3154、3155、3156、3157、3158、3159、3160、3161、3162、3163、3164、3165、3166、3167、3168、3169、3170、3171、3172、3173、3174、3175、3176、3177、3178、3179、3180、3181、3182、3183、3184、3185、3186、3187、3188、3189、3190、3191、3192、3193、3194、3195、3196、3197、3198、3199、3200、3201、3202、3203、3204、3205、3206、3207、3208、3209、3210、3211、3212、3213、3214、3215、3216、3217、3218、3219、3220、3221、3222、3223、3224、3225、3226、3227、3228、3229、3230、3231、3232、3233、3234、3235、3236、3237、3238、3239、3240、3241、3242、3243、3244、3245、3246、3247、3248、3249和3250个核苷酸。病毒基因组的任何填充区的长度可为50
‑
100、100
‑
150、150
‑
200、200
‑
250、250
‑
300、300
‑
350、350
‑
400、400
‑
450、450
‑
500、500
‑
550、550
‑
600、600
‑
650、650
‑
700、700
‑
750、750
‑
800、800
‑
850、850
‑
900、900
‑
950、950
‑
1000、1000
‑
1050、1050
‑
1100、1100
‑
1150、1150
‑
1200、1200
‑
1250、1250
‑
1300、1300
‑
1350、1350
‑
1400、1400
‑
1450、1450
‑
1500、1500
‑
1550、1550
‑
1600、1600
‑
1650、1650
‑
1700、1700
‑
1750、1750
‑
1800、1800
‑
1850、1850
‑
1900、1900
‑
1950、1950
‑
2000、2000
‑
2050、2050
‑
2100、2100
‑
2150、2150
‑
2200、2200
‑
2250、2250
‑
2300、2300
‑
2350、2350
‑
2400、2400
‑
2450、2450
‑
2500、2500
‑
2550、2550
‑
2600、2600
‑
2650、2650
‑
2700、2700
‑
2750、2750
‑
2800、2800
‑
2850、2850
‑
2900、2900
‑
2950、2950
‑
3000、3000
‑
3050、3050
‑
3100、3100
‑
3150、3150
‑
3200和3200
‑
3250个核苷酸。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约55个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约56个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约97个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约103个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约105个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约357个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约363个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约712个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约714个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约1203个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约1209个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约1512个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约1519个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约2395个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约2403个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约2405个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约3013个核苷酸的填充区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约3021个核苷酸的填充区。
120.在某些实施方案中,填充区的长度为714个核苷酸。
121.多克隆位点(mcs)区
122.在某些实施方案中,本公开的aav颗粒包含具有至少一个多克隆位点(mcs)区的病毒基因组。mcs区的长度可独立地为例如但不限于:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149和150个核苷酸。病毒基因组的mcs区的长度可为2
‑
10、5
‑
10、5
‑
15、10
‑
20、10
‑
30、10
‑
40、15
‑
20、15
‑
25、20
‑
30、20
‑
40、20
‑
50、25
‑
30、25
‑
35、30
‑
40、30
‑
50、30
‑
60、35
‑
40、35
‑
45、40
‑
50、40
‑
60、40
‑
70、45
‑
50、45
‑
55、50
‑
60、50
‑
70、50
‑
80、55
‑
60、55
‑
65、60
‑
70、60
‑
80、60
‑
90、65
‑
70、65
‑
75、70
‑
80、70
‑
90、70
‑
100、75
‑
80、75
‑
85、80
‑
90、80
‑
100、80
‑
110、85
‑
90、85
‑
95、90
‑
100、90
‑
110、90
‑
120、95
‑
100、95
‑
105、100
‑
110、100
‑
120、100
‑
130、105
‑
110、105
‑
115、110
‑
120、110
‑
130、110
‑
140、115
‑
120、115
‑
125、120
‑
130、120
‑
140、120
‑
150、125
‑
130、125
‑
135、130
‑
140、130
‑
150、135
‑
140、135
‑
145、140
‑
150和145
‑
150个核苷酸。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约5个核苷酸的mcs区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约10个核苷酸的mcs区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约14个核苷酸的mcs区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约18个核苷酸的mcs区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约73个核苷酸的mcs区。作为一个非限制性实例,病毒基因组包含长度为约121个核苷酸的mcs区。
123.在某些实施方案中,mcs区的长度为5个核苷酸。
124.在某些实施方案中,mcs区的长度为10个核苷酸。
125.基因组大小
126.在某些实施方案中,包含本文所述的有效负载的aav颗粒可为单链或双链载体基因组。载体基因组的大小可为小、中等、大或最大大小。另外,载体基因组可包含启动子和polya尾。
127.在某些实施方案中,包含本文所述的有效负载的载体基因组可为小单链载体基因组。小单链载体基因组的大小可为2.1至3.5kb,例如大小为约2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4和3.5kb。作为一个非限制性实例,小单链载体基因组的大小可为3.2kb。作为另一个非限制性实例,小单链载体基因组的大小可为2.2kb。另外,载体基因组可包含启动子和polya尾。
128.在某些实施方案中,包含本文所述的有效负载的载体基因组可为小双链载体基因组。小双链载体基因组的大小可为1.3至1.7kb,例如大小约1.3、1.4、1.5、1.6和1.7kb。作为一个非限制性实例,小双链载体基因组的大小可为1.6kb。另外,载体基因组可包含启动子和polya尾。
129.在某些实施方案中,包含本文所述的有效负载的载体基因组(例如多核苷酸、sirna或dsrna)可为中等单链载体基因组。中等单链载体基因组的大小可为3.6至4.3kb,例如大小为约3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2和4.3kb。作为一个非限制性实例,中等单链载体基因组的大小可为4.0kb。另外,载体基因组可包含启动子和polya尾。
130.在某些实施方案中,包含本文所述的有效负载的载体基因组可为中等双链载体基因组。中等双链病毒基因组的大小可为1.8至2.1kb,例如大小约1.8、1.9、2.0和2.1kb。作为一个非限制性实例,中等双链载体基因组的大小可为2.0kb。另外,载体基因组可包含启动子和polya尾。
131.在某些实施方案中,包含本文所述的有效负载的载体基因组可为大单链载体基因组。大单链载体基因组的大小可为4.4至6.0kb,例如大小为约4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9和6.0kb。作为一个非限制性实例,大单链载体基因组的大小可为4.7kb。作为另一个非限制性实例,大单链载体基因组的大小可为4.8kb。作为又一个非限制性实例,大单链病毒基因组的大小可为6.0kb。另外,载体基因组可包含启动子和polya尾。
132.在某些实施方案中,包含本文所述的有效负载的载体基因组可为大双链载体基因组。大双链载体基因组的大小可为2.2至3.0kb,例如大小为约2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0kb。作为一个非限制性实例,大双链载体基因组的大小可为2.4kb。另外,载体基因组可包含启动子和polya尾。
133.aav血清型
134.本公开的aav颗粒可包含或来源于任何天然或重组aav血清型。根据本公开,aav颗粒可利用或基于血清型或包含肽,所述血清型或肽选自以下中的任一者:voy101、voy201、aav9、aav9k449r、aavphp.b(php.b)、aavphp.a(php.a)、aavg2b
‑
26、aavg2b
‑
13、aavth1.1
‑
32、aavth1.1
‑
35、aavphp.b2(php.b2)、aavphp.b3(php.b3)、aavphp.n/php.b
‑
dgt、aavphp.b
‑
est、aavphp.b
‑
ggt、aavphp.b
‑
atp、aavphp.b
‑
att
‑
t、aavphp.b
‑
dgt
‑
t、aavphp.b
‑
ggt
‑
t、aavphp.b
‑
sgs、aavphp.b
‑
aqp、aavphp.b
‑
qqp、aavphp.b
‑
snp(3)、
aavphp.b
‑
snp、aavphp.b
‑
qgt、aavphp.b
‑
nqt、aavphp.b
‑
egs、aavphp.b
‑
sgn、aavphp.b
‑
egt、aavphp.b
‑
dst、aavphp.b
‑
dst、aavphp.b
‑
stp、aavphp.b
‑
pqp、aavphp.b
‑
sqp、aavphp.b
‑
qlp、aavphp.b
‑
tmp、aavphp.b
‑
ttp、aavphp.s/g2a12、aavg2a15/g2a3(g2a3)、aavg2b4(g2b4)、aavg2b5(g2b5)、php.s、aav1、aav2、aav2g9、aav3、aav3a、aav3b、aav3
‑
3、aav4、aav4
‑
4、aav5、aav6、aav6.1、aav6.2、aav6.1.2、aav7、aav7.2、aav8、aav9、aav9.11、aav9.13、aav9.16、aav9.24、aav9.45、aav9.47、aav9.61、aav9.68、aav9.84、aav9.9、aav10、aav11、aav12、aav16.3、aav24.1、aav27.3、aav42.12、aav42
‑
1b、aav42
‑
2、aav42
‑
3a、aav42
‑
3b、aav42
‑
4、aav42
‑
5a、aav42
‑
5b、aav42
‑
6b、aav42
‑
8、aav42
‑
10、aav42
‑
11、aav42
‑
12、aav42
‑
13、aav42
‑
15、aav42
‑
aa、aav43
‑
1、aav43
‑
12、aav43
‑
20、aav43
‑
21、aav43
‑
23、aav43
‑
25、aav43
‑
5、aav44.1、aav44.2、aav44.5、aav223.1、aav223.2、aav223.4、aav223.5、aav223.6、aav223.7、aav1
‑
7/rh.48、aav1
‑
8/rh.49、aav2
‑
15/rh.62、aav2
‑
3/rh.61、aav2
‑
4/rh.50、aav2
‑
5/rh.51、aav3.1/hu.6、aav3.1/hu.9、aav3
‑
9/rh.52、aav3
‑
11/rh.53、aav4
‑
8/r11.64、aav4
‑
9/rh.54、aav4
‑
19/rh.55、aav5
‑
3/rh.57、aav5
‑
22/rh.58、aav7.3/hu.7、aav16.8/hu.10、aav16.12/hu.11、aav29.3/bb.1、aav29.5/bb.2、aav106.1/hu.37、aav114.3/hu.40、aav127.2/hu.41、aav127.5/hu.42、aav128.3/hu.44、aav130.4/hu.48、aav145.1/hu.53、aav145.5/hu.54、aav145.6/hu.55、aav161.10/hu.60、aav161.6/hu.61、aav33.12/hu.17、aav33.4/hu.15、aav33.8/hu.16、aav52/hu.19、aav52.1/hu.20、aav58.2/hu.25、aava3.3、aava3.4、aava3.5、aava3.7、aavc1、aavc2、aavc5、aav
‑
dj、aav
‑
dj8、aavf3、aavf5、aavh2、aavrh.72、aavhu.8、aavrh.68、aavrh.70、aavpi.1、aavpi.3、aavpi.2、aavrh.60、aavrh.44、aavrh.65、aavrh.55、aavrh.47、aavrh.69、aavrh.45、aavrh.59、aavhu.12、aavh6、aavlk03、aavh
‑
1/hu.1、aavh
‑
5/hu.3、aavlg
‑
10/rh.40、aavlg
‑
4/rh.38、aavlg
‑
9/hu.39、aavn721
‑
8/rh.43、aavch.5、aavch.5r1、aavcy.2、aavcy.3、aavcy.4、aavcy.5、aavcy.5r1、aavcy.5r2、aavcy.5r3、aavcy.5r4、aavcy.6、aavhu.1、aavhu.2、aavhu.3、aavhu.4、aavhu.5、aavhu.6、aavhu.7、aavhu.9、aavhu.10、aavhu.11、aavhu.13、aavhu.15、aavhu.16、aavhu.17、aavhu.18、aavhu.20、aavhu.21、aavhu.22、aavhu.23.2、aavhu.24、aavhu.25、aavhu.27、aavhu.28、aavhu.29、aavhu.29r、aavhu.31、aavhu.32、aavhu.34、aavhu.35、aavhu.37、aavhu.39、aavhu.40、aavhu.41、aavhu.42、aavhu.43、aavhu.44、aavhu.44r1、aavhu.44r2、aavhu.44r3、aavhu.45、aavhu.46、aavhu.47、aavhu.48、aavhu.48r1、aavhu.48r2、aavhu.48r3、aavhu.49、aavhu.51、aavhu.52、aavhu.54、aavhu.55、aavhu.56、aavhu.57、aavhu.58、aavhu.60、aavhu.61、aavhu.63、aavhu.64、aavhu.66、aavhu.67、aavhu.14/9、aavhu.t19、aavrh.2、aavrh.2r、aavrh.8、aavrh.8r、aavrh.10、aavrh.12、aavrh.13、aavrh.13r、aavrh.14、aavrh.17、aavrh.18、aavrh.19、aavrh.20、aavrh.21、aavrh.22、aavrh.23、aavrh.24、aavrh.25、aavrh.31、aavrh.32、aavrh.33、aavrh.34、aavrh.35、aavrh.36、aavrh.37、aavrh.37r2、aavrh.38、aavrh.39、aavrh.40、aavrh.46、aavrh.48、aavrh.48.1、aavrh.48.1.2、aavrh.48.2、aavrh.49、aavrh.51、aavrh.52、aavrh.53、aavrh.54、aavrh.56、aavrh.57、aavrh.58、aavrh.61、aavrh.64、aavrh.64r1、aavrh.64r2、aavrh.67、aavrh.73、aavrh.74、aavrh8r、aavrh8r a586r突变体、aavrh8r r533a突变体、aaav、baav、山羊aav、牛aav、aavhe1.1、aavher1.5、aavher1.14、aavher1.8、aavher1.16、aavher1.18、aavher1.35、aavher1.7、
aavher1.36、aavher2.29、aavher2.4、aavher2.16、aavher2.30、aavher2.31、aavher2.36、aavher1.23、aavher3.1、aav2.5t、aav
‑
paec、aav
‑
lk01、aav
‑
lk02、aav
‑
lk03、aav
‑
lk04、aav
‑
lk05、aav
‑
lk06、aav
‑
lk07、aav
‑
lk08、aav
‑
lk09、aav
‑
lk10、aav
‑
lk11、aav
‑
lk12、aav
‑
lk13、aav
‑
lk14、aav
‑
lk15、aav
‑
lk16、aav
‑
lk17、aav
‑
lk18、aav
‑
lk19、aav
‑
paec2、aav
‑
paec4、aav
‑
paec6、aav
‑
paec7、aav
‑
paec8、aav
‑
paec11、aav
‑
paec12、aav
‑2‑
pre
‑
mirna
‑
101、aav
‑
8h、aav
‑
8b、aav
‑
h、aav
‑
b、aav sm 10
‑
2、aav改组100
‑
1、aav改组100
‑
3、aav改组100
‑
7、aav改组10
‑
2、aav改组10
‑
6、aav改组10
‑
8、aav改组100
‑
2、aav sm 10
‑
1、aav sm 10
‑
8、aav sm 100
‑
3、aav sm 100
‑
10、bnp61 aav、bnp62 aav、bnp63 aav、aavrh.50、aavrh.43、aavrh.62、aavrh.48、aavhu.19、aavhu.11、aavhu.53、aav4
‑
8/rh.64、aavlg
‑
9/hu.39、aav54.5/hu.23、aav54.2/hu.22、aav54.7/hu.24、aav54.1/hu.21、aav54.4r/hu.27、aav46.2/hu.28、aav46.6/hu.29、aav128.1/hu.43、真型aav(ttaav)、upenn aav 10、日本aav 10血清型、aav cbr
‑
7.1、aav cbr
‑
7.10、aav cbr
‑
7.2、aav cbr
‑
7.3、aav cbr
‑
7.4、aav cbr
‑
7.5、aav cbr
‑
7.7、aav cbr
‑
7.8、aav cbr
‑
b7.3、aav cbr
‑
b7.4、aav cbr
‑
e1、aav cbr
‑
e2、aav cbr
‑
e3、aav cbr
‑
e4、aav cbr
‑
e5、aav cbr
‑
e5、aav cbr
‑
e6、aav cbr
‑
e7、aav cbr
‑
e8、aav cht
‑
1、aav cht
‑
2、aav cht
‑
3、aav cht
‑
6.1、aav cht
‑
6.10、aav cht
‑
6.5、aav cht
‑
6.6、aav cht
‑
6.7、aav cht
‑
6.8、aav cht
‑
p1、aav cht
‑
p2、aav cht
‑
p5、aav cht
‑
p6、aavcht
‑
p8、aav cht
‑
p9、aav ckd
‑
1、aav ckd
‑
10、aav ckd
‑
2、aav ckd
‑
3、aav ckd
‑
4、aav ckd
‑
6、aav ckd
‑
7、aav ckd
‑
8、aav ckd
‑
b1、aav ckd
‑
b2、aav ckd
‑
b3、aav ckd
‑
b4、aav ckd
‑
b5、aav ckd
‑
b6、aav ckd
‑
b7、aav ckd
‑
b8、aav ckd
‑
h1、aav ckd
‑
h2、aav ckd
‑
h3、aav ckd
‑
h4、aav ckd
‑
h5、aav ckd
‑
h6、aav ckd
‑
n3、aav ckd
‑
n4、aav ckd
‑
n9、aav clg
‑
f1、aav clg
‑
f2、aav clg
‑
f3、aav clg
‑
f4、aav clg
‑
f5、aav clg
‑
f6、aav clg
‑
f7、aav clg
‑
f8、aav clv
‑
1、aav clv1
‑
1、aav clv1
‑
10、aav clv1
‑
2、aav clv
‑
12、aav clv1
‑
3、aav clv
‑
13、aav clv1
‑
4、aav clv1
‑
7、aav clv1
‑
8、aav clv1
‑
9、aav clv
‑
2、aav clv
‑
3、aav clv
‑
4、aav clv
‑
6、aav clv
‑
8、aav clv
‑
d1、aav clv
‑
d2、aav clv
‑
d3、aav clv
‑
d4、aav clv
‑
d5、aav clv
‑
d6、aav clv
‑
d7、aav clv
‑
d8、aav clv
‑
e1、aav clv
‑
k1、aav clv
‑
k3、aav clv
‑
k6、aav clv
‑
l4、aav clv
‑
l5、aav clv
‑
l6、aav clv
‑
m1、aav clv
‑
m11、aav clv
‑
m2、aav clv
‑
m5、aav clv
‑
m6、aav clv
‑
m7、aav clv
‑
m8、aav clv
‑
m9、aav clv
‑
r1、aav clv
‑
r2、aav clv
‑
r3、aav clv
‑
r4、aav clv
‑
r5、aav clv
‑
r6、aav clv
‑
r7、aav clv
‑
r8、aav clv
‑
r9、aav csp
‑
1、aav csp
‑
10、aav csp
‑
11、aav csp
‑
2、aav csp
‑
3、aav csp
‑
4、aav csp
‑
6、aav csp
‑
7、aav csp
‑
8、aav csp
‑
8.10、aav csp
‑
8.2、aav csp
‑
8.4、aav csp
‑
8.5、aav csp
‑
8.6、aav csp
‑
8.7、aav csp
‑
8.8、aav csp
‑
8.9、aav csp
‑
9、aav.hu.48r3、aav.vr
‑
355、aav3b、aav4、aav5、aavf1/hsc1、aavf11/hsc11、aavf12/hsc12、aavf13/hsc13、aavf14/hsc14、aavf15/hsc15、aavf16/hsc16、aavf17/hsc17、aavf2/hsc2、aavf3/hsc3、aavf4/hsc4、aavf5/hsc5、aavf6/hsc6、aavf7/hsc7、aavf8/hsc8和/或aavf9/hsc9,和其变体或杂合体/嵌合体/组合。
135.在某些实施方案中,用于本文所公开的组合物的aav血清型可为或包含如美国专利申请公开第us20030138772号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav1(us20030138772的seq id no:6和64)、aav2(us20030138772的seq id no:7和70)、aav3(us20030138772的seq id no:8和71)、aav4(us20030138772的seq id no:63)、aav5(us20030138772的seq id no:114)、aav6
(us20030138772的seq id no:65)、aav7(us20030138772的seq id no:1
‑
3)、aav8(us20030138772的seq id no:4和95)、aav9(us20030138772的seq id no:5和100)、aav10(us20030138772的seq id no:117)、aav11(us20030138772的seq id no:118)、aav12(us20030138772的seq id no:119)、aavrh10(us20030138772的seq id no:81的氨基酸1至738)、aav16.3(us20030138772 seq id no:10)、aav29.3/bb.1(us20030138772seq id no:11)、aav29.4(us20030138772 seq id no:12)、aav29.5/bb.2(us20030138772 seq id no:13)、aav1.3(us20030138772 seq id no:14)、aav13.3(us20030138772 seq id no:15)、aav24.1(us20030138772 seq id no:16)、aav27.3(us20030138772 seq id no:17)、aav7.2(us20030138772 seq id no:18)、aavc1(us20030138772 seq id no:19)、aavc3(us20030138772 seq id no:20)、aavc5(us20030138772 seq id no:21)、aavf1(us20030138772 seq id no:22)、aavf3(us20030138772 seq id no:23)、aavf5(us20030138772 seq id no:24)、aavh6(us20030138772 seq id no:25)、aavh2(us20030138772 seq id no:26)、aav42
‑
8(us20030138772 seq id no:27)、aav42
‑
15(us20030138772 seq id no:28)、aav42
‑
5b(us20030138772 seq id no:29)、aav42
‑
1b(us20030138772 seq id no:30)、aav42
‑
13(us20030138772 seq id no:31)、aav42
‑
3a(us20030138772 seq id no:32)、aav42
‑
4(us20030138772 seq id no:33)、aav42
‑
5a(us20030138772 seq id no:34)、aav42
‑
10(us20030138772 seq id no:35)、aav42
‑
3b(us20030138772 seq id no:36)、aav42
‑
11(us20030138772 seq id no:37)、aav42
‑
6b(us20030138772 seq id no:38)、aav43
‑
1(us20030138772 seq id no:39)、aav43
‑
5(us20030138772 seq id no:40)、aav43
‑
12(us20030138772 seq id no:41)、aav43
‑
20(us20030138772 seq id no:42)、aav43
‑
21(us20030138772 seq id no:43)、aav43
‑
23(us20030138772 seq id no:44)、aav43
‑
25(us20030138772 seq id no:45)、aav44.1(us20030138772 seq id no:46)、aav44.5(us20030138772 seq id no:47)、aav223.1(us20030138772 seq id no:48)、aav223.2(us20030138772 seq id no:49)、aav223.4(us20030138772 seq id no:50)、aav223.5(us20030138772 seq id no:51)、aav223.6(us20030138772 seq id no:52)、aav223.7(us20030138772 seq id no:53)、aava3.4(us20030138772 seq id no:54)、aava3.5(us20030138772 seq id no:55)、aava3.7(us20030138772 seq id no:56)、aava3.3(us20030138772 seq id no:57)、aav42.12(us20030138772 seq id no:58)、aav44.2(us20030138772 seq id no:59)、aav42
‑
2(us20030138772 seq id no:9)或其变体或杂合体/嵌合体/组合。
136.在某些实施方案中,aav血清型可为或包含如美国专利申请公开第us20150159173号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav2(us20150159173的seq id no:7和23)、rh20(us20150159173的seq id no:1)、rh32/33(us20150159173的seq id no:2)、rh39(us20150159173的seq id no:3、20和36)、rh46(us20150159173的seq id no:4和22)、rh73(us20150159173的seq id no:5)、rh74(us20150159173的seq id no:6)、aav6.1(us20150159173的seq id no:29)、rh.8(us20150159173的seq id no:41)、rh.48.1(us20150159173的seq id no:44)、hu.44(us20150159173的seq id no:45)、hu.29(us20150159173的seq id no:42)、hu.48(us20150159173的seq id no:38)、rh54(us20150159173的seq id no:49)、aav2
(us20150159173的seq id no:7)、cy.5(us20150159173的seq id no:8和24)、rh.10(us20150159173的seq id no:9和25)、rh.13(us20150159173的seq id no:10和26)、aav1(us20150159173的seq id no:11和27)、aav3(us20150159173的seq id no:12和28)、aav6(us20150159173的seq id no:13和29)、aav7(us20150159173的seq id no:14和30)、aav8(us20150159173的seq id no:15和31)、hu.13(us20150159173的seq id no:16和32)、hu.26(us20150159173的seq id no:17和33)、hu.37(us20150159173的seq id no:18和34)、hu.53(us20150159173的seq id no:19和35)、rh.43(us20150159173的seq id no:21和37)、rh2(us20150159173的seq id no:39)、rh.37(us20150159173的seq id no:40)、rh.64(us20150159173的seq id no:43)、rh.48(us20150159173的seq id no:44)、ch.5(us20150159173的seq id no 46)、rh.67(us20150159173的seq id no:47)、rh.58(us20150159173的seq id no:48)或其变体,其包括但不限于cy5r1、cy5r2、cy5r3、cy5r4、rh.13r、rh.37r2、rh.2r、rh.8r、rh.48.1、rh.48.2、rh.48.1.2、hu.44r1、hu.44r2、hu.44r3、hu.29r、ch.5r1、rh64r1、rh64r2、aav6.2、aav6.1、aav6.12、hu.48r1、hu.48r2或hu.48r3或其变体或杂合体/嵌合体/组合。
137.在某些实施方案中,aav血清型可为或包含如美国专利第us 7198951号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav9(us 7198951的seq id no:1
‑
3)、aav2(us 7198951的seq id no:4)、aav1(us 7198951的seq id no:5)、aav3(us 7198951的seq id no:6)或aav8(us7198951的seq id no:7)或其变体或杂合体/嵌合体或组合。
138.在某些实施方案中,aav血清型可为n pulicherla等人(molecular therapy 19(6):1070
‑
1078(2011)(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)所述的aav9序列,或者可为其变体,例如但不限于:aav9.9、aav9.11、aav9.13、aav9.16、aav9.24、aav9.45、aav9.47、aav9.61、aav9.68或aav9.84。
139.在某些实施方案中,aav血清型可为或包含如美国专利第us 6156303号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav3b(us 6156303的seq id no:1和10)、aav6(us 6156303的seq id no:2、7和11)、aav2(us 6156303的seq id no:3和8)、aav3a(us 6156303的seq id no:4和9)或其衍生物或变体或杂合体/嵌合体或组合。
140.在某些实施方案中,aav血清型可为或包含如美国专利申请公开第us20140359799号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav8(us20140359799的seq id no:1)、aavdj(us20140359799的seq id no:2和3)或其变体。
141.在某些实施方案中,血清型可为grimm等人(journal of virology 82(12):5887
‑
5911(2008),其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)所述的aavdj或其变体,例如aavdj8(或aav
‑
dj8)。aavdj8的氨基酸序列可包含两个或更多个有效突变以去除肝素结合域(hbd)。作为一个非限制性实例,美国专利第7,588,772号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中描述为seq id no:1的aav
‑
dj序列可包含两种突变:(1)r587q,其中氨基酸587处的精氨酸(r;arg)变为谷氨酰胺(q;gln),和(2)r590t,其中氨基酸590处的精氨酸(r;arg)变为苏氨酸(t;
thr)。作为另一个非限制性实例,美国专利第7,588,772号中所述的aav
‑
dj序列可包含三种突变:(1)k406r,其中氨基酸406处的赖氨酸(k;lys)变为精氨酸(r;arg);(2)r587q,其中氨基酸587处的精氨酸(r;arg)变为谷氨酰胺(q;gln);和(3)r590t,其中氨基酸590处的精氨酸(r;arg)变为苏氨酸(t;thr)。
142.在某些实施方案中,aav血清型可为或包含如国际公开第wo1998011244号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的aav4序列,例如但不限于:aav4(wo1998011244的seq id no:1
‑
20)。
143.在某些实施方案中,aav血清型可为或包含aav2序列中的突变以产生如国际公开第wo2014144229号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的aav2g9。
144.在某些实施方案中,aav血清型可为或包含如国际公开第wo2005033321号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav3
‑
3(wo2005033321的seq id no:217)、aav1(wo2005033321的seq id no:219和202)、aav106.1/hu.37(wo2005033321的seq id no:10)、aav114.3/hu.40(wo2005033321的seq id no:11)、aav127.2/hu.41(wo2005033321的seq id no:6和8)、aav128.3/hu.44(wo2005033321的seq id no:81)、aav130.4/hu.48(wo2005033321的seq id no:78)、aav145.1/hu.53(wo2005033321的seq id no:176和177)、aav145.6/hu.56(wo2005033321的seq id no:168和192)、aav16.12/hu.11(wo2005033321的seq id no:153和57)、aav16.8/hu.10(wo2005033321的seq id no:156和56)、aav161.10/hu.60(wo2005033321的seq id no:170)、aav161.6/hu.61(wo2005033321的seq id no:174)、aav1
‑
7/rh.48(wo2005033321的seq id no:32)、aav1
‑
8/rh.49(wo2005033321的seq id no:103和25)、aav2(wo2005033321的seq id no:211和221)、aav2
‑
15/rh.62(wo2005033321的seq id no:33和114)、aav2
‑
3/rh.61(wo2005033321的seq id no:21)、aav2
‑
4/rh.50(wo2005033321的seq id no:23和108)、aav2
‑
5/rh.51(wo2005033321的seq id no:104和22)、aav3.1/hu.6(wo2005033321的seq id no:5和84)、aav3.1/hu.9(wo2005033321的seq id no:155和58)、aav3
‑
11/rh.53(wo2005033321的seq id no:186和176)、aav3
‑
3(wo2005033321的seq id no:200)、aav33.12/hu.17(wo2005033321的seq id no:4)、aav33.4/hu.15(wo2005033321的seq id no:50)、aav33.8/hu.16(wo2005033321的seq id no:51)、aav3
‑
9/rh.52(wo2005033321的seq id no:96和18)、aav4
‑
19/rh.55(wo2005033321的seq id no:117)、aav4
‑
4(wo2005033321的seq id no:201和218)、aav4
‑
9/rh.54(wo2005033321的seq id no:116)、aav5(wo2005033321的seq id no:199和216)、aav52.1/hu.20(wo2005033321的seq id no:63)、aav52/hu.19(wo2005033321的seq id no:133)、aav5
‑
22/rh.58(wo2005033321的seq id no:27)、aav5
‑
3/rh.57(wo2005033321的seq id no:105)、aav5
‑
3/rh.57(wo2005033321的seq id no:26)、aav58.2/hu.25(wo2005033321的seq id no:49)、aav6(wo2005033321的seq id no:203和220)、aav7(wo2005033321的seq id no:222和213)、aav7.3/hu.7(wo2005033321的seq id no:55)、aav8(wo2005033321的seq id no:223和214)、aavh
‑
1/hu.1(wo2005033321的seq id no:46)、aavh
‑
5/hu.3(wo2005033321的seq id no:44)、aavhu.1(wo2005033321的seq id no:144)、aavhu.10(wo2005033321的seq id no:156)、aavhu.11(wo2005033321的seq id no:
153)、aavhu.12(wo2005033321 seq id no:59)、aavhu.13(wo2005033321的seq id no:129)、aavhu.14/aav9(wo2005033321的seq id no:123和3)、aavhu.15(wo2005033321的seq id no:147)、aavhu.16(wo2005033321的seq id no:148)、aavhu.17(wo2005033321的seq id no:83)、aavhu.18(wo2005033321的seq id no:149)、aavhu.19(wo2005033321的seq id no:133)、aavhu.2(wo2005033321的seq id no:143)、aavhu.20(wo2005033321的seq id no:134)、aavhu.21(wo2005033321的seq id no:135)、aavhu.22(wo2005033321的seq id no:138)、aavhu.23.2(wo2005033321的seq id no:137)、aavhu.24(wo2005033321的seq id no:136)、aavhu.25(wo2005033321的seq id no:146)、aavhu.27(wo2005033321的seq id no:140)、aavhu.29(wo2005033321的seq id no:132)、aavhu.3(wo2005033321的seq id no:145)、aavhu.31(wo2005033321的seq id no:121)、aavhu.32(wo2005033321的seq id no:122)、aavhu.34(wo2005033321的seq id no:125)、aavhu.35(wo2005033321的seq id no:164)、aavhu.37(wo2005033321的seq id no:88)、aavhu.39(wo2005033321的seq id no:102)、aavhu.4(wo2005033321的seq id no:141)、aavhu.40(wo2005033321的seq id no:87)、aavhu.41(wo2005033321的seq id no:91)、aavhu.42(wo2005033321的seq id no:85)、aavhu.43(wo2005033321的seq id no:160)、aavhu.44(wo2005033321的seq id no:144)、aavhu.45(wo2005033321的seq id no:127)、aavhu.46(wo2005033321的seq id no:159)、aavhu.47(wo2005033321的seq id no:128)、aavhu.48(wo2005033321的seq id no:157)、aavhu.49(wo2005033321的seq id no:189)、aavhu.51(wo2005033321的seq id no:190)、aavhu.52(wo2005033321的seq id no:191)、aavhu.53(wo2005033321的seq id no:186)、aavhu.54(wo2005033321的seq id no:188)、aavhu.55(wo2005033321的seq id no:187)、aavhu.56(wo2005033321的seq id no:192)、aavhu.57(wo2005033321的seq id no:193)、aavhu.58(wo2005033321的seq id no:194)、aavhu.6(wo2005033321的seq id no:84)、aavhu.60(wo2005033321的seq id no:184)、aavhu.61(wo2005033321的seq id no:185)、aavhu.63(wo2005033321的seq id no:195)、aavhu.64(wo2005033321的seq id no:196)、aavhu.66(wo2005033321的seq id no:197)、aavhu.67(wo2005033321的seq id no:198)、aavhu.7(wo2005033321的seq id no:150)、aavhu.8(wo2005033321 seq id no:12)、aavhu.9(wo2005033321的seq id no:155)、aavlg
‑
10/rh.40(wo2005033321的seq id no:14)、aavlg
‑
4/rh.38(wo2005033321的seq id no:86)、aavlg
‑
4/rh.38(wo2005033321的seq id no:7)、aavn721
‑
8/rh.43(wo2005033321的seq id no:163)、aavn721
‑
8/rh.43(wo2005033321的seq id no:43)、aavpi.1(wo2005033321 seq id no:28)、aavpi.2(wo2005033321 seq id no:30)、aavpi.3(wo2005033321 seq id no:29)、aavrh.38(wo2005033321的seq id no:86)、aavrh.40(wo2005033321的seq id no:92)、aavrh.43(wo2005033321的seq id no:163)、aavrh.44(wo2005033321 seq id no:34)、aavrh.45(wo2005033321 seq id no:41)、aavrh.47(wo2005033321 seq id no:38)、aavrh.48(wo2005033321的seq id no:115)、aavrh.49(wo2005033321的seq id no:103)、aavrh.50(wo2005033321的seq id no:108)、aavrh.51(wo2005033321的seq id no:104)、aavrh.52(wo2005033321的seq id no:96)、aavrh.53(wo2005033321的seq id no:97)、aavrh.55(wo2005033321 seq id no:37)、aavrh.56(wo2005033321的seq id no:152)、aavrh.57(wo2005033321的seq id no:105)、aavrh.58(wo2005033321的seq id no:106)、aavrh.59
(wo2005033321 seq id no:42)、aavrh.60(wo2005033321 seq id no:31)、aavrh.61(wo2005033321的seq id no:107)、aavrh.62(wo2005033321的seq id no:114)、aavrh.64(wo2005033321的seq id no:99)、aavrh.65(wo2005033321 seq id no:35)、aavrh.68(wo2005033321 seq id no:16)、aavrh.69(wo2005033321 seq id no:39)、aavrh.70(wo2005033321 seq id no:20)、aavrh.72(wo2005033321 seq id no:9)或其变体,其包括但不限于aavcy.2、aavcy.3、aavcy.4、aavcy.5、aavcy.6、aavrh.12、aavrh.17、aavrh.18、aavrh.19、aavrh.21、aavrh.22、aavrh.23、aavrh.24、aavrh.25、aavrh.25/42 15、aavrh.31、aavrh.32、aavrh.33、aavrh.34、aavrh.35、aavrh.36、aavrh.37或aavrh14(其关于aav衣壳的内容各自通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)。变体的非限制性实例包括wo2005033321的seq id no:13、15、17、19、24、36、40、45、47、48、51、52、53、54、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、79、80、82、89、90、93、94、95、98、100、101、109、110、111、112、113、118、119、120、124、126、131、139、142、151、154、158、161、162、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、202、204、205、206、207、208、209、210、211、212、215、219、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235或236(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)。
145.在某些实施方案中,aav血清型可为或包含如国际公开第wo2015168666号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aavrh8r(wo2015168666的seq id no:9)、aavrh8r a586r突变体(wo2015168666的seq id no:10)、aavrh8r r533a突变体(wo2015168666的seq id no:11)或其变体。
146.在某些实施方案中,aav血清型可为或包含如美国专利第us9233131号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aavhe1.1(us9233131的seq id no:44)、aavher1.5(us9233131的seq id no:45)、aavher1.14(us9233131的seq id no:46)、aavher1.8(us9233131的seq id no:47)、aavher1.16(us9233131的seq id no:48)、aavher1.18(us9233131的seq id no:49)、aavher1.35(us9233131的seq id no:50)、aavher1.7(us9233131的seq id no:51)、aavher1.36(us9233131的seq id no:52)、aavher2.29(us9233131的seq id no:53)、aavher2.4(us9233131的seq id no:54)、aavher2.16(us9233131的seq id no:55)、aavher2.30(us9233131的seq id no:56)、aavher2.31(us9233131的seq id no:58)、aavher2.36(us9233131的seq id no:57)、aavher1.23(us9233131的seq id no:53)、aavher3.1(us9233131的seq id no:59)、aav2.5t(us9233131的seq id no:42)或其变体。
147.在某些实施方案中,aav血清型可为或包含如美国专利申请公开第us20150376607号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav
‑
paec(us20150376607的seq id no:1)、aav
‑
lk01(us20150376607的seq id no:2)、aav
‑
lk02(us20150376607的seq id no:3)、aav
‑
lk03(us20150376607的seq id no:4)、aav
‑
lk04(us20150376607的seq id no:5)、aav
‑
lk05(us20150376607的seq id no:6)、aav
‑
lk06(us20150376607的seq id no:7)、aav
‑
lk07(us20150376607的seq id no:8)、aav
‑
lk08(us20150376607的seq id no:9)、aav
‑
lk09
(us20150376607的seq id no:10)、aav
‑
lk10(us20150376607的seq id no:11)、aav
‑
lk11(us20150376607的seq id no:12)、aav
‑
lk12(us20150376607的seq id no:13)、aav
‑
lk13(us20150376607的seq id no:14)、aav
‑
lk14(us20150376607的seq id no:15)、aav
‑
lk15(us20150376607的seq id no:16)、aav
‑
lk16(us20150376607的seq id no:17)、aav
‑
lk17(us20150376607的seq id no:18)、aav
‑
lk18(us20150376607的seq id no:19)、aav
‑
lk19(us20150376607的seq id no:20)、aav
‑
paec2(us20150376607的seq id no:21)、aav
‑
paec4(us20150376607的seq id no:22)、aav
‑
paec6(us20150376607的seq id no:23)、aav
‑
paec7(us20150376607的seq id no:24)、aav
‑
paec8(us20150376607的seq id no:25)、aav
‑
paec11(us20150376607的seq id no:26)、aav
‑
paec12(us20150376607的seq id no:27)或其变体。
148.在某些实施方案中,aav血清型可为或包含如美国专利第us9163261号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav
‑2‑
pre
‑
mirna
‑
101(seq id no:1us9163261)或其变体。
149.在某些实施方案中,aav血清型可为或具有如美国专利申请公开第us20150376240号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav
‑
8h(us20150376240的seq id no:6)、aav
‑
8b(us20150376240的seq id no:5)、aav
‑
h(us20150376240的seq id no:2)、aav
‑
b(us20150376240的seq id no:1)或其变体。
150.在某些实施方案中,aav血清型可为或具有如美国专利申请公开第us20160017295号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav sm 10
‑
2(us20160017295的seq id no:22)、aav改组100
‑
1(us20160017295的seq id no:23)、aav改组100
‑
3(us20160017295的seq id no:24)、aav改组100
‑
7(us20160017295的seq id no:25)、aav改组10
‑
2(us20160017295的seq id no:34)、aav改组10
‑
6(us20160017295的seq id no:35)、aav改组10
‑
8(us20160017295的seq id no:36)、aav改组100
‑
2(us20160017295的seq id no:37)、aav sm 10
‑
1(us20160017295的seq id no:38)、aav sm 10
‑
8(us20160017295的seq id no:39)、aav sm 100
‑
3(us20160017295的seq id no:40)、aav sm 100
‑
10(us20160017295的seq id no:41)或其变体。
151.在某些实施方案中,aav血清型可为或包含如美国专利公开第us20150238550号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:bnp61aav(us20150238550的seq id no:1)、bnp62 aav(us20150238550的seq id no:3)、bnp63 aav(us20150238550的seq id no:4)或其变体。
152.在某些实施方案中,aav血清型可为或可包含如美国专利公开第us20150315612号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aavrh.50(us20150315612的seq id no:108)、aavrh.43(us20150315612的seq id no:163)、aavrh.62(us20150315612的seq id no:114)、aavrh.48(us20150315612的seq id no:115)、aavhu.19(us20150315612的seq id no:133)、aavhu.11(us20150315612的seq id no:153)、aavhu.53(us20150315612的seq id no:186)、aav4
‑
8/rh.64(us20150315612的seq id no:15)、aavlg
‑
9/hu.39(us20150315612
的seq id no:24)、aav54.5/hu.23(us20150315612的seq id no:60)、aav54.2/hu.22(us20150315612的seq id no:67)、aav54.7/hu.24(us20150315612的seq id no:66)、aav54.1/hu.21(us20150315612的seq id no:65)、aav54.4r/hu.27(us20150315612的seq id no:64)、aav46.2/hu.28(us20150315612的seq id no:68)、aav46.6/hu.29(us20150315612的seq id no:69)、aav128.1/hu.43(us20150315612的seq id no:80)或其变体。
153.在某些实施方案中,aav血清型可为或包含如国际公开第wo2015121501号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:真型aav(ttaav)(wo2015121501的seq id no:2)、“upenn aav10”(wo2015121501的seq id no:8)、“日本aav10”(wo2015121501的seq id no:9)或其变体。
154.根据本公开,可选择或使用来自多种物种的aav衣壳血清型。在某些实施方案中,aav可为禽类aav(aaav)。aaav血清型可为或具有如美国专利第us 9238800号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aaav(us 9238800的seq id no:1、2、4、6、8、10、12或14)或其变体。
155.在某些实施方案中,aav可为牛aav(baav)。baav血清型可为或具有如美国专利第us 9,193,769号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:baav(us 9193769的seq id no:1和6)或其变体。baav血清型可为或具有如美国专利第us7427396号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:baav(us7427396的seq id no:5和6)或其变体。
156.在某些实施方案中,aav可为山羊aav。山羊aav血清型可为或具有如美国专利第us7427396号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:山羊aav(us7427396的seq id no:3)或其变体。
157.在某些实施方案中,aav可被工程化为来自两种或更多种亲本血清型的杂合aav。在某些实施方案中,aav可为包含来自aav2和aav9的序列的aav2g9。aav2g9 aav血清型可为或具有如美国专利申请公开第us20160017005号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列。
158.在某些实施方案中,aav可为通过pulicherla等人(molecular therapy 19(6):1070
‑
1078(2011)(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)在氨基酸390
‑
627(vp1编号)中具有突变的aav9衣壳文库产生的血清型。血清型和相应核苷酸和氨基酸取代可为但不限于:aav9.1(g1594c;d532h)、aav6.2(t1418a和t1436x;v473d和i479k)、aav9.3(t1238a;f413y)、aav9.4(t1250c和a1617t;f417s)、aav9.5(a1235g、a1314t、a1642g、c1760t;q412r、t548a、a587v)、aav9.6(t1231a;f411i)、aav9.9(g1203a、g1785t;w595c)、aav9.10(a1500g、t1676c;m559t)、aav9.11(a1425t、a1702c、a1769t;t568p、q590l)、aav9.13(a1369c、a1720t;n457h、t574s)、aav9.14(t1340a、t1362c、t1560c、g1713a;l447h)、aav9.16(a1775t;q592l)、aav9.24(t1507c、t1521g;w503r)、aav9.26(a1337g、a1769c;y446c、q590p)、aav9.33(a1667c;d556a)、aav9.34(a1534g、c1794t;n512d)、aav9.35(a1289t、t1450a、c1494t、a1515t、c1794a、g1816a;q430l、y484n、n98k、v606i)、aav9.40(a1694t、e565v)、aav9.41(a1348t、t1362c;t450s)、aav9.44
no:35和109)、aav clv
‑
r7(us8734809的seq id no:36和110)、aav clv
‑
r8(us8734809的seq id no:37和111)、aav clv
‑
r9(us8734809的seq id no:38和112)、aav clg
‑
f1(us8734809的seq id no:39和113)、aav clg
‑
f2(us8734809的seq id no:40和114)、aav clg
‑
f3(us8734809的seq id no:41和115)、aav clg
‑
f4(us8734809的seq id no:42和116)、aav clg
‑
f5(us8734809的seq id no:43和117)、aav clg
‑
f6(us8734809的seq id no:43和117)、aav clg
‑
f7(us8734809的seq id no:44和118)、aav clg
‑
f8(us8734809的seq id no:43和117)、aav csp
‑
1(us8734809的seq id no:45和119)、aav csp
‑
10(us8734809的seq id no:46和120)、aav csp
‑
11(us8734809的seq id no:47和121)、aav csp
‑
2(us8734809的seq id no:48和122)、aav csp
‑
3(us8734809的seq id no:49和123)、aav csp
‑
4(us8734809的seq id no:50和124)、aav csp
‑
6(us8734809的seq id no:51和125)、aav csp
‑
7(us8734809的seq id no:52和126)、aav csp
‑
8(us8734809的seq id no:53和127)、aav csp
‑
9(us8734809的seq id no:54和128)、aav cht
‑
2(us8734809的seq id no:55和129)、aav cht
‑
3(us8734809的seq id no:56和130)、aav ckd
‑
1(us8734809的seq id no:57和131)、aav ckd
‑
10(us8734809的seq id no:58和132)、aav ckd
‑
2(us8734809的seq id no:59和133)、aav ckd
‑
3(us8734809的seq id no:60和134)、aav ckd
‑
4(us8734809的seq id no:61和135)、aav ckd
‑
6(us8734809的seq id no:62和136)、aav ckd
‑
7(us8734809的seq id no:63和137)、aav ckd
‑
8(us8734809的seq id no:64和138)、aav clv
‑
1(us8734809的seq id no:35和139)、aav clv
‑
12(us8734809的seq id no:66和140)、aav clv
‑
13(us8734809的seq id no:67和141)、aav clv
‑
2(us8734809的seq id no:68和142)、aav clv
‑
3(us8734809的seq id no:69和143)、aav clv
‑
4(us8734809的seq id no:70和144)、aav clv
‑
6(us8734809的seq id no:71和145)、aav clv
‑
8(us8734809的seq id no:72和146)、aav ckd
‑
b1(us8734809的seq id no:73和147)、aav ckd
‑
b2(us8734809的seq id no:74和148)、aav ckd
‑
b3(us8734809的seq id no:75和149)、aav ckd
‑
b4(us8734809的seq id no:76和150)、aav ckd
‑
b5(us8734809的seq id no:77和151)、aav ckd
‑
b6(us8734809的seq id no:78和152)、aav ckd
‑
b7(us8734809的seq id no:79和153)、aav ckd
‑
b8(us8734809的seq id no:80和154)、aav ckd
‑
h1(us8734809的seq id no:81和155)、aav ckd
‑
h2(us8734809的seq id no:82和156)、aav ckd
‑
h3(us8734809的seq id no:83和157)、aav ckd
‑
h4(us8734809的seq id no:84和158)、aav ckd
‑
h5(us8734809的seq id no:85和159)、aav ckd
‑
h6(us8734809的seq id no:77和151)、aav cht
‑
1(us8734809的seq id no:86和160)、aav clv1
‑
1(us8734809的seq id no:171)、aav clv1
‑
2(us8734809的seq id no:172)、aav clv1
‑
3(us8734809的seq id no:173)、aav clv1
‑
4(us8734809的seq id no:174)、aav clv1
‑
7(us8734809的seq id no:175)、aav clv1
‑
8(us8734809的seq id no:176)、aav clv1
‑
9(us8734809的seq id no:177)、aav clv1
‑
10(us8734809的seq id no:178)、aav.vr
‑
355(us8734809的seq id no:181)、aav.hu.48r3(us8734809的seq id no:183)或其变体或衍生物。
161.在某些实施方案中,aav血清型可为或包含如国际公开第wo2016065001号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav cht
‑
p2(wo2016065001的seq id no:1和51)、aav cht
‑
p5(wo2016065001的seq id no:2和52)、aav cht
‑
p9(wo2016065001的seq id no:3和53)、aav cbr
‑
7.1
(wo2016065001的seq id no:4和54)、aav cbr
‑
7.2(wo2016065001的seq id no:5和55)、aav cbr
‑
7.3(wo2016065001的seq id no:6和56)、aav cbr
‑
7.4(wo2016065001的seq id no:7和57)、aav cbr
‑
7.5(wo2016065001的seq id no:8和58)、aav cbr
‑
7.7(wo2016065001的seq id no:9和59)、aav cbr
‑
7.8(wo2016065001的seq id no:10和60)、aav cbr
‑
7.10(wo2016065001的seq id no:11和61)、aav ckd
‑
n3(wo2016065001的seq id no:12和62)、aav ckd
‑
n4(wo2016065001的seq id no:13和63)、aav ckd
‑
n9(wo2016065001的seq id no:14和64)、aav clv
‑
l4(wo2016065001的seq id no:15和65)、aav clv
‑
l5(wo2016065001的seq id no:16和66)、aav clv
‑
l6(wo2016065001的seq id no:17和67)、aav clv
‑
k1(wo2016065001的seq id no:18和68)、aav clv
‑
k3(wo2016065001的seq id no:19和69)、aav clv
‑
k6(wo2016065001的seq id no:20和70)、aav clv
‑
m1(wo2016065001的seq id no:21和71)、aav clv
‑
m11(wo2016065001的seq id no:22和72)、aav clv
‑
m2(wo2016065001的seq id no:23和73)、aav clv
‑
m5(wo2016065001的seq id no:24和74)、aav clv
‑
m6(wo2016065001的seq id no:25和75)、aav clv
‑
m7(wo2016065001的seq id no:26和76)、aav clv
‑
m8(wo2016065001的seq id no:27和77)、aav clv
‑
m9(wo2016065001的seq id no:28和78)、aav cht
‑
p1(wo2016065001的seq id no:29和79)、aav cht
‑
p6(wo2016065001的seq id no:30和80)、aav cht
‑
p8(wo2016065001的seq id no:31和81)、aav cht
‑
6.1(wo 2016065001的seq id no:32和82)、aav cht
‑
6.10(wo2016065001的seq id no:33和83)、aav cht
‑
6.5(wo2016065001的seq id no:34和84)、aav cht
‑
6.6(wo2016065001的seq id no:35和85)、aav cht
‑
6.7(wo2016065001的seq id no:36和86)、aav cht
‑
6.8(wo2016065001的seq id no:37和87)、aav csp
‑
8.10(wo2016065001的seq id no:38和88)、aav csp
‑
8.2(wo2016065001的seq id no:39和89)、aav csp
‑
8.4(wo2016065001的seq id no:40和90)、aav csp
‑
8.5(wo2016065001的seq id no:41和91)、aav csp
‑
8.6(wo2016065001的seq id no:42和92)、aav csp
‑
8.7(wo2016065001的seq id no:43和93)、aav csp
‑
8.8(wo2016065001的seq id no:44和94)、aav csp
‑
8.9(wo2016065001的seq id no:45和95)、aav cbr
‑
b7.3(wo2016065001的seq id no:46和96)、aav cbr
‑
b7.4(wo2016065001的seq id no:47和97)、aav3b(wo2016065001的seq id no:48和98)、aav4(wo2016065001的seq id no:49和99)、aav5(wo2016065001的seq id no:50和100)或其变体或衍生物。
162.在某些实施方案中,aav颗粒可为或包含选自表1中存在的血清型中的任一者的血清型。
163.在某些实施方案中,aav颗粒可包含表1中的序列、片段或任何序列的变体。
164.在某些实施方案中,aav颗粒可由表1中的序列、片段或任何序列的变体编码。
165.在本文所提及和/或所述的dna和rna序列中,单字母符号具有以下说明:a代表腺嘌呤;c代表胞嘧啶;g代表鸟嘌呤;t代表胸腺嘧啶;u代表尿嘧啶;w代表弱碱基,例如腺嘌呤或胸腺嘧啶;s代表强核苷酸,例如胞嘧啶和鸟嘌呤;m代表氨基核苷酸,例如腺嘌呤和胞嘧啶;k代表酮基核苷酸,例如鸟嘌呤和胸腺嘧啶;r代表嘌呤:腺嘌呤和鸟嘌呤;y代表嘧啶:胞嘧啶和胸腺嘧啶;b代表任何非a碱基(例如,胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶);d代表任何非c碱基(例如,腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶);h代表任何非g碱基(例如,腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶);v代表任何非t碱基(例如,腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤);n代表任何核苷酸(其不为空位);
并且z代表零。
166.在本文所提及和/或描述的任何氨基酸序列中,单字母符号具有以下描述:g(gly)代表甘氨酸;a(ala)代表丙氨酸;l(leu)代表亮氨酸;m(met)代表甲硫氨酸;f(phe)代表苯丙氨酸;w(trp)代表色氨酸;k(lys)代表赖氨酸;q(gln)代表谷氨酰胺;e(glu)代表谷氨酸;s(ser)代表丝氨酸;p(pro)代表脯氨酸;v(val)代表缬氨酸;i(ile)代表异亮氨酸;c(cys)代表半胱氨酸;y(tyr)代表酪氨酸;h(his)代表组氨酸;r(arg)代表精氨酸;n(asn)代表天冬酰胺;d(asp)代表天冬氨酸;t(thr)代表苏氨酸;b(asx)代表天冬氨酸或天冬酰胺;j(xle)代表亮氨酸或异亮氨酸;o(pyl)代表吡咯赖氨酸;u(sec)代表硒代半胱氨酸;x(xaa)代表任何氨基酸;并且z(glx)代表谷氨酰胺或谷氨酸。
167.表1.代表性aav血清型
168.169.170.171.172.173.174.175.176.177.178.179.180.181.182.183.184.185.186.187.188.189.190.191.192.193.194.195.196.197.[0198][0199]
表1中所列的专利、申请和/或公开中的每一者关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要它们不与本公开相冲突即可。
[0200]
在某些实施方案中,aav血清型可为或可包含如国际专利公开wo2015038958(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav9(wo2015038958的seq id no:2和11或本文中为seq id no:135和136)、php.b(wo2015038958的seq id no:8和9,本文中为seq id no:3和4)、g2b
‑
13(wo2015038958的seq id no:12,本文中为seq id no:5)、g2b
‑
26(wo2015038958的seq id no:13,本文中为seq id no:3)、th1.1
‑
32(wo2015038958的seq id no:14,本文中为seq id no:6)、th1.1
‑
35(wo2015038958的seq id no:15,本文中为seq id no:7)或其变体。此外,wo2015038958中所述的“靶向肽”或“氨基酸插入序列”(本文中可互换地使用,意指可插入aav衣壳序列中以促进递送至cns组织的序列)中的任一者可插入至任何亲本aav血清型中,例如但不限于aav9(wo2015038958的dna序列的seq id no:135和氨基酸序列的seq id no:136)。在某些实施方案中,将氨基酸插入序列插入亲本aav(例如aav9)的氨基酸586
‑
592之间。在某些实施方案中,将氨基酸插入序列插入亲本aav序列的氨基酸588
‑
589之间。氨基酸插入序列可为但不限于以下氨基酸序列中的任一者:tlavpfk(wo2015038958的seq id no:1;本文中为seq id no:1260)、kfpvalt(wo2015038958的seq id no:3;本文中为seq id no:1261)、lavpfk(wo2015038958的seq id no:31;本文中为seq id no:1262)、avpfk(wo2015038958的seq id no:32;本文中为seq id no:1263)、vpfk(wo2015038958的seq id no:33;本文中为seq id no:1264)、tlavpf(wo2015038958的seq id no:34;本文中为seq id no:1265)、tlavp(wo2015038958的seq id no:35;本文中为seq id no:1266)、tlav(wo2015038958的seq id no:36;本文中为seq id no:1267)、svskpfl(wo2015038958的seq id no:28;本文中为seq id no:1268)、ftlttpk(wo2015038958的seq id no:29;本文中为seq id no:1269)、mnatknv(wo2015038958的seq id no:30;本文中为seq id no:1270)、qssqtpr(wo2015038958的seq id no:54;本文中为seq id no:1271)、ilgtgts(wo2015038958的seq id no:55;本文中为seq id no:1272)、trtnpea(wo2015038958的seq id no:56;本文中为seq id no:1273)、nggtsss(wo2015038958的seq id no:58;本文中为seq id no:1274)或ytlsqgw(wo2015038958的seq id no:60;本文中为seq id no:1275)。可编码氨基酸插入序列的核苷酸序列的非限制性实例包括但不限于以下:aagtttcctgtggcgttgact(对于wo2015038958的seq id no:3;本文中为seq id no:1276)、actttggcggtgccttttaag(wo2015038958的seq id no:24和49;本文中为seq id no:1277)、
agtgtgagtaagccttttttg(wo2015038958的seq id no:25;本文中为seq id no:1278)、tttacgttgacgacgcctaag(wo2015038958的seq id no:26;本文中为seq id no:1279)、atgaatgctacgaagaatgtg(wo2015038958的seq id no:27;本文中为seq id no:1280)、cagtcgtcgcagacgcctagg(wo2015038958的seq id no:48;本文中为seq id no:1281)、attctggggactggtacttcg(wo2015038958的seq id no:50和52;本文中为seq id no:1282)、acgcggactaatcctgaggct(wo2015038958的seq id no:51;本文中为seq id no:1283)、aatggggggactagtagttct(wo2015038958的seq id no:53;本文中为seq id no:1284)或tatactttgtcgcagggttgg(wo2015038958的seq id no:59;本文中为seq id no:1285)。
[0201]
在某些实施方案中,aav血清型可为或可包含如国际专利公开wo2017100671(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav9k449r(wo2017100671的seq id no:45,本文中为seq id no:9)、php.n(wo2017100671的seq id no:46,本文中为seq id no:2)、php.s(wo2017100671的seq id no:47,本文中为seq id no:8)或其变体。此外,wo2017100671中所述的靶向肽或氨基酸插入序列中的任一者均可插入任何亲本aav血清型中,例如但不限于aav9(seq id no:9或seq id no:136)。在某些实施方案中,将氨基酸插入序列插入亲本aav(例如aav9)的氨基酸586
‑
592之间。在某些实施方案中,将氨基酸插入序列插入亲本aav序列的氨基酸588
‑
589之间。氨基酸插入序列可为但不限于以下氨基酸序列中的任一者:aqtlavpfkaq(wo2017100671的seq id no:1;本文中为seq id no:1286)、aqsvskpflaq(wo2017100671的seq id no:2;本文中为seq id no:1287)、aqftlttpkaq(wo2017100671的序列表中的seq id no:3;本文中为seq id no:1288)、dgtlavpfkaq(wo2017100671的序列表中的seq id no:4;本文中为seq id no:1289)、estlavpfkaq(wo2017100671的seq id no:5;本文中为seq id no:1290)、ggtlavpfkaq(wo2017100671的seq id no:6;本文中为seq id no:1291)、aqtlatpfkaq(wo2017100671的seq id no:7和33;本文中为seq id no:1292)、attlatpfkaq(wo2017100671的seq id no:8;本文中为seq id no:1293)、dgtlatpfkaq(wo2017100671的seq id no:9;本文中为seq id no:1294)、ggtlatpfkaq(wo2017100671的seq id no:10;本文中为seq id no:1295)、sgslavpfkaq(wo2017100671的seq id no:11;本文中为seq id no:1296)、aqtlaqpfkaq(wo2017100671的seq id no:12;本文中为seq id no:1297)、aqtlqqpfkaq(wo2017100671的seq id no:13;本文中为seq id no:1298)、aqtlsnpfkaq(wo2017100671的seq id no:14;本文中为seq id no:1299)、aqtlavpfsnp(wo2017100671的seq id no:15;本文中为seq id no:1300)、qgtlavpfkaq(wo2017100671的seq id no:16;本文中为seq id no:1301)、nqtlavpfkaq(wo2017100671的seq id no:17;本文中为seq id no:1302)、egslavpfkaq(wo2017100671的seq id no:18;本文中为seq id no:1303)、sgnlavpfkaq(wo2017100671的seq id no:19;本文中为seq id no:1304)、egtlavpfkaq(wo2017100671的seq id no:20;本文中为seq id no:1305)、dstlavpfkaq(wo2017100671的表1中的seq id no:21;本文中为seq id no:1306)、avtlavpfkaq(wo2017100671的seq id no:22;本文中为seq id no:1307)、aqtlstpfkaq(wo2017100671的seq id no:23;本文中为seq id no:1308)、aqtlpqpfkaq(wo2017100671的seq id no:24和32;本文中为seq id no:1309)、aqtlsqpfkaq(wo2017100671的seq id no:25;本文中为seq id no:1310)、aqtlqlpfkaq(wo2017100671的seq id no:26;本文中为seq id no:1311)、aqtltmpfkaq
id no:1350)、caagtaaaacctctacaaatgtggtaaaatcg(wo2017100671的seq id no:58;本文中为seq id no:1351)、actcatcgaccaatacttgtactatctctctagaac(wo2017100671的seq id no:59;本文中为seq id no:1352)、ggaagtattccttggttttgaaccca(wo2017100671的seq id no:60;本文中为seq id no:1353)、ggtcgcggttcttgtttgtggat(wo2017100671的seq id no:61;本文中为seq id no:1354)、cgaccttgaagcgcatgaactcct(wo2017100671的seq id no:62;本文中为seq id no:1355)、gtattccttggttttgaacccaaccggtctgcgcctgtgcmnnmnnmnnmnnmnnmnnmnnttgggcactctggtggtttgtc(wo2017100671的seq id no:63,其中n可为a、c、t或g;本文中为seq id no:1356)、gtattccttggttttgaacccaaccggtctgcgcmnnmnnmnnaaaaggcaccgccaaagtttg(wo2017100671的seq id no:69,其中n可为a、c、t或g;本文中为seq id no:1357)、gtattccttggttttgaacccaaccggtctgcgcctgtgcmnnmnnmnncaccgccaaagtttgggcact(wo2017100671的seq id no:70,其中n可为a、c、t或g;本文中为seq id no:1358)、gtattccttggttttgaacccaaccggtctgcgcctgtgccttaaamnnmnnmnncaaagtttgggcactctggtgg(wo2017100671的seq id no:71,其中n可为a、c、t或g;本文中为seq id no:1359)、gtattccttggttttgaacccaaccggtctgcgcctgtgccttaaaaggcacmnnmnnmnnttgggcactctggtggtttgtg(wo2017100671的seq id no:72,其中n可为a、c、t或g;本文中为seq id no:1360)、actttggcggtgccttttaag(wo2017100671的seq id no:74;本文中为seq id no:1277)、agtgtgagtaagccttttttg(wo2017100671的seq id no:75;本文中为seq id no:1278)、tttacgttgacgacgcctaag(wo2017100671的seq id no:76;本文中为seq id no:1279)、tatactttgtcgcagggttgg(wo2017100671的seq id no:77;本文中为seq id no:1285)或cttgcgaaggagcggctttcg(wo2017100671的seq id no:79;本文中为seq id no:1361)。
[0203]
在某些实施方案中,aav血清型可为或可包含如美国专利公开第us 9624274号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav1(us9624274的seq id no:181)、aav6(us9624274的seq id no:182)、aav2(us9624274的seq id no:183)、aav3b(us9624274的seq id no:184)、aav7(us9624274的seq id no:185)、aav8(us9624274的seq id no:186)、aav10(us9624274的seq id no:187)、aav4(us9624274的seq id no:188)、aav11(us9624274的seq id no:189)、baav(us9624274的seq id no:190)、aav5(us9624274的seq id no:191)、gpv(us9624274的seq id no:192;本文中为seq id no:992)、b19(us9624274的seq id no:193;本文中为seq id no:993)、mvm(us9624274的seq id no:194;本文中为seq id no:994)、fpv(us9624274的seq id no:195;本文中为seq id no:995)、cpv(us9624274的seq id no:196;本文中为seq id no:996)或其变体。此外,美国专利第us9624274号中所述的结构蛋白质插入序列中的任一者可插入但不限于:任何亲本aav血清型的i
‑
453和i
‑
587,例如但不限于aav2(us9624274的seq id no:183)。氨基酸插入序列可为但不限于以下氨基酸序列中的任一者:vnltwsrasg(us9624274的seq id no:50;本文中为seq id no:1362)、efcinhrgywvcgd(us9624274的seq id no:55;本文中为seq id no:1363)、edgqvmdvdls(us9624274的seq id no:85;本文中为seq id no:1364)、ekqrngtlt(us9624274的seq id no:86;本文中为seq id no:1365)、tyqcrvthphlpralmr(us9624274的seq id no:87;本文中为seq id no:1366)、rhsttqprktkgsg(us9624274的seq id no:88;本文中为seq id no:1367)、dsnprgvsaylsr(us9624274的seq id no:89;本文中为seq id no:1368)、
titclwdlapsk(us9624274的seq id no:90;本文中为seq id no:1369)、ktkgsgffvf(us9624274的seq id no:91;本文中为seq id no:1370)、thphlpralmrs(us9624274的seq id no:92;本文中为seq id no:1371)、getyqcrvthphlpralmrsttk(us9624274的seq id no:93;本文中为seq id no:1372)、lpralmrs(us9624274的seq id no:94;本文中为seq id no:1373)、inhrgywv(us9624274的seq id no:95;本文中为seq id no:1374)、cdagsvrtnapd(us9624274的seq id no:60;本文中为seq id no:1375)、akavsnltesrseslqs(us9624274的seq id no:96;本文中为seq id no:1376)、sltgdefkkvlet(us9624274的seq id no:97;本文中为seq id no:1377)、reavayrfeed(us9624274的seq id no:98;本文中为seq id no:1378)、inpeiitldg(us9624274的seq id no:99;本文中为seq id no:1379)、disvtgapvitatyl(us9624274的seq id no:100;本文中为seq id no:1380)、disvtgapvita(us9624274的seq id no:101;本文中为seq id no:1381)、pktvsnltesssesvqs(us9624274的seq id no:102;本文中为seq id no:1382)、slmgdefkavlet(us9624274的seq id no:103;本文中为seq id no:1383)、qhsvaytfeed(us9624274的seq id no:104;本文中为seq id no:1384)、inpeiitrdg(us9624274的seq id no:105;本文中为seq id no:1385)、disltgdpvitasyl(us9624274的seq id no:106;本文中为seq id no:1386)、disltgdpvita(us9624274的seq id no:107;本文中为seq id no:1387)、dqsidfeidsa(us9624274的seq id no:108;本文中为seq id no:1388)、knvsedlplptfsptllgds(us9624274的seq id no:109;本文中为seq id no:1389)、knvsedlplpt(us9624274的seq id no:110;本文中为seq id no:1390)、cdsgrvrtdapd(us9624274的seq id no:111;本文中为seq id no:1391)、fpehllvdflqsls(us9624274的seq id no:112;本文中为seq id no:1392)、daefrhdsg(us9624274的seq id no:65;本文中为seq id no:1393)、hyaaaqwdfgntmcql(us9624274的seq id no:113;本文中为seq id no:1394)、yaaqwdfgntmcq(us9624274的seq id no:114;本文中为seq id no:1395)、rsqkeglhyt(us9624274的seq id no:115;本文中为seq id no:1396)、ssrtpsdkpvahwanpqae(us9624274的seq id no:116;本文中为seq id no:1397)、srtpsdkpvahwanp(us9624274的seq id no:117;本文中为seq id no:1398)、ssrtpsdkp(us9624274的seq id no:118;本文中为seq id no:1399)、nadgnvdyhmnsvp(us9624274的seq id no:119;本文中为seq id no:1400)、dgnvdyhmnsv(us9624274的seq id no:120;本文中为seq id no:1401)、rsfkeflqsslralrq(us9624274的seq id no:121;本文中为seq id no:1402);fkeflqsslra(us9624274的seq id no:122;本文中为seq id no:1403)或qmwapqwgpd(us9624274的seq id no:123;本文中为seq id no:1404)。
[0204]
在某些实施方案中,aav血清型可为或可具有如美国专利第us 9475845号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:aav衣壳蛋白,其包含在原生aav2衣壳蛋白的氨基酸位置585至590处的一个或多个氨基酸修饰。此外,修饰可产生但不限于氨基酸序列rgnrqa(us9475845的seq id no:3;本文中为seq id no:1405)、ssstdp(us9475845的seq id no:4;本文中为seq id no:1406)、ssntap(us9475845的seq id no:5;本文中为seq id no:1407)、snsnlp(us9475845的seq id no:6;本文中为seq id no:1408)、ssttap(us9475845的seq id no:7;本文中为seq id no:1409)、aantaa(us9475845的seq id no:8;本文中为seq id no:1410)、qqntap
(us9475845的seq id no:9;本文中为seq id no:1411)、saqaqa(us9475845的seq id no:10;本文中为seq id no:1412)、qantgp(us9475845的seq id no:11;本文中为seq id no:1413)、nattap(us9475845的seq id no:12;本文中为seq id no:1414)、sstagp(us9475845的seq id no:13和20;本文中为seq id no:1415)、qqntaa(us9475845的seq id no:14;本文中为seq id no:1416)、pstagp(us9475845的seq id no:15;本文中为seq id no:1417)、nqntap(us9475845的seq id no:16;本文中为seq id no:1418)、qaanap(us9475845的seq id no:17;本文中为seq id no:1419)、sivglp(us9475845的seq id no:18;本文中为seq id no:1420)、aastaa(us9475845的seq id no:19和27;本文中为seq id no:1421)、sqntta(us9475845的seq id no:21;本文中为seq id no:1422)、qqdtap(us9475845的seq id no:22;本文中为seq id no:1423)、qtntgp(us9475845的seq id no:23;本文中为seq id no:1424)、qtngap(us9475845的seq id no:24;本文中为seq id no:1425)、qqnaap(us9475845的seq id no:25;本文中为seq id no:1426)或aantqa(us9475845的seq id no:26;本文中为seq id no:1427)。在某些实施方案中,氨基酸修饰为原生aav2衣壳蛋白中的氨基酸位置262至265处的取代或具有靶向序列的另一aav的衣壳蛋白中的相应位置处的取代。靶向序列可为但不限于以下氨基酸序列中的任一者:ngraha(us9475845的seq id no:38;本文中为seq id no:1428)、qpehsst(us9475845的seq id no:39和50;本文中为seq id no:1429)、vntanst(us9475845的seq id no:40;本文中为seq id no:1430)、hgpmqks(us9475845的seq id no:41;本文中为seq id no:1431)、phkppla(us9475845的seq id no:42;本文中为seq id no:1432)、iknnemw(us9475845的seq id no:43;本文中为seq id no:1433)、rnldtpm(us9475845的seq id no:44;本文中为seq id no:1434)、vdshrqs(us9475845的seq id no:45;本文中为seq id no:1435)、ydsktkt(us9475845的seq id no:46;本文中为seq id no:1436)、sqlphqk(us9475845的seq id no:47;本文中为seq id no:1437)、stmqqnt(us9475845的seq id no:48;本文中为seq id no:1438)、terymtq(us9475845的seq id no:49;本文中为seq id no:1439)、daslsts(us9475845的seq id no:51;本文中为seq id no:1440)、dlpnkkt(us9475845的seq id no:52;本文中为seq id no:1441)、dltaarl(us9475845的seq id no:53;本文中为seq id no:1442)、ephqfny(us9475845的seq id no:54;本文中为seq id no:1443)、epqsnht(us9475845的seq id no:55;本文中为seq id no:1444)、msswpsq(us9475845的seq id no:56;本文中为seq id no:1445)、npkhnat(us9475845的seq id no:57;本文中为seq id no:1446)、pdgmrtt(us9475845的seq id no:58;本文中为seq id no:1447)、pnnnktt(us9475845的seq id no:59;本文中为seq id no:1448)、qstthds(us9475845的seq id no:60;本文中为seq id no:1449)、tgskqkq(us9475845的seq id no:61;本文中为seq id no:1450)、slkhqal(us9475845的seq id no:62;本文中为seq id no:1451)、spidgeq(us9475845的seq id no:63;本文中为seq id no:1452)、wifpwiql(us9475845的seq id no:64和112;本文中为seq id no:1453)、cdcrgdcfc(us9475845的seq id no:65;本文中为seq id no:1454)、cngrc(us9475845的seq id no:66;本文中为seq id no:1455)、cpreces(us9475845的seq id no:67;本文中为seq id no:1456)、ctthwgftlc(us9475845的seq id no:68和123;本文中为seq id no:1457)、cgrraggsc(us9475845的seq id no:69;本文中为seq id no:1458)、ckggrakdc(us9475845的seq id no:70;本文中为seq id no:1459)、cvpelghec
(us9475845的seq id no:71和115;本文中为seq id no:1460)、crretawak(us9475845的seq id no:72;本文中为seq id no:1461)、vswfshryspfavs(us9475845的seq id no:73;本文中为seq id no:1462)、gyrdgyagpilyn(us9475845的seq id no:74;本文中为seq id no:1463)、xxxyxxx(us9475845的seq id no:75;本文中为seq id no:1464)、yxnw(us9475845的seq id no:76;本文中为seq id no:1465)、rplpplp(us9475845的seq id no:77;本文中为seq id no:1466)、applppr(us9475845的seq id no:78;本文中为seq id no:1467)、dvfypypyasgs(us9475845的seq id no:79;本文中为seq id no:1468)、mywypy(us9475845的seq id no:80;本文中为seq id no:1469)、ditwdqlwdlmk(us9475845的seq id no:81;本文中为seq id no:1470)、cwddxwlc(us9475845的seq id no:82;本文中为seq id no:1471)、ewceylggylrcya(us9475845的seq id no:83;本文中为seq id no:1472)、yxcxxgpxtwxcxp(us9475845的seq id no:84;本文中为seq id no:1473)、iegptlrqwlaara(us9475845的seq id no:85;本文中为seq id no:1474)、lwxxx(us9475845的seq id no:86;本文中为seq id no:1475)、xfxxylw(us9475845的seq id no:87;本文中为seq id no:1476)、ssiishfrwglcd(us9475845的seq id no:88;本文中为seq id no:1477)、msrpacppndkye(us9475845的seq id no:89;本文中为seq id no:1478)、clrsgrgc(us9475845的seq id no:90;本文中为seq id no:1479)、chwmfspwc(us9475845的seq id no:91;本文中为seq id no:1480)、wxxf(us9475845的seq id no:92;本文中为seq id no:1481)、cssrldac(us9475845的seq id no:93;本文中为seq id no:1482)、clpvasc(us9475845的seq id no:94;本文中为seq id no:1483)、cgfecvrqcperc(us9475845的seq id no:95;本文中为seq id no:1484)、cvalcreacgegc(us9475845的seq id no:96;本文中为seq id no:1485)、swcepgwcr(us9475845的seq id no:97;本文中为seq id no:1486)、ysgkwgw(us9475845的seq id no:98;本文中为seq id no:1487)、glsggrs(us9475845的seq id no:99;本文中为seq id no:1488)、lmlprad(us9475845的seq id no:100;本文中为seq id no:1489)、cscfrdvcc(us9475845的seq id no:101;本文中为seq id no:1490)、crdvvsvic(us9475845的seq id no:102;本文中为seq id no:1491)、marsgl(us9475845的seq id no:103;本文中为seq id no:1492)、marake(us9475845的seq id no:104;本文中为seq id no:1493)、msrtms(us9475845的seq id no:105;本文中为seq id no:1494)、kccysl(us9475845的seq id no:106;本文中为seq id no:1495)、mywgdshwlqywye(us9475845的seq id no:107;本文中为seq id no:1496)、mqlplat(us9475845的seq id no:108;本文中为seq id no:1497)、ewls(us9475845的seq id no:109;本文中为seq id no:1498)、snew(us9475845的seq id no:110;本文中为seq id no:1499)、tnyl(us9475845的seq id no:111;本文中为seq id no:1500)、wdlawmfrlpvg(us9475845的seq id no:113;本文中为seq id no:1501)、ctvalpggyvrvc(us9475845的seq id no:114;本文中为seq id no:1502)、cvayciehhcwtc(us9475845的seq id no:116;本文中为seq id no:1503)、cvfahnydylvc(us9475845的seq id no:117;本文中为seq id no:1504)、cvftsnyafc(us9475845的seq id no:118;本文中为seq id no:1505)、vhspnkk(us9475845的seq id no:119;本文中为seq id no:1506)、crgdgwc(us9475845的seq id no:120;本文中为seq id no:1507)、xrgcdx(us9475845的seq id no:121;本文中为seq id no:1508)、pxxx(us9475845的seq id no:122;本文中为seq id no:1509)、sgkgprqital(us9475845的
id no:1548)、spsgasn(us20160369298的seq id no:2;本文中为seq id no:1549)、shsgasn(us20160369298的seq id no:3;本文中为seq id no:1550)、srsgasn(us20160369298的seq id no:4;本文中为seq id no:1551)、sksgasn(us20160369298的seq id no:5;本文中为seq id no:1552)、snsgasn(us20160369298的seq id no:6;本文中为seq id no:1553)、sgsgasn(us20160369298的seq id no:7;本文中为seq id no:1554)、sasgasn(us20160369298的seq id no:8、175和221;本文中为seq id no:1555)、sesgtsn(us20160369298的seq id no:9;本文中为seq id no:1556)、sttggsn(us20160369298的seq id no:10;本文中为seq id no:1557)、ssagstn(us 20160369298的seq id no:11;本文中为seq id no:1558)、nndsqa(us20160369298的seq id no:12;本文中为seq id no:1559)、nnrnqa(us20160369298的seq id no:13;本文中为seq id no:1560)、nnnkqa(us20160369298的seq id no:14;本文中为seq id no:1561)、nakrqa(us20160369298的seq id no:15;本文中为seq id no:1562)、ndehqa(us20160369298的seq id no:16;本文中为seq id no:1563)、ntsqka(us20160369298的seq id no:17;本文中为seq id no:1564)、yylsrtntpsgtdtqsrlvfsqaga(us20160369298的seq id no:18;本文中为seq id no:1565)、yylsrtntdsgtetqsgldfsqaga(us20160369298的seq id no:19;本文中为seq id no:1566)、yylsrtntesgtptqsalefsqaga(us20160369298的seq id no:20;本文中为seq id no:1567)、yylsrtnthsgthtqsplhfsqaga(us20160369298的seq id no:21;本文中为seq id no:1568)、yylsrtntssgtitishlifsqaga(us20160369298的seq id no:22;本文中为seq id no:1569)、yylsrtntrsgimtksslmfsqaga(us20160369298的seq id no:23;本文中为seq id no:1570)、yylsrtntksgrktlsnlsfsqaga(us20160369298的seq id no:24;本文中为seq id no:1571)、yylsrtndgsgpvtpsklrfsqrga(us20160369298的seq id no:25;本文中为seq id no:1572)、yylsrtnaasghathsdlkfsqpga(us20160369298的seq id no:26;本文中为seq id no:1573)、yylsrtngqagsltmselgfsqvga(us20160369298的seq id no:27;本文中为seq id no:1574)、yylsrtnstggnqttsqllfsqlsa(us20160369298的seq id no:28;本文中为seq id no:1575)、yflsrtnnntglntnstlnfsqgra(us20160369298的seq id no:29;本文中为seq id no:1576)、sktgadnnnseyswtg(us20160369298的seq id no:30;本文中为seq id no:1577)、sktdadnnnseyswtg(us20160369298的seq id no:31;本文中为seq id no:1578)、skteadnnnseyswtg(us20160369298的seq id no:32;本文中为seq id no:1579)、sktpadnnnseyswtg(us20160369298的seq id no:33;本文中为seq id no:1580)、skthadnnnseyswtg(us20160369298的seq id no:34;本文中为seq id no:1581)、sktqadnnnseyswtg(us20160369298的seq id no:35;本文中为seq id no:1582)、sktiadnnnseyswtg(us20160369298的seq id no:36;本文中为seq id no:1583)、sktmadnnnseyswtg(us20160369298的seq id no:37;本文中为seq id no:1584)、sktradnnnseyswtg(us20160369298的seq id no:38;本文中为seq id no:1585)、sktnadnnnseyswtg(us20160369298的seq id no:39;本文中为seq id no:1586)、sktvgrnnnseyswtg(us20160369298的seq id no:40;本文中为seq id no:1587)、sktadrnnnseyswtg(us20160369298的seq id no:41;本文中为seq id no:1588)、skklsqnnnskyswqg(us20160369298的seq id no:42;本文中为seq id no:1589)、skpttgnnnsdyswpg(us20160369298的seq id no:43;本文中为seq id no:1590)、
stqknennnsnyswpg(us20160369298的seq id no:44;本文中为seq id no:1591)、hkddegkf(us20160369298的seq id no:45;本文中为seq id no:1592)、hkddnrkf(us20160369298的seq id no:46;本文中为seq id no:1593)、hkddtnkf(us 20160369298的seq id no:47;本文中为seq id no:1594)、hedsdknf(us20160369298的seq id no:48;本文中为seq id no:1595)、hrdgadsf(us20160369298的seq id no:49;本文中为seq id no:1596)、hgdnksrf(us20160369298的seq id no:50;本文中为seq id no:1597)、kqgsektnvdfeev(us20160369298的seq id no:51;本文中为seq id no:1598)、kqgsektnvdseev(us20160369298的seq id no:52;本文中为seq id no:1599)、kqgsektnvdveev(us20160369298的seq id no:53;本文中为seq id no:1600)、kqgsdktnvddagv(us20160369298的seq id no:54;本文中为seq id no:1601)、kqgssktnvdprev(us20160369298的seq id no:55;本文中为seq id no:1602)、kqgsrktnvdhkqv(us20160369298的seq id no:56;本文中为seq id no:1603)、kqgskggnvdtnrv(us20160369298的seq id no:57;本文中为seq id no:1604)、kqgsgeanvdngdv(us20160369298的seq id no:58;本文中为seq id no:1605)、kqdaaadnidydhv(us 20160369298的seq id no:59;本文中为seq id no:1606)、kqsgtrsnaaassv(us20160369298的seq id no:60;本文中为seq id no:1607)、kentntndteltnv(us20160369298的seq id no:61;本文中为seq id no:1608)、qrgnnvaatadvnt(us20160369298的seq id no:62;本文中为seq id no:1609)、qrgnneaatadvnt(us20160369298的seq id no:63;本文中为seq id no:1610)、qrgnnpaatadvnt(us20160369298的seq id no:64;本文中为seq id no:1611)、qrgnnhaatadvnt(us20160369298的seq id no:65;本文中为seq id no:1612)、qeenniaatpgvnt(us20160369298的seq id no:66;本文中为seq id no:1613)、qppnnmaathevnt(us20160369298的seq id no:67;本文中为seq id no:1614)、qhhnnsaattivnt(us20160369298的seq id no:68;本文中为seq id no:1615)、qttnnraafnmvet(us20160369298的seq id no:69;本文中为seq id no:1616)、qkknnnaaskkvat(us20160369298的seq id no:70;本文中为seq id no:1617)、qggnnkaaddavkt(us20160369298的seq id no:71;本文中为seq id no:1618)、qaakggaaddavkt(us20160369298的seq id no:72;本文中为seq id no:1619)、qddraaaanesvdt(us20160369298的seq id no:73;本文中为seq id no:1620)、qqqhddaayqrvht(us20160369298的seq id no:74;本文中为seq id no:1621)、qsssslaavstvqt(us20160369298的seq id no:75;本文中为seq id no:1622)、qnnqttaairnvtt(us20160369298的seq id no:76;本文中为seq id no:1623)、nynkksdnvdft(us20160369298的seq id no:77;本文中为seq id no:1624)、nynkksenvdft(us20160369298的seq id no:78;本文中为seq id no:1625)、nynkkslnvdft(us20160369298的seq id no:79;本文中为seq id no:1626)、nynkkspnvdft(us20160369298的seq id no:80;本文中为seq id no:1627)、nyskkshcvdft(us20160369298的seq id no:81;本文中为seq id no:1628)、nyrktiyvdft(us20160369298的seq id no:82;本文中为seq id no:1629)、nykekkdvhft(us20160369298的seq id no:83;本文中为seq id no:1630)、nyghraivqft
(us20160369298的seq id no:84;本文中为seq id no:1631)、nyanhqfvvct(us20160369298的seq id no:85;本文中为seq id no:1632)、nydddptgvllt(us20160369298的seq id no:86;本文中为seq id no:1633)、nyddptgvllt(us20160369298的seq id no:87;本文中为seq id no:1634)、nfeqqnsvewt(us20160369298的seq id no:88;本文中为seq id no:1635)、sqsgasn(us20160369298的seq id no:89和seq id no:241;本文中为seq id no:1636)、nngsqa(us20160369298的seq id no:90;本文中为seq id no:1637)、yylsrtntpsgtttwsrlqfsqaga(us20160369298的seq id no:91;本文中为seq id no:1638)、sktsadnnnseyswtg(us20160369298的seq id no:92;本文中为seq id no:1639)、hkddeekf(us20160369298的seq id no:93、209、214、219、224、234、239和244;本文中为seq id no:1640)、kqgsektnvdieev(us20160369298的seq id no:94;本文中为seq id no:1641)、qrgnnqaatadvnt(us20160369298的seq id no:95;本文中为seq id no:1642)、nynkksvnvdft(us20160369298的seq id no:96;本文中为seq id no:1643)、sqsgasnyntpsgtttqsrlqfstsadnnnseyswtgatkyh(us20160369298的seq id no:106;本文中为seq id no:1644)、sasgasnfnseggsltqsslgfstdgennnsdfswtgatkyh(us20160369298的seq id no:107;本文中为seq id no:1645)、sqsgasnyntpsgtttqsrlqfstdgennnsdfswtgatkyh(us20160369298的seq id no:108;本文中为seq id no:1646)、sasgasnyntpsgtttqsrlqfstsadnnnsefswpgattyh(us20160369298的seq id no:109;本文中为seq id no:1647)、sqsgasnfnseggsltqsslgfstdgennnsdfswtgatkyh(us20160369298的seq id no:110;本文中为seq id no:1648)、sasgasnyntpsgsltqsslgfstdgennnsdfswtgatkyh(us20160369298的seq id no:111;本文中为seq id no:1649)、sqsgasnyntpsgtttqsrlqfstsadnnnsdfswtgatkyh(us20160369298的seq id no:112;本文中为seq id no:1650)、sgagasnfnseggsltqsslgfstdgennnsdfswtgatkyh(us20160369298的seq id no:113;本文中为seq id no:1651)、sgagasn(us20160369298的seq id no:176;本文中为seq id no:1652)、nseggsltqsslgfs(us20160369298的seq id no:177、185、193和202;本文中为seq id no:1653)、tdgennnsdfs(us20160369298的seq id no:178;本文中为seq id no:1654)、sefswpgatt(us20160369298的seq id no:179;本文中为seq id no:1655)、tsadnnnsdfswt(us20160369298的seq id no:180;本文中为seq id no:1656)、sqs gasny(us20160369298的seq id no:181、187和198;本文中为seq id no:1657)、ntpsgtttqsrlqfs(us20160369298的seq id no:182、188、191和199;本文中为seq id no:1658)、tsadnnnseyswtgatkyh(us20160369298的seq id no:183;本文中为seq id no:1659)、sasgasnf(us20160369298的seq id no:184;本文中为seq id no:1660)、tdgennnsdfswtgatkyh(us20160369298的seq id no:186、189、194、197和203;本文中为seq id no:1661)、sasgasny(us20160369298的seq id no:190和seq id no:195;本文中为seq id no:1662)、tsadnnnsefswpgattyh(us20160369298的seq id no:192;本文中为seq id no:1663)、ntpsgsltqsslgfs(us20160369298的seq id no:196;本文中为seq id no:1664)、tsadnnnsdfswtgatkyh(us20160369298的seq id no:200;本文中为seq id no:1665)、sgagasnf(us20160369298的seq id no:201;本文中为seq id no:1666)、ctccagvvsvvsmrsrvcvnsgcagctdhcvvsrnsgtcvmsacacaa(us20160369298的seq id no:204;本文中为seq id no:1667)、ctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaa
(us20160369298的seq id no:205;本文中为seq id no:1668)、saagasn(us20160369298的seq id no:206;本文中为seq id no:1669)、yflsrtntesgsttqstlrfsqag(us20160369298的seq id no:207;本文中为seq id no:1670)、sktsadnnnsdfs(us20160369298的seq id no:208、228和253;本文中为seq id no:1671)、kqgsektdvdidkv(us20160369298的seq id no:210;本文中为seq id no:1672)、stagasn(us20160369298的seq id no:211;本文中为seq id no:1673)、yflsrtnttsgietqstlrfsqag(us20160369298的seq id no:212和seq id no:247;本文中为seq id no:1674)、sktdgennnsdfs(us20160369298的seq id no:213和seq id no:248;本文中为seq id no:1675)、kqgaaaddveidgv(us20160369298的seq id no:215和seq id no:250;本文中为seq id no:1676)、seagasn(us20160369298的seq id no:216;本文中为seq id no:1677)、yylsrtntpsgtttqsrlqfsqag(us20160369298的seq id no:217、232和242;本文中为seq id no:1678)、sktsadnnnseys(us20160369298的seq id no:218、233、238和243;本文中为seq id no:1679)、kqgsektnvdiekv(us20160369298的seq id no:220、225和245;本文中为seq id no:1680)、yflsrtndasgsdtkstllfsqag(us20160369298的seq id no:222;本文中为seq id no:1681)、sttpsennnseys(us20160369298的seq id no:223;本文中为seq id no:1682)、saagatn(us20160369298的seq id no:226和seq id no:251;本文中为seq id no:1683)、yflsrtngeagsatlselrfsqag(us20160369298的seq id no:227;本文中为seq id no:1684)、hgddadrf(us20160369298的seq id no:229和seq id no:254;本文中为seq id no:1685)、kqgaeksdvevdrv(us20160369298的seq id no:230和seqid no:255;本文中为seq id no:1686)、kqdsggdnididqv(us20160369298的seq id no:235;本文中为seq id no:1687)、sdagasn(us20160369298的seq id no:236;本文中为seq id no:1688)、yflsrtntegghdtqstlrfsqag(us20160369298的seq id no:237;本文中为seq id no:1689)、kedgggsdvaidev(us20160369298的seq id no:240;本文中为seq id no:1690)、snagasn(us20160369298的seq id no:246;本文中为seq id no:1691)和yflsrtngeagsatlselrfsqpg(us20160369298的seq id no:252;本文中为seq id no:1692)。可编码氨基酸突变位点的核苷酸序列的非限制性实例包括以下:agcvvmdcaggarscascaac(us20160369298的seq id no:97;本文中为seq id no:1693)、aacracrrsmrsmaggca(us20160369298的seq id no:98;本文中为seq id no:1694)、cacrrggacrrcrmsrrsarsttt(us20160369298的seq id no:99;本文中为seq id no:1695)、tatttcttgagcagaacaaacrvcvvsrscggamncvhsacgmhstcavvscttvdsttttctcagsbcrgsgcg(us20160369298的seq id no:100;本文中为seq id no:1696)、tcaamammavnsrvcsrsaacaacaacagtrasttctcgtggmmagga(us20160369298的seq id no:101;本文中为seq id no:1697)、aagsaarrcrscrvsrvarvcratrycgmsnhcrvmvrsgtc(us20160369298的seq id no:102;本文中为seq id no:1698)、cagvvsvvsmrsrvcvnsgcagctdhcvvsrnsgtcvmsaca(us20160369298的seq id no:103;本文中为seq id no:1699)、aactwcrvsvasmvsvhsddtgtgswstksact(us20160369298的seq id no:104;本文中为seq id no:1700)、ttgttgaacatcaccacgtgacgcacgttc(us20160369298的seq id no:256;本文中为seq id no:1701)、tccccgtggttctactacataatgtggccg(us20160369298的seq id no:257;本文中为seq id no:1702)、ttccacactccgttttggataatgttgaac(us20160369298的seq id no:258;
本文中为seq id no:1703)、agggacatccccagctccatgctgtggtcg(us20160369298的seq id no:259;本文中为seq id no:1704)、agggacaacccctccgactcgccctaatcc(us20160369298的seq id no:260;本文中为seq id no:1705)、tcctagtagaagacaccctctcactgcccg(us20160369298的seq id no:261;本文中为seq id no:1706)、agtaccatgtacacccactctcccagtgcc(us20160369298的seq id no:262;本文中为seq id no:1707)、atatggacgttcatgctgatcaccataccg(us20160369298的seq id no:263;本文中为seq idno:1708)、agcaggagctccttggcctcagcgtgcgag(us20160369298的seq id no:264;本文中为seq id no:1709)、acaagcagcttcactatgacaaccactgac(us20160369298的seq id no:265;本文中为seq id no:1710)、cagcctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagagagtctcaamammavnsrvcsrsaacaacaacagtrasttctcctggmmaggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatcccggaccagctatggcaagccacrrggacrrcrmsrrsarsttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagsaarrcrscrvsrvarvcratrycgmsnhcrvmvrsgtcatgattacagacgaagaggagatctggac(us20160369298的seq id no:266;本文中为seq id no:1711)、tgggacaatggcggtcgtctctcagagttktkkt(us20160369298的seq id no:267;本文中为seq id no:1712)、agaggacckktcctcgatggttcatggtggagtta(us20160369298的seq id no:268;本文中为seq id no:1713)、ccacttagggcctggtcgataccgttcggtg(us20160369298的seq id no:269;本文中为seq id no:1714)或tctcgccccaagagtagaaacccttcsttyyg(us20160369298的seq id no:270;本文中为seq id no:1715)。
[0207]
在某些实施方案中,aav血清型可包含如国际专利公开wo2016134375(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的靶向眼细胞的肽,例如但不限于:wo2016134375的seq id no:9或seq id no:10。此外,wo2016134375中所述的靶向眼细胞的肽或氨基酸中的任一者可插入任何亲本aav血清型中,例如但不限于aav2(wo2016134375的seq id no:8;本文中为seq id no:1716),或aav9(wo2016134375的seq id no:11;本文中为seq id no:1717)。在某些实施方案中,例如插入的修饰发生于aav2蛋白质中的p34
‑
a35、t138
‑
a139、a139
‑
p140、g453
‑
t454、n587
‑
r588和/或r588
‑
q589。在某些实施方案中,插入发生于aav9的d384、g385、1560、t561、n562、e563、e564、e565、n704和/或y705处。靶向眼细胞的肽可为但不限于以下氨基酸序列中的任一者:gstpppm(wo2016134375的seq id no:1;本文中为seq id no:1718),或getrapl(wo2016134375的seq id no:4;本文中为seq id no:1719)。
[0208]
在某些实施方案中,aav血清型可如美国专利申请公开第us 20170145405号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述进行修饰。aav血清型可包含修饰的aav2(例如,y444f、y500f、y730f和/或s662v处的修饰)、修饰的aav3(例如,y705f、y731f和/或t492v处的修饰)和修饰的aav6(例如,s663v和/或t492v处的修饰)。
[0209]
在某些实施方案中,aav血清型可如国际公开第wo2017083722号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述进行修饰。aav血清型可包含aav1(y705 731f t492v)、aav2(y444 500 730f t491v)、aav3(y705 731f)、aav5、aav 5(y436 693 719f)、aav6(vp3变体y705f/y731f/t492v)、aav8(y733f)、aav9、aav9(vp3变体y731f)和aav10(y733f)。
[0210]
在某些实施方案中,aav血清型可包含,如国际专利公开第wo2017015102号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述,包含氨基酸spakfa(wo2017015102的seq id no:24;本文中为seq id no:1720)或nkdkln(wo2017015102的seq id no:2;本文中为seq id no:1721)的工程化表位。可将表位插入氨基酸665至670的区域(基于aav8的vp1衣壳的编号(wo2017015102的seq id no:3))和/或aav3b的残基664至668(seq id no:3)中。
[0211]
在某些实施方案中,aav血清型可为或可具有如国际专利公开第wo2017058892号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的序列,例如但不限于:具有衣壳蛋白的aav变体,其可包含在aav1的氨基酸残基262
‑
268、370
‑
379、451
‑
459、472
‑
473、493
‑
500、528
‑
534、547
‑
552、588
‑
597、709
‑
710或716
‑
722中的一者或多者(例如2、3、4、5、6或7)处以任何组合的取代,或在aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aavrh32.33、牛aav或禽类aav中的等效氨基酸残基。氨基酸取代可为但不限于wo2017058892中所述的氨基酸序列中的任一者。在某些实施方案中,aav可包含在aav1(wo2017058892的seq id no:1)的残基256l、258k、259q、261s、263a、264s、265t、266g、272h、385s、386q、s472r、v473d、n500e 547s、709a、710n、716d、717n、718n、720l、a456t、q457t、n458q、k459s、t492s、k493a、s586r、s587g、s588n、t589r和/或722t处以任何组合,在aav5(wo2017058892的seq id no:5)的244n、246q、248r、249e、250i、251k、252s、253g、254s、255v、256d、263y、377e、378n、453l、456r、532q、533p、535n、536p、537g、538t、539t、540a、541t、542y、543l、546n、653v、654p、656s、697q、698f、704d、705s、706t、707g、708e、709y和/或710r处以任何组合,在aav5(wo2017058892的seq id no:5)的248r、316v、317q、318d、319s、443n、530n、531s、532q、533p、534a、535n、540a、541t、542y、543l、545g、546n、697q、704d、706t、708e、709y和/或710r处以任何组合,在aav6(seq id no:6wo2017058892)的264s、266g、269n、272h、457q、588s和/或589i处以任何组合,在aav8(seq id no:8wo2017058892)的457t、459n、496g、499n、500n、589q、590n和/或592a处以任何组合,在aav9(seq id no:9wo2017058892)的451i、452n、453g、454s、455g、456q、457n和/或458q处以任何组合的氨基酸取代。
[0212]
在某些实施方案中,aav可包含vp1的位置155、156和157处或vp2的位置17、18、19和20处的氨基酸序列,如国际公开第wo 2017066764号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述。氨基酸序列可为但不限于n
‑
s
‑
s、s
‑
x
‑
s、s
‑
s
‑
y、n
‑
x
‑
s、n
‑
s
‑
y、s
‑
x
‑
y或n
‑
x
‑
y,其中n、x和y独立地为但不限于非丝氨酸或非苏氨酸氨基酸,其中aav可为但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11或aav12。在某些实施方案中,aav可包含vp1的位置156、157或158处或vp2的位置19、20或21处的至少一个氨基酸的缺失,其中aav可为但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11或aav12。
[0213]
在某些实施方案中,aav可为由deverman等人(nature biotechnology 34(2):204
‑
209(2016)),chan等人(nature neuroscience20(8):1172
‑
1179(2017))和国际专利申请公开第wo2015038958号和第wo2017100671号(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述的基于cre重组aav靶向进化(create)产生的血清型。在某些实施方案中,以这种方式产生的aav血清型相较于不以这种方式产生的aav
血清型具有改进的cns转导和/或神经元和星形胶质细胞向性。作为非限制性实例,aav血清型可包含靶向肽,例如但不限于php.b、php.b2、php.b3、php.a、php.s、php.n、g2a12、g2a15、g2a3、g2b4或g2b5。在某些实施方案中,这些aav血清型可为aav9(seq id no:136)或aav9k449r(seq id no:9)的衍生物,其具有氨基酸588与589之间的氨基酸插入序列。这些氨基酸插入序列的非限制性实例包括tlavpfk(php.b;seq id no:1260)、svskpfl(php.b2;seq id no:1268)、ftlttpk(php.b3;seq id no:1269)、ytlsqgw(php.a;seq id no:1275)、qavrtsl(php.s;seq id no:1319)、lakerls(g2a3;seq id no:1320)、mnstknv(g2b4;seq id no:1321)、vsgghhs(g2b5;seq id no:1322)和/或dgtlavpfkaq(php.n;seq id no:1289)。
[0214]
在某些实施方案中,aav血清型可如jackson等人(frontiers in molecular neuroscience 9:154(2016))(其关于aav衣壳的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)中所述。
[0215]
在某些实施方案中,aav血清型为aav9(seq id no:135或136)。在某些实施方案中,aav血清型为具有肽插入物的aav9。
[0216]
在某些实施方案中,aav血清型为k449r aav9变体(seq id no:9)。aav9 k449r具有与野生型aav9相同的功能。在某些实施方案中,aav血清型为具有肽插入物的aav9 k449r。
[0217]
在某些实施方案中,aav血清型为php.b(例如wo2015038958中所述)。在某些实施方案中,相较于使用更广泛的启动子(即cba或cmv),aav血清型与突触蛋白启动子配对以增强神经元转导。
[0218]
在某些实施方案中,aav血清型为php.n(例如wo2017100671中所述)。
[0219]
在某些实施方案中,aav血清型为包含aavphp.n(php.n)肽或其变体的血清型。
[0220]
在某些实施方案中,aav血清型为包含aavphp.b(php.b)肽或其变体的血清型。
[0221]
在某些实施方案中,aav血清型为包含aavphp.a(php.a)肽或其变体的血清型。
[0222]
在某些实施方案中,aav血清型为包含php.s肽或其变体的血清型。
[0223]
在某些实施方案中,aav血清型为包含php.b2肽或其变体的血清型。
[0224]
在某些实施方案中,aav血清型为包含php.b3肽或其变体的血清型。
[0225]
在某些实施方案中,aav血清型为包含g2b4肽或其变体的血清型。
[0226]
在某些实施方案中,aav血清型为包含g2b5肽或其变体的血清型。
[0227]
在某些实施方案中,aav血清型为voy101或其变体。在某些实施方案中,voy101包含seq id no:1的氨基酸序列。在某些实施方案中,衣壳序列包含seq id no.:1722的核酸序列。
[0228]
在某些实施方案中,aav血清型为voy201或其变体。在某些实施方案中,voy201包含seq id no:1724的氨基酸序列。在某些实施方案中,衣壳序列包含seq id no:1723的核酸序列。
[0229]
在某些实施方案中,aav衣壳允许在静脉内施用之后穿透血脑屏障。此类aav衣壳的非限制性实例包括aav9、aav9 k449r、voy101、voy201或包含肽插入物的aav衣壳,例如但不限于:aavphp.n(php.n)、aavphp.b(php.b)、php.s、g2a3、g2b4、g2b5、g2a12、g2a15、php.b2、php.b3或aavphp.a(php.a)。
analysis for complete characterization of recombinant adeno
‑
associated virus capsid proteins.hum gene ther methods.2017年10月,28(5):255
‑
267;hwang等人,n
‑
terminal acetylation of cellular proteins creates specific degradation signals.science.2010年2月19日.327(5968):973
‑
977;其关于衣壳蛋白中的met/aa
‑
削减的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0235]
根据本公开,对衣壳蛋白的提及不限于经削减(met
‑
/aa
‑
)或未经削减(met /aa )序列,并且在上下文中可指独立衣壳蛋白、衣壳蛋白混合物包含的病毒衣壳和/或编码、描述、生产或获得本公开的衣壳蛋白的多核苷酸序列(或其片段)。直接提及“衣壳蛋白”或“衣壳多肽”(例如vp1、vp2或vp3)还可包含vp衣壳蛋白,其包含met1/aa1氨基酸(met /aa )以及由于met/aa
‑
削减(met
‑
/aa
‑
)而缺少met1/aa1氨基酸的相应vp衣壳蛋白。
[0236]
此外,根据本公开,提及分别包含或编码包含met1/aa1氨基酸(met /aa )的一种或多种衣壳蛋白的特定seq id no(无论蛋白质或核酸)应理解为在序列检查时教导缺乏met1/aa1氨基酸的vp衣壳蛋白,显而易见的是仅缺乏第一所列出的氨基酸(无论是否为甲硫氨酸)的任何序列。
[0237]
作为一个非限制性实例,提及长度为736个氨基酸并包含由aug/atg起始密码子编码的“met1”氨基酸(met )的vp1多肽序列还可理解为教导长度为735个氨基酸并且不包含736个氨基酸的met 序列的“met1”氨基酸(met
‑
)的vp1多肽序列。作为第二非限制性实例,提及长度为736个氨基酸并包含由任何nnn起始密码子编码的“aa1”氨基酸(aa1 )的vp1多肽序列还可理解为教导长度为735个氨基酸并且不包含736个氨基酸的aa1 序列的“aa1”氨基酸(aa1
‑
)的vp1多肽序列。
[0238]
提及由vp衣壳蛋白形成的病毒衣壳(例如提及特定aav衣壳血清型)可并有vp衣壳蛋白,所述vp衣壳蛋白包含met1/aa1氨基酸(met /aa1 )、由于met/aa1
‑
削减(met
‑
/aa1
‑
)而缺乏met1/aa1氨基酸的相应vp衣壳蛋白或其组合(met /aa1 与met
‑
/aa1
‑
)。
[0239]
作为一个非限制性实例,aav衣壳血清型可包含vp1(met /aa1 )、vp1(met
‑
/aa1
‑
)或vp1(met /aa1 )与vp1(met
‑
/aa1
‑
)的组合。aav衣壳血清型还可包含vp3(met /aa1 )、vp3(met
‑
/aa1
‑
)或vp3(met /aa1 )与vp3(met
‑
/aa1
‑
)的组合;并且还可包含vp2(met /aa1)与vp2(met
‑
/aa1
‑
)的类似任选的组合。
[0240]
有效负载
[0241]
本公开的aav颗粒可包含或使用包含至少一个有效负载区的至少一个有效负载构建体产生。在某些实施方案中,有效负载区可位于病毒基因组,例如有效负载构建体的病毒基因组内。在有效负载区的5'端和/或3'端处可存在至少一个反向末端重复序列(itr)。在有效负载区内,可存在启动子区、内含子区和编码区。
[0242]
在某些实施方案中,本公开的有效负载构建体可为杆粒(bacmid),也称为杆状病毒质粒或重组杆状病毒基因组。
[0243]
在某些实施方案中,aav颗粒的有效负载区包含编码所关注的多肽或蛋白质的一个或多个核酸序列。
[0244]
在某些实施方案中,aav颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组,所述有效负载区包含编码超过一种所关注多肽的核酸序列。在某些实施方案中,编码一种或多种多肽的病毒基因组可复制和包装至病毒颗粒中。用包含载体基因组的病毒颗粒转导的目标细胞可在
单一目标细胞中表达一个或多个多肽中的每一者。
[0245]
在aav颗粒有效负载区编码多肽的情况下,所述多肽可为肽、多肽或蛋白质。作为一个非限制性实例,有效负载区可编码至少一种所关注的治疗蛋白质。编码本文所述的多肽的aav病毒基因组可适用于人类疾病、病毒、感染兽医学应用的领域以及多种体内和体外环境中。
[0246]
在某些实施方案中,向受试者施用配制的aav颗粒(其包含病毒基因组)将增加受试者的蛋白质表达。在某些实施方案中,蛋白质的表达增加将减少与由有效负载编码的多肽相关的疾病或病痛的影响和/或症状。
[0247]
在某些实施方案中,aav颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组,所述有效负载区包含编码所关注的蛋白质(即有效负载蛋白质、治疗蛋白质)的核酸序列。
[0248]
在某些实施方案中,有效负载区包含编码蛋白质的核酸序列,所述蛋白质包括但不限于抗体、芳族l
‑
氨基酸脱羧酶(aadc)、apoe2、共济蛋白、运动神经元生存(smn)蛋白质、葡糖脑苷脂酶、n
‑
磺基葡糖胺磺基水解酶、n
‑
乙酰基
‑
α
‑
氨基葡糖苷酶、艾杜糖醛2
‑
硫酸酯酶、α
‑
l
‑
艾杜糖苷酶、棕榈酰基
‑
蛋白硫酯酶1、三肽基肽酶1、巴登氏病蛋白(battenin)、cln5、cln6(linclin)、mfsd8、cln8、天冬氨酸酰化酶(aspa)、颗粒蛋白前体(grn)、mecp2、β
‑
半乳糖苷酶(glb1)和/或巨轴索神经病蛋白(gigaxonin)(gan)。
[0249]
在某些实施方案中,aav颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组,所述有效负载区包含编码以下国际公开中的任一者所述的疾病相关蛋白质(和其片段或变体)中的任一者的核酸序列:wo2016073693、wo2017023724、wo2016077687、wo2016077689、wo2018204786、wo2017201258、wo2017201248、wo2018204803、wo2018204797、wo2017189959、wo2017189963、wo2017189964、wo2015191508、wo2016094783、wo20160137949、wo2017075335;其内容各自通过引用整体并入本文,只要它们不与本公开相冲突即可。
[0250]
由本公开的病毒基因组的有效负载区编码的氨基酸序列可翻译为整个多肽、多个多肽或多肽片段,其独立地可由一个或多个核酸、核酸片段或前述任一者的变体编码。如本文所用,“多肽
””
意指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然)的聚合物。如本文所用,所述术语是指具有任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。在一些情况下,编码多肽小于约50个氨基酸,并且所述多肽然后被称为肽。如果多肽为肽,则其长度将为至少约2、3、4或至少5个氨基酸残基。因此,多肽包含基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、以上各者的片段和其他等效物、变体和类似物。多肽可为单分子或者可为多分子复合物,例如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可包含单链或多链多肽,并且可为缔合的或连接的。术语多肽也可适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。
[0251]
在某些实施方案中,提供“多肽变体”。术语“多肽变体”是指其氨基酸序列与原生或参考序列不同的分子。与原生或参考序列相比,氨基酸序列变体可在氨基酸序列内某些位置处具有取代、缺失和/或插入。通常,变体将与原生或参考序列具有至少约50%同一性(同源性),并且在某些实施方案中,其将与原生或参考序列具有至少约80%或至少约90%同一性(同源性)。
[0252]
本公开包括使用配制的aav颗粒,所述aav颗粒的载体基因组编码作为治疗剂的调节多核苷酸,例如rna或dna分子。因此,本公开提供编码多核苷酸的载体基因组,将所述多
核苷酸处理成靶向所关注基因的小双链rna(dsrna)分子(小干扰rna、sirna、mirna、pre
‑
mirna)。本公开还提供了将其用于抑制所关注基因的等位基因的基因表达和蛋白质产生,以治疗疾病、病症和/或疾患的方法。
[0253]
在某些实施方案中,aav颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组,所述有效负载区包含编码或包含一种或多种调节多核苷酸的核酸序列。在某些实施方案中,aav颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组,所述有效负载区包含编码所关注的调节多核苷酸的核酸序列。在本公开的某些实施方案中,调节多核苷酸,例如rna或dna分子呈现为治疗剂。由rna干扰介导的基因沉默可特异性抑制靶向基因的表达。
[0254]
在某些实施方案中,有效负载区包含编码调节多核苷酸的核酸序列,所述调节多核苷酸干扰靶基因表达和/或靶蛋白产生。在某些实施方案中,待抑制/修饰的基因表达或蛋白质产生可包括但不限于超氧化歧化酶1(sod1)、染色体9开放阅读框72(c9orf72)、tar dna结合蛋白(tardbp)、ataxin
‑
3(atxn3)、亨廷顿蛋白(htt)、淀粉样蛋白前体蛋白(app)、载脂蛋白e(apoe)、微管相关蛋白质tau(mapt)、α
‑
突触核蛋白(snca)、电压闸控的钠通道α亚基9(scn9a)和/或电压闸控的钠通道α亚基10(scn10a)。
[0255]
在某些实施方案中,aav颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组,所述有效负载区包含编码以下国际公开中的任一者所述的调节多核苷酸、rnai分子、sirna分子、dsrna分子和/或rna双链体中的任一者的核酸序列:wo2016073693、wo2017023724、wo2016077687、wo2016077689、wo2018204786、wo2017201258、wo2017201248、wo2018204803、wo2018204797、wo2017189959、wo2017189963、wo2017189964、wo2015191508、wo2016094783、wo20160137949、wo2017075335;其内容各自通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0256]
在某些实施方案中,编码此类sirna分子或sirna分子的单链的核酸序列被插入腺相关病毒载体中并引入细胞中,特别是中枢神经系统中的细胞中。
[0257]
由于若干独特的特征,aav颗粒已被研究用于sirna递送。特征的非限制性实例包括(i)感染分裂和非分裂细胞的能力;(ii)广泛的感染性宿主范围,包含人类细胞;(iii)野生型aav尚未与任何疾病相关联并且尚未在感染细胞中表现出复制;(iv)缺乏针对载体的细胞介导的免疫反应和(v)宿主染色体中的非整合性质,由此降低长期表达的可能性。此外,用aav颗粒感染对改变细胞基因表达模式的影响极小(stilwell和samulski等人,biotechniques,2003,34,148)。
[0258]
在某些实施方案中,本公开的编码sirna双链体含有杂合在一起形成双链体结构的反义链和有义链,其中反义链与所关注的靶向基因的核酸序列互补,并且其中有义链与所关注的靶向基因的核酸序列同源。在其他方面,在每条链的3'端存在0、1或2个核苷酸突出端。
[0259]
本公开的配制的aav颗粒的有效负载可编码一种或多种试剂,其经受rna干扰(rnai)诱导的基因表达抑制。本文提供了靶向所关注基因的编码sirna双链体或编码dsrna(本文中统称为“sirna分子”)。例如编码sirna双链体、编码dsrna或编码sirna或dsrna前体的此类sirna分子可使细胞例如星形胶质细胞或微神经胶质细胞、皮质、海马、内嗅、丘脑、感觉或运动神经元中的基因表达减少或沉默。
[0260]
rnai(也称为转录后基因沉默(ptgs)、压制或共抑制)是转录后基因沉默过程,其
中rna分子以序列特异性方式抑制基因表达,通常通过破坏特异性mrna分子来进行。rnai的活性组分是短/小双链rna(dsrna),称为小干扰rna(sirna),其通常含有15
‑
30个核苷酸(例如19至25、19至24或19至21个核苷酸)和2个核苷酸3'突出端,并且其匹配靶基因的核酸序列。这些短rna物质可通过dicer介导切割较大dsrna而在体内天然产生,并且它们在哺乳动物细胞中起作用。
[0261]
天然表达的小rna分子,称为微rna(mirna),通过调控mrna的表达诱发基因沉默。含有rna引发的沉默复合物(risc)的mirna靶向呈递与mirna的5'区(其称为种子区)中的核苷酸2
‑
7完美序列互补和其3'区的其他碱基对的mrna。mirna介导的基因表达的下调可由目标mrna的切割、目标mrna的翻译抑制或mrna衰变引起。mirna靶向序列通常位于目标mrna的3'utr中。单个mirna可靶向超过100个来自各种基因的转录物,并且可通过不同mirna靶向一个mrna。
[0262]
靶向特异性mrna的sirna双链体或dsrna可被设计为aav颗粒的有效负载并引入至细胞中以用于激活rnai过程。elbashir等人证明,21
‑
核苷酸sirna双链体(称为小干扰rna)能够在哺乳动物细胞中实现有效且特异性的基因敲低而不诱导免疫反应(elbashir sm等人,nature,2001,411,494
‑
498)。自从这种初始报道以来,通过sirna进行的转录后基因沉默作为用于哺乳动物细胞中遗传分析的有效工具迅速出现,并且具有生产新颖治疗剂的潜力。
[0263]
sirna双链体包含与目标mrna同源的有义链和与目标mrna互补的反义链,在目标rna破坏效率方面提供与使用单链(ss)
‑
sirna(例如,反义链rna或反义寡核苷酸)相比多得多的优点。在许多情况下,需要较高浓度的ss
‑
sirna来实现相应双链体的有效基因沉默效能。
[0264]
在某些实施方案中,sirna分子可编码于还包含分子支架的调节多核苷酸中。如本文所用,“分子支架”是形成序列或结构性基础的框架或起始分子,在所述基础上设计或制成后续分子。
[0265]
在某些实施方案中,包含有效负载(例如,sirna、mirna或本文所述的其他rnai剂)的调节多核苷酸包含分子支架,所述分子支架包含前导5'侧翼序列,其可具有任何长度并且可完全或部分地源自野生型微rna序列或者完全为人工的。3'侧翼序列的大小和起点与5'侧翼序列成镜像。在某些实施方案中,5'和3'侧翼序列中的一者或两者不存在。
[0266]
在某些实施方案中,分子支架可包含一个或多个本领域已知的接头。接头可使各区域隔开或使一个分子支架与另一分子支架隔开。作为一个非限制性实例,分子支架可为多顺反子的。
[0267]
在某些实施方案中,使用以下特性中的至少一者设计调节多核苷酸:环变体、种子错配/凸出/摆动变体、茎错配、环变体和基部茎错配变体、种子错配和基部茎错配变体、茎错配和基部茎错配变体、种子摆动和基部茎摆动变体或茎序列变体。
[0268]
有效负载:多肽和变体
[0269]
在某些实施方案中,aav颗粒的有效负载区包含编码所关注的多肽或蛋白质的一个或多个核酸序列。
[0270]
在某些实施方案中,aav颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组,所述有效负载区包含编码超过一种所关注多肽的核酸序列。在某些实施方案中,编码一种或多种多肽的病
毒基因组可复制和包装至病毒颗粒中。用包含载体基因组的病毒颗粒转导的目标细胞可在单一目标细胞中表达一个或多个多肽中的每一者。
[0271]
在aav颗粒有效负载区编码多肽的情况下,所述多肽可为肽、多肽或蛋白质。作为一个非限制性实例,有效负载区可编码至少一种所关注的治疗蛋白质。编码本文所述的多肽的aav病毒基因组可适用于人类疾病、病毒、感染兽医学应用的领域以及多种体内和体外环境中。
[0272]
在某些实施方案中,向受试者施用配制的aav颗粒(其包含病毒基因组)将增加受试者的蛋白质表达。在某些实施方案中,蛋白质的表达增加将减少与由有效负载编码的多肽相关的疾病或病痛的影响和/或症状。
[0273]
在某些实施方案中,可使用本公开的配制aav颗粒来减小功能能力和日常生活活动的下降,如通过标准评估系统所测量,例如但不限于总功能能力(total functional capacity,tfc)量表。
[0274]
在某些实施方案中,aav颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组,所述有效负载区包含编码所关注的蛋白质(即有效负载蛋白质、治疗蛋白质)的核酸序列。
[0275]
在某些实施方案中,有效负载区包含编码蛋白质的核酸序列,所述蛋白质包括但不限于抗体、芳族l
‑
氨基酸脱羧酶(aadc)、apoe2、共济蛋白、运动神经元生存(smn)蛋白质、葡糖脑苷脂酶、n
‑
磺基葡糖胺磺基水解酶、n
‑
乙酰基
‑
α
‑
氨基葡糖苷酶、艾杜糖醛2
‑
硫酸酯酶、α
‑
l
‑
艾杜糖苷酶、棕榈酰基
‑
蛋白硫酯酶1、三肽基肽酶1、巴登氏病蛋白、cln5、cln6(linclin)、mfsd8、cln8、天冬氨酸酰化酶(aspa)、颗粒蛋白前体(grn)、mecp2、β
‑
半乳糖苷酶(glb1)和/或巨轴索神经病蛋白(gan)。
[0276]
在某些实施方案中,aav颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组,所述有效负载区包含编码aadc或本领域中已知用于治疗帕金森病的任何其他有效负载的核酸序列。作为一个非限制性实例,有效负载可包含例如以下的序列:nm_001082971.1(gi:132814447)、nm_000790.3(gi:132814459)、nm_001242886.1(gi:338968913)、nm_001242887.1(gi:338968916)、nm_001242888.1(gi:338968918)、nm_001242889.1(gi:338968920)、nm_001242890.1(gi:338968922)和其片段或变体。
[0277]
在某些实施方案中,aav颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组,所述有效负载区包含编码共济蛋白或本领域中已知用于治疗弗里德希氏共济失调的任何其他有效负载的核酸序列。作为一个非限制性实例,有效负载可包含例如以下的序列:nm_000144.4(gi:239787167)、nm_181425.2(gi:239787185)、nm_001161706.1(gi:239787197)和其片段或变体。
[0278]
在某些实施方案中,aav颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组,所述有效负载区包含编码smn或本领域中已知用于治疗脊髓性肌萎缩(sma)的任何其他有效负载的核酸序列。作为一个非限制性实例,有效负载可包含例如nm_001297715.1(gi:663070993)、nm_000344.3(gi:196115055)、nm_022874.2(gi:196115040)的序列和其片段或变体。
[0279]
在某些实施方案中,aav颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组,所述有效负载区包含编码美国专利公开第20180258424号中所述的疾病相关蛋白质(和其片段或变体)中的任一者的核酸序列;所述专利公开的内容通过引用整体并入本文。
[0280]
在某些实施方案中,aav颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组,所述有效负载区
包含编码以下国际公开中的任一者所述的任何疾病相关蛋白质(和其片段或变体)的核酸序列:wo2016073693、wo2017023724、wo2016077687、wo2016077689、wo2018204786、wo2017201258、wo2017201248、wo2018204803、wo2018204797、wo2017189959、wo2017189963、wo2017189964、wo2015191508、wo2016094783、wo20160137949、wo2017075335;所述国际公开的内容各自通过引用整体并入本文。
[0281]
在某些实施方案中,可使用本公开的配制aav颗粒改善任何用以测量神经退行性病症/疾病的症状的评估性能。此类评估包括但不限于阿尔茨海默病认知评估量表(alzheimer disease assessment scale
‑
cognitive,adas
‑
cog)、简易精神状态检查(mini
‑
mental state examination,mmse)、老人抑郁量表(geriatric depression scale,gds)、功能活动问卷(functional activities questionnaire,faq)、日常生活活动(activities of daily living,adl)、全科医师认知评估(general practitioner assessment of cognition,gpcog)、简易认知量表(mini
‑
cog)、简略心理测试评分(abbreviated mental test score,amts)、画钟测试(clock
‑
drawing test)、6项认知障碍测试(6
‑
item cognitive impairment test,6
‑
cit)、记忆力测试(test your memory,tym)、蒙特利尔认知评估(montreal cognitive assessment,moca)、阿登布鲁克斯认知评估(addenbrookes cognitive assessment,ace
‑
r)、记忆障碍筛检(memory impairment screen,mis)、布里斯托尔日常生活活动量表(bristol activities of daily living scale,badls)、巴式指数(barthel index)、功能独立性测量(functional independence measure)、工具性日常生活活动(instrumental activities of daily living)、老人认知减退知情者问卷(informant questionnaire on cognitive decline in the elderly,iqcode)、神经精神评估量表(neuropsychiatric inventory)、柯恩
‑
曼斯菲尔德激动情绪行为量表(the cohen
‑
mansfield agitation inventory)、behave
‑
ad、euroqol、简表
‑
36和/或mbr照顾者压力量表(caregiver strain instrument),或如sheehan b,ther adv neurol disord.5(6):349
‑
358(2012)中所述的其他测试中的任一者,其内容通过引用整体并入本文。
[0282]
在某些实施方案中,提供“变体模拟物”。如本文所用,术语“变体模拟物”是含有一个或多个模拟活化序列的氨基酸的模拟物。举例来说,谷氨酸可充当偶磷基
‑
苏氨酸和/或偶磷基
‑
丝氨酸的模拟物。或者,变体模拟物可引起失活或生产含有所述模拟物的不活化产物,例如苯丙氨酸可充当酪氨酸的失活性取代;或者丙氨酸可充当丝氨酸的非活化性取代。
[0283]
在某些实施方案中,提供“氨基酸序列变体”。术语“氨基酸序列变体”是指其氨基酸序列与原生或起始序列相比具有一些差异的分子。氨基酸序列变体可在氨基酸序列内某些位置处具有取代、缺失和/或插入。“原生”或“起始”序列不应与野生型序列混淆。如本文所用,原生或起始序列为相对术语,是指可以与之进行比较的原始分子。“原生”或“起始”序列或分子可表示野生型(在自然中所发现的序列)但不一定为野生型序列。
[0284]
通常,变体将与原生序列具有至少约70%同源性,并且在某些实施方案中,其将与原生序列至少约80%或至少约90%同源。在应用于氨基酸序列时,“同源性”定义为在比对序列并且视需要引入空位以实现最大同源性百分比之后,候选氨基酸序列中的残基与第二序列的氨基酸序列中的残基同一的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域中众所周知的。应理解,同源性取决于同一性百分比的计算,但其值可由于在计算中引入的空位和
罚分而不同。
[0285]
在应用于氨基酸序列时,“同源物”意指与第二物种的第二序列基本上同一的其他物种的相应序列。
[0286]“类似物”意指包含相差一个或多个氨基酸改变(例如氨基酸残基的取代、添加或缺失),仍维持亲本多肽的特性的多肽变体。
[0287]
可将序列标签或氨基酸,例如一个或多个赖氨酸,添加至本公开的肽序列中(例如在n末端或c末端处)。序列标签可用于肽纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽溶解性或允许生物素标记。或者,位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区域的氨基酸残基可任选地缺失,从而提供截短序列。或者可取决于序列的用途,例如序列表达为可溶的或与固体载体连接的较大序列的一部分,缺失某些氨基酸(例如,c末端或n末端残基)。
[0288]
在某些实施方案中,提供“取代型变体”。当提及蛋白质时,“取代型变体”是将原生或起始序列中的至少一个氨基酸残基去除并且将不同氨基酸代替其插入在同一位置处的那些蛋白质。取代可为单取代,其中分子中仅一个氨基酸被取代,或者其可为多取代,其中同一个分子中两个或更多个氨基酸被取代。
[0289]
如本文所用,术语“保守性氨基酸取代”是指用具有相似大小、电荷或极性的不同氨基酸取代通常存在于序列中的氨基酸。保守性取代的实例包括将例如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸的非极性(疏水性)残基取代为另一种非极性残基。同样地,保守性取代的实例包括将一个极性(亲水性)残基取代为例如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间和甘氨酸与丝氨酸之间的另一种残基。另外,将例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸的碱性残基取代为另一种碱性残基,或将例如天冬氨酸或谷氨酸的一种酸性残基取代为另一种酸性残基是保守性取代的额外实例。非保守性取代的实例包括将例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸的非极性(疏水性)氨基酸残基取代为例如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸的极性(亲水性)残基和/或将极性残基取代为非极性残基。
[0290]
在某些实施方案中,提供“插入型变体”。当提及蛋白质时,“插入型变体”是将一个或多个氨基酸紧邻插入原生或起始序列中特定位置处的氨基酸的蛋白质。“紧邻”于氨基酸意指连接至所述氨基酸的α
‑
羧基或α
‑
氨基官能团。
[0291]
在某些实施方案中,提供“缺失型变体”。当提及蛋白质时,“缺失型变体”是将原生或起始氨基酸序列中的一个或多个氨基酸去除的那些蛋白质。通常,缺失型变体将在分子的特定区域中缺失一个或多个氨基酸。
[0292]
如本文所用,术语“衍生物”与术语“变体”同义地使用,并且是指已相对于参考分子或起始分子以任何方式进行修饰或变化的分子。在某些实施方案中,衍生物包含已用有机蛋白质或非蛋白质衍生剂和翻译后修饰来进行修饰的原生或起始蛋白质。共价修饰在传统上通过使蛋白质的靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应,或通过利用在所选重组宿主细胞中起作用的翻译后修饰机制来进行引入。所得共价衍生物适用于旨在鉴定对以下各者至关重要的残基的程序:生物活性、免疫测定或用于重组糖蛋白的免疫亲和纯化的抗蛋白质抗体的制备。此类修饰在本领域普通技术人员的能力范围内,并且无需不正当实验即可进行。
[0293]
某些翻译后修饰由重组宿主细胞对所表达多肽的作用产生。常使谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基在翻译后脱除酰胺基,变成相应谷氨酰基和天冬氨酰基残基。或者,这些
残基在适度酸性条件下脱除酰胺基。任一形式的这些残基均可存在于根据本公开使用的蛋白质中。
[0294]
其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化;丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化;赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α
‑
氨基的甲基化(t.e.creighton,proteins:structure and molecular properties,w.h.freeman&co.,san francisco,第79
‑
86页(1983))。
[0295]
当提及蛋白质时,“特征”定义为分子中基于独特氨基酸序列的组分。本公开的蛋白质的特征包括表面表现、局部构象形状、折叠、环、半环、域、半域、位点、末端或其任何组合。
[0296]
如本文所用,当提及蛋白质时,术语“表面表现”是指出现在最外表面上的基于多肽的蛋白质组分。
[0297]
如本文所用,当提及蛋白质时,术语“局部构象形状”意指位于可限定的蛋白质空间内的基于多肽的蛋白质结构表现。
[0298]
如本文所用,在提及蛋白质时,术语“折叠”意指在能量最小化时所得的氨基酸序列的构象。折叠可出现于折叠过程的二级或三级水平时。二级水平折叠的实例包括β折叠和α螺旋。三级折叠的实例包括由于高能力的聚集或分离而形成的域和区域。以这种方式形成的区域包含疏水性和亲水性袋等。
[0299]
如本文所用,在与蛋白质构象相关时,术语“转角”意指改变肽或多肽的骨架方向并且可涉及一个、两个、三个或更多个氨基酸残基的弯曲。
[0300]
如本文所用,当提及蛋白质时,术语“环”是指使肽或多肽的骨架方向反转并且包含四个或更多个氨基酸残基的肽或多肽结构特征。oliva等人已鉴定至少5类蛋白质环(j.mol biol 266(4):814
‑
830;1997)。
[0301]
如本文所用,当提及蛋白质时,术语“半环”是指所鉴定环的一部分,具有衍生出所述部分的环的至少半数氨基酸残基。应理解,环可能并非始终含有偶数个氨基酸残基。因此,在其中环含有或鉴定为包含奇数个氨基酸的那些情况下,奇数编号环的半环将包含所述环的整数部分或下一整数部分(环的氨基酸数目/2 /
‑
0.5个氨基酸)。举例来说,被鉴定为7个氨基酸环的环可产生3个氨基酸或4个氨基酸的半环(7/2=3.5 /
‑
0.5为3或4)。
[0302]
如本文所用,当提及蛋白质时,术语“域”是指具有一种或多种可鉴定的结构或功能特征或特性(例如,结合能力、作为蛋白质
‑
蛋白质相互作用位点)的多肽的基序。
[0303]
如本文所用,当提及蛋白质时,术语“半域”意指所鉴定域的一部分,具有衍生出所述部分的域的至少半数氨基酸残基。应理解,域可能并非始终含有偶数个氨基酸残基。因此,在其中域含有或鉴定为包含奇数个氨基酸的那些情况下,奇数编号域的半域将包含所述域的整数部分或下一个整数部分(域的氨基酸数目/2 /
‑
0.5个氨基酸)。举例来说,被鉴定为7个氨基酸域的域可产生3个氨基酸或4个氨基酸的半域(7/2=3.5 /
‑
0.5为3或4)。还应理解,可在域或半域内鉴定子域,这些子域并不完全具有其所来源的域或半域中所鉴定的全部结构或功能特性。还应理解,包含本文中的任一域类型的氨基酸不必沿着多肽骨架连续(即非相邻氨基酸可能在结构上折叠以产生域、半域或子域)。
[0304]
如本文所用,当提及蛋白质时,术语“位点”在涉及基于氨基酸的实施方案中,可与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”同义使用。位点表示可在本公开的基于多肽的分子内进行修
mrna以干扰htt的基因表达和/或蛋白质产生。本公开还提供了其用于抑制htt的等位基因的基因表达和蛋白质产生以治疗亨廷顿病(hd)的方法。在某些实施方案中,本公开的sirna双链体可靶向沿着个别核苷酸序列的任何区段的htt。在某些实施方案中,本公开的sirna双链体可靶向snp的位置处的htt或核苷酸序列内的变体。
[0315]
在某些实施方案中,aav颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组,所述有效负载区包含编码以下国际公开中的任一者所述的任何调节多核苷酸、rnai分子、sirna分子、dsrna分子和/或rna双链体的核酸序列:wo2016073693、wo2017023724、wo2016077687、wo2016077689、wo2018204786、wo2017201258、wo2017201248、wo2018204803、wo2018204797、wo2017189959、wo2017189963、wo2017189964、wo2015191508、wo2016094783、wo20160137949、wo2017075335;其内容各自通过引用整体并入本文。
[0316]
在某些实施方案中,编码此类sirna分子或sirna分子的单链的核酸序列被插入腺相关病毒载体中并引入细胞中,特别是中枢神经系统中的细胞中。
[0317]
由于若干独特的特征,aav颗粒已被研究用于sirna递送。特征的非限制性实例包括(i)感染分裂和非分裂细胞的能力;(ii)广泛的感染性宿主范围,包含人类细胞;(iii)野生型aav尚未与任何疾病相关联并且尚未在感染细胞中表现出复制;(iv)缺乏针对载体的细胞介导的免疫反应和(v)宿主染色体中的非整合性质,由此降低长期表达的可能性。此外,用aav颗粒感染对改变细胞基因表达模式的影响极小(stilwell和samulski等人,biotechniques,2003,34,148)。
[0318]
在某些实施方案中,本公开的编码sirna双链体含有杂合在一起形成双链体结构的反义链和有义链,其中反义链与所关注的靶向基因的核酸序列互补,并且其中有义链与所关注的靶向基因的核酸序列同源。在其他方面,在每条链的3'端存在0、1或2个核苷酸突出端。
[0319]
根据本公开,靶向所关注基因的sirna双链体的每条链的长度为约19至25、19至24或19至21个核苷酸,例如长度为约19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸或25个核苷酸。
[0320]
在某些实施方案中,sirna或dsrna包含至少两个彼此互补的序列。dsrna包含具有第一序列的有义链和具有第二序列的反义链。反义链包含基本上与编码所关注基因的mrna的至少一部分互补的核苷酸序列,并且互补区的长度为30个或更少个核苷酸,和至少15个核苷酸。一般来说,dsrna的长度为19至25、19至24或19至21个核苷酸。在某些实施方案中,dsrna的长度为约15至约25个核苷酸,并且在其他实施方案中,dsrna的长度为约25至约30个核苷酸。
[0321]
当通过本领域中已知的方法或如本文所述的方法测定时,在表达载体中编码的dsrna与由所关注基因编码的表达蛋白质的细胞接触后,抑制由所关注基因编码的蛋白质的表达至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或更高。
[0322]
根据本公开,生产配制aav颗粒,其包含sirna双链体、sirna双链体的一个链或靶向所关注基因的dsrna的核酸,aav颗粒血清型可为php.b、php.a、g2b
‑
26、g2b
‑
13、th1.1
‑
32、th1.1
‑
35、aav1、aav2、aav2g9、aav3、aav3a、aav3b、aav3
‑
3、aav4、aav4
‑
4、aav5、aav6、aav6.1、aav6.2、aav6.1.2、aav7、aav7.2、aav8、aav9、aav9.11、aav9.13、aav9.16、aav9.24、
aav9.45、aav9.47、aav9.61、aav9.68、aav9.84、aav9.9、aav10、aav11、aav12、aav16.3、aav24.1、aav27.3、aav42.12、aav42
‑
1b、aav42
‑
2、aav42
‑
3a、aav42
‑
3b、aav42
‑
4、aav42
‑
5a、aav42
‑
5b、aav42
‑
6b、aav42
‑
8、aav42
‑
10、aav42
‑
11、aav42
‑
12、aav42
‑
13、aav42
‑
15、aav42
‑
aa、aav43
‑
1、aav43
‑
12、aav43
‑
20、aav43
‑
21、aav43
‑
23、aav43
‑
25、aav43
‑
5、aav44.1、aav44.2、aav44.5、aav223.1、aav223.2、aav223.4、aav223.5、aav223.6、aav223.7、aav1
‑
7/rh.48、aav1
‑
8/rh.49、aav2
‑
15/rh.62、aav2
‑
3/rh.61、aav2
‑
4/rh.50、aav2
‑
5/rh.51、aav3.1/hu.6、aav3.1/hu.9、aav3
‑
9/rh.52、aav3
‑
11/rh.53、aav4
‑
8/r11.64、aav4
‑
9/rh.54、aav4
‑
19/rh.55、aav5
‑
3/rh.57、aav5
‑
22/rh.58、aav7.3/hu.7、aav16.8/hu.10、aav16.12/hu.11、aav29.3/bb.1、aav29.5/bb.2、aav106.1/hu.37、aav114.3/hu.40、aav127.2/hu.41、aav127.5/hu.42、aav128.3/hu.44、aav130.4/hu.48、aav145.1/hu.53、aav145.5/hu.54、aav145.6/hu.55、aav161.10/hu.60、aav161.6/hu.61、aav33.12/hu.17、aav33.4/hu.15、aav33.8/hu.16、aav52/hu.19、aav52.1/hu.20、aav58.2/hu.25、aava3.3、aava3.4、aava3.5、aava3.7、aavc1、aavc2、aavc5、aav
‑
dj、aav
‑
dj8、aavf3、aavf5、aavh2、aavrh.72、aavhu.8、aavrh.68、aavrh.70、aavpi.1、aavpi.3、aavpi.2、aavrh.60、aavrh.44、aavrh.65、aavrh.55、aavrh.47、aavrh.69、aavrh.45、aavrh.59、aavhu.12、aavh6、aavlk03、aavh
‑
1/hu.1、aavh
‑
5/hu.3、aavlg
‑
10/rh.40、aavlg
‑
4/rh.38、aavlg
‑
9/hu.39、aavn721
‑
8/rh.43、aavch.5、aavch.5r1、aavcy.2、aavcy.3、aavcy.4、aavcy.5、aavcy.5r1、aavcy.5r2、aavcy.5r3、aavcy.5r4、aavcy.6、aavhu.1、aavhu.2、aavhu.3、aavhu.4、aavhu.5、aavhu.6、aavhu.7、aavhu.9、aavhu.10、aavhu.11、aavhu.13、aavhu.15、aavhu.16、aavhu.17、aavhu.18、aavhu.20、aavhu.21、aavhu.22、aavhu.23.2、aavhu.24、aavhu.25、aavhu.27、aavhu.28、aavhu.29、aavhu.29r、aavhu.31、aavhu.32、aavhu.34、aavhu.35、aavhu.37、aavhu.39、aavhu.40、aavhu.41、aavhu.42、aavhu.43、aavhu.44、aavhu.44r1、aavhu.44r2、aavhu.44r3、aavhu.45、aavhu.46、aavhu.47、aavhu.48、aavhu.48r1、aavhu.48r2、aavhu.48r3、aavhu.49、aavhu.51、aavhu.52、aavhu.54、aavhu.55、aavhu.56、aavhu.57、aavhu.58、aavhu.60、aavhu.61、aavhu.63、aavhu.64、aavhu.66、aavhu.67、aavhu.14/9、aavhu.t19、aavrh.2、aavrh.2r、aavrh.8、aavrh.8r、aavrh.10、aavrh.12、aavrh.13、aavrh.13r、aavrh.14、aavrh.17、aavrh.18、aavrh.19、aavrh.20、aavrh.21、aavrh.22、aavrh.23、aavrh.24、aavrh.25、aavrh.31、aavrh.32、aavrh.33、aavrh.34、aavrh.35、aavrh.36、aavrh.37、aavrh.37r2、aavrh.38、aavrh.39、aavrh.40、aavrh.46、aavrh.48、aavrh.48.1、aavrh.48.1.2、aavrh.48.2、aavrh.49、aavrh.51、aavrh.52、aavrh.53、aavrh.54、aavrh.56、aavrh.57、aavrh.58、aavrh.61、aavrh.64、aavrh.64r1、aavrh.64r2、aavrh.67、aavrh.73、aavrh.74、aavrh8r、aavrh8ra586r突变体、aavrh8r r533a突变体、aaav、baav、山羊aav、牛aav、绵羊aav、aavhe1.1、aavher1.5、aavher1.14、aavher1.8、aavher1.16、aavher1.18、aavher1.35、aavher1.7、aavher1.36、aavher2.29、aavher2.4、aavher2.16、aavher2.30、aavher2.31、aavher2.36、aavher1.23、aavher3.1、aav2.5t、aav
‑
paec、aav
‑
lk01、aav
‑
lk02、aav
‑
lk03、aav
‑
lk04、aav
‑
lk05、aav
‑
lk06、aav
‑
lk07、aav
‑
lk08、aav
‑
lk09、aav
‑
lk10、aav
‑
lk11、aav
‑
lk12、aav
‑
lk13、aav
‑
lk14、aav
‑
lk15、aav
‑
lk16、aav
‑
lk17、aav
‑
lk18、aav
‑
lk19、aav
‑
paec2、aav
‑
paec4、aav
‑
paec6、aav
‑
paec7、aav
‑
paec8、aav
‑
paec11、aav
‑
paec12、aav
‑2‑
pre
‑
mirna
‑
101、aav
‑
8h、aav
‑
8b、aav
‑
h、aav
‑
b、aav sm 10
‑
2、
aav改组100
‑
1、aav改组100
‑
3、aav改组100
‑
7、aav改组10
‑
2、aav改组10
‑
6、aav改组10
‑
8、aav改组100
‑
2、aav sm 10
‑
1、aav sm 10
‑
8、aav sm 100
‑
3、aav sm 100
‑
10、bnp61 aav、bnp62 aav、bnp63 aav、aavrh.50、aavrh.43、aavrh.62、aavrh.48、aavhu.19、aavhu.11、aavhu.53、aav4
‑
8/rh.64、aavlg
‑
9/hu.39、aav54.5/hu.23、aav54.2/hu.22、aav54.7/hu.24、aav54.1/hu.21、aav54.4r/hu.27、aav46.2/hu.28、aav46.6/hu.29、aav128.1/hu.43、真型aav(ttaav)、upenn aav 10、日本aav 10血清型、aav cbr
‑
7.1、aav cbr
‑
7.10、aav cbr
‑
7.2、aav cbr
‑
7.3、aav cbr
‑
7.4、aav cbr
‑
7.5、aav cbr
‑
7.7、aav cbr
‑
7.8、aav cbr
‑
b7.3、aav cbr
‑
b7.4、aav cbr
‑
e1、aav cbr
‑
e2、aav cbr
‑
e3、aav cbr
‑
e4、aav cbr
‑
e5、aav cbr
‑
e5、aav cbr
‑
e6、aav cbr
‑
e7、aav cbr
‑
e8、aav cht
‑
1、aav cht
‑
2、aav cht
‑
3、aav cht
‑
6.1、aav cht
‑
6.10、aav cht
‑
6.5、aav cht
‑
6.6、aav cht
‑
6.7、aav cht
‑
6.8、aav cht
‑
p1、aav cht
‑
p2、aav cht
‑
p5、aav cht
‑
p6、aav cht
‑
p8、aav cht
‑
p9、aav ckd
‑
1、aav ckd
‑
10、aav ckd
‑
2、aav ckd
‑
3、aav ckd
‑
4、aav ckd
‑
6、aav ckd
‑
7、aav ckd
‑
8、aav ckd
‑
b1、aav ckd
‑
b2、aav ckd
‑
b3、aav ckd
‑
b4、aav ckd
‑
b5、aav ckd
‑
b6、aav ckd
‑
b7、aav ckd
‑
b8、aav ckd
‑
h1、aav ckd
‑
h2、aav ckd
‑
h3、aav ckd
‑
h4、aav ckd
‑
h5、aav ckd
‑
h6、aav ckd
‑
n3、aav ckd
‑
n4、aav ckd
‑
n9、aav clg
‑
f1、aav clg
‑
f2、aav clg
‑
f3、aav clg
‑
f4、aav clg
‑
f5、aav clg
‑
f6、aav clg
‑
f7、aav clg
‑
f8、aav clv
‑
1、aav clv1
‑
1、aav clv1
‑
10、aav clv1
‑
2、aav clv
‑
12、aav clv1
‑
3、aav clv
‑
13、aav clv1
‑
4、aav clv1
‑
7、aav clv1
‑
8、aav clv1
‑
9、aav clv
‑
2、aav clv
‑
3、aav clv
‑
4、aav clv
‑
6、aav clv
‑
8、aav clv
‑
d1、aav clv
‑
d2、aav clv
‑
d3、aav clv
‑
d4、aav clv
‑
d5、aav clv
‑
d6、aav clv
‑
d7、aav clv
‑
d8、aav clv
‑
e1、aav clv
‑
k1、aav clv
‑
k3、aav clv
‑
k6、aav clv
‑
l4、aav clv
‑
l5、aav clv
‑
l6、aav clv
‑
m1、aav clv
‑
m11、aav clv
‑
m2、aav clv
‑
m5、aav clv
‑
m6、aav clv
‑
m7、aav clv
‑
m8、aav clv
‑
m9、aav clv
‑
r1、aav clv
‑
r2、aav clv
‑
r3、aav clv
‑
r4、aav clv
‑
r5、aav clv
‑
r6、aav clv
‑
r7、aav clv
‑
r8、aav clv
‑
r9、aav csp
‑
1、aav csp
‑
10、aav csp
‑
11、aav csp
‑
2、aav csp
‑
3、aav csp
‑
4、aav csp
‑
6、aav csp
‑
7、aav csp
‑
8、aav csp
‑
8.10、aav csp
‑
8.2、aav csp
‑
8.4、aav csp
‑
8.5、aav csp
‑
8.6、aav csp
‑
8.7、aav csp
‑
8.8、aav csp
‑
8.9、aav csp
‑
9、aav.hu.48r3、aav.vr
‑
355、aav3b、aav4、aav5、aavf1/hsc1、aavf11/hsc11、aavf12/hsc12、aavf13/hsc13、aavf14/hsc14、aavf15/hsc15、aavf16/hsc16、aavf17/hsc17、aavf2/hsc2、aavf3/hsc3、aavf4/hsc4、aavf5/hsc5、aavf6/hsc6、aavf7/hsc7、aavf8/hsc8和/或aavf9/hsc9和其变体。
[0323]
根据本公开,设计sirna分子并测试其降低培养细胞的mrna水平的能力。
[0324]
在某些实施方案中,设计sirna分子并测试其降低培养细胞中所关注的基因水平的能力。
[0325]
本公开还提供了药物组合物,其包含靶向所关注基因的至少一种sirna双链体和药学上可接受的载体。在一些方面,sirna双链体由aav颗粒中的载体基因组编码。
[0326]
在某些实施方案中,本公开提供了用于抑制/沉默基因在细胞中表达的方法。在一些方面,基因表达的抑制是指抑制至少约20%,例如至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%和100%,或至少20
‑
30%、20
‑
40%、20
‑
50%、20
‑
60%、20
‑
70%、20
‑
80%、20
‑
90%、20
‑
95%、20
‑
100%、30
‑
40%、35
‑
40%、30
‑
50%、30
‑
60%、30
‑
70%、30
‑
80%、30
‑
90%、30
‑
95%、30
‑
100%、40
‑
50%、40
‑
60%、40
‑
70%、40
‑
80%、40
‑
90%、40
‑
95%、40
‑
100%、50
‑
60%、50
‑
70%、50
‑
80%、50
‑
90%、50
‑
95%、50
‑
100%、60
‑
70%、60
‑
80%、60
‑
90%、60
‑
95%、60
‑
100%、70
‑
80%、70
‑
90%、70
‑
95%、70
‑
100%、80
‑
90%、80
‑
95%、80
‑
100%、90
‑
95%、90
‑
100%或95
‑
100%。因此,可使靶向基因的蛋白质产物抑制至少约20%,例如至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%和100%,或至少20
‑
30%、20
‑
40%、20
‑
50%、20
‑
60%、20
‑
70%、20
‑
80%、20
‑
90%、20
‑
95%、20
‑
100%、30
‑
40%、30
‑
50%、30
‑
60%、30
‑
70%、30
‑
80%、30
‑
90%、30
‑
95%、30
‑
100%、40
‑
50%、40
‑
60%、40
‑
70%、40
‑
80%、40
‑
90%、40
‑
95%、40
‑
100%、50
‑
60%、50
‑
70%、50
‑
80%、50
‑
90%、50
‑
95%、50
‑
100%、60
‑
70%、60
‑
80%、60
‑
90%、60
‑
95%、60
‑
100%、70
‑
80%、70
‑
90%、70
‑
95%、70
‑
100%、80
‑
90%、80
‑
95%、80
‑
100%、90
‑
95%、90
‑
100%或95
‑
100%。
[0327]
在某些实施方案中,编码的sirna双链体可用于使由所关注基因编码的蛋白质的表达降低至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%和100%,或至少20
‑
30%、20
‑
40%、20
‑
50%、20
‑
60%、20
‑
70%、20
‑
80%、20
‑
90%、20
‑
95%、20
‑
100%、30
‑
40%、35
‑
40%、30
‑
50%、30
‑
60%、30
‑
70%、30
‑
80%、30
‑
90%、30
‑
95%、30
‑
100%、40
‑
50%、40
‑
60%、40
‑
70%、40
‑
80%、40
‑
90%、40
‑
95%、40
‑
100%、50
‑
60%、50
‑
70%、50
‑
80%、50
‑
90%、50
‑
95%、50
‑
100%、60
‑
70%、60
‑
80%、60
‑
90%、60
‑
95%、60
‑
100%、70
‑
80%、70
‑
90%、70
‑
95%、70
‑
100%、80
‑
90%、80
‑
95%、80
‑
100%、90
‑
95%、90
‑
100%或95
‑
100%。作为一个非限制性实例,蛋白质的表达可降低50
‑
90%。作为一个非限制性实例,蛋白质的表达可降低30
‑
70%。作为一个非限制性实例,蛋白质的表达可降低40
‑
70%。
[0328]
在某些实施方案中,编码的sirna双链体可用于使转录自所关注基因的mrna的表达降低至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%和100%,或至少20
‑
30%、20
‑
40%、20
‑
50%、20
‑
60%、20
‑
70%、20
‑
80%、20
‑
90%、20
‑
95%、20
‑
100%、30
‑
40%、35
‑
40%、30
‑
50%、30
‑
60%、30
‑
70%、30
‑
80%、30
‑
90%、30
‑
95%、30
‑
100%、40
‑
50%、40
‑
60%、40
‑
70%、40
‑
80%、40
‑
90%、40
‑
95%、40
‑
100%、50
‑
60%、50
‑
70%、50
‑
80%、50
‑
90%、50
‑
95%、50
‑
100%、60
‑
70%、60
‑
80%、60
‑
90%、60
‑
95%、60
‑
100%、70
‑
80%、70
‑
90%、70
‑
95%、70
‑
100%、80
‑
90%、80
‑
95%、80
‑
100%、90
‑
95%、90
‑
100%或95
‑
100%。作为一个非限制性实例,mrna表达的表达可降低50
‑
90%。
[0329]
在某些实施方案中,编码的sirna双链体可用于降低cns的至少一个区域中的由所关注基因和/或转录mrna编码的蛋白质的表达。使cns的至少一个区域中的蛋白质和/或mrna的表达降低至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%和100%,或至少20
‑
30%、20
‑
40%、20
‑
50%、20
‑
60%、20
‑
70%、20
‑
80%、20
‑
90%、20
‑
95%、20
‑
100%、30
‑
40%、35
‑
40%、30
‑
50%、30
‑
60%、30
‑
70%、30
‑
80%、30
‑
90%、30
‑
95%、30
‑
100%、40
‑
50%、40
‑
60%、40
‑
70%、40
‑
80%、40
‑
90%、40
‑
95%、40
‑
100%、50
‑
60%、50
‑
70%、50
‑
80%、50
‑
90%、50
‑
95%、50
‑
100%、60
‑
70%、60
‑
80%、60
‑
90%、60
‑
95%、60
‑
100%、70
‑
80%、70
‑
90%、70
‑
95%、70
‑
100%、80
‑
90%、80
‑
95%、80
‑
100%、90
‑
95%、90
‑
100%或95
‑
100%。作为一个非限制性实例,区域为神经元(例如,皮质神经元)。
[0330]
在某些实施方案中,可将包含此类编码sirna分子的配制aav颗粒直接引入受试者的中枢神经系统中,例如通过输注至壳核中。
[0331]
在某些实施方案中,可将包含此类编码sirna分子的配制aav颗粒直接引入受试者的中枢神经系统中,例如通过输注至受试者的丘脑中。
[0332]
在某些实施方案中,可将包含此类编码sirna分子的配制aav颗粒直接引入受试者的中枢神经系统中,例如通过输注至受试者的白质中。
[0333]
在某些实施方案中,可将包含此类编码sirna分子的配制aav颗粒直接引入受试者的中枢神经系统中,例如通过向受试者静脉内施用。
[0334]
在某些实施方案中,本公开的药物组合物用作单独疗法。在某些实施方案中,本公开的药物组合物用于组合疗法中。组合疗法可与已针对其对运动神经元退化的神经保护作用进行测试的一种或多种神经保护剂组合,所述神经保护剂例如小分子化合物、生长因子和激素。
[0335]
sirna分子
[0336]
本公开的配制aav颗粒的有效负载可编码一种或多种试剂,其经受rna干扰(rnai)诱导的基因表达抑制。本文提供了靶向所关注基因的编码sirna双链体或编码dsrna(本文中统称为“sirna分子”)。例如编码sirna双链体、编码dsrna或编码sirna或dsrna前体的此类sirna分子可使细胞例如星形胶质细胞或微神经胶质细胞、皮质、海马、内嗅、丘脑、感觉或运动神经元中的基因表达减少或沉默。
[0337]
rnai(也称为转录后基因沉默(ptgs)、压制或共抑制)是转录后基因沉默过程,其中rna分子以序列特异性方式抑制基因表达,通常通过破坏特异性mrna分子来进行。rnai的活性组分是短/小双链rna(dsrna),称为小干扰rna(sirna),其通常含有15
‑
30个核苷酸(例如19至25、19至24或19至21个核苷酸)和2个核苷酸3'突出端,并且其匹配目标基因的核酸序列。这些短rna物质可通过dicer介导切割较大dsrna而在体内天然产生,并且其在哺乳动物细胞中起作用。
[0338]
天然表达的小rna分子,称为微rna(mirna),通过调控mrna的表达诱发基因沉默。含有rna引发的沉默复合物(risc)的mirna靶向呈递与mirna的5'区(其称为种子区)中的核苷酸2
‑
7完美序列互补和其3'区的其他碱基对的mrna。mirna介导的基因表达的下调可由目标mrna的切割、目标mrna的翻译抑制或mrna衰变引起。mirna靶向序列通常位于目标mrna的3'utr中。单个mirna可靶向超过100个来自各种基因的转录物,并且可通过不同mirna靶向一个mrna。
[0339]
靶向特异性mrna的sirna双链体或dsrna可被设计为aav颗粒的有效负载并引入至细胞中以用于激活rnai过程。elbashir等人证明,21
‑
核苷酸sirna双链体(称为小干扰rna)能够在哺乳动物细胞中实现有效且特异性的基因敲低而不诱导免疫反应(elbashir sm等人,nature,2001,411,494
‑
498)。自从这种初始报道以来,通过sirna进行的转录后基因沉默作为用于哺乳动物细胞中遗传分析的有效工具迅速出现,并且具有生产新颖治疗剂的潜力。
[0340]
sirna双链体包含与目标mrna同源的有义链和与目标mrna互补的反义链,在目标rna破坏效率方面提供与使用单链(ss)
‑
sirna(例如,反义链rna或反义寡核苷酸)相比多得多的优点。在许多情况下,需要较高浓度的ss
‑
sirna来实现相应双链体的有效基因沉默效能。
[0341]
前述分子中的任一者可由aav颗粒或载体基因组编码。
[0342]
靶向所关注基因的sirna双链体的设计和序列
[0343]
已在本领域中提出用于设计例如本文中编码为载体基因组中的有效负载的sirna
的一些准则。这些准则通常建议产生靶向待沉默基因中的区域的19
‑
核苷酸双链体区域、对称的2
‑
3核苷酸3'突出端、5
‑
磷酸酯基和3
‑
羟基。可控管sirna序列偏好的其他规则包括但不限于:(i)反义链的5'端处的a/u;(ii)有义链的5'端处的g/c;(iii)反义链的5'末端三分之一处的至少五个a/u残基;和(iv)不存在长度超过9个核苷酸的任何gc延伸部分。根据这种考虑因素,连同目标基因的特定序列,可容易地设计抑制哺乳动物目标基因表达所必需的高效sirna分子。
[0344]
在某些实施方案中,本公开的sirna分子包含有义链和互补反义链,其中两条链杂交在一起以形成双链体结构。反义链与mrna序列具有足够的互补性以引导目标特异性rnai,即sirna分子具有足以通过rnai机制或过程触发对目标mrna破坏的序列。
[0345]
在某些实施方案中,反义链与目标mrna序列具有100%互补性。反义链可与目标mrna序列的任何部分互补。
[0346]
在某些实施方案中,反义链与目标mrna序列包含至少一个错配。作为一个非限制性实例,反义链和目标mrna序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,或至少20
‑
30%、20
‑
40%、20
‑
50%、20
‑
60%、20
‑
70%、20
‑
80%、20
‑
90%、20
‑
95%、20
‑
99%、30
‑
40%、30
‑
50%、30
‑
60%、30
‑
70%、30
‑
80%、30
‑
90%、30
‑
95%、30
‑
99%、40
‑
50%、40
‑
60%、40
‑
70%、40
‑
80%、40
‑
90%、40
‑
95%、40
‑
99%、50
‑
60%、50
‑
70%、50
‑
80%、50
‑
90%、50
‑
95%、50
‑
99%、60
‑
70%、60
‑
80%、60
‑
90%、60
‑
95%、60
‑
99%、70
‑
80%、70
‑
90%、70
‑
95%、70
‑
99%、80
‑
90%、80
‑
95%、80
‑
99%、90
‑
95%、90
‑
99%或95
‑
99%互补。
[0347]
根据本公开,编码sirna分子的长度为约10
‑
50个或更多个核苷酸,即每条链包含10
‑
50个核苷酸(或核苷酸类似物)。在某些实施方案中,在每条链中sirna分子的长度为约15
‑
30个,例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸,其中每条链中的一者与目标区域充分互补。在某些实施方案中,编码sirna分子的长度为约19至25、19至24或19至21个核苷酸。
[0348]
在某些实施方案中,本公开的编码sirna分子可包含所关注基因的核苷酸序列(例如有义或随从序列)的区域或对其进行编码。作为一个非限制性实例,用于本公开的sirna分子的有义序列与所关注基因或编码所关注基因的核苷酸序列的一部分具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,或至少20
‑
30%、20
‑
40%、20
‑
50%、20
‑
60%、20
‑
70%、20
‑
80%、20
‑
90%、20
‑
95%、20
‑
99%、30
‑
40%、30
‑
50%、30
‑
60%、30
‑
70%、30
‑
80%、30
‑
90%、30
‑
95%、30
‑
99%、40
‑
50%、40
‑
60%、40
‑
70%、40
‑
80%、40
‑
90%、40
‑
95%、40
‑
99%、50
‑
60%、50
‑
70%、50
‑
80%、50
‑
90%、50
‑
95%、50
‑
99%、60
‑
70%、60
‑
80%、60
‑
90%、60
‑
95%、60
‑
99%、70
‑
80%、70
‑
90%、70
‑
95%、70
‑
99%、80
‑
90%、80
‑
95%、80
‑
99%、90
‑
95%90
‑
99%或95
‑
99%的同一性。作为另一个非限制性实例,用于本公开的sirna分子的有义序列包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或超过21个所关注基因或编码所关注基因的核苷酸序列的连续核苷酸。
[0349]
在某些实施方案中,本公开的编码sirna分子可包含所关注基因或编码所关注基因的核苷酸序列(例如,反义或引导序列)的区域,例如但不限于至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或超过21个核苷酸,所述核苷酸与所关注基因的核苷
酸序列或其片段或变体反向互补。作为一个非限制性实例,用于本公开的编码sirna分子的反义序列与所关注基因或编码所关注基因的核苷酸序列的一部分至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,或至少20
‑
30%、20
‑
40%、20
‑
50%、20
‑
60%、20
‑
70%、20
‑
80%、20
‑
90%、20
‑
95%、20
‑
99%、30
‑
40%、30
‑
50%、30
‑
60%、30
‑
70%、30
‑
80%、30
‑
90%、30
‑
95%、30
‑
99%、40
‑
50%、40
‑
60%、40
‑
70%、40
‑
80%、40
‑
90%、40
‑
95%、40
‑
99%、50
‑
60%、50
‑
70%、50
‑
80%、50
‑
90%、50
‑
95%、50
‑
99%、60
‑
70%、60
‑
80%、60
‑
90%、60
‑
95%、60
‑
99%、70
‑
80%、70
‑
90%、70
‑
95%、70
‑
99%、80
‑
90%、80
‑
95%、80
‑
99%、90
‑
95%、90
‑
99%或95
‑
99%反向互补。作为另一个非限制性实例,用于本公开的sirna分子的反义序列包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或超过21个连续核苷酸,所述核苷酸与所关注基因或编码所关注基因的核苷酸序列反向互补。
[0350]
在某些实施方案中,本公开的编码sirna分子可包含反义序列和有义序列或其片段或变体。作为一个非限制性实例,反义序列与有义序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%,或至少20
‑
30%、20
‑
40%、20
‑
50%、20
‑
60%、20
‑
70%、20
‑
80%、20
‑
90%、20
‑
95%、20
‑
99%、30
‑
40%、30
‑
50%、30
‑
60%、30
‑
70%、30
‑
80%、30
‑
90%、30
‑
95%、30
‑
99%、40
‑
50%、40
‑
60%、40
‑
70%、40
‑
80%、40
‑
90%、40
‑
95%、40
‑
99%、50
‑
60%、50
‑
70%、50
‑
80%、50
‑
90%、50
‑
95%、50
‑
99%、60
‑
70%、60
‑
80%、60
‑
90%、60
‑
95%、60
‑
99%、70
‑
80%、70
‑
90%、70
‑
95%、70
‑
99%、80
‑
90%、80
‑
95%、80
‑
99%、90
‑
95%、90
‑
99%或95
‑
99%互补。
[0351]
在一个方面,编码sirna双链体的有义链和反义链通常由短间隔序列连接,引起称为短发夹rna(shrna)的茎环结构的表达。发夹通过dicer识别并切割,由此产生成熟sirna分子。
[0352]
在某些实施方案中,本公开的编码sirna双链体抑制(或降解)目标mrna。因此,编码sirna双链体可用于基本上抑制细胞例如神经元或星形胶质细胞中的基因表达。在一些方面,基因表达的抑制是指抑制至少约20%,例如至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%和100%,或至少20
‑
30%、20
‑
40%、20
‑
50%、20
‑
60%、20
‑
70%、20
‑
80%、20
‑
90%、20
‑
95%、20
‑
100%、30
‑
40%、30
‑
50%、30
‑
60%、30
‑
70%、30
‑
80%、30
‑
90%、30
‑
95%、30
‑
100%、40
‑
50%、40
‑
60%、40
‑
70%、40
‑
80%、40
‑
90%、40
‑
95%、40
‑
100%、50
‑
60%、50
‑
70%、50
‑
80%、50
‑
90%、50
‑
95%、50
‑
100%、60
‑
70%、60
‑
80%、60
‑
90%、60
‑
95%、60
‑
100%、70
‑
80%、70
‑
90%、70
‑
95%、70
‑
100%、80
‑
90%、80
‑
95%、80
‑
100%、90
‑
95%、90
‑
100%或95
‑
100%。因此,可使靶向基因的蛋白质产物抑制至少约20%,例如至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%和100%,或至少20
‑
30%、20
‑
40%、20
‑
50%、20
‑
60%、20
‑
70%、20
‑
80%、20
‑
90%、20
‑
95%、20
‑
100%、30
‑
40%、30
‑
50%、30
‑
60%、30
‑
70%、30
‑
80%、30
‑
90%、30
‑
95%、30
‑
100%、40
‑
50%、40
‑
60%、40
‑
70%、40
‑
80%、40
‑
90%、40
‑
95%、40
‑
100%、50
‑
60%、50
‑
70%、50
‑
80%、50
‑
90%、50
‑
95%、50
‑
100%、60
‑
70%、60
‑
80%、60
‑
90%、60
‑
95%、60
‑
100%、70
‑
80%、70
‑
90%、70
‑
95%、70
‑
100%、80
‑
90%、80
‑
95%、80
‑
100%、90
‑
95%、90
‑
100%或95
‑
100%。
[0353]
根据本公开,设计sirna分子(作为不在aav载体基因组中编码的典型结构)并测试
其降低所培养细胞的目标mrna水平的能力。
[0354]
在某些实施方案中,编码sirna分子包含引导链的mirna种子匹配。在另一个实施方案中,sirna分子包含随从链的mirna种子匹配。在又一个实施方案中,靶向所关注基因的编码sirna双链体或编码dsrna不包含引导链或随从链的种子匹配。
[0355]
在某些实施方案中,靶向所关注基因的编码sirna双链体或编码dsrna可能几乎没有引导链的显著全长脱靶。在另一个实施方案中,靶向所关注基因的编码sirna双链体可能几乎没有随从链的显著全长脱靶。靶向所关注基因的编码sirna双链体的随从链可具有低于1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、1
‑
5%、2
‑
6%、3
‑
7%、4
‑
8%、5
‑
9%、5
‑
10%、6
‑
10%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%5
‑
30%、10
‑
20%、10
‑
30%、10
‑
40%、10
‑
50%、15
‑
30%、15
‑
40%、15
‑
45%、20
‑
40%、20
‑
50%、25
‑
50%、30
‑
40%、30
‑
50%、35
‑
50%、40
‑
50%、45
‑
50%的全长脱靶。在又一个实施方案中,靶向所关注基因的编码sirna双链体的引导链或随从链几乎没有显著的全长脱靶。靶向所关注基因的编码sirna双链体的引导链或随从链可具有低于1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、1
‑
5%、2
‑
6%、3
‑
7%、4
‑
8%、5
‑
9%、5
‑
10%、6
‑
10%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%、5
‑
30%、10
‑
20%、10
‑
30%、10
‑
40%、10
‑
50%、15
‑
30%、15
‑
40%、15
‑
45%、20
‑
40%、20
‑
50%、25
‑
50%、30
‑
40%、30
‑
50%、35
‑
50%、40
‑
50%、45
‑
50%的全长脱靶。
[0356]
在某些实施方案中,靶向所关注基因的编码sirna双链体可具有体外高活性。在另一个实施方案中,sirna分子可具有体外低活性。在又一个实施方案中,靶向所关注基因的sirna双链体或dsrna可具有体外高引导链活性和低随从链活性。
[0357]
在某些实施方案中,sirna分子具有体外高引导链活性和低随从链活性。通过引导链实现的目标敲低(kd)可为至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、99.5%或100%。通过引导链的目标敲低可为60
‑
65%、60
‑
70%、60
‑
75%、60
‑
80%、60
‑
85%、60
‑
90%、60
‑
95%、60
‑
99%、60
‑
99.5%、60
‑
100%、65
‑
70%、65
‑
75%、65
‑
80%、65
‑
85%、65
‑
90%、65
‑
95%、65
‑
99%、65
‑
99.5%、65
‑
100%、70
‑
75%、70
‑
80%、70
‑
85%、70
‑
90%、70
‑
95%、70
‑
99%、70
‑
99.5%、70
‑
100%、75
‑
80%、75
‑
85%、75
‑
90%、75
‑
95%、75
‑
99%、75
‑
99.5%、75
‑
100%、80
‑
85%、80
‑
90%、80
‑
95%、80
‑
99%、80
‑
99.5%、80
‑
100%、85
‑
90%、85
‑
95%、85
‑
99%、85
‑
99.5%、85
‑
100%、90
‑
95%、90
‑
99%、90
‑
99.5%、90
‑
100%、95
‑
99%、95
‑
99.5%、95
‑
100%、99
‑
99.5%、99
‑
100%或99.5
‑
100%。作为一个非限制性实例,通过引导链实现的目标敲低(kd)为大于70%。
[0358]
在某些实施方案中,随从链对最近脱靶的ic
50
大于100乘以引导链对目标的ic
50
。作为一个非限制性实例,如果随从链对最近脱靶的ic
50
大于100乘以引导链对目标的ic
50
,则称sirna分子具有体外高引导链活性和低随从链活性。
[0359]
在某些实施方案中,引导链的5'处理在体外或体内时间的至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%时在5'端处具有正确起始(n)。作为一个非限制性实例,引导链的5'处理是精确的,并且在体外时间的至少99%时在5'端处具有正确起始(n)。作为一个非限制性实例,引导链的5'处理是精确的,并且在体内时间的至少99%时在5'端处具有正确起始(n)。
[0360]
在某些实施方案中,体外或体内引导与随从(g:p)(也称为反义与有义)链比率表
示为1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1;1、2:10、2:9、2:8、2:7、2:6、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1、3:10、3:9、3:8、3:7、3:6、3:5、3:4、3:3、3:2、3:1、4:10、4:9、4:8、4:7、4:6、4:5、4:4、4:3、4:2、4:1、5:10、5:9、5:8、5:7、5:6、5:5、5:4、5:3、5:2、5:1、6:10、6:9、6:8、6:7、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1、7:10、7:9、7:8、7:7、7:6、7:5、7:4、7:3、7:2、7:1、8:10、8:9、8:8、8:7、8:6、8:5、8:4、8:3、8:2、8:1、9:10、9:9、9:8、9:7、9:6、9:5、9:4、9:3、9:2、9:1、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1、1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。引导与随从比是指在切除引导链之后引导链与随从链的比率。举例来说,80:20的引导与随从比表示每从前体剪下2个随从链就剪下8个引导链。作为一个非限制性实例,体外引导链与随从链比率为80:20。作为一个非限制性实例,体内引导链与随从链比率为80:20。作为一个非限制性实例,体外引导链与随从链比率为8:2。作为一个非限制性实例,体内引导链与随从链比率为8:2。作为一个非限制性实例,体外引导链比随从链比率为9:1。作为一个非限制性实例,体内引导链与随从链比率为9:1。
[0361]
在某些实施方案中,体外或体内随从与引导(p:g)(也称为有义与反义)链比率表示为1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1;1、2:10、2:9、2:8、2:7、2:6、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1、3:10、3:9、3:8、3:7、3:6、3:5、3:4、3:3、3:2、3:1、4:10、4:9、4:8、4:7、4:6、4:5、4:4、4:3、4:2、4:1、5:10、5:9、5:8、5:7、5:6、5:5、5:4、5:3、5:2、5:1、6:10、6:9、6:8、6:7、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1、7:10、7:9、7:8、7:7、7:6、7:5、7:4、7:3、7:2、7:1、8:10、8:9、8:8、8:7、8:6、8:5、8:4、8:3、8:2、8:1、9:10、9:9、9:8、9:7、9:6、9:5、9:4、9:3、9:2、9:1、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1、1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。随从与引导比是指在切除引导链之后随从链与引导链的比率。举例来说,80:20的随从与引导比表示每从前体剪下2个引导链就剪下8个随从链。作为一个非限制性实例,体外随从链与引导链比率为80:20。作为一个非限制性实例,体内随从链与引导链比率为80:20。作为一个非限制性实例,体外随从链与引导链比率为8:2。作为一个非限制性实例,体内随从链与引导链比率为8:2。作为一个非限制性实例,体外随从链与引导链比率为9:1。作为一个非限制性实例,体内随从链与引导链比率为9:1。
[0362]
在某些实施方案中,编码dsrna的载体基因组的完整性为构建体的全长的至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或超过99%。作为一个非限制性实例,载体基因组的完整性为构建体的全长的80%。
[0363]
在某些实施方案中,基于欧洲专利公开第ep1752536号中所概述的方法和规则来设计随从链和/或引导链,所述欧洲专利公开的内容通过引用整体并入本文。作为一个非限制性实例,序列的3'末端碱基为腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。作为一个非限制性实例,序列的5'末端碱基为鸟嘌呤或胞嘧啶。作为一个非限制性实例,3'末端序列包含七个碱基,这七个碱基富含腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的一种或多种碱基。作为一个非限制性实例,碱基数达到造成rna干扰但不表现出细胞毒性的水平。
[0364]
分子支架
[0365]
在某些实施方案中,sirna分子可编码于还包含分子支架的调节多核苷酸中。如本文所用,“分子支架”是形成序列或结构性基础的框架或起始分子,在所述基础上设计或制
成后续分子。
[0366]
在某些实施方案中,包含有效负载(例如,sirna、mirna或本文所述的其他rnai剂)的调节多核苷酸包含分子支架,所述分子支架包含前导5'侧翼序列,其可具有任何长度并且可完全或部分地源自野生型微rna序列或完全为人工的。3'侧翼序列的大小和起点与5'侧翼序列成镜像。在某些实施方案中,5'和3'侧翼序列中的一者或两者不存在。
[0367]
在某些实施方案中,5'和3'侧翼序列长度相同。
[0368]
在某些实施方案中,5'侧翼序列的长度为1
‑
10个核苷酸,长度为5
‑
15个核苷酸,长度为10
‑
30个核苷酸,长度为20
‑
50个核苷酸,长度为超过40个核苷酸,长度为超过50个核苷酸,长度为超过100个核苷酸或长度为超过200个核苷酸。
[0369]
在某些实施方案中,5'侧翼序列的长度可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500个核苷酸。
[0370]
在某些实施方案中,3'侧翼序列的长度为1
‑
10个核苷酸,长度为5
‑
15个核苷酸,长度为10
‑
30个核苷酸,长度为20
‑
50个核苷酸,长度为超过40个核苷酸,长度为超过50个核苷酸,长度为超过100个核苷酸或长度为超过200个核苷酸。
[0371]
在某些实施方案中,3'侧翼序列的长度可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500个核苷酸。
[0372]
在某些实施方案中,5'和3'侧翼序列为相同序列。在某些实施方案中,当彼此比对时,其相差2%、3%、4%、5%、10%、20%或超过30%。
[0373]
3'侧翼序列可任选地含有一个或多个cnnc基序,其中“n”表示任何核苷酸。
[0374]
形成茎环结构的茎为最少至少一个有效负载序列。在某些实施方案中,有效负载序列包含至少一个与目标序列部分互补或将与目标序列杂交的核酸序列。在某些实施方案中,有效负载为sirna分子或sirna分子的片段。
[0375]
在某些实施方案中,茎环的5'臂包含有义序列。
[0376]
在某些实施方案中,茎环的3'臂包含反义序列。在一些情况下,反义序列在5'最末端包含“g”核苷酸。
[0377]
在某些实施方案中,有义序列可存在于茎环结构的茎的3'臂上,而反义序列存在于5'臂上。
[0378]
有义序列和反义序列可在其长度的实质性部分两端完全互补。在某些实施方案中,有义序列和反义序列可在每条链的独立地至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%长度上至少70%、80%、90%、95%或99%互补。
[0379]
有义序列的同一性或反义序列的同源性都不需要与目标100%互补。
[0380]
茎环结构的有义序列与反义序列由环(也称为环基序)隔开。环可具有以下任何长度:在4
‑
30个核苷酸之间、在4
‑
20个核苷酸之间、在4
‑
15个核苷酸之间、在5
‑
15个核苷酸之间、在6
‑
12个核苷酸之间、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸和/或12个核苷酸。
[0381]
在某些实施方案中,环包含至少一个ugug基序。在某些实施方案中,ugug基序位于环的5'末端。
[0382]
可在调节多核苷酸中存在间隔子区以将一个或多个模块相互隔开。可存在一个或多个此类间隔子区。
[0383]
在某些实施方案中,在8
‑
20个之间,即8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的间隔子区可存在于有义序列与侧翼序列之间。
[0384]
在某些实施方案中,间隔子为13个核苷酸并且位于有义序列的5'末端与侧翼序列之间。在某些实施方案中,间隔子具有足够的长度以形成序列的大约一个螺旋形转弯。
[0385]
在某些实施方案中,在8至20个之间,即8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸之间的间隔子区可存在于反义序列与侧翼序列之间。
[0386]
在某些实施方案中,间隔序列为10
‑
13个(即10、11、12或13个)核苷酸之间并且位于反义序列的3'末端与侧翼序列之间。在某些实施方案中,间隔子具有足够的长度以形成序列的大约一个螺旋形转弯。
[0387]
在某些实施方案中,调节多核苷酸沿5'至3'方向包含5'侧翼序列、5'臂、环基序、3'臂和3'侧翼序列。作为一个非限制性实例,5'臂可包含有义序列并且3'臂包含反义序列。在另一个非限制性实例中,5'臂包含反义序列并且3'臂包含有义序列。
[0388]
在某些实施方案中,5'臂、有效负载(例如有义和/或反义序列)、环基序和/或3'臂序列可有所改变(例如取代1个或多个核苷酸、添加核苷酸和/或缺失核苷酸)。改变可引起构建体的功能的有益变化(例如增加目标序列的敲低,减少构建体的降解,减少脱靶作用,提高有效负载的效率以及减少有效负载的降解)。
[0389]
在某些实施方案中,为了使引导链的切除率超过随从链的切除率,比对调节多核苷酸的分子支架。引导链或随从链的切除率可独立地为1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或超过99%。作为一个非限制性实例,引导链的切除率为至少80%。作为另一个非限制性实例,引导链的切除率为至少90%。
[0390]
在某些实施方案中,引导链的切除率大于随从链的切除率。在一个方面,引导链的切除率可比随从链大至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或超过99%。
[0391]
在某些实施方案中,引导链的切除效率为至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或超过99%。作为一个非限制性实例,引导链的切除效率超过80%。
[0392]
在某些实施方案中,引导链的切除效率大于从分子支架的随从链的切除效率。引导链的切除可比随从链从分子支架的切除效率高2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10倍。
[0393]
在某些实施方案中,分子支架包含双重功能靶向调节多核苷酸。如本文所用,“双重功能靶向”调节多核苷酸是引导链和随从链敲低相同目标或引导链和随从链敲低不同目
标的多核苷酸。
[0394]
在某些实施方案中,本文所述的调节多核苷酸的分子支架包含5'侧翼区域、环区域和3'侧翼区域。可用于本文所述的分子支架中的5'侧翼区域、环区域和3'侧翼区域的序列的非限制性实例显示于表2
‑
4中。
[0395]
表2.分子支架的5'侧翼区域
[0396][0397]
表3.分子支架的环基序区域
[0398]
环基序区域名称环基序区域序列seq id nol1ugugaccugg1734l2ugugauuugg1735l3uauaauuugg1736l4ccugacccagu1737l5gucugcaccugucacuag1738l6gugacccaag1739l7guggccacugagaag1740l8gugacccaau1741l9gugacccaac1742l10guggccacugagaaa1743
[0399]
表4.分子支架的3'侧翼区域
[0400][0401]
表2
‑
4中所述区域中的任一者均可用于本文所述的分子支架中。
[0402]
在某些实施方案中,分子支架可包含一个或多个本领域中已知的接头。接头可使各区域隔开或使一个分子支架与另一分子支架隔开。作为一个非限制性实例,分子支架可为多顺反子的。
[0403]
在某些实施方案中,使用以下特性中的至少一者设计调节多核苷酸:环变体、种子错配/凸出/摆动变体、茎错配、环变体和基部茎错配变体、种子错配和基部茎错配变体、茎错配和基部茎错配变体、种子摆动和基部茎摆动变体或茎序列变体。
[0404]
引入至细胞中
[0405]
本公开的编码sirna分子(例如sirna双链体)可通过由aav颗粒的载体基因组编码而引入至细胞中。这些aav颗粒被工程化和优化以便于进入不可被转染/转导轻易修改的细胞。此外,一些合成病毒载体能够将shrna整合至细胞基因组中,从而引起稳定sirna表达和目标基因的长期敲低。以这种方式,病毒载体被工程化为用于特异性递送,同时缺乏发现于野生型病毒中的有害复制和/或整合特征的媒介物。
[0406]
在某些实施方案中,通过用aav颗粒转染、感染或转导细胞将编码sirna分子引入至细胞中,所述aav颗粒包含当在细胞中转录时能够产生sirna分子的核酸序列。在某些实施方案中,通过将aav颗粒注射至细胞或组织中而将sirna分子引入至细胞中,所述aav颗粒包含当在细胞中转录时能够产生sirna分子的核酸序列。
[0407]
在某些实施方案中,在转染/转导之前,本公开的包含编码sirna分子的核酸序列的aav颗粒可转染至细胞中。
[0408]
引入本文所述的包含用于sirna分子的核酸序列的aav颗粒的其他方法可包含如美国专利公开第20120264807号中所述的光化学内化;所述美国专利公开关于光化学内化的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0409]
在某些实施方案中,本文所述的制剂可含有至少一种aav颗粒,其包含编码本文所述的sirna分子的核酸序列。在某些实施方案中,sirna分子可靶向一个目标位点处的所关注基因。在另一个实施方案中,制剂包含多个aav颗粒,每个aav颗粒包含编码靶向不同目标位点处的所关注基因的sirna分子的核酸序列。可靶向2、3、4、5个或超过5个位点处的所关注基因。
[0410]
在某些实施方案中,可将来自任何相关物种的aav颗粒引入细胞中,相关物种例如但不限于人类、猪、狗、小鼠、大鼠或猴。
[0411]
在某些实施方案中,配制aav颗粒可引入至与待治疗的疾病相关的细胞或组织中。
[0412]
在某些实施方案中,配制aav颗粒可引入至具有高内源目标序列表达水平的细胞中。
[0413]
在另一个实施方案中,配制aav颗粒可引入至具有低内源目标序列表达水平的细胞中。
[0414]
在某些实施方案中,细胞可为具有高aav转导效率的细胞。
[0415]
在某些实施方案中,包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的配制aav颗粒可用于将sirna分子递送至中枢神经系统(例如美国专利第6,180,613号;其关于sirna分子和aav颗粒的递送和治疗用途的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)。
[0416]
在某些实施方案中,本公开的包含编码sirna分子的核酸序列的配制aav颗粒还可包含修饰衣壳,其包含来自非病毒来源的肽。在其他方面,aav颗粒可含有cns特异性嵌合衣壳以促进将编码sirna双链体递送至大脑和脊髓中。举例来说,可构建来自展现cns向性的aav变体的cap核苷酸序列的比对以鉴定可变区(vr)序列和结构。
[0417]
在某些实施方案中,本公开的包含编码sirna分子的核酸序列的配制aav颗粒可编码作为多顺反子分子的sirna分子。sirna分子可在sirna分子的区域之间另外包含一个或多个接头。
[0418]
在某些实施方案中,配制aav颗粒可包含编码本文所述的sirna序列或双链体中的至少一者的调节多核苷酸中的至少一者。
[0419]
在某些实施方案中,表达载体从itr至itr叙述的5'至3'可包含itr、启动子、内含子、调节多核苷酸、polya序列和itr。
[0420]
在某些实施方案中,编码sirna分子在表达载体中可位于启动子下游,启动子例如但不限于cmv、u6、h1、cba或具有sv40内含子的cba启动子。此外,编码sirna分子也可位于表达载体中的多聚腺苷酸化序列上游。作为一个非限制性实例,编码sirna分子在表达载体中可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超过30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例,编码sirna分子在表达载体中可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游1
‑
5、1
‑
10、1
‑
15、1
‑
20、1
‑
25、1
‑
30、5
‑
10、5
‑
15、5
‑
20、5
‑
25、5
‑
30、10
‑
15、10
‑
20、10
‑
25、10
‑
30、15
‑
20、15
‑
25、15
‑
30、20
‑
25、20
‑
30或25
‑
30个核苷酸内。作为一个非限制性实例,编码sirna分子在表达载体中可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游的前1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%或超过25%核苷酸内。作为另一个非限制性实例,编码sirna分子在表达载体中可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游的前1
‑
5%、1
‑
10%、1
‑
15%、1
‑
20%、1
‑
25%、5
‑
10%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%、10
‑
15%、10
‑
20%、10
‑
25%、15
‑
20%、15
‑
25%或20
‑
25%内。
[0421]
在某些实施方案中,编码sirna分子在表达载体中可位于多聚腺苷酸化序列上游。此外,编码sirna分子在表达载体中可位于启动子的下游,启动子例如但不限于cmv、u6、cba或具有sv40内含子的cba启动子。作为一个非限制性实例,编码sirna分子在表达载体中可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超过30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例,编码sirna分子在表达载体中可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游1
‑
5、1
‑
10、1
‑
15、1
‑
20、1
‑
25、1
‑
30、5
‑
10、5
‑
15、5
‑
20、5
‑
25、5
‑
30、10
‑
15、10
‑
20、10
‑
25、10
‑
30、15
‑
20、15
‑
25、15
‑
30、20
‑
25、20
‑
30或25
‑
30个核苷酸内。作为一个非限制性实例,编码sirna分子在表达载体中可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游的前1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%或超过25%核苷酸内。作为另一个非限制性实例,编码sirna分子在表达载体中可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游的前1
‑
5%、1
‑
10%、1
‑
15%、1
‑
20%、1
‑
25%、5
‑
10%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%、10
‑
15%、10
‑
20%、10
‑
25%、15
‑
20%、15
‑
25%或20
‑
25%内。
[0422]
在某些实施方案中,编码sirna分子可位于scaav中。
[0423]
在某些实施方案中,编码sirna分子可位于ssaav中。
[0424]
在某些实施方案中,编码sirna分子在表达载体中可位于flip itr的5'端附近。在另一个实施方案中,编码sirna分子在表达载体中可位于flip itr的3'端附近。在又一个实施方案中,编码sirna分子在表达载体中可位于flop itr的5'端附近。在又一个实施方案中,编码sirna分子在表达载体中可位于flop itr的3'端附近。在某些实施方案中,编码sirna分子在表达载体中可位于flip itr的5'端与flop itr的3'端之间。在某些实施方案中,编码sirna分子在表达载体中可位于flip itr的3'端与flip itr的5'端之间(例如,flip itr的5'端与flop itr的3'端或flop itr的3'端与flip itr的5'端之间的中间位置)。作为一个非限制性实例,编码sirna分子在表达载体中可位于itr(例如,flip或flop itr)的5'或3'端下游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超过30个核苷酸内。作为一个非限制性实例,编码sirna分子在表达载体中可位于itr(例如,flip或flop itr)的5'或3'端上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超过30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例,编码sirna分子在表达载体中可位于itr(例如flip或flop itr)的5'端或3'端下游的1
‑
5、1
‑
10、1
‑
15、1
‑
20、1
‑
25、1
‑
30、5
‑
10、5
‑
15、5
‑
20、5
‑
25、5
‑
30、10
‑
15、10
‑
20、10
‑
25、10
‑
30、15
‑
20、15
‑
25、15
‑
30、20
‑
25、20
‑
30或25
‑
30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例,编码sirna分子在表达载体中可位于itr(例如,flip或flop itr)的5'或3'端上游1
‑
5、1
‑
10、1
‑
15、1
‑
20、1
‑
25、1
‑
30、5
‑
10、5
‑
15、5
‑
20、5
‑
25、5
‑
30、10
‑
15、10
‑
20、10
‑
25、10
‑
30、15
‑
20、15
‑
25、15
‑
30、20
‑
25、20
‑
30或25
‑
30内。作为一个非限制性实例,编码sirna分子在表达载体中可位于itr(例如flip或flop itr)的5'端或3'端上游的前1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%或超过25%核苷酸内。作为另一个非限制性实例,编码sirna分子在表达载体中可位于itr(例如,flip或flop itr)的5'或3'端下游的前1
‑
5%、1
‑
10%、1
‑
15%、1
‑
20%、1
‑
25%、5
‑
10%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%、
10
‑
15%、10
‑
20%、10
‑
25%、15
‑
20%、15
‑
25%或20
‑
25%内。
[0425]
在某些实施方案中,本公开的包含用于sirna分子的核酸序列的aav颗粒可被配制用于cns递送。可使用穿过脑血屏障的试剂。举例来说,可将sirna分子靶向脑血屏障内皮的一些细胞穿透肽可用于配制靶向所关注基因的sirna双链体。
[0426]
在某些实施方案中,本公开的包含编码sirna分子的核酸序列的配制aav颗粒可直接施用至cns。作为一个非限制性实例,载体包含编码靶向所关注基因的sirna分子的核酸序列。
[0427]
在特定实施方案中,本公开的包含编码sirna分子的核酸序列的配制aav颗粒的组合物可以便于载体或sirna分子进入中枢神经系统并穿透至运动神经元中的方式施用。
[0428]
在某些实施方案中,配制aav颗粒可以对于sirna双链体或dsrna靶向脊髓和/或脑干中的运动神经元和星形胶质细胞来说的治疗有效量向受试者施用(例如,经由鞘内施用向受试者的cns施用)。作为一个非限制性实例,sirna双链体或dsrna可降低蛋白质或mrna的表达。
[0429]
ii.aav生产
[0430]
一般病毒生产工艺
[0431]
用于生产raav颗粒的病毒生产细胞通常包含哺乳动物细胞类型。然而,哺乳动物细胞对raav颗粒的大规模产生呈现若干并发症,其包含每个复制细胞病毒颗粒的总产量一般较低,以及病毒生产细胞中其他哺乳动物生物材料产生非所需污染的风险较高。因此,昆虫细胞已成为大规模生产raav颗粒的替代媒介物。
[0432]
使用昆虫细胞的aav生产系统也呈现一系列并发情况。举例来说,高产率生产raav颗粒通常需要rep78相较于rep52的较低表达。控制rep78和rep52在昆虫细胞中的相对表达因此需要rep操纵子内的小心设计的控制机制。这些控制机制可包含单独工程化昆虫细胞启动子,例如用于rep78的δie1启动子和用于rep52的polh启动子,或rep编码核苷酸序列在独立工程化序列或构建体上的分区。然而,实施这些控制机构通常导致raav颗粒产率降低或产生结构上不稳定的病毒颗粒。
[0433]
在另一个实例中,生产raav颗粒需要组装形成aav衣壳的vp1、vp2和vp3蛋白质。高产率生产raav颗粒需要调节vp1、vp2和vp3的比率,其通常应分别为约1:1:10,但相对于10个vp3拷贝,vp1可在1
‑
2之间变化和/或vp2可在1
‑
2之间变化。该比率对于衣壳的质量十分重要,因为过多vp1使衣壳不稳定,并且过少vp1将降低病毒的感染性。
[0434]
野生型aav使用缺陷剪接方法来控制vp1表达;具有特殊周围序列(“kozak”序列)的弱起始密码子(acg)用于控制vp2;以及标准起始密码子(atg)用于vp3表达。然而,在一些杆状病毒系统中,哺乳动物剪接序列并非始终被识别并且无法恰当地控制vp1、vp2和vp3的产生。因此,来自vp2的相邻核苷酸和acg起始序列可用于驱动衣壳蛋白产生。令人遗憾的是,对于大部分aav血清型,这种方法产生相较于vp2,vp1的比率较低(相对于10个vp3拷贝<1)的衣壳。为了更有效地控制vp蛋白质的产生,已使用非典型或起始密码子,如ttg、gtg或ctg。然而,相对于野生型atg或acg起始密码子,这些起始密码子可被视为次最佳的(例如wo2007046703和wo2007148971,其关于aav衣壳蛋白的产生的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)。
[0435]
在另一个实例中,使用杆状病毒/sf9系统生产raav颗粒通常需要广泛使用的基于
杆粒的杆状病毒表达载体系统(bev),其未针对大规模aav生产进行优化。病毒蛋白质在基于杆粒的bev中的异常蛋白质水解降解是出人意料的问题,妨碍了使用杆状病毒/sf9系统可靠地大规模生产aav衣壳蛋白。
[0436]
仍需要允许在哺乳动物和昆虫细胞中有效且高效地大规模(商业)生产raav颗粒的方法和系统。
[0437]
本公开的一个或多个实施方案的细节阐述于以下所附说明书中。本公开的其他特征、目的和优点将从说明书、附图和权利要求显而易见。在本说明书中,除非上下文另外明确规定,否则单数形式也包含复数。除非另有定义,否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。在与以引用的方式并入的公开内容有冲突的情况下,将以本说明书为准。
[0438]
在某些实施方案中,本公开的构建体、多核苷酸、多肽、载体、血清型、衣壳制剂或颗粒可为以下国际公开中的一者中所述的任何序列、元件、构建体、系统、目标或过程,可包含其,可由其修改,可由其使用,可用于其,可与其一起使用或可由其产生:wo2016073693、wo2017023724、wo2016077687、wo2016077689、wo2018204786、wo2017201258、wo2017201248、wo2018204803、wo2018204797、wo2017189959、wo2017189963、wo2017189964、wo2015191508、wo2016094783、wo20160137949、wo2017075335;所述国际公开的内容各自通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0439]
本公开的aav生产包括用于生产aav颗粒和病毒载体的工艺和方法,所述aav颗粒和病毒载体可接触目标细胞以递送有效负载(例如重组病毒构建体),所述有效负载包含编码有效负载分子的核苷酸。在某些实施方案中,病毒载体为腺相关病毒(aav)载体,例如重组腺相关病毒(raav)载体。在某些实施方案中,aav颗粒为腺相关病毒(aav)颗粒,例如重组腺相关病毒(raav)颗粒。
[0440]
本公开提供了通过以下生产aav颗粒或病毒载体的方法:(a)使病毒生产细胞与编码至少一种aav衣壳蛋白和/或至少一种aav复制蛋白质的一个或多个病毒表达构建体和一个或多个有效负载构建体载体接触,其中所述有效负载构建体载体包含编码选自由转基因、多核苷酸编码蛋白质和调节核酸组成的组的有效负载分子的有效负载构建体;(b)在使得生产至少一种aav颗粒或病毒载体的条件下培养所述病毒生产细胞,以及(c)分离所述至少一种aav颗粒或病毒载体。
[0441]
在这些方法中,病毒表达构建体可编码至少一种结构蛋白质和/或至少一种非结构蛋白质。结构蛋白质可包含原生或野生型衣壳蛋白vp1、vp2和/或vp3或嵌合蛋白质中的任一者。非结构蛋白质可包含原生或野生型rep78、rep68、rep52和/或rep40蛋白质或嵌合蛋白质中的任一者。
[0442]
在某些实施方案中,接触经由瞬时转染、病毒转导和/或电穿孔发生。
[0443]
在某些实施方案中,病毒生产细胞选自由哺乳动物细胞和昆虫细胞组成的组。在某些实施方案中,昆虫细胞包含草地贪夜蛾昆虫细胞。在某些实施方案中,昆虫细胞包含sf9昆虫细胞。在某些实施方案中,昆虫细胞包含sf21昆虫细胞。
[0444]
本公开的有效负载构建体载体可包含至少一个反向末端重复序列(itr)并且可包含哺乳动物dna。
[0445]
还提供了根据本文所述的方法生产的aav颗粒和病毒载体。
[0446]
本公开的aav颗粒可配制为具有一种或多种可接受的赋形剂的药物组合物。
[0447]
在某些实施方案中,aav颗粒或病毒载体可由本文所述的方法生产。
[0448]
在某些实施方案中,aav颗粒可通过使病毒生产细胞(例如昆虫细胞或哺乳动物细胞)与编码至少一个衣壳蛋白和至少一个aav复制蛋白质的至少一个病毒表达构建体和至少一个有效负载构建体载体接触来产生。病毒生产细胞可通过瞬时转染、病毒转导和/或电穿孔接触。有效负载构建体载体可包含编码有效负载分子(例如但不限于转基因、多核苷酸编码蛋白质和调节核酸)的有效负载构建体。病毒生产细胞可在使得产生、分离(例如使用温度诱导的溶胞、机械性溶胞和/或化学性溶胞)和/或纯化(例如使用过滤、色谱法和/或免疫亲和纯化)至少一种aav颗粒或病毒载体的条件下培养。作为一个非限制性实例,有效负载构建体载体可包含哺乳动物dna。
[0449]
在某些实施方案中,使用本文所述的方法在昆虫细胞(例如草地贪夜蛾(sf9)细胞)中生产aav颗粒。作为一个非限制性实例,使用可包含杆状病毒转导的病毒转导来接触昆虫细胞。
[0450]
在另一个实施方案中,使用本文所述的方法在哺乳动物细胞中生产aav颗粒。作为一个非限制性实例,使用瞬时转染来接触哺乳动物细胞。
[0451]
在某些实施方案中,病毒表达构建体可编码至少一种结构蛋白质和至少一种非结构蛋白质。作为一个非限制性实例,结构蛋白质包含vp1、vp2和/或vp3。作为另一个非限制性实例,非结构蛋白质包含rep78、rep68、rep52和/或rep40。
[0452]
在某些实施方案中,本文所述的aav颗粒生产方法在病毒生产细胞中生产大于101、大于102、大于103、大于104或大于105个aav颗粒。
[0453]
在某些实施方案中,本公开的工艺包括使用病毒生产系统在病毒生产细胞中生产病毒颗粒,所述病毒生产系统包含至少一种病毒表达构建体和至少一种有效负载构建体。至少一种病毒表达构建体和至少一种有效负载构建体可共转染(例如双重转染、三重转染)至病毒生产细胞中。使用本领域技术人员已知并且常规进行的标准分子生物学技术来完成转染。病毒生产细胞提供蛋白质表达所需的细胞机构和生产aav颗粒所需的其他生物材料,包含复制有效负载构建体的rep蛋白质和组装形成围封复制有效负载构建体的衣壳的cap蛋白质。从病毒生产细胞提取所得aav颗粒并处理成用于施用的药物制剂。
[0454]
一旦施用,aav颗粒接触目标细胞并在内体中进入细胞。aav颗粒从内体释放并且随后接触目标细胞的细胞核以递送有效负载构建体。有效负载构建体,例如重组病毒构建体递送至目标细胞的细胞核,其中可表达由有效负载构建体编码的有效负载分子。
[0455]
在某些实施方案中,用于生产病毒颗粒的工艺利用包含一种或多种杆状病毒的病毒生产细胞的种子培养物(例如杆状病毒表达载体(bev)或杆状病毒感染的昆虫细胞(biic),其已经病毒表达构建体和有效负载构建体载体转染)。在某些实施方案中,收获种子培养物,将其分成等分试样并冷冻,并且可在稍后时间点使用以起始原生生产细胞群体的感染。
[0456]
大规模生产aav颗粒可利用生物反应器。使用生物反应器允许精确测量和/或控制支持病毒生产细胞的生长和活性的变量,例如质量、温度、混合条件(叶轮rpm或波振荡)、co2浓度、o2浓度、气体喷射速率和体积、气体覆盖速率和体积、ph、活细胞密度(vcd)、细胞活力、细胞直径和/或光密度(od)。在某些实施方案中,生物反应器用于批量生产,其中整个培
养物在以实验方式测定的时间点收获并且aav颗粒被纯化。在另一个实施方案中,生物反应器用于连续生产,其中一部分培养物在以实验方式测定的时间点收获用于aav颗粒纯化,并且生物反应器中的剩余培养物用额外生长培养基组分更新。
[0457]
aav病毒颗粒可在包括细胞溶胞、澄清、灭菌和纯化的过程中从病毒生产细胞提取。细胞溶胞包括破坏病毒生产细胞的结构,由此释放aav颗粒的任何过程。在某些实施方案中,细胞溶胞可包括热冲击、化学或机械性溶胞方法。澄清可包括总体纯化溶解细胞、培养基组分和aav颗粒的混合物。在某些实施方案中,澄清包括离心和/或过滤,包括但不限于深层末端、切向流和/或中空纤维过滤。
[0458]
病毒生产的最终结果是纯化aav颗粒集合,其包含两种组分:(1)有效负载构建体(例如重组病毒基因组构建体)和(2)病毒衣壳。
[0459]
在某些实施方案中,例如图1中呈现的实施方案,本公开的病毒生产系统或工艺包括使用病毒生产细胞(vpc)和质粒构建体生产杆状病毒感染的昆虫细胞(biic)的步骤。来自细胞库(cb)的病毒生产细胞(vpc)被解冻和扩增,得到目标工作体积和vpc浓度。将所得vpc池分成rep/cap vpc池和有效负载vpc池。将一个或多个rep/cap质粒构建体(病毒表达构建体)处理成rep/cap杆粒多核苷酸并转染至rep/cap vpc池中。将一种或多种有效负载质粒构建体(有效负载构建体)处理成有效负载杆粒多核苷酸并转染至有效负载vpc池中。温育两个vpc池,以生产p1 rep/cap杆状病毒表达载体(bev)和p1有效负载bev。将两个bev池扩增成斑块集合,单一斑块被选择用于克隆斑块(cp)纯化(也称为单一斑块扩增)。所述工艺可包括单个cp纯化步骤或者可包括连续或由其他处理步骤分开的多个cp纯化步骤。一个或多个cp纯化步骤提供cp rep/cap bev池和cp有效负载bev池。这两个bev池然后可被储存并用于未来的生产步骤,或者它们然后可转染至vpc中,以生产rep/cap biic池和有效负载biic池。
[0460]
在某些实施方案中,例如图2中呈现的实施方案,本公开的病毒生产系统或工艺包括使用病毒生产细胞(vpc)和杆状病毒感染的昆虫细胞(biic)生产aav颗粒的步骤。来自细胞库(cb)的病毒生产细胞(vpc)被解冻和扩增,得到目标工作体积和vpc浓度。将工作体积的病毒生产细胞接种至生产型生物反应器中,并且可进一步扩增至具有用于biic感染的目标vpc浓度的200
‑
2000l工作体积。生产型生物反应器中的工作体积的vpc然后以目标vpc:biic比率和目标biic:biic比率与rep/cap biic和有效负载biic共感染。vcd感染也可利用bev。将共感染vpc在生产型生物反应器中温育和扩增,以生产aav颗粒和vpc的批量收获物。
[0461]
在某些实施方案中,例如图3中呈现的实施方案,本公开的病毒生产系统或工艺包括通过处理、澄清和纯化aav颗粒和病毒生产细胞的批量收获物来产生原料药的步骤。经由细胞破坏和溶胞(例如,化学性溶胞和/或机械性溶胞),接着核酸酶处理溶胞物池,由此产生粗溶胞物池,来处理aav颗粒和vpc的批量收获物(在生产型生物反应器内)。经由一个或多个过滤和澄清步骤(包括深层过滤和微滤)处理粗溶胞物池,得到澄清溶胞物池。经由一个或多个色谱和纯化步骤处理澄清溶胞物池(包含亲和色谱法(afc)和离子交换色谱法(aex或cex)),得到纯化产物池。然后任选地经由纳米过滤并且然后经由切向流过滤(tff)处理纯化产物池。tff工艺包括连续或交替的一个或多个渗滤(df)步骤和一个或多个超滤(uf)步骤。产物池经由病毒截留性过滤(vrf)和另一个过滤步骤进一步处理,得到原料药池。原料药池可进一步过滤,然后等分到小瓶中用于储存和处理。
[0462]
病毒表达构建体
[0463]
本公开的病毒生产系统包含一种或多种病毒表达构建体,其可转染/转导至病毒生产细胞中。在某些实施方案中,本公开的病毒表达构建体或有效负载构建体可为杆粒,也称为杆状病毒质粒或重组杆状病毒基因组。在某些实施方案中,病毒表达包含蛋白质编码核苷酸序列和用于在病毒生产细胞中表达的至少一个表达控制序列。在某些实施方案中,病毒表达包含蛋白质编码核苷酸序列,其可操作地连接于至少一个用于在病毒生产细胞中表达的表达控制序列。在某些实施方案中,病毒表达构建体含有在一个或多个启动子控制下的细小病毒基因。细小病毒基因可包含编码非结构aav复制蛋白质的核苷酸序列,例如编码rep52、rep40、rep68或rep78蛋白质的rep基因。细小病毒基因可包含编码结构aav蛋白质的核苷酸序列,例如cap基因,其编码vp1、vp2和vp3蛋白质。
[0464]
本公开的病毒生产系统不受用于将细小病毒功能引入至病毒复制细胞中的病毒表达载体限制。病毒表达构建体在病毒复制细胞中的存在不必是永久的。病毒表达构建体可通过任何已知方法引入,例如通过细胞化学处理、电穿孔或感染。
[0465]
本公开的病毒表达构建体可包含任何化合物或制剂、生物或化学物质,其促进细胞用核酸转化、转染或转导。示例性生物病毒表达构建体包含质粒、线性核酸分子和重组病毒,包含杆状病毒。示例性化学载体包含脂质复合物。病毒表达构建体用于将核酸序列并入至根据本公开的病毒复制细胞中。(o'reilly,david r.,lois k.miller和verne a.luckow.baculovirus expression vectors:a laboratory manual.oxford university press,1994.);maniatis等人编,molecular cloning.csh laboratory,ny,n.y.(1982);以及philiport和scluber编,liposoes as tools in basic research and industry.crc press,ann arbor,mich.(1995),其关于病毒表达构建体和其用途的内容各自通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0466]
在某些实施方案中,病毒表达构建体是aav表达构建体,其包含编码非结构aav复制蛋白质、结构aav衣壳蛋白或其组合的一个或多个核苷酸序列。
[0467]
在某些实施方案中,本公开的病毒表达构建体可为质粒载体。在某些实施方案中,本公开的病毒表达构建体可为杆状病毒构建体。
[0468]
本公开不受用于生产aav颗粒或病毒载体的病毒表达构建体的数目限制。在某些实施方案中,一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个病毒表达构建体可用于在根据本公开的病毒生产细胞中生产aav颗粒。在一个非限制性实例中,五个表达构建体可单独地编码aav vp1、aav vp2、aav vp3、rep52、rep78,并且具有包含有效负载多核苷酸和至少一个aav itr的伴随的有效负载构建体。在另一个实施方案中,表达构建体可用于表达例如rep52和rep40,或rep78和rep 68。表达构建体可包含vp1、vp2、vp3、rep52/rep40和rep78/rep68编码序列的任何组合。
[0469]
在本公开的某些实施方案中,病毒表达构建体可用于在昆虫细胞中生产aav颗粒。在某些实施方案中,可对衣壳和/或rep基因的野生型aav序列进行修饰,例如以改善病毒颗粒的属性,例如增大感染性或特异性,或增强生产产量。
[0470]
在某些实施方案中,病毒表达构建体可编码具有并入的gly
‑
ala重复区的细小病毒衣壳的组分,所述重复区可充当免疫侵入序列,如美国专利申请20110171262中所述,其关于细小病毒衣壳蛋白的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0471]
在本公开的某些实施方案中,病毒表达构建体可用于在昆虫细胞中生产aav颗粒。在某些实施方案中,可对衣壳和/或rep基因的野生型aav序列进行修饰,例如以改善病毒颗粒的属性,例如增大感染性或特异性,或提高来自昆虫细胞的生产产量。
[0472]
在某些实施方案中,vp编码区编码特定aav血清型的一种或多种aav衣壳蛋白。vp编码区的aav血清型可相同或不同。在某些实施方案中,vp编码区可进行密码子优化。在某些实施方案中,vp编码区或核苷酸序列可针对哺乳动物细胞进行密码子优化。在某些实施方案中,vp编码区或核苷酸序列可针对昆虫细胞进行密码子优化。在某些实施方案中,vp编码区或核苷酸序列可针对草地贪夜蛾细胞进行密码子优化。在某些实施方案中,vp编码区或核苷酸序列可针对sf9或sf21细胞系进行密码子优化。
[0473]
在某些实施方案中,编码一种或多种vp衣壳蛋白的核苷酸序列可进行密码子优化以与参考核苷酸序列具有低于100%的核苷酸同源性。在某些实施方案中,密码子优化的vp核苷酸序列与参考vp核苷酸序列之间的核苷酸同源性为低于100%、低于99%、低于98%、低于97%、低于96%、低于95%、低于94%、低于93%、低于92%、低于91%、低于90%、低于89%、低于88%、低于87%、低于86%、低于85%、低于84%、低于83%、低于82%、低于81%、低于80%、低于78%、低于76%、低于74%、低于72%、低于70%、低于68%、低于66%、低于64%、低于62%、低于60%、低于55%、低于50%和低于40%。
[0474]
vp编码区
[0475]
在某些实施方案中,病毒表达构建体可包含vp编码区;vp编码区是包含编码vp1、vp2、vp3或其组合的vp核苷酸序列的核苷酸序列。在某些实施方案中,病毒表达构建体可包含vp1
‑
编码区;vp1
‑
编码区是包含编码vp1蛋白质的vp1核苷酸序列的核苷酸序列。在某些实施方案中,病毒表达构建体可包含vp2
‑
编码区;vp2
‑
编码区是包含编码vp2蛋白质的vp2核苷酸序列的核苷酸序列。在某些实施方案中,病毒表达构建体可包含vp3
‑
编码区;vp3
‑
编码区是包含编码vp3蛋白质的vp3核苷酸序列的核苷酸序列。
[0476]
病毒表达构建体的结构vp蛋白质vp1、vp2和vp3可在单一开放阅读框中编码,所述单一开放阅读框通过利用替代剪接受体和非典型翻译起始密码子来调控。vp1、vp2和vp3可从单一转录物转录和翻译,其中框内和/或框外起始密码子均被工程化以控制由核苷酸转录物生产的vp1:vp2:vp3比。在某些实施方案中,vp1可产生自仅编码vp1的序列。如本文所用,术语“仅用于vp1”或“仅vp1”是指编码vp1衣壳蛋白的核苷酸序列或转录物,并且(i)缺乏vp1序列内用于从相同序列完全转录或翻译vp2和vp3的必需起始密码子(即缺失或突变);(ii)包含vp1序列内阻止vp2和vp3从相同序列转录或翻译的额外密码子;或(iii)包含vp1的起始密码子(例如atg),使得vp1为由核苷酸转录物产生的初级vp蛋白质。
[0477]
在某些实施方案中,vp2可产生自仅编码vp2的序列。如本文所用,术语“仅用于vp2”或“仅vp2”是指编码vp2衣壳蛋白的核苷酸序列或转录物,并且:(i)核苷酸转录物为编码仅vp2和vp3衣壳蛋白的完整vp衣壳序列的截短变体;以及(ii)其包含vp2的起始密码子(例如atg),使得vp2为由核苷酸转录物产生的初级vp蛋白质。
[0478]
在某些实施方案中,vp1和vp2可产生自仅编码vp1和vp2的序列。如本文所用,术语“仅用于vp1和vp2”或“仅vp1和vp2”是指编码vp1和vp2衣壳蛋白的核苷酸序列或转录物,并且:(i)在vp序列内缺乏从相同序列完全转录或翻译vp3所需的起始密码子(即缺失的或突变的);(ii)在vp序列内包含防止从相同序列转录或翻译vp3的额外密码子;(iii)包含用于
vp1(例如atg)和vp2(例如atg)的起始密码子,使得vp1和vp2是由核苷酸转录物产生的初级vp蛋白质;或(iv)包含由接头如ires区连接的仅vp1的核苷酸转录物和仅vp2的核苷酸转录物。
[0479]
在某些实施方案中,病毒表达构建体可含有包含起始密码子区的核苷酸序列,例如编码包含一个或多个起始密码子区的aav衣壳蛋白的序列。在某些实施方案中,起始密码子区可在表达控制序列内。起始密码子可为atg或非atg密码子(即次最佳起始密码子,其中aav vp1衣壳蛋白的起始密码子为非atg)。在某些实施方案中,用于aav生产的病毒表达构建体可含有编码aav衣壳蛋白的核苷酸序列,其中aav vp1衣壳蛋白的起始密码子是非atg,即次最佳起始密码子,其允许在产生系统中表达修饰比率的病毒衣壳蛋白,以提供宿主细胞的改进感染性。在一个非限制性实例中,病毒构建体载体可含有核酸构建体,其包含编码aav vp1、vp2和vp3衣壳蛋白的核苷酸序列,其中用于翻译aav vp1衣壳蛋白的起始密码子是ctg、ttg或gtg,如美国专利第us8,163,543号中所述,所述美国专利关于aav衣壳蛋白和其生产的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0480]
rep编码区
[0481]
在某些实施方案中,病毒表达构建体可包含rep52编码区;rep52编码区是包含编码rep52蛋白质的rep52核苷酸序列的核苷酸序列。在某些实施方案中,病毒表达构建体可包含rep78编码区;rep78编码区是包含编码rep78蛋白质的rep78核苷酸序列的核苷酸序列。在某些实施方案中,病毒表达构建体可包含rep40编码区;rep40编码区是包含编码rep40蛋白质的rep40核苷酸序列的核苷酸序列。在某些实施方案中,病毒表达构建体可包含rep68编码区;rep68编码区是包含编码rep68蛋白质的rep68核苷酸序列的核苷酸序列。
[0482]
病毒表达构建体的非结构蛋白质rep52和rep78可在单一开放阅读框中编码,所述单一开放阅读框通过利用替代剪接受体和非典型翻译起始密码子来调控。
[0483]
rep78和rep52都可从单一转录物翻译:rep78翻译起始于第一起始密码子(aug或非aug),并且rep52翻译起始自rep78序列内的rep52起始密码子(例如aug)。rep78和rep52也可从具有独立起始密码子的独立转录物翻译。rep78序列内的rep52起始密码子可被突变、修饰或去除,使得修饰的rep78序列的处理将不产生rep52蛋白质。
[0484]
在某些实施方案中,本公开的病毒表达构建体可为质粒载体或杆状病毒构建体,其编码用于在昆虫细胞中表达的细小病毒rep蛋白质。在某些实施方案中,单一编码序列用于rep78和rep52蛋白质,其中用于翻译rep78蛋白质的起始密码子是次最佳起始密码子,其选自由acg、ttg、ctg和gtg组成的组,其在昆虫细胞中的表达时影响部分外显子跳跃,如美国专利第8,512,981号中所述,所述美国专利关于促进rep78相较于rep52的较低丰度表达以促进高载体产量的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0485]
在某些实施方案中,病毒表达构建体可为用于在含有具有不同密码子偏差的重复密码子的昆虫细胞中表达的质粒载体或杆状病毒构建体,例如以改善rep蛋白质(例如rep78和rep52)比率,由此改善昆虫细胞中病毒表达构建体和/或有效负载构建体的大规模(商业)生产,如美国专利第8,697,417号中所教导,所述美国专利关于aav复制蛋白质和其生产的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0486]
在某些实施方案中,可使用如美国专利第8,642,314号中所述的方法和构建体来改善rep蛋白质比率,所述美国专利关于aav复制蛋白质和其生产的内容通过引用整体并入
本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0487]
在某些实施方案中,病毒表达构建体可编码突变体细小病毒rep多肽,所述多肽与其相应野生型rep多肽相比具有一种或多种改进特性,例如制备较高病毒滴度以供大规模生产。或者,它们可能能够允许生产更好质量的病毒颗粒或维持更稳定的病毒生产。在一个非限制性实例中,病毒表达构建体可编码具有突变核定位序列或锌指域的突变体rep多肽,如美国专利申请us 20130023034中所述,所述美国专利申请关于aav复制蛋白质和其生产的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0488]
ren进入点和多核苷酸插入序列
[0489]
在某些实施方案中,本公开的病毒表达构建体或有效负载构建体可为杆粒,也称为杆状病毒质粒或重组杆状病毒基因组。在某些实施方案中,本公开的病毒表达构建体或有效负载构建体(例如杆粒)可包含多核苷酸,其通过本领域技术人员已知和进行的标准分子生物学技术由同源重组(转座子供体/受体系统)并入至杆粒中。
[0490]
在某些实施方案中,并入杆粒中的多核苷酸(即多核苷酸插入序列)可包含可操作地连接于蛋白质编码核苷酸序列的表达控制序列。在某些实施方案中,并入杆粒中的多核苷酸可包含表达控制序列,其包含启动子,例如p10或polh,并且其可操作地连接于编码结构aav衣壳蛋白(例如vp1、vp2、vp3或其组合)的核苷酸序列。在某些实施方案中,并入杆粒中的多核苷酸可包含表达控制序列,其包含启动子,例如p10或polh,并且其可操作地连接于编码非结构aav衣壳蛋白(例如rep78、rep52或其组合)的核苷酸序列。
[0491]
在某些实施方案中,多核苷酸插入序列可在杆状病毒基因的位置处并入杆粒中。在某些实施方案中,多核苷酸插入序列可在非必需杆状病毒基因的位置处并入杆粒中。在某些实施方案中,多核苷酸插入序列可通过用多核苷酸插入序列代替杆状病毒基因或杆状病毒基因的一部分而并入杆粒中。在某些实施方案中,多核苷酸插入序列可通过用融合多核苷酸代替杆状病毒基因或杆状病毒基因的一部分而并入杆粒中,所述融合多核苷酸包含多核苷酸插入序列和代替的杆状病毒基因(或其部分)。
[0492]
在某些实施方案中,多核苷酸插入序列可通过用多核苷酸插入序列分裂杆状病毒基因而并入杆粒中(即将多核苷酸插入序列并入至基因中部,使基因的5'部分与杆粒基因的3'部分分离)。在某些实施方案中,多核苷酸插入序列可通过用融合多核苷酸分裂杆状病毒基因而并入杆粒中,所述融合多核苷酸包含多核苷酸插入序列和分裂的杆状病毒基因的一部分。在某些实施方案中,融合多核苷酸的3'端包含分裂的基因的5'部分,使得融合多核苷酸中的基因的5'部分与保留于杆粒中的基因的3'部分形成完整杆状病毒基因或其功能部分。在某些实施方案中,融合多核苷酸的5'端包含分裂的基因的3'部分,使得融合多核苷酸中的基因的3'部分与保留于杆粒中的基因的5'部分形成完整杆状病毒基因或其功能部分。
[0493]
在某些实施方案中,多核苷酸可在与杆状病毒基因相关的限制性核酸内切酶(ren)切割位点(即ren进入点)的位置处并入杆粒中。在某些实施方案中,杆粒中的ren进入点为fsei(与gta杆状病毒基因相对应)(ggccggcc)。在某些实施方案中,杆粒中的ren进入点为sdai(与dna聚合酶杆状病毒基因相对应)(cctgcagg)。在某些实施方案中,杆粒中的ren进入点为maubi(与lef
‑
4杆状病毒基因相对应)(cgcgcgcg)。在某些实施方案中,杆粒中的ren进入点为sbfi(与gp64/gp67杆状病毒基因相对应)(cctgcagg)。在某些实施方案中,
杆粒中的ren进入点为i
‑
ceui(与v
‑
cath杆状病毒基因相对应)(seq id no:1752)。在某些实施方案中,杆粒中的ren进入点为avrii(与egt杆状病毒基因相对应)(cctagg)。在某些实施方案中,杆粒中的ren进入点为nhei(gctagc)。在某些实施方案中,杆粒中的ren进入点为spei(actagt)。在某些实施方案中,杆粒中的ren进入点为bstz17i(gtatac)。在某些实施方案中,杆粒中的ren进入点为ncoi(ccatgg)。在某些实施方案中,杆粒中的ren进入点为mlui(acgcgt)。
[0494]
在杆粒为双链构建体的某些实施方案中,ren切割位点可在一条链中包含切割序列,并且在另一条链中包含切割序列的反向互补序列(其也充当切割序列)。多核苷酸插入序列(或其链)可因此包含ren切割序列或反向互补ren切割序列(其一般为功能上可互换的)。作为一个非限制性实例,多核苷酸插入序列的链可包含fsei切割序列(ggccggcc)或其反向互补ren切割序列(ccggccgg)。
[0495]
多核苷酸可通过以下并入这些ren进入点中:(i)提供已被工程化以包含目标ren切割序列的多核苷酸插入序列(例如被工程化以在多核苷酸的两端包含fsei ren序列的多核苷酸插入序列);(ii)提供杆粒,其包含用于多核苷酸插入序列的目标ren进入点(例如acmnpv杆粒bmon14272的变体,其包含用适当ren酶消化ren工程化多核苷酸的fsei切割位点(ii)(例如使用fsei酶消化在两端包含fsei区的ren工程化多核苷酸,以产生多核苷酸
‑
fsei插入序列);(iii)用相同ren酶消化杆粒以在ren进入点产生单切杆粒(例如使用fsei酶在fsei位置处产生单切杆粒);以及(iv)使用适当接合酶,例如t4接合酶将多核苷酸插入序列接合至单切杆粒中。结果是工程化杆粒dna,其在目标ren进入点包含工程化多核苷酸插入序列。
[0496]
可重复插入过程一次或多次,以在不同ren进入点将其他工程化多核苷酸插入序列并入至相同杆粒中(例如在egt中的avrii ren进入点插入第一工程化多核苷酸插入序列,接着在cath基因中的i
‑
ceui ren进入点插入第二工程化多核苷酸插入序列,并且接着在gta基因中的fsei ren进入点插入第三工程化多核苷酸插入序列)。
[0497]
在某些实施方案中,限制性核酸内切酶(ren)切割可用于从杆粒去除一个或多个野生型基因。在某些实施方案中,限制性核酸内切酶(ren)切割可用于去除先前已插入至杆粒中的一个或多个工程化多核苷酸插入序列。在某些实施方案中,限制性核酸内切酶(ren)切割可用于用包含相同ren切割序列的不同工程化多核苷酸插入序列代替一个或多个工程化多核苷酸插入序列(例如fsei ren进入点处的工程化多核苷酸插入序列可用包含fsei ren切割序列的不同工程化多核苷酸插入序列代替)。
[0498]
表达控制
[0499]
表达控制区
[0500]
本公开的病毒表达构建体可包含由表达控制序列编码的一个或多个表达控制区。在某些实施方案中,表达控制序列用于在病毒生产细胞,例如昆虫细胞中表达。在某些实施方案中,表达控制序列可操作地连接于蛋白质编码核苷酸序列。在某些实施方案中,表达控制序列可操作地连接于vp编码核苷酸序列或rep编码核苷酸序列。
[0501]
本文中,术语“编码核苷酸序列”、“蛋白质编码基因”或“蛋白质编码核苷酸序列”是指编码或被翻译成蛋白质产物例如vp蛋白质或rep蛋白质的核苷酸序列。“可操作地连接”意指表达控制序列相对于编码序列定位,使其可促进编码基因产物的表达。
[0502]“表达控制序列”是指调控其可操作地连接的核苷酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调控核苷酸序列的转录和/或翻译时,表达控制序列“可操作地连接”于核苷酸序列。因此,表达控制序列可包括启动子、增强子、未翻译区(utr)、内部核糖体进入位点(ires)、转录终止子、蛋白质编码基因前面的起始密码子、内含子的剪接信号和终止密码子。在最低限度下,术语“表达控制序列”意在包含其存在被设计以影响表达的序列,并且还可包含额外有利组分。举例来说,前导序列和融合伴侣序列为表达控制序列。所述术语还可包含核酸序列的设计,使得从所述序列去除框中和框外的非所需潜在起始密码子。其还可包含核酸序列的设计,以使得去除非所需潜在剪接位点。其包含序列或多聚腺苷酸化序列(pa),所述序列引导polya尾添加,polya尾即mrna的3'端处的一串腺嘌呤残基,序列称为polya序列。其也可被设计以增强mrna稳定性。在昆虫细胞中已知影响转录和翻译稳定性的表达控制序列,例如启动子,以及影响翻译的序列,例如kozak序列。表达控制序列可具有如下性质:调节其可操作地连接的核苷酸序列,以便实现更低表达水平或更高表达水平。
[0503]
在某些实施方案中,表达控制序列可包含一个或多个启动子。启动子可包括但不限于杆状病毒主要晚期启动子、昆虫病毒启动子、非昆虫病毒启动子、脊椎动物病毒启动子、核基因启动子、来自包含病毒和非病毒元件的一个或多个物种的嵌合启动子和/或合成启动子。在某些实施方案中,启动子可为ctx、op
‑
ei、ei、δei、ei
‑
1、ph、pio、polh(多面体)、δpolh、dmhsp70、hr1、hsp70、4xhsp27 ecre 最小hsp70、ie、ie
‑
1、δie
‑
1、δie、p10、δp10(p10的修饰变体或衍生物)、p5、p19、p35、p40、p6.9和其变体或衍生物。在某些实施方案中,启动子为ctx启动子。在某些实施方案中,启动子为p10启动子。在某些实施方案中,启动子为polh启动子。在某些实施方案中,启动子可选自组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子、细胞周期特异性启动子和其变体或衍生物。在某些实施方案中,启动子可为cmv启动子、α1
‑
抗胰蛋白酶(α1
‑
at)启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白(lps)启动子、hcr
‑
apocii杂合启动子、hcr
‑
haat杂合启动子、白蛋白启动子、载脂蛋白e启动子、α1
‑
at eaib启动子、肿瘤选择性e2f启动子、单核血液il
‑
2启动子和其变体或衍生物。在某些实施方案中,启动子为低表达启动子序列。在某些实施方案中,启动子为表达增强的启动子序列。在某些实施方案中,启动子可包含如美国专利申请20110136227中所述的rep或cap启动子,所述美国专利申请关于表达启动子的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0504]
在某些实施方案中,病毒表达构建体可在所有核苷酸序列中包含相同启动子。在某些实施方案中,病毒表达构建体可在两个或更多个核苷酸序列中包含相同启动子。在某些实施方案中,病毒表达构建体可在两个或更多个核苷酸序列中包含不同启动子。在某些实施方案中,病毒表达构建体可在所有核苷酸序列中包含不同启动子。
[0505]
在某些实施方案中,病毒表达构建体编码元件以改善在某些细胞类型中的表达。在另一个实施方案中,表达构建体可包含polh和/或δie
‑
1昆虫转录启动子、cmv哺乳动物转录启动子和/或p10昆虫特异性启动子,以在哺乳动物或昆虫细胞中表达所需基因。
[0506]
超过一个表达控制序列能够可操作地连接于给定核苷酸序列。举例来说,启动子序列、翻译起始序列和终止密码子能够可操作地连接于核苷酸序列。
[0507]
在某些实施方案中,病毒表达构建体可包含蛋白质编码核苷酸序列之间的一个或多个表达控制序列。在某些实施方案中,表达控制区可包含ires序列区,其包含编码内部核
糖体进入位点(ires)的ires核苷酸序列。内部核糖体进入位点(ires)可选自由以下组成的组:来自口蹄疫病毒的fmdv
‑
ires、来自脑心肌炎病毒的emcv
‑
ires以及其组合。
[0508]
在某些实施方案中,表达控制区可包含2a序列区域,其包含编码病毒2a肽的2a核苷酸序列。序列允许在单一开放阅读框(orf)内共翻译多个多肽。随着orf被翻译,甘氨酸和脯氨酸残基与2a序列防止形成正常肽键,其导致多肽链内的核糖体“跳跃”和“自切割”。病毒2a肽可选自由以下组成的组:来自口蹄疫病毒的f2a、来自明脉扁刺蛾病毒的t2a、来自马a型鼻炎病毒的e2a、来自猪捷申病毒
‑
1的p2a、来自质型多角体病毒的bmcpv2a、来自家蚕软化病病毒的bmifv 2a以及其组合。
[0509]
在某些实施方案中,病毒表达构建体可含有包含起始密码子区的核苷酸序列,例如编码包含一个或多个起始密码子区的aav衣壳蛋白的序列。在某些实施方案中,起始密码子区可在表达控制序列内。
[0510]
本公开的方法不受使用特定表达控制序列限制。然而,当实现vp产物的某一化学计量(分别对于vp1、vp2和vp3,接近1:1:10)时,以及当rep52或rep40(也称为p19 rep)的水平显著高于rep78或rep68(也称为p5 rep)时,可获得生产细胞(例如昆虫细胞)中改进的aav产率。在某些实施方案中,p5/p19比低于0.6、低于0.4或低于0.3,但始终为至少0.03。这些比率可在蛋白质水平上测量或者可与特异性mrna的相对水平有关。
[0511]
在某些实施方案中,aav颗粒生产于病毒生产细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)中,其中所有三种vp蛋白质均以接近、约或为1:1:10(vp1:vp2:vp3)的化学计量表达。
[0512]
在某些实施方案中,aav颗粒生产于病毒生产细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)中,其中所有三种vp蛋白质均以接近、约或为2:2:10(vp1:vp2:vp3)的化学计量表达。
[0513]
在某些实施方案中,aav颗粒生产于病毒生产细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)中,其中所有三种vp蛋白质均以接近、约或为2:0:10(vp1:vp2:vp3)的化学计量表达。
[0514]
在某些实施方案中,aav颗粒生产于病毒生产细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)中,其中所有三种vp蛋白质均以接近、约或为1
‑
2:0
‑
2:10(vp1:vp2:vp3)的化学计量表达。
[0515]
在某些实施方案中,aav颗粒生产于病毒生产细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)中,其中所有三种vp蛋白质均以接近、约或为1
‑
2:1
‑
2:10(vp1:vp2:vp3)的化学计量表达。
[0516]
在某些实施方案中,aav颗粒生产于病毒生产细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)中,其中所有三种vp蛋白质均以接近、约或为2
‑
3:0
‑
3:10(vp1:vp2:vp3)的化学计量表达。
[0517]
在某些实施方案中,aav颗粒生产于病毒生产细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)中,其中所有三种vp蛋白质均以接近、约或为2
‑
3:2
‑
3:10(vp1:vp2:vp3)的化学计量表达。
[0518]
在某些实施方案中,aav颗粒生产于病毒生产细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)中,其中所有三种vp蛋白质均以接近、约或为3:3:10(vp1:vp2:vp3)的化学计量表达。
[0519]
在某些实施方案中,aav颗粒生产于病毒生产细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)中,其中所有三种vp蛋白质均以接近、约或为3
‑
5:0
‑
5:10(vp1:vp2:vp3)的化学计量表达。
[0520]
在某些实施方案中,aav颗粒生产于病毒生产细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)中,其中所有三种vp蛋白质均以接近、约或为3
‑
5:3
‑
5:10(vp1:vp2:vp3)的化学计量表达。
[0521]
在某些实施方案中,表达控制区被工程化以产生选自由以下组成的组的vp1:vp2:vp3比:约或恰好1:0:10;约或恰好1:1:10;约或恰好2:1:10;约或恰好2:1:10;约或恰好2:2:10;约或恰好3:0:10;约或恰好3:1:10;约或恰好3:2:10;约或恰好3:3:10;约或恰好4:0:
generation of protein database search programs”,nucleic acids res.25:3389
‑
3402)。本文描述了其他工具,特别是在“同一性”的定义中。
[0531]
本公开的工程化多核苷酸可单独或与其他多核苷酸序列或特征组合并入载体或质粒中,所述多核苷酸序列或特征例如公开于国际公开wo2007046703和wo2007148971(公开在昆虫细胞中产生的替代起始密码子和aav载体);wo2009104964(公开aav蛋白质在昆虫细胞的表达优化并涉及启动子强度、增强子元件、温度控制的变化);以及wo2015137802(公开替代起始密码子、去除在昆虫细胞中产生的起始密码子和aav载体)中的特征,所述国际公开的内容各自通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0532]
在某些实施方案中,工程化5'utr包含80
‑
120个核苷酸、90
‑
110个核苷酸、95
‑
105个核苷酸、98
‑
100个核苷酸或约99个核苷酸或由其组成。在某些实施方案中,工程化5'utr包含24个核苷酸或由其组成。
[0533]
在某些实施方案中,工程化5'utr来源于aav2。在某些实施方案中,工程化5'utr来源于aav2。在某些实施方案中,工程化5'utr来源于aav9。在某些实施方案中,工程化5'utr来源于aavrh10。在某些实施方案中,工程化5'utr来源于aavphp.b。在某些实施方案中,工程化5'utr来源于表1中提供的aav血清型。
[0534]
5'utr发夹结构
[0535]
在某些实施方案中,工程化5'utr包含发夹结构。在某些实施方案中,工程化5'utr包含:5'utr的启动子5'(上游),其包含发夹的5'(上游)的“a”区域(5'侧翼区域)、位于茎环的3'(下游)的“b”区域(一个3'侧翼区域,其可包含一个起始密码子和所述起始密码子周围的kozak核苷酸)、表示茎
‑
环结构的茎的“c”区域,和环(其可在4
‑
16个核苷酸范围内)。在某些实施方案中,发夹结构可包含kozak序列(例如ttt)的全部或一部分。启动子和5'utr可与cap基因(其编码结构衣壳蛋白vp1、vp2和/或vp3)或rep基因(其编码非结构复制蛋白质rep78和rep52)相关。
[0536]
在某些实施方案中,工程化5'utr包含由发夹核苷酸序列编码的发夹结构。在某些实施方案中,发夹核苷酸序列包含前导序列。在某些实施方案中,发夹核苷酸序列包含前导序列和起始密码子(例如atg)。在某些实施方案中,发夹核苷酸序列包含前导序列和kozak序列序列或修饰kozak序列内的起始密码子(例如atg)。
[0537]
在某些实施方案中,工程化5'utr包含具有由5'侧翼序列编码的5'侧翼区域(即上游区域)的发夹结构。在某些实施方案中,5'侧翼序列可具有任何长度并且可全部或部分来源于野生型aav序列或完全为人工的。
[0538]
在某些实施方案中,工程化5'utr包含具有由3'侧翼序列编码的3'侧翼区域(即下游区域)的发夹结构。在某些实施方案中,3'侧翼序列可具有任何长度并且可全部或部分来源于野生型aav序列或完全为人工的。
[0539]
5'侧翼序列和3'侧翼序列可具有相同大小和来源,不同大小、不同来源或不同大小和来源。可不存在任一侧翼序列。5'侧翼序列可包含2
‑
50、2
‑
40、2
‑
30、2
‑
20或2
‑
15个核苷酸或由其组成。3'侧翼序列可包含2
‑
50、2
‑
40、2
‑
30、2
‑
20或2
‑
15个核苷酸或由其组成。3'侧翼序列可任选地含有一种或多种aav蛋白质的起始密码子以及例如kozak或修饰kozak序列的其他序列。
[0540]
在某些实施方案中,工程化5'utr包含发夹结构,其包含茎
‑
环结构。在某些实施方
案中,发夹结构包含茎区域和环区域。在某些实施方案中,发夹结构包含茎区域、环区域和茎互补区。茎
‑
环结构可包含由茎序列编码的茎区域。茎
‑
环结构可包含由环序列编码的环区域。茎
‑
环结构可包含由茎互补序列编码的茎互补区。形成发夹的茎
‑
环结构的茎是成对的或基本上成对的2至50对的核碱基。茎可含有一个或多个错配、凸出或环。在某些实施方案中,茎序列与茎互补序列100%互补(即零错配)。在某些实施方案中,茎序列和茎互补序列包含零个、一个、二个、三个、四个或五个错配。
[0541]
在某些实施方案中,工程化5'utr包含表5中提供的发夹结构,或表5中所列出的上游、茎(上游)、环、茎(下游)和/或下游组分的组合。发夹的环部分的位置中对具有呈大写字母的典型atg起始密码子的序列加下划线。
[0542]
表5
‑
5'utr发夹结构
[0543]
[0544][0545]
在某些实施方案中,工程化5'utr包含发夹结构或其组分,其由选自seq id no:1753
‑
1768的发夹核苷酸序列编码。在某些实施方案中,工程化5'utr包含由与seq id no:1753
‑
1768具有至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性或至少95%同一性的核苷酸序列编码的发夹结构或其组分。
[0546]
g:c含量
[0547]
在某些实施方案中,本公开的工程化5'utr可包含核苷酸序列,例如前导序列,其具有变化的g:c含量或百分比。在某些实施方案中,5'utr的5'侧翼区域具有变化的g:c含量。在某些实施方案中,5'utr的茎具有变化的g:c含量。在某些实施方案中,5'utr的3'侧翼区域具有变化的g:c含量。在某些实施方案中,工程化5'utr的g:c含量为10%
‑
80%、20%
‑
70%、25%
‑
65%或30%
‑
60%。在某些实施方案中,工程化5'utr的g:c含量为约25%、约30%、34%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、58%、约60%、62%或约65%。
[0548]
在某些实施方案中,工程化5'utr包含98
‑
100个核苷酸或由其组成,并且包含约25%、约30%、34%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、58%、约60%、62%或约65%的g:c含量。
[0549]
修饰的kozak序列
[0550]
真核mrna的翻译起始位点部分地由称作kozak序列的核苷酸序列控制,如kozak,m cell.1986年1月31日;44(2):283
‑
92和kozak,m.j cell biol.1989年2月;108(2):229
‑
41中所述,其关于kozak序列和其用途的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。kozak形式的天然存在和合成(即修饰的或工程化的)翻译起始位点均可用于通过分子遗传技术生产多肽,如kozak,m.mamm genome.1996年8月;7(8):563
‑
74中所述,其关于kozak序列和其用途的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。kozak
共同序列通常定义为gccrcc(nnn)gc(seq.id no:1788),其中r是嘌呤(即a或g)并且其中(nnn)代表翻译起始起始密码子,例如次最佳起始密码子。在某些实施方案中,kozak序列被修饰以提供vp
‑
编码区的漏泄核糖体扫描。vp1生产的任何相应增加将相反地降低vp3翻译,使得vp1起始速率的边缘变化可诱导vp1/vp3比率的较大变化。如本文所用,术语“修饰的kozak序列”或“工程化kozak序列”表示改变的kozak序列,例如包含核苷酸突变、添加或缺失的kozak序列。
[0551]
在某些实施方案中,本公开的工程化5'utr可包含修饰的kozak序列,例如修饰的弱kozak序列。在某些实施方案中,本公开的工程化5'utr可包含修饰的kozak序列,其包含vp起始密码子和/或vp翻译起始区域或与其相关。在某些实施方案中,本公开的工程化5'utr可包含修饰的kozak序列,其包含vp1起始密码子和/或vp1翻译起始区域或与其相关。在某些实施方案中,本公开的工程化5'utr可包含修饰的kozak序列,其包含vp2起始密码子和/或vp2翻译起始区域或与其相关。在某些实施方案中,本公开的工程化5'utr可包含修饰的kozak序列,其包含vp3起始密码子和/或vp3翻译起始区域或与其相关。
[0552]
在某些实施方案中,本公开的工程化5'utr可包含选自表6的修饰的kozak序列。
[0553]
表6
‑
修饰的kozak序列
[0554]
序列seq id no:tttagatggct1789tttagatgttg1790tttttatgttg1791
[0555]
在某些实施方案中,本公开的工程化5'utr可包含选自seq id no:1789
‑
1791的修饰的kozak序列。在某些实施方案中,本公开的工程化5'utr可包含与选自seq id no:1789
‑
1791的修饰的kozak序列具有至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性或至少95%同一性的修饰的kozak序列。
[0556]
在某些实施方案中,本公开的工程化5'utr可包含seq id no:1789的修饰的kozak序列。在某些实施方案中,本公开的工程化5'utr可包含seq id no:1790的修饰的kozak序列。在某些实施方案中,本公开的工程化5'utr可包含seq id no:1791的修饰的kozak序列。
[0557]
在某些实施方案中,修饰的kozak序列被工程化或选择以产生选自以下的vp1:vp2:vp3比:约或恰好1:1:10;约或恰好2:2:10;约或恰好3:3:10;约或恰好4:4:10;约或恰好5:5:10;约或恰好1
‑
2:1
‑
2:10;约或恰好1
‑
3:1
‑
3:10;约或恰好1
‑
4:1
‑
4:10;约或恰好1
‑
5:1
‑
5:10;约或恰好2
‑
3:2
‑
3:10;约或恰好2
‑
4:2
‑
4:10;约或恰好2
‑
5:2
‑
5:10;约或恰好3
‑
4:3
‑
4:10;约或恰好3
‑
5:3
‑
5:10;以及约或恰好4
‑
5:4
‑
5:10。
[0558]
在某些实施方案中,本公开提供了一种在例如昆虫细胞的病毒生产细胞中生产raav颗粒的方法。在某些实施方案中,所述方法包括(i)用有效负载构建体和病毒表达构建体转染病毒生产细胞(例如sf9昆虫细胞),所述病毒表达构建体包含编码修饰的kozak序列的核苷酸序列以及编码vp1、vp2和/或vp3衣壳蛋白的序列,以及(ii)在适合于生产raav颗粒的条件下培养昆虫细胞。
[0559]
病毒生产细胞和载体
[0560]
哺乳动物细胞
[0561]
本文所公开的本公开的病毒生产描述了用于生产aav颗粒或病毒载体的工艺和方法,所述aav颗粒或病毒载体接触目标细胞以递送有效负载构建体(例如重组aav颗粒或病毒构建体),所述有效负载构建体包含编码有效负载分子的核苷酸。病毒生产细胞可选自任何生物有机体,包含原核(例如细菌)细胞,和真核细胞,包含昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
[0562]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒可在包含哺乳动物细胞的病毒生产细胞中产生。病毒生产细胞可包含哺乳动物细胞,例如源于哺乳动物的a549、weh1、3t3、10t1/2、bhk、mdck、cos 1、cos 7、bsc 1、bsc 40、bmt 10、vero.w138、hela、hek293、hek293t(293t)、saos、c2c12、l细胞、ht1080、hepg2和初级纤维母细胞、肝细胞和肌母细胞。病毒生产细胞可包含来源于哺乳动物物种的细胞,所述哺乳动物物种包括但不限于人类、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠或细胞类型,其包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞、细胞系转化细胞等。
[0563]
通常用于生产重组aav颗粒的aav病毒生产细胞包括但不限于hek293细胞、cos细胞、c127、3t3、cho、hela细胞、kb细胞、bhk和如美国专利第6,156,303号、第5,387,484号、第5,741,683号、第5,691,176号、第6,428,988号和第5,688,676号;美国专利申请2002/0081721和国际专利公开第wo 00/47757号、第wo 00/24916号和第wo 96/17947号中所述的其他哺乳动物细胞系,其内容各自通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。在某些实施方案中,aav病毒生产细胞是反式互补包装细胞系,其提供复制缺陷型辅助病毒(例如hek293细胞或其他ea反式互补细胞)缺失的功能。
[0564]
在某些实施方案中,包装细胞系293
‑
10
‑
3(atcc登录号pta
‑
2361)可用于生产aav颗粒,如美国专利第us6,281,010号中所述,其关于293
‑
10
‑
3包装细胞系和其用途的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0565]
在本公开的某些实施方案中,在磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子的控制下编码腺病毒e1a和腺病毒e1b的反式互补e1缺失型腺病毒载体的细胞系(例如hela细胞系)可用于如美国专利第6365394号中所述的aav颗粒生产,所述美国专利关于hela细胞系和其用途的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0566]
在某些实施方案中,aav颗粒使用三重转染方法在哺乳动物细胞中产生,其中有效负载构建体、细小病毒rep和细小病毒cap以及辅助构建体包含在三种不同构建体内。aav颗粒生产的三种组分的三重转染方法可用于生产小批量病毒以用于包括转导效率、目标组织(向性)评估和稳定性的测定。
[0567]
待配制aav颗粒可由三重转染或杆状病毒介导的病毒生产或本领域中已知的任何其他方法产生。可采用本领域中已知的任何合适的容许或包装细胞来产生载体。在某些实施方案中,使用提供从复制缺陷型辅助病毒缺失的功能的反式互补包装细胞系,例如293细胞或其他e1a反式互补细胞。
[0568]
基因盒可含有小病毒(例如aav)cap和rep基因中的一些或全部。在某些实施方案中,通过将编码衣壳和/或rep蛋白质的包装载体引入至细胞中来以反式形式提供cap和rep功能中的一些或全部。在某些实施方案中,基因盒不编码衣壳或rep蛋白质。或者,使用被稳定转化以表达cap和/或rep基因的包装细胞系。
[0569]
在某些实施方案中,根据如us2016/0032254中所述的程序由培养上清液产生和纯化重组aav病毒颗粒,所述文件关于重组aav病毒颗粒的产生和处理的内容通过引用整体并
入本文,只要其不与本公开相冲突即可。产生还可涉及本领域中已知的方法,包括使用293t细胞的方法、三重转染或任何合适的生产方法。
[0570]
在某些实施方案中,哺乳动物病毒生产细胞(例如293t细胞)可呈粘着/粘附状态(例如与磷酸钙)或悬浮状态(例如与聚乙二亚胺(pei))。哺乳动物病毒生产细胞用生产aav所需的质粒(即aav rep/cap构建体、腺病毒辅助构建体和/或itr侧接有效负载构建体)转染。在某些实施方案中,转染过程可包含任选的培养基更换(例如对于呈粘着形式的细胞更换培养基、对于呈悬浮形式的细胞不更换培养基、对于呈悬浮形式的细胞在必要时更换培养基)。在某些实施方案中,转染过程可包含例如dmem或f17的转染培养基。在某些实施方案中,转染培养基可包含血清或者可不含血清(例如具有磷酸钙和具有血清的粘着状态的细胞、具有pei和无血清的悬浮液状态的细胞)。
[0571]
细胞可随后通过刮擦(粘附形式)和/或粒化(悬浮形式和刮擦的粘附形式)收集并转移至容器中。可视需要重复收集步骤以完全收集产生的细胞。接着,可通过连续冻融循环(
‑
80c至37c)、化学性溶胞(例如添加洗涤剂曲拉通(triton))、机械性溶胞或通过使细胞培养物在达到约0%活力之后降解来实现细胞溶胞。通过离心和/或深层过滤去除细胞碎片。通过dna qpcr通过dna酶抗性基因组滴定针对aav颗粒对样品进行定量。
[0572]
根据基因组拷贝数(每毫升基因组颗粒数)测量aav颗粒滴度。基因组颗粒浓度是基于如先前所报道的载体dna的dna qpcr(clark等人,(1999)hum.gene ther.,10:1031
‑
1039;veldwijk等人,(2002)mol.ther.,6:272
‑
278,其关于颗粒浓度的测量的内容各自通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可)。
[0573]
昆虫细胞
[0574]
本公开的病毒生产包括用于生产aav颗粒或病毒载体的工艺和方法,所述aav颗粒或病毒载体可接触目标细胞以递送有效负载构建体(例如重组病毒构建体),所述有效负载构建体包含编码有效负载分子的核苷酸。在某些实施方案中,本公开的aav颗粒或病毒载体可在包含昆虫细胞的病毒生产细胞中产生。
[0575]
在培养物中昆虫细胞的生长条件和在培养物中昆虫细胞中的异源产物的产生是本领域众所周知的,参见美国专利第6,204,059号,其关于昆虫细胞在病毒生产中的生长和用途的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0576]
可根据本公开使用允许复制细小病毒并且可维持在培养物中的任何昆虫细胞。通常用于生产重组aav颗粒的aav病毒生产细胞包括但不限于草地贪夜蛾,包括但不限于sf9或sf21细胞系;果蝇细胞系;或蚊子细胞系,例如白纹伊蚊(aedes albopictus)源性细胞系。昆虫细胞用于表达异源蛋白质的用途已被充分证明,将核酸(例如载体,例如昆虫细胞相容性载体)引入此类细胞的方法和此类细胞在培养物中维持的方法也已充分证明。参见例如methods in molecular biology,richard编,humana press,nj(1995);o'reilly等人,baculovirus expression vectors,a laboratory manual,oxford univ.press(1994);samulski等人,j.vir.63:3822
‑
8(1989);kajigaya等人,proc.nat'l.acad.sci.usa 88:4646
‑
50(1991);ruffing等人,j.vir.66:6922
‑
30(1992);kimbauer等人,vir.219:37
‑
44(1996);zhao等人,vir.272:382
‑
93(2000);和samulski等人,美国专利第6,204,059号,其关于昆虫细胞在病毒生产中的用途的内容各自通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0577]
在一个实施方案中,使用wo2015/191508中所述的方法制得aav颗粒,其内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0578]
在某些实施方案中,可使用昆虫宿主细胞系统与杆状病毒系统的组合(例如如luckow等人,bio/technology 6:47(1988)所述)。在某些实施方案中,用于制备嵌合肽的表达系统为粉纹夜蛾(trichoplusia ni),tn 5b1
‑
4昆虫细胞/杆状病毒系统,其可用于高蛋白质水平,如美国专利第6660521号中所述,其内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0579]
昆虫细胞的扩增、培养、转染、感染和储存可在本领域中已知的任何细胞培养基、细胞转染培养基或储存培养基中进行,包括hyclone sfx昆虫细胞培养基、expression system esf af昆虫细胞培养基、basal ipl
‑
41昆虫细胞培养基、thermofisher sf900ii培养基、thermofisher sf900iii培养基或thermofisher grace昆虫培养基。本公开的昆虫细胞混合物还可包含本公开所述的配制添加剂或元件中的任一者,其包括(但不限于)盐、酸、碱、缓冲液、表面活性剂(例如泊洛沙姆188/普洛尼克f
‑
68)和其他已知培养基元件。配制添加剂可逐渐或作为“峰值”(在短时间内并入大量体积)并入。
[0580]
杆状病毒生产系统
[0581]
在某些实施方案中,本公开的工艺可包括使用病毒表达构建体和有效负载构建体载体在杆状病毒系统中生产aav颗粒或病毒载体。在某些实施方案中,杆状病毒系统包含杆状病毒表达载体(bev)和/或杆状病毒感染的昆虫细胞(biic)。在某些实施方案中,本公开的病毒表达构建体或有效负载构建体可为杆粒,也称为杆状病毒质粒或重组杆状病毒基因组。在某些实施方案中,本公开的病毒表达构建体或有效负载构建体可为多核苷酸,其通过本领域技术人员已知和进行的标准分子生物学技术由同源重组(转座子供体/受体系统)并入至杆粒中。转染独立病毒复制细胞群体产生两组或更多组(例如两组、三组)杆状病毒(bev),其中的一个或多个组可包含病毒表达构建体(表达bev),并且其中的一个或多个组可包含有效负载构建体(有效负载bev)。杆状病毒可用于感染病毒生产细胞以生产aav颗粒或病毒载体。
[0582]
在某些实施方案中,所述工艺包括转染单一病毒复制细胞群体以产生包含病毒表达构建体和有效负载构建体的单一杆状病毒(bev)组。这些杆状病毒可用于感染病毒生产细胞以生产aav颗粒或病毒载体。
[0583]
在某些实施方案中,使用杆粒转染剂,例如promega fugene hd、wfi水或thermofisher cellfectin ii试剂来产生bev。在某些实施方案中,在例如昆虫细胞的病毒生产细胞中产生和扩增bev。
[0584]
在某些实施方案中,所述方法利用包含一种或多种bev(包含杆状病毒感染的昆虫细胞(biic))的病毒生产细胞的种子培养物。种子biic已用包含病毒表达构建体的表达bev以及包含有效负载构建体的有效负载bev转染/转导/感染。在某些实施方案中,收获种子培养物,将其分成等分试样并冷冻,并且可在稍后使用以起始原生生产细胞群体的转染/转导/感染。在某些实施方案中,将一组种子biic储存于
‑
80℃下或ln2蒸气中。
[0585]
杆状病毒由若干必需蛋白质制成,所述必需蛋白质对于杆状病毒的功能和复制是必需的,例如复制蛋白、包膜蛋白和衣壳蛋白。杆状病毒基因组因此包含编码必需蛋白质的若干必需基因核苷酸序列。作为一个非限制性实例,基因组可包含必需基因区,其包含编码
用于杆状病毒构建体的必需蛋白质的必需基因核苷酸序列。必需蛋白质可包含:gp64杆状病毒包膜蛋白、vp39杆状病毒衣壳蛋白或用于杆状病毒构建体的其他类似的必需蛋白质。
[0586]
用于在包括但不限于草地贪夜蛾(sf9)细胞的昆虫细胞中生产aav颗粒的杆状病毒表达载体(bev)提供高滴度的病毒载体产物。编码病毒表达构建体和有效负载构建体的重组杆状病毒起始病毒载体复制细胞的产毒性感染(productive infection)。由初级感染释放的感染性杆状病毒颗粒在培养物中二次感染额外细胞,在多个感染周期中以指数方式感染整个细胞培养物群体,其为初始感染倍率的函数,参见urabe,m.等人,j virol.2006年2月;80(4):1874
‑
85,其关于bev和病毒颗粒的产生和用途的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0587]
在昆虫细胞系统中产生具有杆状病毒的aav颗粒可解决已知杆状病毒基因和物理不稳定性。
[0588]
在某些实施方案中,通过利用无滴度感染细胞保存和按比例扩大系统,本公开的产生系统在多次传代内解决杆状病毒不稳定性。病毒生产细胞的小规模种子培养物用编码aav颗粒的结构和/或非结构组分的病毒表达构建体转染。杆状病毒感染的病毒生产细胞收获到可在液氮中低温保存的等分试样;所述等分试样保留了感染大规模病毒生产细胞培养物的活力和感染性,wasilko dj等人,protein expr purif.2009年6月;65(2):122
‑
32,其关于bev和病毒颗粒的产生和用途的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0589]
遗传稳定的杆状病毒可用于生产用以在无脊椎细胞中生产aav颗粒的组分中的一者或多者的来源。在某些实施方案中,缺陷性杆状病毒表达载体可游离地维持在昆虫细胞中。在这种实施方案中,相应杆粒载体用复制控制元件(包括但不限于启动子、增强子和/或细胞周期调节的复制元件)工程化。
[0590]
在某些实施方案中,杆状病毒可用标记物工程化以用于重组至壳质酶/组织蛋白酶基因座中。chia/v
‑
cath基因座对于在组织培养物中繁殖杆状病毒是非必要的,并且v
‑
cath(ec 3.4.22.50)是对含有底物的arg
‑
arg二肽活性最强的半胱氨酸内切蛋白酶。arg
‑
arg二肽存在于浓核病毒和细小病毒衣壳结构蛋白质中但偶尔出现于依赖病毒vp1中。
[0591]
在某些实施方案中,容许杆状病毒感染的稳定病毒生产细胞用aav复制和载体产生所需元件中的任一者的至少一个稳定整合拷贝工程化,所述至少一个拷贝包括但不限于完整aav基因组、rep和cap基因、rep基因、cap基因、呈独立转录盒形式的每个rep蛋白质、呈独立转录盒形式的每个vp蛋白质、aap(组装活化蛋白质)或具有原生或非原生启动子的至少一种杆状病毒辅助基因。
[0592]
在某些实施方案中,杆状病毒表达载体(bev)是基于acmnpv杆状病毒或bmnpv杆状病毒bmnpv。在某些实施方案中,本公开的杆粒是基于acmnpv杆粒如bmon14272、vace25ko或vaclef11ko(即工程化变体)。
[0593]
在某些实施方案中,杆状病毒表达载体(bev)是其中杆状病毒v
‑
cath基因已部分或完全缺失(“v
‑
cath缺失的bev”)或突变的bev。在某些实施方案中,bev缺乏v
‑
cath基因或包含v
‑
cath基因的突变不活化型式。在某些实施方案中,bev缺乏v
‑
cath基因。在某些实施方案中,bev包含v
‑
cath基因的突变不活化型式。
[0594]
本公开的病毒生产杆粒可包含某些杆状病毒基因或基因座的缺失。
[0595]
杆状病毒/sf9系统是用于raav生产建立的cgmp相容性和可调式制造平台。杆状病毒接种物是这种制造过程的关键原料并且可对过程产量和产物质量具有显著影响。然而,如同任何其他基于生物的生产工艺一样,杆状病毒接种物的生产批次间存在较大变化可能性。每个杆状病毒接种物库需要广泛的分析性表征和优化的生物反应器生产参数,以最佳用于raav生产(其增加了大规模制造的时间和成本)。因此有利的是产生大量杆状病毒接种物,因为这些较大库允许来自相同杆状病毒接种物库的多种制造活动中的大规模生物反应器中一致且可重复地生产raav。
[0596]
在某些实施方案中,杆状病毒接种物库可使用小规模摇瓶,例如3l或5l摇瓶产生。然而,该工艺通常受限于可产生的biic细胞的最大细胞密度,并且因此需要离心以将所得细胞浓缩至可工作浓度。这相应地限制了可使用这种方法产生和储存的杆状病毒接种物库的体积(即数量)(约600ml)。由于开放操作,这个过程也存在无菌问题。
[0597]
在某些实施方案中,杆状病毒接种物库可使用生物反应器,例如20
‑
50l生物反应器产生。然而,这个过程也通常受限于可产生的biic细胞的最大细胞密度,并且因此需要经由切向流过滤(tff)和/或离心显著处理,以将所得细胞浓缩至可工作浓度(需要3l培养物材料产生约600ml的浓缩biic制剂,对应于15
‑
25%产率)。这相应地限制了可使用这种方法产生和储存的杆状病毒接种物库的体积(即数量)(约3000ml)。由于开放操作,这个过程也存在无菌问题。
[0598]
在某些实施方案中,灌注技术可用于生产杆状病毒接种物库中。灌注系统为流体循环系统,其使用泵、过滤器与筛网的组合来截留生物反应器内部的细胞,同时不断地去除细胞废物并且通过细胞代谢替换缺乏营养物的培养基。在某些实施方案中,灌注系统是交替切向流(atf)灌注系统。在某些实施方案中,灌注系统可与生物反应器协同使用,以在产生杆状病毒感染的昆虫细胞(biic)期间管理和循环生物反应器内的细胞培养基。在某些实施方案中,灌注系统可用于支持大规模生产具有出乎意料的高细胞密度的高质量biic库。在某些实施方案中,灌注系统可用于提供大于70%(例如75
‑
80%、80
‑
85%、85
‑
90%、90
‑
95%或95
‑
100%)的感染细胞与生产细胞产率。在某些实施方案中,灌注系统可用于在生物反应器内进行培养基切换,例如用允许biic细胞冷冻和保存的低温保存培养基替换细胞培养基。
[0599]
本公开提供了用于生产杆状病毒感染的昆虫细胞(biic)的方法。在某些实施方案中,本公开提供了用于生产杆状病毒感染的昆虫细胞(biic)的方法,所述方法包括以下步骤:(a)将一定体积的细胞培养基引入生物反应器中;(b)将至少一种病毒生产细胞(vpc)引入生物反应器中并且在生物反应器中扩增vpc数量至目标vpc细胞密度;(c)将至少一种杆状病毒表达载体(bev)引入生物反应器中,其中bev包含aav病毒表达构建体或aav有效负载构建体;(d)在允许至少一种bev感染至少一种vpc以产生杆状病毒感染的昆虫细胞(biic)的条件下温育所述生物反应器中的vpc与bev的混合物;(e)在允许生物反应器中的biic数目达到目标biic细胞密度的条件下温育生物反应器;以及(f)从生物反应器收获biic。在某些实施方案中,生物反应器的体积为至少5l、10l、20l、50l、100l或200l。在某些实施方案中,生物反应器中的细胞培养基的体积(即工作体积)为至少5l、10l、20l、50l、100l或200l。
[0600]
在某些实施方案中,bev引入时vpc密度为1.0
×
105‑
2.5
×
105、2.5
×
105‑
5.0
×
105、5.0
×
105‑
7.5
×
105、7.5
×
105‑
1.0
×
106、1.0
×
106‑
5.0
×
106、1.0
×
106‑
2.0
×
106、1.5
×
106‑
2.5
×
106、2.0
×
106‑
3.0
×
106、2.5
×
106‑
3.5
×
106、3.0
×
106‑
4.0
×
106、3.5
×
106‑
4.5
×
106、4.0
×
106‑
5.0
×
106、4.5
×
106‑
5.5
×
106、5.0
×
106‑
1.0
×
107、5.0
×
106‑
6.0
×
106、5.5
×
106‑
6.5
×
106、6.0
×
106‑
7.0
×
106、6.5
×
106‑
7.5
×
106、7.0
×
106‑
8.0
×
106、7.5
×
106‑
8.5
×
106、8.0
×
106‑
9.0
×
106、8.5
×
106‑
9.5
×
106、9.0
×
106‑
1.0
×
107、9.5
×
106‑
1.5
×
107、1.0
×
107‑
5.0
×
107或5.0
×
107‑
1.0
×
108个细胞/毫升。在某些实施方案中,bev引入时vpc密度为5.0
×
105、6.0
×
105、7.0
×
105、8.0
×
105、9.0
×
105、1.0
×
106、1.5
×
106、2.0
×
106、2.5
×
106、3.0
×
106、3.5
×
106、4.0
×
106、4.5
×
106、5.0
×
106、5.5
×
106、6.0
×
106、6.5
×
106、7.0
×
106、7.5
×
106、8.0
×
106、8.5
×
106、9.0
×
106、9.5
×
106、1.0
×
107、1.5
×
107、2.0
×
107、2.5
×
107、3.0
×
107、4.0
×
107、5.0
×
107、6.0
×
107、7.0
×
107、8.0
×
107或9.0
×
107个细胞/毫升。
[0601]
在某些实施方案中,bev引入时目标vpc细胞密度为1.5
‑
4.0
×
106个细胞/毫升。在某些实施方案中,bev引入时目标vpc细胞密度为2.0
‑
3.5
×
106个细胞/毫升。
[0602]
在某些实施方案中,将bev以bev与vpc的目标感染倍率(moi)引入生物反应器中。在某些实施方案中,bev moi为0.0005
‑
0.003,或更具体地0.001
‑
0.002。
[0603]
在某些实施方案中,生物反应器可包含用于管理生物反应器内的细胞培养基的灌注系统。在某些实施方案中,灌注系统为交替切向流(atf)灌注系统。在某些实施方案中,灌注系统替换生物反应器中的培养基的至少一部分,同时截留生物反应器内的至少90%的vpc和biic。在某些实施方案中,灌注系统从生物反应器内的细胞培养基去除细胞废物。在某些实施方案中,灌注系统已通过细胞代谢替换缺乏营养物的细胞培养基。在某些实施方案中,灌注系统用允许biic细胞冷冻和保存的低温保存培养基替换细胞培养基。在某些实施方案中,灌注系统用补充有生长或生产增强因子的细胞培养基替换细胞培养基来增加aav产物的质量和数量。
[0604]
在某些实施方案中,在特定biic细胞密度下从生物反应器收获biic。在某些实施方案中,从生物反应器收获的biic具有特定biic细胞密度。在某些实施方案中,收获时biic细胞密度为6.0
‑
18.0
×
106个细胞/毫升、8.0
‑
16.5
×
106个细胞/毫升、10.0
‑
16.5
×
106个细胞/毫升。
[0605]
其他
[0606]
在某些实施方案中,表达宿主包括但不限于埃希氏杆菌属(escherichia)、芽孢杆菌属(bacillus)、假单胞菌属(pseudomonas)或沙门氏菌属(salmonella)内的细菌物种。
[0607]
在某些实施方案中,可将包含稳定整合于细胞的染色体内的aav rep和cap基因的宿主细胞用于aav颗粒生产。在一个非限制性实例中,可根据美国专利第7238526号中所述的方法和构建体使用已稳定整合于其染色体中aav rep基因和aav cap基因的至少两个拷贝的宿主细胞来生产aav颗粒,所述美国专利关于病毒颗粒生产的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0608]
在某些实施方案中,aav颗粒可在用分子稳定转化的宿主细胞中产生,所述分子包含容许在宿主细胞中调控稀有限制性酶的表达的核酸序列,如us20030092161和ep1183380中所述,其关于生产病毒颗粒的内容通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0609]
在某些实施方案中,生产aav颗粒的生产方法和细胞系可包括但不限于以下所教
导的那些:pct/us1996/010245、pct/us1997/015716、pct/us1997/015691、pct/us1998/019479、pct/us1998/019463、pct/us2000/000415、pct/us2000/040872、pct/us2004/016614、pct/us2007/010055、pct/us1999/005870、pct/us2000/004755、美国专利申请第us08/549489号、us08/462014、us09/659203、us10/246447、us10/465302、美国专利第us6281010号、us6270996、us6261551、us5756283(指派为nih)、us6428988、us6274354、us6943019、us6482634、(指派为nih:us7238526、us6475769)、us6365394(指派为nih)、us7491508、us7291498、us7022519、us6485966、us6953690、us6258595、ep2018421、ep1064393、ep1163354、ep835321、ep931158、ep950111、ep1015619、ep1183380、ep2018421、ep1226264、ep1636370、ep1163354、ep1064393、us20030032613、us20020102714、us20030073232、us20030040101(指派为nih)、us20060003451、us20020090717、us20030092161、us20070231303、us20060211115、us20090275107、us2007004042、us20030119191、us20020019050,其内容各自通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[0610]
病毒生产系统
[0611]
大规模生产
[0612]
在某些实施方案中,aav颗粒生产可被修改以增大生产规模。根据本公开的大规模病毒生产方法可包括以下所教导的任何工艺或处理步骤中的任一者:美国专利第5,756,283号、第6,258,595号、第6,261,551号、第6,270,996号、第6,281,010号、第6,365,394号、第6,475,769号、第6,482,634号、第6,485,966号、第6,943,019号、第6,953,690号、第7,022,519号、第7,238,526号、第7,291,498号和第7,491,508号或国际公开第wo1996039530号、第wo1998010088号、第wo1999014354号、第wo1999015685号、第wo1999047691号、第wo2000055342号、第wo2000075353号和第wo2001023597号,其中每一者的内容通过引用整体并入本文。
[0613]
增大aav颗粒生产规模的方法通常包括增加病毒生产细胞的数目。在某些实施方案中,病毒生产细胞包含粘附细胞。为了通过粘附病毒生产细胞增大aav颗粒生产规模,需要较大细胞培养表面。在某些实施方案中,大规模生产方法包括使用滚瓶以增大细胞培养物表面。表面积增大的其他细胞培养基质是本领域中已知的。表面积增大的额外粘附细胞培养产物的实例包括但不限于icellis(pall corp,port washington,ny)、(corning corp.,corning,ny)和nunc
tm cell factory
tm
(thermo scientific,waltham,ma)。在某些实施方案中,大规模粘附细胞表面可包含约1,000cm2至约100,000cm2。
[0614]
在某些实施方案中,本公开的大规模病毒生产方法可包括使用悬浮细胞培养物。悬浮细胞培养物可允许显著增加细胞数目。典型地,可在约10
‑
50cm2表面积上生长的粘附细胞的数目可在悬浮液中的约1cm3体积中生长。
[0615]
在某些实施方案中,大规模细胞培养物可包含约107至约109个细胞、约108至约10
10
个细胞、约109至约10
12
个细胞或至少10
12
个细胞。在某些实施方案中,大规模培养物可生产约109至约10
12
个、约10
10
至约10
13
个、约10
11
至约10
14
个、约10
12
至约10
15
个或至少10
15
个aav颗粒。
[0616]
大规模培养物型式中的复制细胞的转染可根据本领域中已知的任何方法进行。对
于大规模粘附细胞培养物,转染方法可包括但不限于使用无机化合物(例如磷酸钙)、有机化合物(例如聚乙二亚胺(pei))或使用非化学方法(例如电穿孔)。对于悬浮液中的细胞生长,转染方法可包括但不限于使用无机化合物(例如磷酸钙)、有机化合物(例如聚乙二亚胺(pei))或使用非化学方法(例如电穿孔)。在某些实施方案中,可根据feng,l.等人,2008.biotechnol appl biochem 50:121
‑
32中所述的名称为“转染程序(transfection procedure)”的章节进行大规模悬浮培养物的转染,所述文献的内容通过引用整体并入本文。根据此类实施方案,可形成pei
‑
dna复合物以用于引入待转染的质粒。在某些实施方案中,用pei
‑
dna复合物转染的细胞可在转染之前进行
‘
休克’。这包括将细胞培养物温度降低至4℃持续约1小时的时段。在某些实施方案中,细胞培养物可休克约10分钟至约5小时的时段。在某些实施方案中,细胞培养物可在约0℃至约20℃的温度下休克。
[0617]
在某些实施方案中,转染可包含用于表达rna效应分子的一种或多种载体,以降低来自一种或多种有效负载构建体的核酸的表达。此类方法可通过减少在表达有效负载构建体上浪费的细胞资源来增加aav颗粒的生产。在某些实施方案中,此类方法可根据美国公开第us2014/0099666号中所教导的那些进行,所述美国公开的内容通过引用整体并入本文。
[0618]
生物反应器
[0619]
在某些实施方案中,细胞培养生物反应器可用于大规模生产aav颗粒。在某些实施方案中,生物反应器包含搅拌槽反应器。此类反应器通常包含具有搅拌器(例如叶轮)的容器,其形状通常为圆柱形。在某些实施方案中,此类生物反应器容器可置放于水夹套内以控制容器温度和/或将环境温度变化的影响降至最低。
[0620]
生物反应器容器体积的尺寸可在以下范围:约500ml至约2l、约1l至约5l、约2.5l至约20l、约10l至约50l、约25l至约100l、约75l至约500l、约250l至约2,000l、约1,000l至约10,000l、约5,000l至约50,000l或至少50,000l。容器底部可为圆形或平的。在某些实施方案中,动物细胞培养物可维持在具有圆形容器底部的生物反应器中。
[0621]
在某些实施方案中,生物反应器容器可经由使用热循环器升温。热循环器在水夹套周围泵送热水。在某些实施方案中,经加热的水可经由存在于生物反应器容器内的管道(例如蛇形管)泵送。在某些实施方案中,温热空气可在生物反应器周围循环,包括但不限于培养基正上方的空气空间。另外,可维持ph值和co2水平以优化细胞存活率。
[0622]
在某些实施方案中,生物反应器可包括中空纤维反应器。中空纤维生物反应器可支持固着依赖性和固着非依赖性细胞两者的培养物。其他生物反应器可包括但不限于填充床或固定床生物反应器。此类生物反应器可包括具有用于粘附细胞附着的玻璃珠的容器。其他填充床反应器可包含陶瓷珠粒。
[0623]
在某些实施方案中,病毒颗粒经由使用一次性生物反应器产生。在某些实施方案中,生物反应器可包括ge wave生物反应器、ge xcellerax生物反应器、sartorius biostat生物反应器、thermofisher hyclone生物反应器或pall allegro生物反应器。
[0624]
在某些实施方案中,细胞生物反应器培养物中的aav颗粒生产可根据美国专利第5,064764号、第6,194,191号、第6,566,118号、第8,137,948号或美国专利申请第us2011/0229971号中所教导的方法或系统进行,其中每一者的内容通过引用整体并入本文。
[0625]
在某些实施方案中,灌注技术可用于生产病毒颗粒。灌注系统是流体循环系统,其使用过滤器和筛网来截留生物反应器内部的细胞,同时通过细胞代谢不断地去除细胞废物
和缺乏营养物的培养基。在某些实施方案中,灌注系统是交替切向流(atf)灌注系统。在某些实施方案中,灌注系统可与生物反应器协同使用以在生产病毒颗粒,例如aav病毒颗粒期间管理和循环生物反应器内的细胞培养基。在某些实施方案中,灌注系统可用于支持大规模生产具有出乎意料的高细胞密度的高质量aav病毒颗粒。在某些实施方案中,灌注系统可用于在生物反应器内进行培养基交换,例如用补充有生长或生产增强因子的细胞培养基代替细胞培养基,以增大aav产物的质量和数量。
[0626]
有利的是在单次生产活动中生产大批次aav颗粒用于基因疗法临床发展活动,因为大批次治疗材料确保临床研究同一性和使由多种较小制造活动引起的治疗和统计变化降至最低。有利的是在单次生产活动中生产大批次aav颗粒用于商业产物发展活动,因为大批次治疗材料使因多种较小制造活动引起的变化和与小批次生产相关的质量控制和产物分析的相应并发症降至最低。
[0627]
扩增病毒生产细胞(vpc)混合物
[0628]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒或病毒载体可在病毒生产细胞(vpc),例如昆虫细胞中生产。生产细胞可源自细胞库(cb)并且通常储存于冷冻细胞库中。
[0629]
在某些实施方案中,来自细胞库的病毒生产细胞将以冷冻形式提供。将冷冻细胞小瓶解冻,通常直至冰晶消散。在某些实施方案中,冷冻细胞在10
‑
50℃、15
‑
40℃、20
‑
30℃、25
‑
50℃、30
‑
45℃、35
‑
40℃或37
‑
39℃的温度下解冻。在某些实施方案中,使用热水浴解冻冷冻的病毒生产细胞。
[0630]
在某些实施方案中,解冻的cb细胞混合物的细胞密度将为1.0
×
104‑
1.0
×
109个细胞/毫升。在某些实施方案中,解冻的cb细胞混合物的细胞密度为1.0
×
104‑
2.5
×
104个细胞/毫升、2.5
×
104‑
5.0
×
104个细胞/毫升、5.0
×
104‑
7.5
×
104个细胞/毫升、7.5
×
104‑
1.0
×
105个细胞/毫升、1.0
×
105‑
2.5
×
105个细胞/毫升、2.5
×
105‑
5.0
×
105个细胞/毫升、5.0
×
105‑
7.5
×
105个细胞/毫升、7.5
×
105‑
1.0
×
106个细胞/毫升、1.0
×
106‑
2.5
×
106个细胞/毫升、2.5
×
106‑
5.0
×
106个细胞/毫升、5.0
×
106‑
7.5
×
106个细胞/毫升、7.5
×
106‑
1.0
×
107个细胞/毫升、1.0
×
107‑
2.5
×
107个细胞/毫升、2.5
×
107‑
5.0
×
107个细胞/毫升、5.0
×
107‑
7.5
×
107个细胞/毫升、7.5
×
107‑
1.0
×
108个细胞/毫升、1.0
×
108‑
2.5
×
108个细胞/毫升、2.5
×
108‑
5.0
×
108个细胞/毫升、5.0
×
108‑
7.5
×
108个细胞/毫升或7.5
×
108‑
1.0
×
109个细胞/毫升。
[0631]
在某些实施方案中,cb细胞混合物的体积扩大。这个过程通常称为种子培养(seed train)、种子扩增(seed expansion)或cb细胞扩增(cb cellular expansion)。细胞/种子扩增可包括使用依次增大的工作体积经由多个扩增步骤来接种和扩增细胞混合物的连续步骤。在某些实施方案中,细胞扩增可包括一、二、三、四、五、六、七或超过七个扩增步骤。在某些实施方案中,细胞扩增的工作体积可包含以下工作体积或工作体积范围中的一者或多者:5ml、10ml、20ml、5
‑
20ml、25ml、30ml、40ml、50ml、20
‑
50ml、75ml、100ml、125ml、150ml、175ml、200ml、50
‑
200ml、250ml、300ml、400ml、500ml、750ml、1000ml、250
‑
1000ml、1250ml、1500ml、1750ml、2000ml、1000
‑
2000ml、2250ml、2500ml、2750ml、3000ml、2000
‑
3000ml、3500ml、4000ml、4500ml、5000ml、3000
‑
5000ml、5.5l、6.0l、7.0l、8.0l、9.0l、10.0l和5.0
‑
10.0l。
[0632]
在某些实施方案中,来自第一扩增细胞混合物的一定体积的细胞可用于接种第二
独立种子培养物/种子扩增物(而非使用解冻的cb细胞混合物)。这个过程通常称为“滚动接种(rolling inoculum)”。在某些实施方案中,滚动接种用于一系列的两个或更多个(例如两个、三个、四个或五个)独立种子培养物/种子扩增物中。
[0633]
在某些实施方案中,大体积细胞扩增可包括使用生物反应器,例如ge wave生物反应器、ge xcellerax生物反应器、sartorius biostat生物反应器、thermofisher hyclone生物反应器或pall allegro生物反应器。
[0634]
在某些实施方案中,工作体积内的细胞密度扩增至目标输出细胞密度。在某些实施方案中,扩增步骤的输出细胞密度为1.0
×
105‑
5.0
×
105、5.0
×
105‑
1.0
×
106、1.0
×
106‑
5.0
×
106、5.0
×
106‑
1.0
×
107、1.0
×
107‑
5.0
×
107、5.0
×
107‑
1.0
×
108、5.0
×
105、6.0
×
105、7.0
×
105、8.0
×
105、9.0
×
105、1.0
×
106、2.0
×
106、3.0
×
106、4.0
×
106、5.0
×
106、6.0
×
106、7.0
×
106、8.0
×
106、9.0
×
106、1.0
×
107、2.0
×
107、3.0
×
107、4.0
×
107、5.0
×
107、6.0
×
107、7.0
×
107、8.0
×
107或9.0
×
107个细胞/毫升。
[0635]
在某些实施方案中,工作体积的输出细胞密度提供用于更大的连续工作体积的接种细胞密度。在某些实施方案中,扩增步骤的接种细胞密度为1.0
×
105‑
5.0
×
105、5.0
×
105‑
1.0
×
106、1.0
×
106‑
5.0
×
106、5.0
×
106‑
1.0
×
107、1.0
×
107‑
5.0
×
107、5.0
×
107‑
1.0
×
108、5.0
×
105、6.0
×
105、7.0
×
105、8.0
×
105、9.0
×
105、1.0
×
106、2.0
×
106、3.0
×
106、4.0
×
106、5.0
×
106、6.0
×
106、7.0
×
106、8.0
×
106、9.0
×
106、1.0
×
107、2.0
×
107、3.0
×
107、4.0
×
107、5.0
×
107、6.0
×
107、7.0
×
107、8.0
×
107或9.0
×
107个细胞/毫升。
[0636]
在某些实施方案中,细胞扩增可持续1
‑
50天。每个细胞扩增步骤或总细胞扩增可持续1
‑
10天、1
‑
5天、1
‑
3天、2
‑
3天、2
‑
4天、2
‑
5天、2
‑
6天、3
‑
4天、3
‑
5天、3
‑
6天、3
‑
8天、4
‑
5天、4
‑
6天、4
‑
8天、5
‑
6天或5
‑
8天。在某些实施方案中,每个细胞扩增步骤或总细胞扩增可持续1
‑
100代、1
‑
1000代、100
‑
1000代、100代或更多代、或1000代或更多代。
[0637]
在某些实施方案中,感染或转染的生产细胞可以与cb细胞混合物相同的方式扩增,如本公开中所述。
[0638]
感染病毒生产细胞
[0639]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒在例如昆虫细胞的病毒生产细胞(vpc)中通过用包含aav表达构建体和/或包含aav有效负载构建体的病毒载体感染vpc来生产。在某些实施方案中,vpc用包含aav表达构建体的表达bev和包含aav有效负载构建体的有效负载bev感染。
[0640]
在某些实施方案中,通过用包含aav表达构建体和aav有效负载构建体二者的病毒载体感染vpc而生产aav颗粒。在某些实施方案中,vpc用包含aav表达构建体和aav有效负载构建体二者的单一bev感染。
[0641]
在某些实施方案中,在包括以下步骤的感染过程中使用感染biic来感染vpc(例如昆虫细胞):(i)将vpc集合接种至生产型生物反应器中;(ii)接种的vpc可任选地扩增至目标工作体积和细胞密度;(iii)将包含表达bev的感染biic和包含有效负载bev的感染biic注入生产型生物反应器中,得到感染的病毒生产细胞;以及(iv)温育感染的病毒生产细胞,以在病毒生产细胞内生产aav颗粒。
[0642]
在某些实施方案中,感染时vpc密度为1.0
×
105‑
2.5
×
105、2.5
×
105‑
5.0
×
105、5.0
×
105‑
7.5
×
105、7.5
×
105‑
1.0
×
106、1.0
×
106‑
5.0
×
106、1.0
×
106‑
2.0
×
106、1.5
×
106‑
2.5
×
106、2.0
×
106‑
3.0
×
106、2.5
×
106‑
3.5
×
106、3.0
×
106‑
3.4
×
106、3.0
×
106‑
4.0
×
106、3.5
×
106‑
4.5
×
106、4.0
×
106‑
5.0
×
106、4.5
×
106‑
5.5
×
106、5.0
×
106‑
1.0
×
107、5.0
×
106‑
6.0
×
106、5.5
×
106‑
6.5
×
106、6.0
×
106‑
7.0
×
106、6.5
×
106‑
7.5
×
106、7.0
×
106‑
8.0
×
106、7.5
×
106‑
8.5
×
106、8.0
×
106‑
9.0
×
106、8.5
×
106‑
9.5
×
106、9.0
×
106‑
1.0
×
107、9.5
×
106‑
1.5
×
107、1.0
×
107‑
5.0
×
107或5.0
×
107‑
1.0
×
108个细胞/毫升。在某些实施方案中,感染时vpc密度为5.0
×
105、6.0
×
105、7.0
×
105、8.0
×
105、9.0
×
105、1.0
×
106、1.5
×
106、2.0
×
106、2.5
×
106、3.0
×
106、3.1
×
106、3.2
×
106、3.3
×
106、3.4
×
106、3.5
×
106、4.0
×
106、4.5
×
106、5.0
×
106、5.5
×
106、6.0
×
106、6.5
×
106、7.0
×
106、7.5
×
106、8.0
×
106、8.5
×
106、9.0
×
106、9.5
×
106、1.0
×
107、1.5
×
107、2.0
×
107、2.5
×
107、3.0
×
107、4.0
×
107、5.0
×
107、6.0
×
107、7.0
×
107、8.0
×
107或9.0
×
107个细胞/毫升。在某些实施方案中,感染时vpc密度为2.0
‑
3.5
×
106个细胞/毫升。在某些实施方案中,感染时vpc密度为3.5
‑
5.0
×
106个细胞/毫升。在某些实施方案中,感染时vpc密度为5.0
‑
7.5
×
106个细胞/毫升。在某些实施方案中,感染时vpc密度为5.0
‑
10.0
×
106个细胞/毫升。
[0643]
图5a、图5b、图6a和图6b显示了转染/感染时vpc密度在3.0
‑
3.4
×
106个细胞/毫升之间,特别是3.2
×
106个细胞/毫升,以及vpc与biic
rep/cap
比率为约1:300k v/v,提供了有利的aav滴度(vg/ml)和衣壳完全%。
[0644]
在某些实施方案中,感染biic与vpc以vpc与biic的目标比率组合。在某些实施方案中,vpc与biic感染比率(体积/体积)为1.0
×
103‑
5.0
×
103、5.0
×
103‑
1.0
×
104、1.0
×
104‑
5.0
×
104、5.0
×
104‑
1.0
×
105、1.0
×
105‑
5.0
×
105、5.0
×
105‑
1.0
×
106、1.0
×
103、2.0
×
103、3.0
×
103、4.0
×
103、5.0
×
103、6.0
×
103、7.0
×
103、8.0
×
103、9.0
×
103、1.0
×
104、2.0
×
104、3.0
×
104、4.0
×
104、5.0
×
104、6.0
×
104、7.0
×
104、8.0
×
104或9.0
×
104、1.0
×
105、2.0
×
105、3.0
×
105、4.0
×
105、5.0
×
105、6.0
×
105、7.0
×
105、8.0
×
105或9.0
×
105biic/vpc。在某些实施方案中,vpc与biic感染比率(细胞/细胞)为1.0
×
103‑
5.0
×
103、5.0
×
103‑
1.0
×
104、1.0
×
104‑
5.0
×
104、5.0
×
104‑
1.0
×
105、1.0
×
105‑
5.0
×
105、5.0
×
105‑
1.0
×
106、1.0
×
103、2.0
×
103、3.0
×
103、4.0
×
103、5.0
×
103、6.0
×
103、7.0
×
103、8.0
×
103、9.0
×
103、1.0
×
104、2.0
×
104、3.0
×
104、4.0
×
104、5.0
×
104、6.0
×
104、7.0
×
104、8.0
×
104或9.0
×
104、1.0
×
105、2.0
×
105、3.0
×
105、4.0
×
105、5.0
×
105、6.0
×
105、7.0
×
105、8.0
×
105或9.0
×
105biic/vpc。
[0645]
在某些实施方案中,包含表达bev的感染biic与vpc以vpc与biic的目标比率组合。在某些实施方案中,vpc与biic感染比率(体积/体积)为1.0
×
103‑
5.0
×
103、5.0
×
103‑
1.0
×
104、1.0
×
104‑
5.0
×
104、5.0
×
104‑
1.0
×
105、1.0
×
105‑
5.0
×
105、5.0
×
105‑
1.0
×
106、1.0
×
103、2.0
×
103、3.0
×
103、4.0
×
103、5.0
×
103、6.0
×
103、7.0
×
103、8.0
×
103、9.0
×
103、1.0
×
104、2.0
×
104、3.0
×
104、4.0
×
104、5.0
×
104、6.0
×
104、7.0
×
104、8.0
×
104或9.0
×
104、1.0
×
105、2.0
×
105、3.0
×
105、4.0
×
105、5.0
×
105、6.0
×
105、7.0
×
105、8.0
×
105或9.0
×
105biic/vpc。在某些实施方案中,vpc与biic感染比率(细胞/细胞)为1.0
×
103‑
5.0
×
103、5.0
×
103‑
1.0
×
104、1.0
×
104‑
5.0
×
104、5.0
×
104‑
1.0
×
105、1.0
×
105‑
5.0
×
105、5.0
×
105‑
1.0
×
106、1.0
×
103、2.0
×
103、3.0
×
103、4.0
×
103、5.0
×
103、6.0
×
103、7.0
×
103、8.0
×
103、9.0
×
103、1.0
×
104、2.0
×
104、3.0
×
104、4.0
×
104、5.0
×
104、6.0
×
104、7.0
×
104、8.0
×
104或9.0
×
104、1.0
×
105、2.0
×
105、3.0
×
105、4.0
×
105、5.0
×
105、6.0
×
105、7.0
×
105、8.0
×
105或9.0
×
105biic/vpc。
[0646]
在某些实施方案中,包含有效负载bev的感染biic与vpc以vpc与biic的目标比率组合。在某些实施方案中,vpc与biic感染比率(体积/体积)为1.0
×
103‑
5.0
×
103、5.0
×
103‑
1.0
×
104、1.0
×
104‑
5.0
×
104、5.0
×
104‑
1.0
×
105、1.0
×
105‑
5.0
×
105、5.0
×
105‑
1.0
×
106、1.0
×
103、2.0
×
103、3.0
×
103、4.0
×
103、5.0
×
103、6.0
×
103、7.0
×
103、8.0
×
103、9.0
×
103、1.0
×
104、2.0
×
104、3.0
×
104、4.0
×
104、5.0
×
104、6.0
×
104、7.0
×
104、8.0
×
104或9.0
×
104、1.0
×
105、2.0
×
105、3.0
×
105、4.0
×
105、5.0
×
105、6.0
×
105、7.0
×
105、8.0
×
105或9.0
×
105biic/vpc。在某些实施方案中,vpc与biic感染比率(细胞/细胞)为1.0
×
103‑
5.0
×
103、5.0
×
103‑
1.0
×
104、1.0
×
104‑
5.0
×
104、5.0
×
104‑
1.0
×
105、1.0
×
105‑
5.0
×
105、5.0
×
105‑
1.0
×
106、1.0
×
103、2.0
×
103、3.0
×
103、4.0
×
103、5.0
×
103、6.0
×
103、7.0
×
103、8.0
×
103、9.0
×
103、1.0
×
104、2.0
×
104、3.0
×
104、4.0
×
104、5.0
×
104、6.0
×
104、7.0
×
104、8.0
×
104或9.0
×
104、1.0
×
105、2.0
×
105、3.0
×
105、4.0
×
105、5.0
×
105、6.0
×
105、7.0
×
105、8.0
×
105或9.0
×
105biic/vpc。
[0647]
在某些实施方案中,包含表达bev的感染biic和包含有效负载bev的感染biic与vpc以目标biic与biic比率组合。在某些实施方案中,表达(rep/cap)biic与有效负载biic的比率为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:9、1:10、3.5
‑
4.5:1、3
‑
4:1、2.5
‑
3.5:1、2
‑
3:1、1.5
‑
2.5:1、1
‑
2:1、1
‑
1.5:1、1:1
‑
1.5、1:1
‑
2、1:1.5
‑
2.5、1:2
‑
3、1:2.5
‑
3.5、1:3
‑
4、1:3.5
‑
4.5、1:4
‑
5、1:4.5
‑
5.5、1:5
‑
6、1:5.5
‑
6.5、1:6
‑
7或1:6.5
‑
7.5。
[0648]
图4a、图4b、图6a和图6b显示了转染/感染时vpc密度在3.0
‑
3.4
×
106个细胞/毫升之间,特别是3.2
×
106个细胞/毫升,以及vpc与biic
rep/cap
比率为约1:300k v/v并且vpc与biic
有效负载
比率为约1:100k v/v(biic与biic比率为3:1),提供了有利的aav滴度(vg/ml)和衣壳完全%。
[0649]
在某些实施方案中,感染的病毒生产细胞在特定溶解氧(do)含量(do%)下温育。在某些实施方案中,感染的病毒生产细胞在以下之间的do%下温育:10%
‑
50%、20%
‑
40%、10%
‑
20%、15%
‑
25%、20%
‑
30%、25%
‑
35%、30%
‑
40%、35%
‑
45%、40%
‑
50%、10%
‑
15%、15%
‑
20%、20%
‑
25%、25%
‑
30%、30%
‑
35%、35%
‑
40%、40%
‑
45%或45%
‑
50%。在某些实施方案中,感染的病毒生产细胞在约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%的do%下温育。在某些实施方案中,感染的病毒生产细胞在20%
‑
30%之间或约25%的do%下温育。在某些实施方案中,感染的病毒生产细胞在25%
‑
35%之间或约30%的do%下温育。在某些实施方案中,感染的病毒生产细胞在30%
‑
40%之间或约35%的do%下温育。在某些实施方案中,感染的病毒生产细胞在35%
‑
45%之间或约40%的do%下温育。
[0650]
细胞溶胞
[0651]
包括但不限于病毒生产细胞的本公开的细胞可根据本领域中已知的任何方法进行细胞溶胞。可进行细胞溶胞,得到本公开的任何细胞内存在的一种或多种试剂(例如病毒颗粒)。在某些实施方案中,根据本公开对aav颗粒的批量收获物和病毒生产细胞进行细胞溶胞。
[0652]
在某些实施方案中,细胞溶胞可根据以下提供的方法或系统中的任一者进行:美国专利第7,326,555号、第7,579,181号、第7,048,920号、第6,410,300号、第6,436,394号、第7,732,129号、第7,510,875号、第7,445,930号、第6,726,907号、第6,194,191号、第7,125,706号、第6,995,006号、第6,676,935号、第7,968,333号、第5,756,283号、第6,258,595号、第6,261,551号、第6,270,996号、第6,281,010号、第6,365,394号、第6,475,769号、第6,482,634号、第6,485,966号、第6,943,019号、第6,953,690号、第7,022,519号、第7,238,526号、第7,291,498号和第7,491,508号或国际公开第wo1996039530号、第wo1998010088号、第wo1999014354号、第wo1999015685号、第wo1999047691号、第wo2000055342号、第wo2000075353号和第wo2001023597号,其中每一者的内容通过引用整体并入本文。
[0653]
细胞溶胞方法和系统可为化学性或机械性。化学性细胞溶胞通常包括在化学溶胞条件下使一种或多种细胞与一种或多种化学溶胞剂接触。机械性溶胞通常包括使一种或多种细胞经受通过机械力进行的细胞溶胞。溶胞还可通过使细胞在达到约0%活力之后降解来完成。
[0654]
在某些实施方案中,化学性溶胞可用于溶解细胞。如本文所用,术语“化学溶胞剂”是指可有助于破坏细胞的任何试剂。在某些实施方案中,将溶胞剂引入称为溶胞溶液或溶胞缓冲液的溶液中。如本文所用,术语“化学溶胞溶液”是指包含一种或多种溶胞剂的溶液(典型地呈水溶液)。除溶胞剂之外,溶胞溶液可包含一种或多种缓冲剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、低温保护剂、酶、酶抑制剂和/或螯合剂。溶胞缓冲剂为包含一种或多种缓冲剂的溶胞溶液。溶胞溶液的额外组分可包含一种或多种增溶剂。如本文所用,术语“增溶剂”是指提高溶液的一种或多种组分的溶解性和/或涂覆溶液的一种或多种实体的溶解性的化合物。在某些实施方案中,增溶剂提高蛋白质溶解性。在某些实施方案中,基于其提高蛋白质溶解性同时维持蛋白质构象和/或活性的能力选择增溶剂。
[0655]
示例性溶胞剂可包含以下所述的任一者:美国专利第8,685,734号、第7,901,921号、第7,732,129号、第7,223,585号、第7,125,706号、第8,236,495号、第8,110,351号、第7,419,956号、第7,300,797号、第6,699,706号和第6,143,567号,其中每一者的内容通过引用整体并入本文。在某些实施方案中,溶胞剂可选自溶胞盐、两性试剂、阳离子型试剂、离子型洗涤剂和非离子型洗涤剂。溶胞盐可包括但不限于氯化钠(nacl)和氯化钾(kcl)。其他溶胞盐可包括以下所述的那些盐中的任一者:美国专利第8,614,101号、第7,326,555号、第7,579,181号、第7,048,920号、第6,410,300号、第6,436,394号、第7,732,129号、第7,510,875号、第7,445,930号、第6,726,907号、第6,194,191号、第7,125,706号、第6,995,006号、第6,676,935号和第7,968,333号,其中每一者的内容通过引用整体并入本文。
[0656]
在某些实施方案中,细胞溶胞产物溶液包含稳定化添加剂。在某些实施方案中,稳定化添加剂可包括海藻糖、甘氨酸甜菜碱、甘露糖醇、柠檬酸钾、cucl2、脯氨酸、木糖醇、ndsb 201、ctab和k2po4。在某些实施方案中,稳定化添加剂可包含氨基酸,例如精氨酸,或酸化氨基酸混合物,例如精氨酸hcl。在某些实施方案中,稳定化添加剂可包含0.1m精氨酸或精氨酸hcl。在某些实施方案中,稳定化添加剂可包含0.2m精氨酸或精氨酸hcl。在某些实施方案中,稳定化添加剂可包含0.25m精氨酸或精氨酸hcl。在某些实施方案中,稳定化添加剂可包含0.3m精氨酸或精氨酸hcl。在某些实施方案中,稳定化添加剂可包含0.4m精氨酸或精氨酸hcl。在某些实施方案中,稳定化添加剂可包含0.5m精氨酸或精氨酸hcl。在某些实施方
案中,稳定化添加剂可包含0.6m精氨酸或精氨酸hcl。在某些实施方案中,稳定化添加剂可包含0.7m精氨酸或精氨酸hcl。在某些实施方案中,稳定化添加剂可包含0.8m精氨酸或精氨酸hcl。在某些实施方案中,稳定化添加剂可包含0.9m精氨酸或精氨酸hcl。在某些实施方案中,稳定化添加剂可包含1.0m精氨酸或精氨酸hcl。
[0657]
可提高或降低盐浓度,得到用于细胞膜破裂的有效浓度。如本文所提及的两性试剂是能够呈酸或碱形式进行反应的化合物。两性试剂可包括但不限于溶血磷脂酰胆碱、3
‑
((3
‑
胆酰胺基丙基)二甲基铵)
‑1‑
丙磺酸盐(chaps)、等。阳离子型试剂可包括但不限于溴化十六烷基三甲铵(c(16)tab)和苯扎氯铵。包含洗涤剂的溶胞剂可包含离子型洗涤剂或非离子型洗涤剂。
[0658]
洗涤剂可用以分裂或溶解细胞结构,所述细胞结构包括但不限于细胞膜、细胞壁、脂质、碳水化合物、脂蛋白和糖蛋白。示例性离子型洗涤剂包括美国专利第7,625,570号和第6,593,123号或美国公开第us2014/0087361号中所教导的那些中的任一者,其中每一者的内容通过引用整体并入本文。在某些实施方案中,溶胞溶液包含一种或多种离子型洗涤剂。用于溶胞溶液的离子型洗涤剂的实例包括但不限于十二烷基硫酸钠(sds)、胆酸盐和脱氧胆酸盐。在某些实施方案中,离子型洗涤剂可以增溶剂形式包含于溶胞溶液中。在某些实施方案中,溶胞溶液包含一种或多种非离子型洗涤剂。用于溶胞溶液中的非离子型洗涤剂可包括但不限于辛基葡糖苷、毛地黄皂苷、lubrol、c12e8、triton x
‑
100、triton x
‑
114、brij
‑
35、brij
‑
58和noniodet p
‑
40。非离子型洗涤剂通常为较弱溶胞剂,但可以增溶剂形式包含在内以用于溶解细胞和/或病毒蛋白质。在某些实施方案中,溶胞溶液包含一种或多种两性离子洗涤剂。用于分解溶液的两性离子洗涤剂可包括但不限于:月桂基二甲基胺n
‑
氧化物(ldao);n,n
‑
二甲基
‑
n
‑
十二烷基甘氨酸甜菜碱(bb);3
‑
(n,n
‑
二甲基十四烷基铵基)丙磺酸酯(3
‑
10);正十二烷基
‑
n,n
‑
二甲基
‑3‑
铵基
‑1‑
丙磺酸酯(3
‑
12);正十四烷基
‑
n,n
‑
二甲基
‑3‑
铵基
‑1‑
丙磺酸酯(3
‑
14);3
‑
(n,n
‑
二甲基棕榈基铵基)丙磺酸酯(3
‑
16);3
‑
((3
‑
胆酰胺基丙基)二甲基铵基)
‑1‑
丙磺酸酯(chaps)和3
‑
([3
‑
胆酰胺基丙基]二甲基铵基)
‑2‑
羟基
‑1‑
丙磺酸酯(chapso)。
[0659]
在某些实施方案中,溶胞溶液包含triton x
‑
100,例如0.5%w/v的triton x
‑
100。在某些实施方案中,溶胞溶液包含月桂基二甲基胺n
‑
氧化物(ldao),例如0.184%w/v(4
×
cmc)的ldao。在某些实施方案中,溶胞溶液包含种子油表面活性剂,例如ecosurf
tm sa
‑
9。在某些实施方案中,溶胞溶液包含n,n
‑
二甲基
‑
n
‑
十二烷基甘氨酸甜菜碱(bb)。在某些实施方案中,溶胞溶液包含洗涤剂,例如3
‑
12(正十二烷基
‑
n,n
‑
二甲基
‑3‑
铵基
‑1‑
丙磺酸酯)、3
‑
14(正十四烷基
‑
n,n
‑
二甲基
‑3‑
铵基
‑1‑
丙磺酸酯)或3
‑
16(3
‑
(n,n
‑
二甲基棕榈基铵基)丙磺酸酯)。
[0660]
其他溶胞剂可包含酶和脲。在某些实施方案中,一种或多种溶胞剂可合并于溶胞溶液中以便增强细胞溶胞和蛋白质溶解性中的一者或多者。在某些实施方案中,酶抑制剂可包含于溶胞溶液中以便防止可能由细胞膜破坏触发的蛋白质分解。
[0661]
在某些实施方案中,溶胞溶液包含0.1
‑
1.0%w/v之间、0.2
‑
0.8%w/v之间、0.3
‑
0.7%w/v之间、0.4
‑
0.6%w/v之间或约0.5%w/v的细胞溶胞剂(例如洗涤剂)。在某些实施方案中,溶胞溶液包含0.3
‑
0.35%w/v之间、0.35
‑
0.4%w/v之间、0.4
‑
0.45%w/v之间、0.45
‑
0.5%w/v之间、0.5
‑
0.55%w/v之间、0.55
‑
0.6%w/v之间、0.6
‑
0.65%w/v之间或0.65%
‑
0.7%w/v之间的细胞溶胞剂(例如洗涤剂)。
[0662]
在某些实施方案中,由粘附细胞培养物产生的细胞溶胞物可用一种或多种核酸酶,例如benzonase核酸酶(i级,99%纯)或c
‑
lecta denarase核酸酶(先前为sartorius denarase)处理。在某些实施方案中,添加核酸酶以降低由所释放dna引起的溶胞物的粘度。
[0663]
在某些实施方案中,化学性溶胞使用单一化学溶胞混合物。在某些实施方案中,化学性溶胞使用连续添加的若干溶胞剂,以提供最终化学溶胞混合物。
[0664]
在某些实施方案中,化学溶胞混合物包含酸化氨基酸混合物(例如精氨酸hcl)、非离子型洗涤剂(例如triton x
‑
100)和核酸酶(例如benzonase核酸酶)。在某些实施方案中,化学溶胞混合物可包含酸或碱,以提供目标溶胞ph。
[0665]
在某些实施方案中,化学溶胞在化学溶胞条件下进行。如本文所用,术语“化学溶胞条件”是指可通过化学溶胞剂溶解目标细胞的环境条件(例如,温度、压力、ph等)的任何组合。
[0666]
在某些实施方案中,溶胞ph在3.0
‑
3.5、3.5
‑
4.0、4.0
‑
4.5、4.5
‑
5.0、5.0
‑
5.5、5.5
‑
6.0、6.0
‑
6.5、6.5
‑
7.0、7.0
‑
7.5或7.5
‑
8.0之间。在某些实施方案中,溶胞ph在6.0
‑
7.0、6.5
‑
7.0、6.5
‑
7.5或7.0
‑
7.5之间。
[0667]
在某些实施方案中,溶胞温度在15
‑
35℃之间、在20
‑
30℃之间、25
‑
39℃之间、20
‑
21℃之间、20
‑
22℃之间、21
‑
22℃之间、21
‑
23℃之间、22
‑
23℃之间、22
‑
24℃之间、23
‑
24℃之间、23
‑
25℃之间、24
‑
25℃之间、24
‑
26℃之间、25
‑
26℃之间、25
‑
27℃之间、26
‑
27℃之间、26
‑
28℃之间、27
‑
28℃之间、27
‑
29℃之间、28
‑
29℃之间、28
‑
30℃之间、29
‑
30℃之间、29
‑
31℃之间、30
‑
31℃之间、30
‑
32℃之间、31
‑
32℃之间或31
‑
33℃之间。
[0668]
在某些实施方案中,进行机械性细胞溶胞。机械性细胞溶胞方法可包括使用一种或多种溶胞条件和/或一种或多种溶胞力。如本文所用,术语“溶胞条件”是指促进细胞破坏的状态或情况。溶胞条件可包括特定温度、压力、渗透纯度、盐度等。在某些实施方案中,溶胞条件包括升高或降低的温度。根据某些实施方案,溶胞条件包含温度变化以促进细胞破坏。根据此类实施方案进行的细胞溶胞可包括冻融溶胞。如本文所用,术语“冻融溶胞”是指细胞溶液经受一个或多个冻融循环的细胞溶胞。根据冻融溶胞方法,溶液中的细胞被冷冻以诱导由冰晶形成和扩张引起的细胞膜的机械破坏。根据冻融溶胞方法使用的细胞溶液还可包含一种或多种溶胞剂、增溶剂、缓冲剂、低温保护剂、表面活性剂、防腐剂、酶、酶抑制剂和/或螯合剂。在经受冻结的细胞溶液解冻之后,此类组分可增强所需细胞产物的恢复。在某些实施方案中,一种或多种低温保护剂包含于经历冻融溶胞的细胞溶液中。如本文所用,术语“低温保护剂”是指用于保护一种或多种物质免于由于冻结引起的损坏的试剂。低温保护剂可包含美国公开第us2013/0323302号或美国专利第6,503,888号、第6,180,613号、第7,888,096号、第7,091,030号所教导的那些中的任一者,所述文件中的每一者的内容通过引用整体并入本文。在某些实施方案中,低温保护剂可包括但不限于二甲亚砜、1,2
‑
丙二醇、2,3
‑
丁二醇、甲酰胺、甘油、乙二醇、1,3
‑
丙二醇和正二甲基甲酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、羟
乙基淀粉、琼脂糖、聚葡萄糖、肌醇、葡萄糖、羟乙基淀粉、乳糖、山梨糖醇、甲基葡萄糖、蔗糖和脲。在某些实施方案中,冻融溶胞可根据美国专利第7,704,721号中所述的任何方法进行,所述美国专利的内容通过引用整体并入本文。
[0669]
如本文所用,术语“溶胞力”是指用于破坏细胞的物理活性。溶胞力可包括但不限于机械力、声波力、重力、光学力、电力等。通过机械力进行的细胞溶胞在本文中称为“机械性溶胞”。可根据机械性溶胞使用的机械力可包含高剪切流体力。根据机械性溶胞的此类方法,可使用微流化床。微流化床通常包括可施加细胞溶液的入口储集器。然后可经由泵(例如高压泵)在高速和/或高压下将细胞溶液泵送至相互作用腔室以产生剪切流体力。所得溶胞产物然后可收集于一个或多个输出储集器中。可调节泵速度和/或压力以调节细胞溶胞并增强产物(例如病毒颗粒)的回收。其他机械性溶胞方法可包括通过刮擦进行的细胞的物理破坏。
[0670]
可基于待溶解细胞的细胞培养物型式选择细胞溶胞方法。举例来说,对于粘附细胞培养物,可使用一些化学性和机械性溶胞方法。此类机械性溶胞方法可包括冻融溶胞或刮擦。在另一个实例中,粘附细胞培养物的化学性溶胞可经由与包含表面活性剂(例如triton
‑
x
‑
100)的溶胞溶液一起温育来进行。
[0671]
在某些实施方案中,用于在无溶胞下收获aav颗粒的方法可用于有效和可扩充的aav颗粒生产。在一个非限制性实例中,aav颗粒可通过以下生产:培养缺乏肝素结合位点的aav颗粒,从而允许aav颗粒进入细胞培养物中的上清液中,从培养物收集上清液;以及使aav颗粒与上清液分离,如美国专利申请20090275107中所述,所述美国专利申请的内容通过引用整体并入本文。
[0672]
澄清和纯化:总则
[0673]
包含病毒颗粒的细胞溶胞物可经受澄清和纯化。澄清通常是指从细胞溶胞物纯化病毒颗粒中进行的初始步骤,并用于通过从大量溶胞收获物去除较大的不溶性碎片而制备供进一步纯化的溶胞物。病毒生产可在病毒生产工艺中的任何时间点包括澄清步骤。澄清步骤可包括但不限于离心和过滤。在澄清期间,离心可在低速下进行以仅去除较大碎片。类似地,过滤可使用具有较大孔径的过滤器进行使得仅去除较大碎片。
[0674]
纯化通常是指通过从澄清的溶胞收获物去除较小碎片而从细胞溶胞物纯化和浓缩病毒颗粒以制备最终合并原料药中进行的最终步骤。病毒生产可在病毒生产工艺中的任何时间点包括纯化步骤。纯化步骤可包括但不限于过滤和色谱法。过滤可使用具有较小孔径的过滤器进行以从产物去除较小碎片,或使用具有较大孔径的过滤器进行以从产物保留较大碎片。过滤可用于改变病毒生产池或物料流的浓度和/或含量。可进行色谱法以从杂质池选择性分离目标颗粒。
[0675]
高浓度的aav颗粒的聚集或聚结倾向使大规模生产高浓度aav制剂复杂化。小规模澄清和浓缩系统,例如透析盒或旋转离心对于大规模生产一般是不可充分扩充的。本公开提供了用于处理大体积的高浓度aav生产制剂的澄清、纯化和浓缩系统的实施方案。在某些实施方案中,大体积澄清系统包括以下处理步骤中的一者或多者:深层过滤、微滤(例如0.2μm过滤)、亲和色谱法、离子交换色谱法(例如阴离子交换色谱法(aex)或阳离子交换色谱法(cex))、切向流过滤系统(tff)、纳米过滤(例如病毒截留性过滤(vrf))、最终过滤(ff)和填充过滤。
[0676]
病毒澄清和纯化的目标包括高通量地处理细胞溶胞物和优化最终病毒回收。包含本公开的澄清和纯化步骤的优点包括处理较大体积的溶胞物的可扩充性。在某些实施方案中,澄清和纯化可根据以下提供的方法或系统中的任一者进行:美国专利第8,524,446号、第5,756,283号、第6,258,595号、第6,261,551号、第6,270,996号、第6,281,010号、第6,365,394号、第6,475,769号、第6,482,634号、第6,485,966号、第6,943,019号、第6,953,690号、第7,022,519号、第7,238,526号、第7,291,498号、第7,491,508号,美国公开第us2013/0045186号、第us2011/0263027号、第us2011/0151434号、第us2003/0138772号以及国际公开第wo2002012455号、第wo1996039530号、第wo1998010088号、第wo1999014354号、第wo1999015685号、第wo1999047691号、第wo2000055342号、第wo2000075353号和第wo2001023597号,其内容各自通过引用整体并入本文。
[0677]
在某些实施方案中,包含至少一种aav颗粒的组合物可使用美国专利第us 6146874号、第us 6660514号、第us 8283151号或第us 8524446号中所述的方法或系统分离或纯化,所述美国专利的内容通过引用整体并入本文。
[0678]
澄清和纯化:离心
[0679]
根据某些实施方案,细胞溶胞物可通过一个或多个离心步骤澄清。可使用离心使溶胞物中的不溶性颗粒集结。在澄清期间,离心强度(其可以重力单位(g)表示,g表示标准重力的倍数)可低于后续纯化步骤中的离心强度。在某些实施方案中,可在约200g至约800g、约500g至约1500g、约1000g至约5000g、约1200g至约10000g或约8000g至约15000g的重力下对细胞溶胞物进行离心。在某些实施方案中,细胞溶胞物离心在8000g下进行15分钟。在某些实施方案中,可进行密度梯度离心以便通过沉降速率分隔细胞溶胞物中的微粒。根据本公开的方法或系统使用的梯度可包括但不限于氯化铯梯度和碘克沙醇步骤梯度。在某些实施方案中,离心使用倾析器离心系统。在某些实施方案中,离心使用盘堆叠离心系统。在某些实施方案中,离心包括超速离心,例如双循环cscl梯度超速离心或碘克沙醇不连续密度梯度超速离心。
[0680]
澄清和纯化:过滤
[0681]
在某些实施方案中,在澄清、纯化和/或灭菌期间可使用一个或多个微滤、纳米过滤和/或超滤步骤。一个或多个微滤、纳米过滤或超滤步骤可包括使用例如以下的过滤系统:emd millipore express shc xl10 0.5/0.2μm过滤器、emd millipore express shcxl6000 0.5/0.2μm过滤器、emd millipore express shcxl150过滤器、emd millipore millipak gamma gold 0.22μm过滤器(双线灭菌级过滤器)、pall supor ekv,0.2μm灭菌级过滤器、asahi planova 35n、asahi planova 20n、asahi planova 75n、asahi planova bioex、millipore viresolve nfr或sartorius sartopore 2xlg,0.8/0.2μm。
[0682]
在某些实施方案中,可在澄清、纯化和/或灭菌期间使用一个或多个微滤步骤。微滤利用孔径通常在0.1μm与10μm之间的微滤膜。微滤通常用于微粒的大致澄清、灭菌和去除。在某些实施方案中,微滤用于去除病毒颗粒的聚集凝块。在某些实施方案中,本公开的生产工艺或系统包括至少一个微滤步骤。一个或多个微滤步骤可包括利用深层过滤系统的深层过滤步骤,例如emd millipore millistak
pod过滤器(d0hc培养基系列)、millipore mc0sp23cl3过滤器(c0sp培养基系列)或sartorius sartopore过滤器系列。本公开的微滤系统可用本领域技术人员已知的制剂(包括本公开的aav制药、处理和储存制剂)预冲洗、填
充、平衡、冲洗、处理、洗脱、洗涤或清洁。
[0683]
在某些实施方案中,可在澄清和纯化期间使用一个或多个超滤步骤。超滤步骤可用于对本公开的处理和/或配制溶液进行浓缩、配制、脱盐或脱水。超滤利用孔径通常在0.001与0.1μm之间的超滤膜。超滤膜也可由其分子量截止值(mwco)定义并且可具有1kd至500kd的范围。超滤通常用于浓缩和配制溶解的生物分子,例如蛋白质、肽、质粒、病毒颗粒、核酸和碳水化合物。本公开的超滤系统可用本领域技术人员已知的制剂(包括本公开的aav制药、处理和储存制剂)预冲洗、填充、平衡、冲洗、处理、洗脱、洗涤或清洁。
[0684]
在某些实施方案中,可在澄清和纯化期间使用一个或多个纳米过滤步骤。纳米过滤利用孔径通常低于100nm的纳米过滤膜。纳米过滤通常用于去除非所需内源病毒杂质(例如杆状病毒)。在某些实施方案中,纳米过滤可包括病毒去除过滤(vrf)。vrf过滤器可具有通常在15nm与100nm之间的过滤大小。vrf过滤器的实例包括(但不限于):planova 15n、planova 20n和planova 35n(asahi
‑
kasei corp,tokyo,japan);以及viresolve nfp和viresolve nfr(millipore corp,billerica,ma,usa)。本公开的纳米过滤系统可用本领域技术人员已知的制剂(包含本公开的aav制药、处理和储存制剂)预冲洗、填充、平衡、冲洗、处理、洗脱、洗涤或清洁。在某些实施方案中,纳米过滤用于去除病毒颗粒的聚集凝块。
[0685]
在某些实施方案中,可在澄清和纯化期间使用一个或多个切向流过滤(tff)(也称为交叉流过滤)步骤。切向流过滤是一种膜过滤形式,其中进料流(其包含待澄清和浓缩的目标试剂/颗粒)从进料槽流至过滤模块或滤筒中。在tff过滤模块内,进料流平行于膜表面传递,使得一部分物料流穿过膜(渗透物/滤液),而其余部分的物料流(渗余物)经由过滤系统再循环返回并进入进料槽中。
[0686]
在某些实施方案中,tff过滤模块可为平板模块(堆叠的平面盒)、螺旋卷绕的模块(螺旋卷绕的膜层)或中空纤维模块(膜管束)。用于本公开的tff系统的实例包括但不限于:spectrum mpes中空纤维tff系统(0.5mm纤维id,100kda mwco)或millipore ultracel plctk系统伴以pellicon
‑
3盒(0.57m2,30kda mwco)。
[0687]
可在进料流经由tff过滤系统循环时将新缓冲材料添加至tff进料槽。在某些实施方案中,可在流动物料流经由tff过滤系统循环时完全补充缓冲材料。在这个实施方案中,以与渗透物中损失的缓冲材料相等的量将缓冲材料添加至物料流,得到恒定浓度。在某些实施方案中,可在流动物料流经由tff过滤系统循环时减少缓冲材料。在这个实施方案中,将相对于渗透物中损失的缓冲材料减少量的缓冲材料添加至物料流,得到增大的浓度。在某些实施方案中,可在流动物料流经由tff过滤系统循环时替换缓冲材料。在这个实施方案中,添加至物料流的缓冲液不同于渗透物中损失的缓冲材料,以使得最终更换物料流中的缓冲材料。本公开的tff系统可用本领域技术人员已知的制剂(包括本公开的aav制药、处理和储存制剂)预冲洗、填充、平衡、冲洗、处理、洗脱、洗涤或清洁。
[0688]
在某些实施方案中,tff负载池可在过滤之前外加赋形剂或稀释剂。在某些实施方案中,tff负载池在过滤之前外加高盐混合物(例如氯化钠或氯化钾)。在某些实施方案中,tff负载池在过滤之前外加高糖混合物(例如50%w/v蔗糖)。
[0689]
tff处理的效果可取决于若干因素,其包括(但不限于):来自流动设计的剪应力、交叉流动速率、滤液流动控制、跨膜压力(tmp)、膜调节、膜组成(例如中空纤维构造)和设计(例如表面积)、系统流动设计、储集器设计和混合策略。在某个实施方案中,过滤膜可经受
预tff膜调节。
[0690]
在某些实施方案中,tff处理可包括一个或多个微滤阶段。在某些实施方案中,tff处理可包括一个或多个超滤阶段。在某些实施方案中,tff处理可包括一个或多个纳米过滤阶段。
[0691]
在某些实施方案中,tff处理可包括一个或多个浓缩阶段,例如超滤(uf)或微滤(mf)浓缩阶段。在浓缩阶段中,在物料流经由过滤系统循环时替换减少量的缓冲材料(相对于作为渗透物损失的缓冲材料的量)。未能完全替换渗透物中损失的所有缓冲材料导致过滤物料流内的病毒颗粒的浓度增加。在某些实施方案中,在物料流经由过滤系统循环时替换增加量的缓冲材料。并入相对于渗透物中损失的缓冲材料的量过量的缓冲材料导致过滤物料流内的病毒颗粒的浓度减小。
[0692]
在某些实施方案中,tff处理可包括一个或多个渗滤(df)阶段。渗滤阶段包括替换第二缓冲材料(例如低盐或零盐材料)内的第一缓冲材料(例如高盐材料)。在这个实施方案中,将不同于渗透物中损失的第一缓冲材料的第二缓冲液添加至流动物料流,以使得最终替换物料流中的缓冲材料。
[0693]
在某些实施方案中,tff处理可包括连续的多个阶段。在某些实施方案中,tff处理过程可包括超滤(uf)浓缩阶段,接着渗滤阶段(df)。在某些实施方案中,tff处理可包括渗滤阶段,接着超滤浓缩阶段。在某些实施方案中,tff处理可包括第一渗滤阶段,接着超滤浓缩阶段,接着第二渗滤阶段。在某些实施方案中,tff处理可包括第一渗滤阶段,其将高盐低糖的缓冲材料并入至流动物料流中,接着超滤/浓缩阶段,其产生流动物料流中的病毒材料的高浓度,接着第二渗滤阶段,其将低盐高糖或零盐高糖的缓冲材料并入至流动物料流中。在某些实施方案中,盐可为氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾或其组合。在某些实施方案中,糖可为蔗糖,例如5%w/v蔗糖混合物或7%w/v蔗糖混合物。
[0694]
在某些实施方案中,一个或多个tff步骤可包括配制渗滤步骤,其中用高蔗糖渗滤缓冲液替换所述病毒生产池的至少一部分所述液体培养基。在某些实施方案中,所述高蔗糖配制缓冲液包含6
‑
8%w/v糖或糖替代物和90
‑
100mm之间的碱氯化物盐。在某些实施方案中,高蔗糖配制缓冲液包含7%w/v蔗糖和90
‑
100mm之间的氯化钠。在某些实施方案中,高蔗糖配制缓冲液包含7%w/v蔗糖、10mm磷酸钠、95
‑
100mm之间的氯化钠和0.001%(w/v)泊洛沙姆188。在某些实施方案中,配制渗滤步骤是一个或多个tff步骤中的最终渗滤步骤。在某些实施方案中,配制渗滤步骤是一个或多个tff步骤中的唯一渗滤步骤。
[0695]
在某些实施方案中,tff处理可包括同时进行的多个阶段。作为一个非限制性实例,tff澄清过程可包括与浓缩阶段同时进行的超滤阶段。
[0696]
通过过滤进行细胞溶胞物澄清和纯化的方法是本领域中充分理解的,并且可根据包括但不限于被动过滤和流过滤的多种可用方法进行。所用过滤器可包含多种材料和孔径。举例来说,细胞溶胞物过滤器可包含约1μm至约5μm、约0.5μm至约2μm、约0.1μm至约1μm、约0.05μm至约0.05μm和约0.001μm至约0.1μm的孔径。细胞溶胞物过滤器的示例性孔径可包括但不限于2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.22、0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.02、0.019、0.018、
0.017、0.016、0.015、0.014、0.013、0.012、0.011、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002、0.001和0.001μm。在某些实施方案中,澄清可包括经由孔径为2.0μm的过滤器进行过滤以去除大碎片,接着穿过孔径为0.45μm的过滤器以去除完整细胞。
[0697]
过滤器材料可由多种材料构成。此类材料可包括但不限于聚合材料和金属材料(例如烧结金属和多孔铝)。示例性材料可包括但不限于尼龙、纤维素材料(例如乙酸纤维素)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚醚砜、聚酰胺、聚砜、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二醇酯。在某些实施方案中,适用于澄清细胞溶胞物的过滤器可包括但不限于ultipleat profile
tm
过滤器(pall corporation,port washington,ny)、supor
tm
膜过滤器(pall corporation,port washington,ny)。
[0698]
在某些实施方案中,可进行流过滤以提高过滤速度和/或效果。在某些实施方案中,流过滤可包括真空过滤。根据此类方法,在与待过滤的细胞溶胞物的侧部相对的过滤器侧部上产生真空。在某些实施方案中,细胞溶胞物可通过离心力穿过过滤器。在某些实施方案中,使用泵迫使细胞溶胞物穿过澄清过滤器。细胞溶胞物穿过一个或多个过滤器的流动速率可通过调整通道尺寸和/或流体压力中的一者来调节。
[0699]
澄清和纯化:色谱法
[0700]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒可经由使用一种或多种不同色谱方法的一个或多个色谱步骤从细胞溶胞物澄清和纯化。色谱法是指用于从混合物选择性分离一种或多种成分的本领域中已知的任何数目的方法。此类方法可包括但不限于离子交换色谱法(例如阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法)、亲和色谱法(例如免疫亲和色谱法、金属亲和色谱法、假亲和色谱法,例如blue sepharose树脂)、疏水相互作用色谱法(hic)、尺寸排阻色谱法和多模态色谱法(mmc)(利用固定相与分析物之间的超过一种相互作用形式的色谱方法)。在某些实施方案中,病毒色谱的方法或系统可包括以下所教导的方法或系统中的任一者:美国专利第5,756,283号、第6,258,595号、第6,261,551号、第6,270,996号、第6,281,010号、第6,365,394号、第6,475,769号、第6,482,634号、第6,485,966号、第6,943,019号、第6,953,690号、第7,022,519号、第7,238,526号、第7,291,498号和第7,491,508号或国际公开第wo1996039530号、第wo1998010088号、第wo1999014354号、第wo1999015685号、第wo1999047691号、第wo2000055342号、第wo2000075353号和第wo2001023597号,其内容各自通过引用整体并入本文。
[0701]
本公开的色谱系统可用本领域技术人员已知的制剂(包括本公开的aav制药、处理和储存制剂)预冲洗、填充、平衡、冲洗、处理、洗脱、洗涤或清洁。
[0702]
在某些实施方案中,一个或多个离子交换(iex)色谱步骤可用于分离病毒颗粒。离子交换步骤可包含阴离子交换(aex)色谱法、阳离子交换(cex)色谱法或其组合。在某些实施方案中,在结合/洗脱模式中使用离子交换色谱法。可通过基于病毒颗粒的衣壳蛋白(或其他带电组分)与固定相上存在的带电位点之间的电荷
‑
电荷相互作用将病毒颗粒结合至固定相来使用结合/洗脱iex。这个过程可包含使用柱,其中病毒制剂(例如澄清的溶胞物)穿过所述柱。在向带电固定相(例如柱)施用病毒制剂之后,结合的病毒颗粒然后可通过施用洗脱溶液以破坏电荷
‑
电荷相互作用而从固定相洗脱。洗脱溶液可通过调整盐浓度和/或ph值优化以增强结合的病毒颗粒的回收。在某些实施方案中,洗脱溶液可包含核酸酶,例如benzonase核酸酶。取决于所分离的病毒衣壳的电荷,可选择阳离子或阴离子交换色谱方
法。在某些实施方案中,在穿流模式中使用离子交换色谱法。可通过将非病毒杂质或非所需病毒颗粒结合至固定相(基于电荷
‑
电荷相互作用)并允许病毒制剂中的目标病毒颗粒“流经”iex系统进入收集池来使用穿流iex。
[0703]
离子交换色谱的方法或系统可包括但不限于以下所教导的那些中的任一者:美国专利第7,419,817号、第6,143,548号、第7,094,604号、第6,593,123号、第7,015,026号和第8,137,948号,所述美国专利中的每一者的内容通过引用整体并入本文。
[0704]
在某些实施方案中,iex过程使用aex色谱系统,例如sartorius sartobind q膜、sartorius sartobind stic膜、millipore fractogel tmae hicap(m)穿流膜、ge q sepharose hp膜、poros xq或porox hq。在某些实施方案中,iex过程使用cex系统,例如poros xs膜。在某些实施方案中,aex系统包含固定相,其包含三甲基铵甲基(tmae)官能团。在某些实施方案中,iex过程使用多模态色谱(mmc)系统,例如nuvia aprime 4a膜。
[0705]
在某些实施方案中,一个或多个亲和色谱步骤,例如免疫亲和色谱,可用于分离病毒颗粒。免疫亲和色谱是利用一种或多种免疫化合物(例如抗体或抗体相关结构)以保留病毒颗粒的色谱形式。免疫化合物可特异性地结合至病毒颗粒表面上的一种或多种结构,包括但不限于一种或多种病毒外壳蛋白。在某些实施方案中,免疫化合物可对特定病毒变体具有特异性。在某些实施方案中,免疫化合物可与多种病毒变体结合。在某些实施方案中,免疫化合物可包含重组单链抗体。此类重组单链抗体可包含smith,r.h.等人,2009.mol.ther.17(11):1888
‑
96中所述的那些抗体,其内容通过引用整体并入本文。此类免疫化合物能够结合至若干aav衣壳变体,包括但不限于aav1、aav2、aav6和aav8或本文中所教导那些中的任一者。在某些实施方案中,afc过程使用ge avb sepharose hp柱树脂、poros captureselect aav8树脂(thermofisher)、poros captureselect aav9树脂(thermofisher)和poros captureselect aavx树脂(thermofisher)。
[0706]
在某些实施方案中,一个或多个尺寸排阻色谱(sec)步骤可用于分离病毒颗粒。sec可包含使用凝胶以根据尺寸分离颗粒。在病毒颗粒纯化中,sec过滤有时称作“抛光”。在某些实施方案中,可进行sec以产生几乎均质的最终产物。在某些实施方案中,此类最终产物可用于临床前研究和/或临床研究(kotin,r.m.2011.human molecular genetics.20(1):r2
‑
r6,其内容通过引用整体并入本文)。在某些实施方案中,sec可根据以下所教导的方法中的任一者进行:美国专利第6,143,548号、第7,015,026号、第8,476,418号、第6,410,300号、第8,476,418号、第7,419,817号、第7,094,604号、第6,593,123号和第8,137,948号,所述美国专利中的每一者的内容通过引用整体并入本文。
[0707]
iii.组合物和制剂
[0708]
总则
[0709]
基因疗法药物产品(例如raav颗粒)由于其有限液态稳定性和在低浓度下大规模聚集的高倾向而对于并入至组合物和制剂中具挑战性。基因疗法药物产品通常直接递送至治疗区域(包含cns组织);其需要赋形剂和制剂参数与组织功能、微环境和体积限制相容。
[0710]
根据本公开,aav颗粒可如药物组合物制备或包含于其中。应理解,此类组合物必然包含一种或多种活性成分,和最常包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
[0711]
取决于所治疗的受试者的身份、体型和/或状况,并且进一步取决于用以施用组合物的途径,根据本公开的药物组合物中的活性成分(例如aav颗粒)、药学上可接受的赋形剂
和/或任何额外成分的相对量可变化。举例来说,组合物可包含0.1%与99%(w/w)之间的活性成分。举例来说,组合物可包含0.1%与100%之间,例如.5与50%之间、1
‑
30%之间、5
‑
80%之间或至少80%(w/w)的活性成分。
[0712]
在某些实施方案中,本文所述的aav颗粒药物组合物可包含至少一种本公开的有效负载。作为一个非限制性实例,药物组合物可含有具有1、2、3、4或5个有效负载的aav颗粒。
[0713]
尽管描述本文提供的药物组合物主要针对适于向人类施用的药物组合物,但本领域技术人员应理解,此类组合物通常适于向任何其他动物施用,例如向非人类动物,例如非人类哺乳动物施用。应充分理解,为使组合物适于向各种动物施用,对适于向人类施用的药物组合物进行修改,并且一般熟练的兽医药理学家可仅用普通实验(如果存在)设计和/或执行这种修改。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于人类和/或其他灵长类动物;哺乳动物,包括商业相关的哺乳动物,例如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠、大鼠、鸟类,包括商业相关的鸟类,例如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
[0714]
在某些实施方案中,向人类、人类患者或受试者施用组合物。
[0715]
本公开的制剂可包括但不限于生理盐水、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、肽、蛋白质、用aav颗粒转染细胞(例如用于向受试者中转移或移植)和其组合。
[0716]
本文所述的药物组合物的制剂可通过药理学领域中已知或此后研发的任何方法来进行制备。如本文所用,术语“药物组合物”是指包含至少一种活性成分和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物。
[0717]
一般来说,此类制备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他附属成分缔合的步骤。如本文所用,短语“活性成分”通常是指本公开的携有编码多核苷酸或多肽的有效负载区的aav颗粒或由如本文所述的aav颗粒的病毒基因组编码的最终产物。
[0718]
在某些实施方案中,制剂可包含至少一种非活性成分。如本文所用,术语“非活性成分”是指包含于制剂中的一种或多种非活性剂。在某些实施方案中,可用于本公开的制剂的非活性成分中的全部、无或一些可被美国食品和药物管理局(fda)批准。
[0719]
本文所述的aav颗粒和药物组合物的制剂可通过药理学领域中已知或此后研发的任何方法制备。一般来说,此类制备方法包括以下步骤:使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他附属成分缔合,以及然后在必要和/或需要时,将产物分割、成型和/或包装成所需单剂量或多剂量单位。
[0720]
根据本公开的药物组合物可以散装、以单一单位剂量形式和/或以多个单一单位剂量形式制备、包装和/或出售。如本文所用,“单位剂量”是指包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将向受试者施用的活性成分的剂量和/或此剂量的适宜分数,例如此剂量的一半或三分之一。
[0721]
在某些实施方案中,本公开的制剂是水性制剂(即包含水的制剂)。在某些实施方案中,本公开的制剂包含水、消毒水或注射用水(wfi)。
[0722]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒可在ph为约7.0的具有0.001%
‑
0.1%(w/v)泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)的pbs中配制。
[0723]
在某些实施方案中,本文所述的aav制剂可含有足以表达至少一个所表达的功能性有效负载的aav颗粒。作为一个非限制性实例,aav颗粒可含有编码1、2、3、4或5个功能性
有效负载的病毒基因组。
[0724]
根据本公开,aav颗粒可配制用于cns递送。可使用穿过脑血屏障的试剂。举例来说,可使分子靶向脑血屏障内皮的一些细胞穿透肽可用于配制(例如mathupala,expert opin ther pat.,2009,19,137
‑
140;其内容通过引用整体并入本文)。
[0725]
在某些实施方案中,本文所述的aav制剂可包含缓冲系统,其包含磷酸盐、tris和/或组氨酸。磷酸盐、tris和/或组氨酸的缓冲剂可在2
‑
12mm范围内独立地用于制剂中。
[0726]
本公开的制剂可用于生产、处理、制备、储存、扩增或施用本公开的aav颗粒和病毒载体的任何步骤中。在某些实施方案中,药物制剂和组分可用于本公开的aav生产、aav处理、aav澄清、aav纯化和aav精整系统中,所述系统都可用本领域技术人员已知的制剂(包括本公开的aav制药、处理和储存制剂)来预冲洗、填充、平衡、冲洗、处理、洗脱、洗涤或清洁。
[0727]
赋形剂和稀释剂
[0728]
本公开的aav颗粒可配制成包含一种或多种赋形剂或稀释剂的药物组合物,以(1)增加稳定性;(2)增加细胞转染或转导;(3)允许持续或延迟释放有效负载;(4)改变生物分布(例如使病毒颗粒靶向特定组织或细胞类型);(5)增加编码蛋白质的翻译;(6)改变编码蛋白质的释放曲线;和/或(7)允许本公开有效负载实现可调节表达。
[0729]
根据本公开的药物组合物中的活性成分(例如aav颗粒)、药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量可取决于所治疗的受试者的身份、体型和/或状况,并且进一步取决于待施用组合物的途径而变化。在某些实施方案中,组合物可包含0.001%与99%(w/w)之间的活性成分。举例来说,组合物可包含0.001%与100%之间,例如0.5与50%之间、1
‑
30%之间、5
‑
80%之间或至少80%(w/w)的活性成分。在某些实施方案中,组合物可包含0.001%与99%(w/w)之间的赋形剂和稀释剂。举例来说,组合物可包含0.001%与100%之间、例如0.5与50%之间、1
‑
30%之间、5
‑
80%之间或至少80%(w/w)的赋形剂和稀释剂。
[0730]
在某些实施方案中,药学上可接受的赋形剂可为至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%纯度。在某些实施方案中,赋形剂被批准用于人类和用于兽医学用途。在某些实施方案中,赋形剂可由美国食品和药物管理局(united states food and drug administration)批准。在某些实施方案中,赋形剂可为医药级的。在某些实施方案中,赋形剂可满足美国药典(usp)、欧洲药典(ep)、英国药典和/或国际药典的标准。
[0731]
如本文所用,赋形剂包括但不限于适于所需特定剂型的任何和所有的溶剂、分散培养基、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂等。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备所述组合物的技术是本领域中已知的(参见remington:the science and practice of pharmacy,第21版,a.r.gennaro,lippincott,williams&wilkins,baltimore,md,2006;其通过引用整体并入本文)。除非任何常规赋形剂培养基可与物质或其衍生物不相容,例如产生任何非所需生物作用或以有害的方式与药物组合物的任何其他组分另外相互作用,否则常规赋形剂培养基的用途可涵盖于本公开的范围内。
[0732]
可包含于本公开的制剂中的示例性赋形剂和稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、无水淀粉、玉米淀粉、糖粉等,和/或其组合。
[0733]
可包含于本公开的制剂中的示例性赋形剂和稀释剂包括但不限于1,2,6
‑
己三醇;
1,2
‑
二肉豆蔻酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
(磷酸
‑
s
‑
(1
‑
甘油));1,2
‑
二肉豆蔻酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱;1,2
‑
二油酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱;1,2
‑
二棕榈酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
(磷酸
‑
rac
‑
(1
‑
甘油));1,2
‑
二硬脂酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
(磷酸
‑
rac
‑
(1
‑
甘油));1,2
‑
二硬脂酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱;1
‑
o
‑
甲苯基双胍;2
‑
乙基1,6
‑
己二醇;乙酸;冰乙酸;乙酸酐;丙酮;丙酮亚硫酸氢钠;乙酰化羊毛蜡醇;乙酰化单甘油酯;乙酰半胱氨酸;乙酰色氨酸,dl
‑
;丙烯酸酯共聚物;丙烯酸
‑
丙烯酸异辛酯共聚物;丙烯酸粘着剂788;活性木炭;adcote 72a103;粘合带;己二酸;aerotex树脂3730;丙氨酸;聚合白蛋白;胶体白蛋白;人白蛋白;醇;脱水醇;变性醇;稀释醇;alfadex;褐藻酸;烷基铵磺酸甜菜碱;烷基芳基磺酸钠;尿囊素;烯丙基α
‑
紫罗兰酮;杏仁油;α
‑
松香醇;α
‑
生育酚;α
‑
生育酚乙酸酯,dl
‑
;α
‑
生育酚,dl
‑
;乙酸铝;氯羟基尿囊酸铝;氢氧化铝;水合氢氧化铝
‑
蔗糖;氢氧化铝凝胶;氢氧化铝凝胶f 500;氢氧化铝凝胶f 5000;单硬脂酸铝;氧化铝;铝聚酯;硅酸铝;淀粉辛烯基丁二酸铝;硬脂酸铝;次乙酸铝;无水硫酸铝;amerchol c;amerchol
‑
cab;氨甲基丙醇;氨;氨溶液;强氨溶液;乙酸铵;氢氧化铵;月桂基硫酸铵;壬苯醇醚
‑
4硫酸铵;c
‑
12
‑
c
‑
15线性伯醇乙氧基化物的铵盐;硫酸铵;ammonyx;两性
‑
2;两性
‑
9;大茴香脑;无水柠檬酸;无水右旋糖;无水乳糖;无水柠檬酸三钠;洋茴香油;anoxid sbn;消泡剂;安替比林;阿帕氟烷;杏仁油peg
‑
6酯;阿克氟(aquaphor);精氨酸;阿拉赛(arlacel);抗坏血酸;抗坏血酸棕榈酸酯;天冬氨酸;秘鲁香脂(balsam peru);硫酸钡;蜂蜡;合成蜂蜡;山嵛醇聚醚(beheneth)
‑
10;膨润土;苯扎氯铵(benzalkonium chloride);苯磺酸;苄索氯铵(benzethonium chloride);苯度溴铵(benzododecinium bromide);苯甲酸;苄醇;苯甲酸苄酯;氯甲苯;倍他环糊精(betadex);双巴西肽(bibapcitide);次没食子酸铋;硼酸;溴克利那(brocrinat);丁烷;丁醇;乙烯基甲基醚的丁酯/顺丁烯二酸酐共聚物(125000mw);硬脂酸丁酯;丁基化羟基大茴香醚;丁基化羟基甲苯;丁二醇;对羟基苯甲酸丁酯(butylparaben);丁酸;c20
‑
40链烷醇醚(pareth)
‑
24;咖啡碱;钙;碳酸钙;氯化钙;葡庚糖酸钙;氢氧化钙;乳酸钙;考布曲钙;卡地胺钠;钙塞酸三钠;钙立醇钙;加拿大香脂;辛酸/癸酸三甘油酯;辛酸/癸酸/硬脂酸三甘油酯;盖普丹(captan);卡布迪索(captisol);焦糖;卡波姆1342;卡波姆1382;卡波姆934;卡波姆934p;卡波姆940;卡波姆941;卡波姆980;卡波姆981;卡波姆均聚物b型(交联型烯丙基季戊四醇);卡波姆均聚物c型(交联型烯丙基季戊四醇);二氧化碳;羧基乙烯基共聚物;羧基甲基纤维素;羧甲基纤维素钠;羧基聚亚甲基;角叉菜胶;角叉菜胶盐;蓖麻油;柏叶油;纤维素;微晶纤维素;cerasynt
‑
se;纯地蜡;十六硬脂醇醚
‑
12;十六硬脂醇醚
‑
15;十六硬脂醇醚
‑
30;十六醇十八醇/十六硬脂醇醚
‑
20;乙基己酸十六硬脂酯;十六醇聚醚
‑
10;十六醇聚醚
‑
2;十六醇聚醚
‑
20;十六醇聚醚
‑
23;十六硬脂醇;氯化十六基三甲基铵;十六醇;十六酯蜡;棕榈酸十六酯;氯化十六烷基吡锭;氯丁醇;氯丁醇半水合物;无水氯丁醇;氯甲酚;氯二甲酚;胆固醇;胆固醇聚醚;胆固醇聚醚
‑
24;柠檬酸酯;柠檬酸;单水合柠檬酸;含水柠檬酸;椰油酰胺醚硫酸酯;氧化椰油胺;可可甜菜碱;可可二乙醇酰胺;可可单乙醇酰胺;可可脂;可可
‑
甘油酯;椰子油;氢化椰子油;氢化椰子油/棕榈仁油甘油酯;椰油酰基癸酰基癸酸酯;光亮可乐果(cola nitida)种子提取物;胶原蛋白;着色悬浮液;玉米油;棉籽油;乳膏基质;肌酸;肌酐;甲酚;交联羧甲纤维素钠;交联聚维酮;硫酸铜;无水硫酸铜;环甲硅油;环甲硅油/二甲硅油共聚醇;半胱氨酸;半胱氨酸盐酸盐;无水半胱氨酸盐酸盐;半胱氨酸,dl
‑
;d&c红第28号;d&c红第33号;d&c红第36号;d&c红第39号;d&c黄第10号;达方吡啶;daubert 1
‑
5pestr(matte)164z;癸基甲基亚砜;dehydag蜡sx;脱氢乙酸;dehymuls e;地那铵苯甲酸盐;脱氧胆酸;聚葡萄糖;聚葡萄糖40;糊精;右旋糖;单水合右旋糖;右旋糖溶液;泛影酸;重氮利定脲;二氯苯甲基醇;二氯二氟甲烷;二氯四氟乙烷;二乙醇胺;焦碳酸二乙酯;癸二酸二乙酯;二乙二醇单乙醚;邻苯二甲酸二乙基己酯;氨基乙酸二羟基铝;二异丙醇胺;己二酸二异丙酯;二亚麻油酸二异丙酯;二甲硅油350;二甲硅油共聚醇;二甲硅油mdx4
‑
4210;二甲硅油医用液体360;二甲基异山梨醇;二甲亚砜;甲基丙烯酸二甲氨基乙酯
‑
甲基丙烯酸丁酯
‑
甲基丙烯酸甲酯共聚物;二甲基二(十八烷基)铵膨润土;二甲基硅氧烷/甲基乙烯基硅氧烷共聚物;达诺杀(dinoseb)铵盐;dl
‑
二棕榈酰磷脂酰甘油;二丙二醇;椰油两性二乙酸二钠;月桂醇醚磺基丁二酸二钠;月桂基磺基丁二酸二钠;磺基水杨酸二钠;地索苯宁(disofenin);二乙烯基苯
‑
苯乙烯共聚物;dmdm乙内酰脲;多可沙诺(docosanol);多库酯钠(docusate sodium);duro
‑
tak 280
‑
2516;duro
‑
tak 387
‑
2516;duro
‑
tak 80
‑
1196;duro
‑
tak 87
‑
2070;duro
‑
tak 87
‑
2194;duro
‑
tak 87
‑
2287;duro
‑
tak 87
‑
2296;duro
‑
tak 87
‑
2888;duro
‑
tak 87
‑
2979;乙二胺四乙酸钙二钠;乙二胺四乙酸二钠;无水乙二胺四乙酸二钠;乙二胺四乙酸钠;乙二胺四乙酸;卵磷脂;恩磺酸(entsufon);恩磺酸钠;表半乳糖;表四环素盐酸盐;essence bouquet 9200;乙醇胺盐酸盐;乙酸乙酯;油酸乙酯;乙基纤维素;乙二醇;乙烯乙酸乙烯酯共聚物;乙二胺;乙二胺二盐酸盐;乙烯
‑
丙烯共聚物;乙烯
‑
乙酸乙烯酯共聚物(28%乙酸乙烯酯);乙烯
‑
乙酸乙烯酯共聚物(9%乙酸乙烯酯);羟基硬脂酸乙基己酯;对羟基苯甲酸乙酯;桉油醇;依沙美肟;食用脂肪;固体脂肪;脂肪酸酯;脂肪酸季戊四醇酯;脂肪酸;脂肪醇柠檬酸酯;脂肪醇;fd&c蓝第1号;fd&c绿第3号;fd&c红第4号;fd&c红第40号;fd&c黄第10号(未列);fd&c黄第5号;fd&c黄第6号;氯化铁;氧化铁;香料89
‑
186;香料89
‑
259;香料df
‑
119;香料df
‑
1530;香料增强剂;香料无花果827118;香料覆盆子pfc
‑
8407;香料罗地亚医药编号rf 451;氟氯烃;甲醛;甲醛溶液;分馏椰子油;芳香剂3949
‑
5;芳香剂520a;芳香剂6.007;芳香剂91
‑
122;芳香剂9128
‑
y;芳香剂93498g;香脂松树芳香剂5124号;芳香剂bouquet 10328;芳香剂chemoderm 6401
‑
b;芳香剂chemoderm 6411;芳香剂乳膏73457号;芳香剂cs
‑
28197;芳香剂felton 066m;芳香剂firmenich 47373;芳香剂givaudan ess 9090/1c;芳香剂h
‑
6540;芳香剂herbal 10396;芳香剂nj
‑
1085;芳香剂p o fl
‑
147;芳香剂pa 52805;芳香剂pera derm d;芳香剂rbd
‑
9819;芳香剂shaw mudge u
‑
7776;芳香剂tf 044078;芳香剂ungerer honeysuckle k 2771;芳香剂ungerer n5195;果糖;氧化钆;半乳糖;γ环糊精;明胶;交联明胶;明胶海绵(gelfoam sponge);结兰胶(gellan gum)(低酰基);gelva 737;龙胆酸;龙胆酸乙醇酰胺;葡庚糖酸钠;二水合葡庚糖酸钠;葡萄糖酸内酯;葡萄糖醛酸;dl
‑
谷氨酸;谷胱甘肽;甘油;氢化松香的甘油酯;柠檬酸甘油酯;异硬脂酸甘油酯;月桂酸甘油酯;单硬脂酸甘油酯;油酸甘油酯;油酸甘油酯/丙二醇;棕榈酸甘油酯;蓖麻油酸甘油酯;硬脂酸甘油酯;硬脂酸甘油酯
‑
月桂醇醚
‑
23;硬脂酸甘油酯/peg硬脂酸酯;硬脂酸甘油酯/peg
‑
100硬脂酸酯;硬脂酸甘油酯/peg
‑
40硬脂酸酯;硬脂酸甘油酯
‑
硬脂酰胺基乙基二乙胺;三油酸甘油酯;甘氨酸;甘氨酸盐酸盐;乙二醇二硬脂酸酯;乙二醇硬脂酸酯;胍盐酸盐;瓜尔胶(guar gum);护发素(18n195
‑
1m);庚烷;羟乙基淀粉;己二醇;高密度聚乙烯;组氨酸;人白蛋白微球;玻尿酸钠;烃;塑化烃凝胶;盐酸;稀盐酸;氢皮质酮(hydrocortisone);水凝胶聚合物;过氧化氢;氢化蓖麻油;氢化棕榈油;氢化棕榈/棕榈仁油peg
‑
6酯;氢化聚丁烯635
‑
690;氢氧根离子;羟乙基纤维素;羟乙基哌嗪乙磺
酸;羟甲基纤维素;羟基硬脂酸羟基二十八烷基酯;羟丙基纤维素;羟丙基甲基纤维素2906;羟丙基
‑
β
‑
环糊精;羟丙甲纤维素2208(15000mpa.s);羟丙甲纤维素2910(15000mpa.s);羟丙甲纤维素;咪脲(imidurea);碘;碘沙酸(iodoxamic acid);碘非他胺盐酸盐(iofetamine hydrochloride);爱尔兰苔提取物(irish moss extract);异丁烷;异鲸蜡醇聚醚(isoceteth)
‑
20;异亮氨酸;丙烯酸异辛酯;异丙醇;异硬脂酸异丙酯;肉豆蔻酸异丙酯;肉豆蔻酸异丙酯
‑
肉豆蔻醇;棕榈酸异丙酯;硬脂酸异丙酯;异硬脂酸;异硬脂醇;等渗氯化钠溶液;节冷(jelene);高岭土;卡松(kathon)cg;卡松cg ii;乳酸酯;乳酸;dl
‑
乳酸;l
‑
乳酸;乳糖酸;乳糖;单水合乳糖;水合乳糖;羊毛脂醇聚醚(laneth);羊毛脂;羊毛脂醇
‑
矿物油;羊毛脂醇;无水羊毛脂;羊毛脂胆固醇;羊毛脂非离子衍生物;乙氧基化羊毛脂;氢化羊毛脂;劳拉氯铵(lauralkonium chloride);氧化月桂基胺;月桂基二甲基铵水解动物胶原蛋白;月桂醇醚硫酸盐;月桂醇醚
‑
2;月桂醇醚
‑
23;月桂醇醚
‑
4;月桂酸二乙醇酰胺;月桂酸肉豆蔻酸二乙醇酰胺;月桂酰基肌氨酸;乳酸月桂酯;硫酸月桂酯;熏衣草花顶端(lavandula angustifolia flowering top);卵磷脂;未漂白卵磷脂;蛋卵磷脂;氢化卵磷脂;氢化大豆卵磷脂;大豆卵磷脂;柠檬油;亮氨酸;乙酰丙酸;利多苯宁(lidofenin);轻质矿物油;轻质矿物油(85ssu);( /
‑
)
‑
柠檬烯;lipocol sc
‑
15;赖氨酸;乙酸赖氨酸;单水合赖氨酸;硅酸镁铝;水合硅酸镁铝;氯化镁;硝酸镁;硬脂酸镁;顺丁烯二酸;甘露糖醇;磺化脂肪醇(maprofix);甲溴菲宁(mebrofenin);改质医用粘着剂s
‑
15;医用消泡剂a
‑
f乳液;亚甲基二膦酸二钠(medronate disodium);亚甲基二膦酸(medronic acid);葡甲胺(meglumine);薄荷脑(menthol);间甲酚;偏磷酸;甲磺酸;甲硫氨酸;甲醇;甲基葡糖醇聚醚(methyl gluceth)
‑
10;甲基葡糖醇聚醚
‑
20;葡糖醇聚醚
‑
20倍半硬脂酸甲酯;葡萄糖倍半硬脂酸甲酯;月桂酸甲酯;甲基吡咯烷酮;水杨酸甲酯;硬脂酸甲酯;甲基硼酸;甲基纤维素(4000mpa.s);甲基纤维素;甲基氯异噻唑啉酮(methylchloroisothiazolinone);亚甲基蓝;甲基异噻唑啉酮;对羟基苯甲酸甲酯;微晶蜡;矿物油;单酸甘油脂和二酸甘油脂;柠檬酸单硬脂基酯;单硫甘油;多固醇提取物;肉豆蔻醇;乳酸肉豆蔻基酯;氯化肉豆蔻基
‑
γ
‑
甲基吡啶;n
‑
(氨甲酰基
‑
甲氧基peg
‑
40)
‑
1,2
‑
二硬脂酰基
‑
脑磷脂钠;n,n
‑
二甲基乙酰胺;烟碱酰胺;环己二酮二肟(nioxime);硝酸;氮气;壬苯醇醚碘;壬苯醇醚
‑
15;壬苯醇醚
‑
9;诺氟烷(norflurane);燕麦片(oatmeal);十八烯
‑
1/顺丁烯二酸共聚物;辛酸;奥替柳酯(octisalate);辛苯聚醇
‑
1;辛苯聚醇
‑
40;辛苯聚醇
‑
9;辛基十二烷醇;辛基苯酚聚亚甲基;油酸;油醇醚
‑
10/油醇醚
‑
5;油醇醚
‑
2;油醇醚
‑
20;油醇;油醇油酸酯;橄榄油;羟亚甲基二膦酸二钠;氧基喹啉;棕榈仁油;氧化棕榈胺;对羟基苯甲酸酯;石蜡;白软石蜡;帕尔姆乳膏(parfum creme)45/3;花生油;精制花生油;果胶;peg 6
‑
32硬脂酸酯/乙二醇硬脂酸酯;peg植物油;peg
‑
100硬脂酸酯;peg
‑
12月桂酸甘油酯;peg
‑
120硬脂酸甘油酯;peg
‑
120葡萄糖二油酸甲酯;peg
‑
15椰油胺;peg
‑
150二硬脂酸酯;peg
‑
2硬脂酸酯;peg
‑
20脱水山梨糖醇异硬脂酸酯;peg
‑
22甲基醚/十二烷基乙二醇共聚物;peg
‑
25丙二醇硬脂酸酯;peg
‑
4二月桂酸酯;peg
‑
4月桂酸酯;peg
‑
40蓖麻油;peg
‑
40脱水山梨糖醇二异硬脂酸酯;peg
‑
45/十二烷基乙二醇共聚物;peg
‑
5油酸酯;peg
‑
50硬脂酸酯;peg
‑
54氢化蓖麻油;peg
‑
6异硬脂酸酯;peg
‑
60蓖麻油;peg
‑
60氢化蓖麻油;peg
‑
7甲基醚;peg
‑
75羊毛脂;peg
‑
8月桂酸酯;peg
‑
8硬脂酸酯;pegoxol 7硬脂酸酯;十五内酯;异戊四醇椰油酸酯;喷替酸五钠(pentasodium pentetate);喷替酸钙三钠;喷替酸(pentetic acid);薄荷油;全氟丙烷;香料25677;花香
香料;香料e
‑
1991;香料gd 5604;香料tana 90/42scba;香料w
‑
1952
‑
1;矿脂;白矿脂;石油馏出物;苯酚;液化苯酚;酚尼普(phenonip);苯氧基乙醇;苯丙氨酸;苯乙醇;乙酸苯汞;硝酸苯汞;磷脂酰基甘油卵磷脂;卵磷脂;phospholipon 90g;磷酸;松针油(欧洲赤松(pinus sylvestris));六水合哌嗪;plastibase
‑
50w;泊拉可林(polacrilin);泊利氯铵(polidronium chloride);泊洛沙姆(poloxamer)124;泊洛沙姆181;泊洛沙姆182;泊洛沙姆188;泊洛沙姆237;泊洛沙姆407;聚(双(对羧基苯氧基)丙烷酸酐):癸二酸;聚(二甲基硅氧烷/甲基乙烯基硅氧烷/甲基氢硅氧烷)二甲基乙烯基或二甲基羟基或三甲基封端;聚(dl
‑
乳酸
‑
共
‑
乙醇酸),50:50;聚(dl
‑
乳酸
‑
共
‑
乙醇酸),乙酯封端,50:50;聚丙烯酸(250000mw);聚丁烯(1400mw);聚卡波非(polycarbophil);聚酯;聚酯多元胺共聚物;聚酯人造丝(rayon);聚乙二醇1000;聚乙二醇1450;聚乙二醇1500;聚乙二醇1540;聚乙二醇200;聚乙二醇300;聚乙二醇300
‑
1600;聚乙二醇3350;聚乙二醇400;聚乙二醇4000;聚乙二醇540;聚乙二醇600;聚乙二醇6000;聚乙二醇8000;聚乙二醇900;含有氧化铁黑(<1%)的高密度聚乙烯;含有硫酸钡(20
‑
24%)的低密度聚乙烯;聚乙烯t;聚对苯二甲酸乙二醇酯;聚多糖;聚甘油基
‑
3油酸酯;聚甘油基
‑
4油酸酯;聚甲基丙烯酸羟乙酯;聚异丁烯;聚异丁烯(1100000mw);聚异丁烯(35000mw);聚异丁烯178
‑
236;聚异丁烯241
‑
294;聚异丁烯35
‑
39;低分子量聚异丁烯;中分子量聚异丁烯;聚异丁烯/聚丁烯粘着剂;聚丙交酯;多元醇;聚氧化乙烯
‑
聚环氧丙烷1800;聚氧化乙烯醇;聚氧化乙烯脂肪酸酯;聚氧化乙烯丙烯;聚乙二醇20十六基十八基醚;聚乙二醇35蓖麻油;聚乙二醇40氢化蓖麻油;聚乙二醇40硬脂酸酯;聚乙二醇400硬脂酸酯;聚乙二醇6和聚乙二醇32棕榈基硬脂酸酯;聚乙二醇二硬脂酸酯;聚乙二醇硬脂酸甘油酯;聚乙二醇羊毛脂;聚乙二醇棕榈酸酯;聚乙二醇硬脂酸酯;聚丙烯;聚丙二醇;聚季铵
‑
10;聚季铵
‑
7(70/30丙烯酰胺/dadmac);聚硅氧烷;聚山梨醇酯20;聚山梨醇酯40;聚山梨醇酯60;聚山梨醇酯65;聚山梨醇酯80;聚氨基甲酸酯;聚乙酸乙烯酯;聚乙烯醇;聚氯乙烯;聚氯乙烯
‑
聚乙酸乙烯酯共聚物;聚乙烯吡啶;罂粟籽油;钾肥(potash);乙酸钾;铝钾矾(potassium alum);碳酸氢钾;亚硫酸氢钾;氯化钾;柠檬酸钾;氢氧化钾;偏亚硫酸氢钾;磷酸氢二钾;磷酸二氢钾;钾皂;山梨酸钾;聚维酮丙烯酸酯共聚物;聚维酮水凝胶;聚维酮k17;聚维酮k25;聚维酮k29/32;聚维酮k30;聚维酮k90;聚维酮k90f;聚维酮/二十烯共聚物;聚维酮;ppg
‑
12/smdi共聚物;ppg
‑
15硬脂酰基醚;ppg
‑
20甲基葡萄糖醚二硬脂酸酯;ppg
‑
26油酸酯;产物wat;脯氨酸;普洛姆津(promulgen)d;普洛姆津g;丙烷;推进剂a
‑
46;没食子酸丙酯;碳酸丙二酯;丙二醇;丙二醇二乙酸酯;丙二醇二辛酸酯;丙二醇单月桂酸酯;丙二醇单棕榈酰硬脂酸酯;丙二醇棕榈基硬脂酸酯;丙二醇蓖麻油酸酯;丙二醇/重氮利定;脲/对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯;对羟基苯甲酸丙酯;硫酸鱼精蛋白;蛋白质水解产物;pvm/ma共聚物;季铵盐
‑
15;顺式季铵盐
‑
15;季铵盐
‑
52;ra
‑
2397;ra
‑
3011;糖精;糖精钠;无水糖精钠;红花油;变性酒精3a;变性酒精40;变性酒精40
‑
2;变性酒精40b;sepineo p 600;丝氨酸;芝麻油;乳油木油脂;硅橡胶牌医用级管材;硅橡胶医用粘着剂,a型硅酮;牙科硅石;硅;二氧化硅;胶状二氧化硅;硅酮;硅酮粘着剂4102;硅酮粘着剂4502;硅酮粘着剂bio
‑
psa q7
‑
4201;硅酮粘着剂bio
‑
psa q7
‑
4301;硅酮乳液;硅酮/聚酯膜带材;二甲硅油;二甲硅油乳液;sipon ls 20np;苏打灰(soda ash);乙酸钠;无水乙酸钠;烷基硫酸钠;抗坏血酸钠;苯甲酸钠;碳酸氢钠;硫酸氢钠;亚硫酸氢钠;硼酸钠;十水合硼酸钠;碳酸钠;十水合碳酸钠;单水合碳酸钠;鲸蜡基硬酯酰基硫酸钠;氯酸钠;氯化钠;氯化钠注射
剂;抑菌性氯化钠注射剂;胆固醇基硫酸钠;柠檬酸钠;椰油酰基肌氨酸钠;脱氧胆酸钠;二硫磺酸钠;十二烷基苯磺酸钠;甲醛合次硫酸氢钠;葡糖酸钠;氢氧化钠;次氯酸钠;碘化钠;乳酸钠;l
‑
乳酸钠;月桂醇醚
‑
2硫酸钠;月桂醇醚
‑
3硫酸钠;月桂醇醚
‑
5硫酸钠;月桂酰基肌氨酸钠;月桂基硫酸钠;月桂基磺基乙酸钠;偏亚硫酸氢钠;硝酸钠;磷酸钠;二水合磷酸钠;磷酸氢二钠;无水磷酸氢二钠;二水合磷酸氢二钠;十二水合磷酸氢二钠;七水合磷酸氢二钠;磷酸二氢钠;无水磷酸二氢钠;二水合磷酸二氢钠;单水合磷酸二氢钠;聚丙烯酸钠(2500000mw);焦磷酸钠;吡咯烷酮甲酸钠;羟基乙酸淀粉钠;六水合丁二酸钠;硫酸钠;无水硫酸钠;十水合硫酸钠;亚硫酸钠;磺基丁二酸钠十一烯酸单醇酰胺;酒石酸钠;巯乙酸钠;硫苹果酸钠;硫代硫酸钠;无水硫代硫酸钠;三偏磷酸钠;二甲苯磺酸钠;索马伊(somay)44;山梨酸;脱水山梨糖醇;脱水山梨糖醇异硬脂酸酯;脱水山梨糖醇单月桂酸酯;脱水山梨糖醇单油酸酯;脱水山梨糖醇单棕榈酸酯;脱水山梨糖醇单硬脂酸酯;脱水山梨糖醇倍半油酸酯;脱水山梨糖醇三油酸酯;脱水山梨糖醇三硬酯酸酯;山梨糖醇;山梨糖醇溶液;大豆粉;大豆油;绿薄荷油;鲸蜡(spermaceti);角鲨烷;稳定氧氯复合物;2
‑
乙基己酸亚锡;氯化亚锡;无水氯化亚锡;氟化亚锡;酒石酸亚锡;淀粉;预胶凝淀粉1500;玉米淀粉;硬酯基二甲基苄基氯化铵(stearalkonium chloride);司拉氯铵水辉石(stearalkonium hectorite)/碳酸丙二酯;硬脂酰胺基乙基二乙胺;硬脂醇醚
‑
10;硬脂醇醚
‑
100;硬脂醇醚
‑
2;硬脂醇醚
‑
20;硬脂醇醚
‑
21;硬脂醇醚
‑
40;硬脂酸;硬脂酸二乙醇酰胺;硬脂氧基三甲基硅烷;硬脂基三甲基铵水解动物胶原蛋白;硬脂醇;无菌吸入用水;苯乙烯/异戊二烯/苯乙烯嵌段共聚物;二巯丁二酸(succimer);丁二酸;蔗糖素;蔗糖;蔗糖二硬脂酸酯;蔗糖聚酯;磺胺乙酰胺钠;磺基丁醚
‑
β
‑
环糊精;二氧化硫;硫酸;亚硫酸;表面活性剂(surfactol qs);d
‑
塔格糖(tagatose);滑石;松油(tall oil);动物脂甘油酯;酒石酸;dl
‑
酒石酸;特诺克斯(tenox);特诺克斯
‑
2;叔丁醇;氢过氧化叔丁基;叔丁基氢醌;四氟硼酸四(2
‑
甲氧基异丁基异氰化物)铜(i);正硅酸四丙酯;替曲膦(tetrofosmin);茶碱(theophylline);硫柳汞(thimerosal);苏氨酸;瑞香草酚(thymol);锡;二氧化钛;生育酚;托可索仑(tocophersolan);全营养注射剂(total parenteral nutrition)脂质乳液;三乙酸甘油酯(triacetin);三辛酸甘油酯(tricaprylin);三氯单氟甲烷;十三烷醇聚醚
‑
10;月桂基硫酸三乙醇胺;三氟乙酸;中链三酸甘油酯;三羟基硬脂精(trihydroxystearin);三羊毛醇聚醚
‑
4磷酸酯;三月桂醇聚醚
‑
4磷酸酯;二水合柠檬酸三钠;hedta三钠;曲拉通(triton)720;曲拉通x
‑
200;三乙醇胺;曲金刚胺(tromantadine);缓血酸胺(tromethamine)(tris);色氨酸;泰洛沙泊(tyloxapol);酪氨酸;十一烯酸;union 76amsco
‑
res 6038;脲;缬氨酸;植物油;氢化植物油甘油酯;氢化植物油;维塞胺(versetamide);韦斯卡林(viscarin);粘胶(viscose)/棉花;维生素e;乳化蜡;wecobee fs;白地蜡;白蜡;三仙胶(xanthan gum);锌;乙酸锌;碳酸锌;氯化锌;和氧化锌。
[0734]
本文公开的aav颗粒的药物制剂可包含阳离子或阴离子。在某些实施方案中,制剂包含金属阳离子,例如但不限于zn
2
、ca
2
、cu
2
、mn
2
、mg
和其组合。作为一个非限制性实例,制剂可包含具有金属阳离子的聚合物和复合物(参见例如美国专利第6,265,389号和第6,555,525号,所述美国专利中的每一者通过引用整体并入本文)。
[0735]
本公开的制剂还可包含一种或多种药学上可接受的盐。如本文所用,“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物,其中母体化合物通过将现有酸或碱部分转化为其
盐形式(例如通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)来修饰。
[0736]
在某些实施方案中,可用于配制药物组合物的其他赋形剂可包含氯化镁(mgcl2)、精氨酸、山梨糖醇和/或海藻糖。
[0737]
除aav颗粒以外,本公开的制剂可包含至少一种赋形剂和/或稀释剂。除aav颗粒以外,制剂可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10种赋形剂和/或稀释剂。
[0738]
在某些实施方案中,制剂可包括但不限于磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)。作为一个非限制性实例,pbs可包含氯化钠、氯化钾、磷酸二钠、磷酸一钾和蒸馏水。在一些情况下,pbs不含钾或镁。在其他情况下,pbs含有钙和镁。
[0739]
磷酸钠
[0740]
在某些实施方案中,制剂中组分中的至少一者为磷酸钠。制剂可包含一元磷酸钠、二元磷酸钠或一元磷酸钠与二元磷酸钠的组合。
[0741]
在某些实施方案中,制剂中的磷酸钠的浓度可为但不限于0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3mm、3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、3.5mm、3.6mm、3.7mm、3.8mm、3.9mm、4mm、4.1mm、4.2mm、4.3mm、4.4mm、4.5mm、4.6mm、4.7mm、4.8mm、4.9mm、5mm、5.1mm、5.2mm、5.3mm、5.4mm、5.5mm、5.6mm、5.7mm、5.8mm、5.9mm、6mm、6.1mm、6.2mm、6.3mm、6.4mm、6.5mm、6.6mm、6.7mm、6.8mm、6.9mm、7mm、7.1mm、7.2mm、7.3mm、7.4mm、7.5mm、7.6mm、7.7mm、7.8mm、7.9mm、8mm、8.1mm、8.2mm、8.3mm、8.4mm、8.5mm、8.6mm、8.7mm、8.8mm、8.9mm、9mm、9.1mm、9.2mm、9.3mm、9.4mm、9.5mm、9.6mm、9.7mm、9.8mm、9.9mm、10mm、10.1mm、10.2mm、10.3mm、10.4mm、10.5mm、10.6mm、10.7mm、10.8mm、10.9mm、11mm、11.1mm、11.2mm、11.3mm、11.4mm、11.5mm、11.6mm、11.7mm、11.8mm、11.9mm、12mm、12.1mm、12.2mm、12.3mm、12.4mm、12.5mm、12.6mm、12.7mm、12.8mm、12.9mm、13mm、13.1mm、13.2mm、13.3mm、13.4mm、13.5mm、13.6mm、13.7mm、13.8mm、13.9mm、14mm、14.1mm、14.2mm、14.3mm、14.4mm、14.5mm、14.6mm、14.7mm、14.8mm、14.9mm或15mm。
[0742]
制剂可包含在以下范围内的磷酸钠:0
‑
0.5mm、0.1
‑
0.6mm、0.2
‑
0.7mm、0.3
‑
0.8mm、0.4
‑
0.9mm、0.5
‑
1mm、0.6
‑
1.1mm、0.7
‑
1.2mm、0.8
‑
1.3mm、0.9
‑
1.4mm、1
‑
1.5mm、1.1
‑
1.6mm、1.2
‑
1.7mm、1.3
‑
1.8mm、1.4
‑
1.9mm、1.5
‑
2mm、1.6
‑
2.1mm、1.7
‑
2.2mm、1.8
‑
2.3mm、1.9
‑
2.4mm、2
‑
2.5mm、2.1
‑
2.6mm、2.2
‑
2.7mm、2.3
‑
2.8mm、2.4
‑
2.9mm、2.5
‑
3mm、2.6
‑
3.1mm、2.7
‑
3.2mm、2.8
‑
3.3mm、2.9
‑
3.4mm、3
‑
3.5mm、3.1
‑
3.6mm、3.2
‑
3.7mm、3.3
‑
3.8mm、3.4
‑
3.9mm、3.5
‑
4mm、3.6
‑
4.1mm、3.7
‑
4.2mm、3.8
‑
4.3mm、3.9
‑
4.4mm、4
‑
4.5mm、4.1
‑
4.6mm、4.2
‑
4.7mm、4.3
‑
4.8mm、4.4
‑
4.9mm、4.5
‑
5mm、4.6
‑
5.1mm、4.7
‑
5.2mm、4.8
‑
5.3mm、4.9
‑
5.4mm、5
‑
5.5mm、5.1
‑
5.6mm、5.2
‑
5.7mm、5.3
‑
5.8mm、5.4
‑
5.9mm、5.5
‑
6mm、5.6
‑
6.1mm、5.7
‑
6.2mm、5.8
‑
6.3mm、5.9
‑
6.4mm、6
‑
6.5mm、6.1
‑
6.6mm、6.2
‑
6.7mm、6.3
‑
6.8mm、6.4
‑
6.9mm、6.5
‑
7mm、6.6
‑
7.1mm、6.7
‑
7.2mm、6.8
‑
7.3mm、6.9
‑
7.4mm、7
‑
7.5mm、7.1
‑
7.6mm、7.2
‑
7.7mm、7.3
‑
7.8mm、7.4
‑
7.9mm、7.5
‑
8mm、7.6
‑
8.1mm、7.7
‑
8.2mm、7.8
‑
8.3mm、7.9
‑
8.4mm、8
‑
8.5mm、8.1
‑
8.6mm、8.2
‑
8.7mm、8.3
‑
8.8mm、8.4
‑
8.9mm、8.5
‑
9mm、8.6
‑
9.1mm、8.7
‑
9.2mm、8.8
‑
9.3mm、8.9
‑
9.4mm、9
‑
9.5mm、9.1
‑
9.6mm、9.2
‑
9.7mm、9.3
‑
9.8mm、9.4
‑
9.9mm、9.5
‑
10mm、9.6
‑
10.1mm、9.7
‑
10.2mm、9.8
‑
10.3mm、9.9
‑
10.4mm、10
‑
10.5mm、10.1
‑
10.6mm、10.2
‑
10.7mm、10.3
‑
10.8mm、10.4
‑
10.9mm、10.5
‑
11mm、10.6
‑
11.1mm、10.7
‑
11.2mm、10.8
‑
11.3mm、10.9
‑
11.4mm、
11
‑
11.5mm、11.1
‑
11.6mm、11.2
‑
11.7mm、11.3
‑
11.8mm、11.4
‑
11.9mm、11.5
‑
12mm、11.6
‑
12.1mm、11.7
‑
12.2mm、11.8
‑
12.3mm、11.9
‑
12.4mm、12
‑
12.5mm、12.1
‑
12.6mm、12.2
‑
12.7mm、12.3
‑
12.8mm、12.4
‑
12.9mm、12.5
‑
13mm、12.6
‑
13.1mm、12.7
‑
13.2mm、12.8
‑
13.3mm、12.9
‑
13.4mm、13
‑
13.5mm、13.1
‑
13.6mm、13.2
‑
13.7mm、13.3
‑
13.8mm、13.4
‑
13.9mm、13.5
‑
14mm、13.6
‑
14.1mm、13.7
‑
14.2mm、13.8
‑
14.3mm、13.9
‑
14.4mm、14
‑
14.5mm、14.1
‑
14.6mm、14.2
‑
14.7mm、14.3
‑
14.8mm、14.4
‑
14.9mm、14.5
‑
15mm、0
‑
1mm、1
‑
2mm、2
‑
3mm、3
‑
4mm、4
‑
5mm、5
‑
6mm、6
‑
7mm、7
‑
8mm、8
‑
9mm、9
‑
10mm、10
‑
11mm、11
‑
12mm、12
‑
13mm、13
‑
14mm、14
‑
15mm、15
‑
16mm、0
‑
2mm、1
‑
3mm、2
‑
4mm、3
‑
5mm、4
‑
6mm、5
‑
7mm、6
‑
8mm、7
‑
9mm、8
‑
10mm、9
‑
11mm、10
‑
12mm、11
‑
13mm、12
‑
14mm、13
‑
15mm、0
‑
3mm、1
‑
4mm、2
‑
5mm、3
‑
6mm、4
‑
7mm、5
‑
8mm、6
‑
9mm、7
‑
10mm、8
‑
11mm、9
‑
12mm、10
‑
13mm、11
‑
14mm、12
‑
15mm、0
‑
4mm、1
‑
5mm、2
‑
6mm、3
‑
7mm、4
‑
8mm、5
‑
9mm、6
‑
10mm、7
‑
11mm、8
‑
12mm、9
‑
13mm、10
‑
14mm、11
‑
15mm、0
‑
5mm、1
‑
6mm、2
‑
7mm、3
‑
8mm、4
‑
9mm、5
‑
10mm、6
‑
11mm、7
‑
12mm、8
‑
13mm、9
‑
14mm、10
‑
15mm、0
‑
6mm、1
‑
7mm、2
‑
8mm、3
‑
9mm、4
‑
10mm、5
‑
11mm、6
‑
12mm、7
‑
13mm、8
‑
14mm、9
‑
15mm、0
‑
7mm、1
‑
8mm、2
‑
9mm、3
‑
10mm、4
‑
11mm、5
‑
12mm、6
‑
13mm、7
‑
14mm、8
‑
15mm、0
‑
8mm、1
‑
9mm、2
‑
10mm、3
‑
11mm、4
‑
12mm、5
‑
13mm、6
‑
14mm、7
‑
15mm、0
‑
9mm、1
‑
10mm、2
‑
11mm、3
‑
12mm、4
‑
13mm、5
‑
14mm、6
‑
15mm、0
‑
10mm、1
‑
11mm、2
‑
12mm、3
‑
13mm、4
‑
14mm、5
‑
15mm、0
‑
11mm、1
‑
12mm、2
‑
13mm、3
‑
14mm、4
‑
15mm、0
‑
12mm、1
‑
13mm、2
‑
14mm、3
‑
15mm、0
‑
13mm、1
‑
14mm、2
‑
15mm、0
‑
14mm、1
‑
15mm或0
‑
15mm。
[0743]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
10mm的磷酸钠。
[0744]
在某些实施方案中,制剂可包含2
‑
12mm的磷酸钠。
[0745]
在某些实施方案中,制剂可包含2
‑
3mm的磷酸钠。
[0746]
在某些实施方案中,制剂可包含9
‑
10mm的磷酸钠。
[0747]
在某些实施方案中,制剂可包含10
‑
11mm的磷酸钠。
[0748]
在某些实施方案中,制剂可包含2.7mm的磷酸钠。
[0749]
在某些实施方案中,制剂可包含10mm的磷酸钠。
[0750]
磷酸钾
[0751]
在某些实施方案中,制剂中的组分中的至少一者为磷酸钾。制剂可包含一元磷酸钾、二元磷酸钾或一元磷酸钾与二元磷酸钾的组合。
[0752]
在某些实施方案中,制剂中的磷酸钾的浓度可为但不限于0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3mm、3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、3.5mm、3.6mm、3.7mm、3.8mm、3.9mm、4mm、4.1mm、4.2mm、4.3mm、4.4mm、4.5mm、4.6mm、4.7mm、4.8mm、4.9mm、5mm、5.1mm、5.2mm、5.3mm、5.4mm、5.5mm、5.6mm、5.7mm、5.8mm、5.9mm、6mm、6.1mm、6.2mm、6.3mm、6.4mm、6.5mm、6.6mm、6.7mm、6.8mm、6.9mm、7mm、7.1mm、7.2mm、7.3mm、7.4mm、7.5mm、7.6mm、7.7mm、7.8mm、7.9mm、8mm、8.1mm、8.2mm、8.3mm、8.4mm、8.5mm、8.6mm、8.7mm、8.8mm、8.9mm、9mm、9.1mm、9.2mm、9.3mm、9.4mm、9.5mm、9.6mm、9.7mm、9.8mm、9.9mm、10mm、10.1mm、10.2mm、10.3mm、10.4mm、10.5mm、10.6mm、10.7mm、10.8mm、10.9mm、11mm、11.1mm、11.2mm、11.3mm、11.4mm、11.5mm、11.6mm、11.7mm、11.8mm、11.9mm、12mm、12.1mm、12.2mm、12.3mm、12.4mm、12.5mm、12.6mm、12.7mm、12.8mm、12.9mm、13mm、13.1mm、13.2mm、13.3mm、13.4mm、13.5mm、13.6mm、13.7mm、13.8mm、13.9mm、
14mm、14.1mm、14.2mm、14.3mm、14.4mm、14.5mm、14.6mm、14.7mm、14.8mm、14.9mm或15mm。
[0753]
制剂可包含在以下范围内的磷酸钾:0
‑
0.5mm、0.1
‑
0.6mm、0.2
‑
0.7mm、0.3
‑
0.8mm、0.4
‑
0.9mm、0.5
‑
1mm、0.6
‑
1.1mm、0.7
‑
1.2mm、0.8
‑
1.3mm、0.9
‑
1.4mm、1
‑
1.5mm、1.1
‑
1.6mm、1.2
‑
1.7mm、1.3
‑
1.8mm、1.4
‑
1.9mm、1.5
‑
2mm、1.6
‑
2.1mm、1.7
‑
2.2mm、1.8
‑
2.3mm、1.9
‑
2.4mm、2
‑
2.5mm、2.1
‑
2.6mm、2.2
‑
2.7mm、2.3
‑
2.8mm、2.4
‑
2.9mm、2.5
‑
3mm、2.6
‑
3.1mm、2.7
‑
3.2mm、2.8
‑
3.3mm、2.9
‑
3.4mm、3
‑
3.5mm、3.1
‑
3.6mm、3.2
‑
3.7mm、3.3
‑
3.8mm、3.4
‑
3.9mm、3.5
‑
4mm、3.6
‑
4.1mm、3.7
‑
4.2mm、3.8
‑
4.3mm、3.9
‑
4.4mm、4
‑
4.5mm、4.1
‑
4.6mm、4.2
‑
4.7mm、4.3
‑
4.8mm、4.4
‑
4.9mm、4.5
‑
5mm、4.6
‑
5.1mm、4.7
‑
5.2mm、4.8
‑
5.3mm、4.9
‑
5.4mm、5
‑
5.5mm、5.1
‑
5.6mm、5.2
‑
5.7mm、5.3
‑
5.8mm、5.4
‑
5.9mm、5.5
‑
6mm、5.6
‑
6.1mm、5.7
‑
6.2mm、5.8
‑
6.3mm、5.9
‑
6.4mm、6
‑
6.5mm、6.1
‑
6.6mm、6.2
‑
6.7mm、6.3
‑
6.8mm、6.4
‑
6.9mm、6.5
‑
7mm、6.6
‑
7.1mm、6.7
‑
7.2mm、6.8
‑
7.3mm、6.9
‑
7.4mm、7
‑
7.5mm、7.1
‑
7.6mm、7.2
‑
7.7mm、7.3
‑
7.8mm、7.4
‑
7.9mm、7.5
‑
8mm、7.6
‑
8.1mm、7.7
‑
8.2mm、7.8
‑
8.3mm、7.9
‑
8.4mm、8
‑
8.5mm、8.1
‑
8.6mm、8.2
‑
8.7mm、8.3
‑
8.8mm、8.4
‑
8.9mm、8.5
‑
9mm、8.6
‑
9.1mm、8.7
‑
9.2mm、8.8
‑
9.3mm、8.9
‑
9.4mm、9
‑
9.5mm、9.1
‑
9.6mm、9.2
‑
9.7mm、9.3
‑
9.8mm、9.4
‑
9.9mm、9.5
‑
10mm、9.6
‑
10.1mm、9.7
‑
10.2mm、9.8
‑
10.3mm、9.9
‑
10.4mm、10
‑
10.5mm、10.1
‑
10.6mm、10.2
‑
10.7mm、10.3
‑
10.8mm、10.4
‑
10.9mm、10.5
‑
11mm、10.6
‑
11.1mm、10.7
‑
11.2mm、10.8
‑
11.3mm、10.9
‑
11.4mm、11
‑
11.5mm、11.1
‑
11.6mm、11.2
‑
11.7mm、11.3
‑
11.8mm、11.4
‑
11.9mm、11.5
‑
12mm、11.6
‑
12.1mm、11.7
‑
12.2mm、11.8
‑
12.3mm、11.9
‑
12.4mm、12
‑
12.5mm、12.1
‑
12.6mm、12.2
‑
12.7mm、12.3
‑
12.8mm、12.4
‑
12.9mm、12.5
‑
13mm、12.6
‑
13.1mm、12.7
‑
13.2mm、12.8
‑
13.3mm、12.9
‑
13.4mm、13
‑
13.5mm、13.1
‑
13.6mm、13.2
‑
13.7mm、13.3
‑
13.8mm、13.4
‑
13.9mm、13.5
‑
14mm、13.6
‑
14.1mm、13.7
‑
14.2mm、13.8
‑
14.3mm、13.9
‑
14.4mm、14
‑
14.5mm、14.1
‑
14.6mm、14.2
‑
14.7mm、14.3
‑
14.8mm、14.4
‑
14.9mm、14.5
‑
15mm、0
‑
1mm、1
‑
2mm、2
‑
3mm、3
‑
4mm、4
‑
5mm、5
‑
6mm、6
‑
7mm、7
‑
8mm、8
‑
9mm、9
‑
10mm、10
‑
11mm、11
‑
12mm、12
‑
13mm、13
‑
14mm、14
‑
15mm、15
‑
16mm、0
‑
2mm、1
‑
3mm、2
‑
4mm、3
‑
5mm、4
‑
6mm、5
‑
7mm、6
‑
8mm、7
‑
9mm、8
‑
10mm、9
‑
11mm、10
‑
12mm、11
‑
13mm、12
‑
14mm、13
‑
15mm、0
‑
3mm、1
‑
4mm、2
‑
5mm、3
‑
6mm、4
‑
7mm、5
‑
8mm、6
‑
9mm、7
‑
10mm、8
‑
11mm、9
‑
12mm、10
‑
13mm、11
‑
14mm、12
‑
15mm、0
‑
4mm、1
‑
5mm、2
‑
6mm、3
‑
7mm、4
‑
8mm、5
‑
9mm、6
‑
10mm、7
‑
11mm、8
‑
12mm、9
‑
13mm、10
‑
14mm、11
‑
15mm、0
‑
5mm、1
‑
6mm、2
‑
7mm、3
‑
8mm、4
‑
9mm、5
‑
10mm、6
‑
11mm、7
‑
12mm、8
‑
13mm、9
‑
14mm、10
‑
15mm、0
‑
6mm、1
‑
7mm、2
‑
8mm、3
‑
9mm、4
‑
10mm、5
‑
11mm、6
‑
12mm、7
‑
13mm、8
‑
14mm、9
‑
15mm、0
‑
7mm、1
‑
8mm、2
‑
9mm、3
‑
10mm、4
‑
11mm、5
‑
12mm、6
‑
13mm、7
‑
14mm、8
‑
15mm、0
‑
8mm、1
‑
9mm、2
‑
10mm、3
‑
11mm、4
‑
12mm、5
‑
13mm、6
‑
14mm、7
‑
15mm、0
‑
9mm、1
‑
10mm、2
‑
11mm、3
‑
12mm、4
‑
13mm、5
‑
14mm、6
‑
15mm、0
‑
10mm、1
‑
11mm、2
‑
12mm、3
‑
13mm、4
‑
14mm、5
‑
15mm、0
‑
11mm、1
‑
12mm、2
‑
13mm、3
‑
14mm、4
‑
15mm、0
‑
12mm、1
‑
13mm、2
‑
14mm、3
‑
15mm、0
‑
13mm、1
‑
14mm、2
‑
15mm、0
‑
14mm、1
‑
15mm或0
‑
15mm。
[0754]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
10mm的磷酸钾。
[0755]
在某些实施方案中,制剂可包含1
‑
3mm的磷酸钾。
[0756]
在某些实施方案中,制剂可包含1
‑
2mm的磷酸钾。
[0757]
在某些实施方案中,制剂可包含2
‑
3mm的磷酸钾。
[0758]
在某些实施方案中,制剂可包含2
‑
12mm的磷酸钾。
[0759]
在某些实施方案中,制剂可包含1.5mm的磷酸钾。作为一个非限制性实例,制剂可
包含1.54mm的磷酸钾。
[0760]
在某些实施方案中,制剂可包含2mm的磷酸钾。
[0761]
氯化钠
[0762]
在某些实施方案中,制剂中的组分中的至少一者为氯化钠。
[0763]
在某些实施方案中,制剂中的氯化钠的浓度可为但不限于75mm、76mm、77mm、78mm、79mm、80mm、81mm、82mm、83mm、84mm、85mm、86mm、87mm、88mm、89mm、90mm、91mm、92mm、93mm、94mm、95mm、96mm、97mm、98mm、99mm、100mm、101mm、102mm、103mm、104mm、105mm、106mm、107mm、108mm、109mm、110mm、111mm、112mm、113mm、114mm、115mm、116mm、117mm、118mm、119mm、120mm、121mm、122mm、123mm、124mm、125mm、126mm、127mm、128mm、129mm、130mm、131mm、132mm、133mm、134mm、135mm、136mm、137mm、138mm、139mm、140mm、141mm、142mm、143mm、144mm、145mm、146mm、147mm、148mm、149mm、150mm、151mm、152mm、153mm、154mm、155mm、156mm、157mm、158mm、159mm、160mm、161mm、162mm、163mm、164mm、165mm、166mm、167mm、168mm、169mm、170mm、171mm、172mm、173mm、174mm、175mm、176mm、177mm、178mm、179mm、180mm、181mm、182mm、183mm、184mm、185mm、186mm、187mm、188mm、189mm、190mm、191mm、192mm、193mm、194mm、195mm、196mm、197mm、198mm、199mm、200mm、201mm、202mm、203mm、204mm、205mm、206mm、207mm、208mm、209mm、210mm、211mm、212mm、213mm、214mm、215mm、216mm、217mm、218mm、219mm或220mm。
[0764]
制剂可包含在以下范围内的氯化钠:75
‑
85mm、80
‑
90mm、85
‑
95mm、90
‑
100mm、95
‑
105mm、100
‑
110mm、105
‑
115mm、110
‑
120mm、115
‑
125mm、120
‑
130mm、125
‑
135mm、130
‑
140mm、135
‑
145mm、140
‑
150mm、145
‑
155mm、150
‑
160mm、155
‑
165mm、160
‑
170mm、165
‑
175mm、170
‑
180mm、175
‑
185mm、180
‑
190mm、185
‑
195mm、190
‑
200mm、75
‑
95mm、80
‑
100mm、85
‑
105mm、90
‑
110mm、95
‑
115mm、100
‑
120mm、105
‑
125mm、110
‑
130mm、115
‑
135mm、120
‑
140mm、125
‑
145mm、130
‑
150mm、135
‑
155mm、140
‑
160mm、145
‑
165mm、150
‑
170mm、155
‑
175mm、160
‑
180mm、165
‑
185mm、170
‑
190mm、175
‑
195mm、180
‑
200mm、75
‑
100mm、80
‑
105mm、85
‑
110mm、90
‑
115mm、95
‑
120mm、100
‑
125mm、105
‑
130mm、110
‑
135mm、115
‑
140mm、120
‑
145mm、125
‑
150mm、130
‑
155mm、135
‑
160mm、140
‑
165mm、145
‑
170mm、150
‑
175mm、155
‑
180mm、160
‑
185mm、165
‑
190mm、170
‑
195mm、175
‑
200mm、75
‑
105mm、80
‑
110mm、85
‑
115mm、90
‑
120mm、95
‑
125mm、100
‑
130mm、105
‑
135mm、110
‑
140mm、115
‑
145mm、120
‑
150mm、125
‑
155mm、130
‑
160mm、135
‑
165mm、140
‑
170mm、145
‑
175mm、150
‑
180mm、155
‑
185mm、160
‑
190mm、165
‑
195mm、170
‑
200mm、75
‑
115mm、80
‑
120mm、85
‑
125mm、90
‑
130mm、95
‑
135mm、100
‑
140mm、105
‑
145mm、110
‑
150mm、115
‑
155mm、120
‑
160mm、125
‑
165mm、130
‑
170mm、135
‑
175mm、140
‑
180mm、145
‑
185mm、150
‑
190mm、155
‑
195mm、160
‑
200mm、75
‑
120mm、80
‑
125mm、85
‑
130mm、90
‑
135mm、95
‑
140mm、100
‑
145mm、105
‑
150mm、110
‑
155mm、115
‑
160mm、120
‑
165mm、125
‑
170mm、130
‑
175mm、135
‑
180mm、140
‑
185mm、145
‑
190mm、150
‑
195mm、155
‑
200mm、75
‑
125mm、80
‑
130mm、85
‑
135mm、90
‑
140mm、95
‑
145mm、100
‑
150mm、105
‑
155mm、110
‑
160mm、115
‑
165mm、120
‑
170mm、125
‑
175mm、130
‑
180mm、135
‑
185mm、140
‑
190mm、145
‑
195mm、150
‑
200mm、75
‑
125mm、80
‑
130mm、85
‑
135mm、90
‑
140mm、95
‑
145mm、100
‑
150mm、105
‑
155mm、110
‑
160mm、115
‑
165mm、120
‑
170mm、125
‑
175mm、130
‑
180mm、135
‑
185mm、140
‑
190mm、145
‑
195mm、150
‑
200mm、75
‑
135mm、80
‑
140mm、85
‑
145mm、90
‑
150mm、95
‑
155mm、100
‑
160mm、105
‑
165mm、110
‑
170mm、115
‑
175mm、120
‑
180mm、125
‑
185mm、130
‑
190mm、
135
‑
195mm、140
‑
200mm、75
‑
145mm、80
‑
150mm、85
‑
155mm、90
‑
160mm、95
‑
165mm、100
‑
170mm、105
‑
175mm、110
‑
180mm、115
‑
185mm、120
‑
190mm、125
‑
195mm、130
‑
200mm、75
‑
155mm、80
‑
160mm、85
‑
165mm、90
‑
170mm、95
‑
175mm、100
‑
180mm、105
‑
185mm、110
‑
190mm、115
‑
195mm、120
‑
200mm、75
‑
165mm、80
‑
170mm、85
‑
175mm、90
‑
180mm、95
‑
185mm、100
‑
190mm、105
‑
195mm、110
‑
200mm、75
‑
175mm、80
‑
180mm、85
‑
185mm、90
‑
190mm、95
‑
195mm、100
‑
200mm、80
‑
220mm、90
‑
220mm、100
‑
220mm、110
‑
220mm、120
‑
220mm、130
‑
220mm、140
‑
220mm、150
‑
220mm、160
‑
220mm、170
‑
220mm、180
‑
220mm、190
‑
220mm、200
‑
220mm或210
‑
220mm。
[0765]
在某些实施方案中,制剂可包含80
‑
220mm的氯化钠。
[0766]
在某些实施方案中,制剂可包含80
‑
150mm的氯化钠。
[0767]
在某些实施方案中,制剂可包含75mm的氯化钠。
[0768]
在某些实施方案中,制剂可包含83mm的氯化钠。
[0769]
在某些实施方案中,制剂可包含92mm的氯化钠。
[0770]
在某些实施方案中,制剂可包含95mm的氯化钠。
[0771]
在某些实施方案中,制剂可包含98mm的氯化钠。
[0772]
在某些实施方案中,制剂可包含100mm的氯化钠。
[0773]
在某些实施方案中,制剂可包含107mm的氯化钠。
[0774]
在某些实施方案中,制剂可包含109mm的氯化钠。
[0775]
在某些实施方案中,制剂可包含118mm的氯化钠。
[0776]
在某些实施方案中,制剂可包含125mm的氯化钠。
[0777]
在某些实施方案中,制剂可包含127mm的氯化钠。
[0778]
在某些实施方案中,制剂可包含133mm的氯化钠。
[0779]
在某些实施方案中,制剂可包含142mm的氯化钠。
[0780]
在某些实施方案中,制剂可包含150mm的氯化钠。
[0781]
在某些实施方案中,制剂可包含155mm的氯化钠。
[0782]
在某些实施方案中,制剂可包含180mm的氯化钠。
[0783]
在某些实施方案中,制剂可包含192mm的氯化钠。
[0784]
在某些实施方案中,制剂可包含210mm的氯化钠。
[0785]
氯化钾
[0786]
在某些实施方案中,制剂中的组分中的至少一者为氯化钾。
[0787]
在某些实施方案中,制剂中的氯化钾的浓度可为但不限于0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3mm、3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、3.5mm、3.6mm、3.7mm、3.8mm、3.9mm、4mm、4.1mm、4.2mm、4.3mm、4.4mm、4.5mm、4.6mm、4.7mm、4.8mm、4.9mm、5mm、5.1mm、5.2mm、5.3mm、5.4mm、5.5mm、5.6mm、5.7mm、5.8mm、5.9mm、6mm、6.1mm、6.2mm、6.3mm、6.4mm、6.5mm、6.6mm、6.7mm、6.8mm、6.9mm、7mm、7.1mm、7.2mm、7.3mm、7.4mm、7.5mm、7.6mm、7.7mm、7.8mm、7.9mm、8mm、8.1mm、8.2mm、8.3mm、8.4mm、8.5mm、8.6mm、8.7mm、8.8mm、8.9mm、9mm、9.1mm、9.2mm、9.3mm、9.4mm、9.5mm、9.6mm、9.7mm、9.8mm、9.9mm、10mm、10.1mm、10.2mm、10.3mm、10.4mm、10.5mm、10.6mm、10.7mm、10.8mm、10.9mm、11mm、11.1mm、11.2mm、11.3mm、11.4mm、11.5mm、11.6mm、11.7mm、
11.8mm、11.9mm、12mm、12.1mm、12.2mm、12.3mm、12.4mm、12.5mm、12.6mm、12.7mm、12.8mm、12.9mm、13mm、13.1mm、13.2mm、13.3mm、13.4mm、13.5mm、13.6mm、13.7mm、13.8mm、13.9mm、14mm、14.1mm、14.2mm、14.3mm、14.4mm、14.5mm、14.6mm、14.7mm、14.8mm、14.9mm或15mm。
[0788]
制剂可包含在以下范围内的氯化钾:0
‑
0.5mm、0.1
‑
0.6mm、0.2
‑
0.7mm、0.3
‑
0.8mm、0.4
‑
0.9mm、0.5
‑
1mm、0.6
‑
1.1mm、0.7
‑
1.2mm、0.8
‑
1.3mm、0.9
‑
1.4mm、1
‑
1.5mm、1.1
‑
1.6mm、1.2
‑
1.7mm、1.3
‑
1.8mm、1.4
‑
1.9mm、1.5
‑
2mm、1.6
‑
2.1mm、1.7
‑
2.2mm、1.8
‑
2.3mm、1.9
‑
2.4mm、2
‑
2.5mm、2.1
‑
2.6mm、2.2
‑
2.7mm、2.3
‑
2.8mm、2.4
‑
2.9mm、2.5
‑
3mm、2.6
‑
3.1mm、2.7
‑
3.2mm、2.8
‑
3.3mm、2.9
‑
3.4mm、3
‑
3.5mm、3.1
‑
3.6mm、3.2
‑
3.7mm、3.3
‑
3.8mm、3.4
‑
3.9mm、3.5
‑
4mm、3.6
‑
4.1mm、3.7
‑
4.2mm、3.8
‑
4.3mm、3.9
‑
4.4mm、4
‑
4.5mm、4.1
‑
4.6mm、4.2
‑
4.7mm、4.3
‑
4.8mm、4.4
‑
4.9mm、4.5
‑
5mm、4.6
‑
5.1mm、4.7
‑
5.2mm、4.8
‑
5.3mm、4.9
‑
5.4mm、5
‑
5.5mm、5.1
‑
5.6mm、5.2
‑
5.7mm、5.3
‑
5.8mm、5.4
‑
5.9mm、5.5
‑
6mm、5.6
‑
6.1mm、5.7
‑
6.2mm、5.8
‑
6.3mm、5.9
‑
6.4mm、6
‑
6.5mm、6.1
‑
6.6mm、6.2
‑
6.7mm、6.3
‑
6.8mm、6.4
‑
6.9mm、6.5
‑
7mm、6.6
‑
7.1mm、6.7
‑
7.2mm、6.8
‑
7.3mm、6.9
‑
7.4mm、7
‑
7.5mm、7.1
‑
7.6mm、7.2
‑
7.7mm、7.3
‑
7.8mm、7.4
‑
7.9mm、7.5
‑
8mm、7.6
‑
8.1mm、7.7
‑
8.2mm、7.8
‑
8.3mm、7.9
‑
8.4mm、8
‑
8.5mm、8.1
‑
8.6mm、8.2
‑
8.7mm、8.3
‑
8.8mm、8.4
‑
8.9mm、8.5
‑
9mm、8.6
‑
9.1mm、8.7
‑
9.2mm、8.8
‑
9.3mm、8.9
‑
9.4mm、9
‑
9.5mm、9.1
‑
9.6mm、9.2
‑
9.7mm、9.3
‑
9.8mm、9.4
‑
9.9mm、9.5
‑
10mm、9.6
‑
10.1mm、9.7
‑
10.2mm、9.8
‑
10.3mm、9.9
‑
10.4mm、10
‑
10.5mm、10.1
‑
10.6mm、10.2
‑
10.7mm、10.3
‑
10.8mm、10.4
‑
10.9mm、10.5
‑
11mm、10.6
‑
11.1mm、10.7
‑
11.2mm、10.8
‑
11.3mm、10.9
‑
11.4mm、11
‑
11.5mm、11.1
‑
11.6mm、11.2
‑
11.7mm、11.3
‑
11.8mm、11.4
‑
11.9mm、11.5
‑
12mm、11.6
‑
12.1mm、11.7
‑
12.2mm、11.8
‑
12.3mm、11.9
‑
12.4mm、12
‑
12.5mm、12.1
‑
12.6mm、12.2
‑
12.7mm、12.3
‑
12.8mm、12.4
‑
12.9mm、12.5
‑
13mm、12.6
‑
13.1mm、12.7
‑
13.2mm、12.8
‑
13.3mm、12.9
‑
13.4mm、13
‑
13.5mm、13.1
‑
13.6mm、13.2
‑
13.7mm、13.3
‑
13.8mm、13.4
‑
13.9mm、13.5
‑
14mm、13.6
‑
14.1mm、13.7
‑
14.2mm、13.8
‑
14.3mm、13.9
‑
14.4mm、14
‑
14.5mm、14.1
‑
14.6mm、14.2
‑
14.7mm、14.3
‑
14.8mm、14.4
‑
14.9mm、14.5
‑
15mm、0
‑
1mm、1
‑
2mm、2
‑
3mm、3
‑
4mm、4
‑
5mm、5
‑
6mm、6
‑
7mm、7
‑
8mm、8
‑
9mm、9
‑
10mm、10
‑
11mm、11
‑
12mm、12
‑
13mm、13
‑
14mm、14
‑
15mm、15
‑
16mm、0
‑
2mm、1
‑
3mm、2
‑
4mm、3
‑
5mm、4
‑
6mm、5
‑
7mm、6
‑
8mm、7
‑
9mm、8
‑
10mm、9
‑
11mm、10
‑
12mm、11
‑
13mm、12
‑
14mm、13
‑
15mm、0
‑
3mm、1
‑
4mm、2
‑
5mm、3
‑
6mm、4
‑
7mm、5
‑
8mm、6
‑
9mm、7
‑
10mm、8
‑
11mm、9
‑
12mm、10
‑
13mm、11
‑
14mm、12
‑
15mm、0
‑
4mm、1
‑
5mm、2
‑
6mm、3
‑
7mm、4
‑
8mm、5
‑
9mm、6
‑
10mm、7
‑
11mm、8
‑
12mm、9
‑
13mm、10
‑
14mm、11
‑
15mm、0
‑
5mm、1
‑
6mm、2
‑
7mm、3
‑
8mm、4
‑
9mm、5
‑
10mm、6
‑
11mm、7
‑
12mm、8
‑
13mm、9
‑
14mm、10
‑
15mm、0
‑
6mm、1
‑
7mm、2
‑
8mm、3
‑
9mm、4
‑
10mm、5
‑
11mm、6
‑
12mm、7
‑
13mm、8
‑
14mm、9
‑
15mm、0
‑
7mm、1
‑
8mm、2
‑
9mm、3
‑
10mm、4
‑
11mm、5
‑
12mm、6
‑
13mm、7
‑
14mm、8
‑
15mm、0
‑
8mm、1
‑
9mm、2
‑
10mm、3
‑
11mm、4
‑
12mm、5
‑
13mm、6
‑
14mm、7
‑
15mm、0
‑
9mm、1
‑
10mm、2
‑
11mm、3
‑
12mm、4
‑
13mm、5
‑
14mm、6
‑
15mm、0
‑
10mm、1
‑
11mm、2
‑
12mm、3
‑
13mm、4
‑
14mm、5
‑
15mm、0
‑
11mm、1
‑
12mm、2
‑
13mm、3
‑
14mm、4
‑
15mm、0
‑
12mm、1
‑
13mm、2
‑
14mm、3
‑
15mm、0
‑
13mm、1
‑
14mm、2
‑
15mm、0
‑
14mm、1
‑
15mm或0
‑
15mm。
[0789]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
10mm的氯化钾。
[0790]
在某些实施方案中,制剂可包含1
‑
3mm的氯化钾。
[0791]
在某些实施方案中,制剂可包含1
‑
2mm的氯化钾。
[0792]
在某些实施方案中,制剂可包含2
‑
3mm的氯化钾。
[0793]
在某些实施方案中,制剂可包含1.5mm的氯化钾。
[0794]
在某些实施方案中,制剂可包含2.7mm的氯化钾。
[0795]
氯化镁
[0796]
在某些实施方案中,制剂中的组分中的至少一者为氯化镁。
[0797]
在某些实施方案中,氯化镁的浓度可为但不限于1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm、25mm、26mm、27mm、28mm、29mm、30mm、31mm、32mm、33mm、34mm、35mm、36mm、37mm、38mm、39mm、40mm、41mm、42mm、43mm、44mm、45mm、46mm、47mm、48mm、49mm、50mm、51mm、52mm、53mm、54mm、55mm、56mm、57mm、58mm、59mm、60mm、61mm、62mm、63mm、64mm、65mm、66mm、67mm、68mm、69mm、70mm、71mm、72mm、73mm、74mm、75mm、76mm、77mm、78mm、79mm、80mm、81mm、82mm、83mm、84mm、85mm、86mm、87mm、88mm、89mm、90mm、91mm、92mm、93mm、94mm、95mm、96mm、97mm、98mm、99mm或100mm。
[0798]
制剂可包含在以下范围内的氯化镁:0
‑
5mm、1
‑
5mm、2
‑
5mm、3
‑
5mm、4
‑
5mm、0
‑
10mm、1
‑
10mm、2
‑
10mm、3
‑
10mm、4
‑
10mm、5
‑
10mm、6
‑
10mm、7
‑
10mm、8
‑
10mm、9
‑
10mm、0
‑
25mm、1
‑
25mm、2
‑
25mm、3
‑
25mm、4
‑
25mm、5
‑
25mm、6
‑
25mm、7
‑
25mm、8
‑
25mm、9
‑
25mm、10
‑
25mm、11
‑
25mm、12
‑
25mm、13
‑
25mm、14
‑
25mm、15
‑
25mm、16
‑
25mm、17
‑
25mm、18
‑
25mm、19
‑
25mm、20
‑
25mm、21
‑
25mm、22
‑
25mm、23
‑
25mm、24
‑
25mm、0
‑
50mm、1
‑
50mm、2
‑
50mm、3
‑
50mm、4
‑
50mm、5
‑
50mm、6
‑
50mm、7
‑
50mm、8
‑
50mm、9
‑
50mm、10
‑
50mm、11
‑
50mm、12
‑
50mm、13
‑
50mm、14
‑
50mm、15
‑
50mm、16
‑
50mm、17
‑
50mm、18
‑
50mm、19
‑
50mm、20
‑
50mm、21
‑
50mm、22
‑
50mm、23
‑
50mm、24
‑
50mm、25
‑
50mm、26
‑
50mm、27
‑
50mm、28
‑
50mm、29
‑
50mm、30
‑
50mm、31
‑
50mm、32
‑
50mm、33
‑
50mm、34
‑
50mm、35
‑
50mm、36
‑
50mm、37
‑
50mm、38
‑
50mm、39
‑
50mm、40
‑
50mm、41
‑
50mm、42
‑
50mm、43
‑
50mm、44
‑
50mm、45
‑
50mm、46
‑
50mm、47
‑
50mm、48
‑
50mm、49
‑
50mm、0
‑
75mm、1
‑
75mm、2
‑
75mm、3
‑
75mm、4
‑
75mm、5
‑
75mm、6
‑
75mm、7
‑
75mm、8
‑
75mm、9
‑
75mm、10
‑
75mm、11
‑
75mm、12
‑
75mm、13
‑
75mm、14
‑
75mm、15
‑
75mm、16
‑
75mm、17
‑
75mm、18
‑
75mm、19
‑
75mm、20
‑
75mm、21
‑
75mm、22
‑
75mm、23
‑
75mm、24
‑
75mm、25
‑
75mm、26
‑
75mm、27
‑
75mm、28
‑
75mm、29
‑
75mm、30
‑
75mm、31
‑
75mm、32
‑
75mm、33
‑
75mm、34
‑
75mm、35
‑
75mm、36
‑
75mm、37
‑
75mm、38
‑
75mm、39
‑
75mm、40
‑
75mm、41
‑
75mm、42
‑
75mm、43
‑
75mm、44
‑
75mm、45
‑
75mm、46
‑
75mm、47
‑
75mm、48
‑
75mm、49
‑
75mm、50
‑
75mm、51
‑
75mm、52
‑
75mm、53
‑
75mm、54
‑
75mm、55
‑
75mm、56
‑
75mm、57
‑
75mm、58
‑
75mm、59
‑
75mm、60
‑
75mm、61
‑
75mm、62
‑
75mm、63
‑
75mm、64
‑
75mm、65
‑
75mm、66
‑
75mm、67
‑
75mm、68
‑
75mm、69
‑
75mm、70
‑
75mm、71
‑
75mm、72
‑
75mm、73
‑
75mm、74
‑
75mm、50
‑
100mm、60
‑
100mm、75
‑
100mm、80
‑
100mm或90
‑
100mm。
[0799]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
75mm的氯化镁。
[0800]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
5mm的氯化镁。
[0801]
在某些实施方案中,制剂可包含50
‑
100mm的氯化镁。
[0802]
在某些实施方案中,制剂可包含2mm的氯化镁。
[0803]
在某些实施方案中,制剂可包含75mm的氯化镁。
[0804]
tris
[0805]
在某些实施方案中,制剂中的组分中的至少一者为tris(也称为三(羟甲基)氨基甲烷、缓血酸胺或tham)。
[0806]
在某些实施方案中,制剂中的tris的浓度可为但不限于0.1mm、0.2mm、0.3mm、
0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3mm、3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、3.5mm、3.6mm、3.7mm、3.8mm、3.9mm、4mm、4.1mm、4.2mm、4.3mm、4.4mm、4.5mm、4.6mm、4.7mm、4.8mm、4.9mm、5mm、5.1mm、5.2mm、5.3mm、5.4mm、5.5mm、5.6mm、5.7mm、5.8mm、5.9mm、6mm、6.1mm、6.2mm、6.3mm、6.4mm、6.5mm、6.6mm、6.7mm、6.8mm、6.9mm、7mm、7.1mm、7.2mm、7.3mm、7.4mm、7.5mm、7.6mm、7.7mm、7.8mm、7.9mm、8mm、8.1mm、8.2mm、8.3mm、8.4mm、8.5mm、8.6mm、8.7mm、8.8mm、8.9mm、9mm、9.1mm、9.2mm、9.3mm、9.4mm、9.5mm、9.6mm、9.7mm、9.8mm、9.9mm、10mm、10.1mm、10.2mm、10.3mm、10.4mm、10.5mm、10.6mm、10.7mm、10.8mm、10.9mm、11mm、11.1mm、11.2mm、11.3mm、11.4mm、11.5mm、11.6mm、11.7mm、11.8mm、11.9mm、12mm、12.1mm、12.2mm、12.3mm、12.4mm、12.5mm、12.6mm、12.7mm、12.8mm、12.9mm、13mm、13.1mm、13.2mm、13.3mm、13.4mm、13.5mm、13.6mm、13.7mm、13.8mm、13.9mm、14mm、14.1mm、14.2mm、14.3mm、14.4mm、14.5mm、14.6mm、14.7mm、14.8mm、14.9mm或15mm。
[0807]
制剂可包含在以下范围内的tris:0
‑
0.5mm、0.1
‑
0.6mm、0.2
‑
0.7mm、0.3
‑
0.8mm、0.4
‑
0.9mm、0.5
‑
1mm、0.6
‑
1.1mm、0.7
‑
1.2mm、0.8
‑
1.3mm、0.9
‑
1.4mm、1
‑
1.5mm、1.1
‑
1.6mm、1.2
‑
1.7mm、1.3
‑
1.8mm、1.4
‑
1.9mm、1.5
‑
2mm、1.6
‑
2.1mm、1.7
‑
2.2mm、1.8
‑
2.3mm、1.9
‑
2.4mm、2
‑
2.5mm、2.1
‑
2.6mm、2.2
‑
2.7mm、2.3
‑
2.8mm、2.4
‑
2.9mm、2.5
‑
3mm、2.6
‑
3.1mm、2.7
‑
3.2mm、2.8
‑
3.3mm、2.9
‑
3.4mm、3
‑
3.5mm、3.1
‑
3.6mm、3.2
‑
3.7mm、3.3
‑
3.8mm、3.4
‑
3.9mm、3.5
‑
4mm、3.6
‑
4.1mm、3.7
‑
4.2mm、3.8
‑
4.3mm、3.9
‑
4.4mm、4
‑
4.5mm、4.1
‑
4.6mm、4.2
‑
4.7mm、4.3
‑
4.8mm、4.4
‑
4.9mm、4.5
‑
5mm、4.6
‑
5.1mm、4.7
‑
5.2mm、4.8
‑
5.3mm、4.9
‑
5.4mm、5
‑
5.5mm、5.1
‑
5.6mm、5.2
‑
5.7mm、5.3
‑
5.8mm、5.4
‑
5.9mm、5.5
‑
6mm、5.6
‑
6.1mm、5.7
‑
6.2mm、5.8
‑
6.3mm、5.9
‑
6.4mm、6
‑
6.5mm、6.1
‑
6.6mm、6.2
‑
6.7mm、6.3
‑
6.8mm、6.4
‑
6.9mm、6.5
‑
7mm、6.6
‑
7.1mm、6.7
‑
7.2mm、6.8
‑
7.3mm、6.9
‑
7.4mm、7
‑
7.5mm、7.1
‑
7.6mm、7.2
‑
7.7mm、7.3
‑
7.8mm、7.4
‑
7.9mm、7.5
‑
8mm、7.6
‑
8.1mm、7.7
‑
8.2mm、7.8
‑
8.3mm、7.9
‑
8.4mm、8
‑
8.5mm、8.1
‑
8.6mm、8.2
‑
8.7mm、8.3
‑
8.8mm、8.4
‑
8.9mm、8.5
‑
9mm、8.6
‑
9.1mm、8.7
‑
9.2mm、8.8
‑
9.3mm、8.9
‑
9.4mm、9
‑
9.5mm、9.1
‑
9.6mm、9.2
‑
9.7mm、9.3
‑
9.8mm、9.4
‑
9.9mm、9.5
‑
10mm、9.6
‑
10.1mm、9.7
‑
10.2mm、9.8
‑
10.3mm、9.9
‑
10.4mm、10
‑
10.5mm、10.1
‑
10.6mm、10.2
‑
10.7mm、10.3
‑
10.8mm、10.4
‑
10.9mm、10.5
‑
11mm、10.6
‑
11.1mm、10.7
‑
11.2mm、10.8
‑
11.3mm、10.9
‑
11.4mm、11
‑
11.5mm、11.1
‑
11.6mm、11.2
‑
11.7mm、11.3
‑
11.8mm、11.4
‑
11.9mm、11.5
‑
12mm、11.6
‑
12.1mm、11.7
‑
12.2mm、11.8
‑
12.3mm、11.9
‑
12.4mm、12
‑
12.5mm、12.1
‑
12.6mm、12.2
‑
12.7mm、12.3
‑
12.8mm、12.4
‑
12.9mm、12.5
‑
13mm、12.6
‑
13.1mm、12.7
‑
13.2mm、12.8
‑
13.3mm、12.9
‑
13.4mm、13
‑
13.5mm、13.1
‑
13.6mm、13.2
‑
13.7mm、13.3
‑
13.8mm、13.4
‑
13.9mm、13.5
‑
14mm、13.6
‑
14.1mm、13.7
‑
14.2mm、13.8
‑
14.3mm、13.9
‑
14.4mm、14
‑
14.5mm、14.1
‑
14.6mm、14.2
‑
14.7mm、14.3
‑
14.8mm、14.4
‑
14.9mm、14.5
‑
15mm、0
‑
1mm、1
‑
2mm、2
‑
3mm、3
‑
4mm、4
‑
5mm、5
‑
6mm、6
‑
7mm、7
‑
8mm、8
‑
9mm、9
‑
10mm、10
‑
11mm、11
‑
12mm、12
‑
13mm、13
‑
14mm、14
‑
15mm、15
‑
16mm、0
‑
2mm、1
‑
3mm、2
‑
4mm、3
‑
5mm、4
‑
6mm、5
‑
7mm、6
‑
8mm、7
‑
9mm、8
‑
10mm、9
‑
11mm、10
‑
12mm、11
‑
13mm、12
‑
14mm、13
‑
15mm、0
‑
3mm、1
‑
4mm、2
‑
5mm、3
‑
6mm、4
‑
7mm、5
‑
8mm、6
‑
9mm、7
‑
10mm、8
‑
11mm、9
‑
12mm、10
‑
13mm、11
‑
14mm、12
‑
15mm、0
‑
4mm、1
‑
5mm、2
‑
6mm、3
‑
7mm、4
‑
8mm、5
‑
9mm、6
‑
10mm、7
‑
11mm、8
‑
12mm、9
‑
13mm、10
‑
14mm、11
‑
15mm、0
‑
5mm、1
‑
6mm、2
‑
7mm、3
‑
8mm、4
‑
9mm、5
‑
10mm、6
‑
11mm、7
‑
12mm、8
‑
13mm、9
‑
14mm、10
‑
15mm、0
‑
6mm、1
‑
7mm、2
‑
8mm、3
‑
9mm、4
‑
10mm、5
‑
11mm、6
‑
12mm、7
‑
13mm、8
‑
14mm、9
‑
15mm、0
‑
7mm、1
‑
8mm、2
‑
9mm、3
‑
10mm、4
‑
11mm、5
‑
12mm、6
‑
13mm、7
‑
14mm、8
‑
15mm、0
‑
8mm、1
‑
9mm、2
‑
10mm、3
‑
11mm、4
‑
12mm、5
‑
13mm、6
‑
14mm、7
‑
15mm、0
‑
9mm、1
‑
10mm、2
‑
11mm、3
‑
12mm、4
‑
13mm、5
‑
14mm、6
‑
15mm、0
‑
10mm、1
‑
11mm、2
‑
12mm、3
‑
13mm、4
‑
14mm、5
‑
15mm、0
‑
11mm、1
‑
12mm、2
‑
13mm、3
‑
14mm、4
‑
15mm、0
‑
12mm、1
‑
13mm、2
‑
14mm、3
‑
15mm、0
‑
13mm、1
‑
14mm、2
‑
15mm、0
‑
14mm、1
‑
15mm或0
‑
15mm。
[0808]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
10mm的tris。
[0809]
在某些实施方案中,制剂可包含2
‑
12mm的tris。
[0810]
在某些实施方案中,制剂可包含10mm的tris。
[0811]
组氨酸
[0812]
在某些实施方案中,制剂中的组分中的至少一者为组氨酸。
[0813]
在某些实施方案中,制剂中的组氨酸的浓度可为但不限于0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3mm、3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、3.5mm、3.6mm、3.7mm、3.8mm、3.9mm、4mm、4.1mm、4.2mm、4.3mm、4.4mm、4.5mm、4.6mm、4.7mm、4.8mm、4.9mm、5mm、5.1mm、5.2mm、5.3mm、5.4mm、5.5mm、5.6mm、5.7mm、5.8mm、5.9mm、6mm、6.1mm、6.2mm、6.3mm、6.4mm、6.5mm、6.6mm、6.7mm、6.8mm、6.9mm、7mm、7.1mm、7.2mm、7.3mm、7.4mm、7.5mm、7.6mm、7.7mm、7.8mm、7.9mm、8mm、8.1mm、8.2mm、8.3mm、8.4mm、8.5mm、8.6mm、8.7mm、8.8mm、8.9mm、9mm、9.1mm、9.2mm、9.3mm、9.4mm、9.5mm、9.6mm、9.7mm、9.8mm、9.9mm、10mm、10.1mm、10.2mm、10.3mm、10.4mm、10.5mm、10.6mm、10.7mm、10.8mm、10.9mm、11mm、11.1mm、11.2mm、11.3mm、11.4mm、11.5mm、11.6mm、11.7mm、11.8mm、11.9mm、12mm、12.1mm、12.2mm、12.3mm、12.4mm、12.5mm、12.6mm、12.7mm、12.8mm、12.9mm、13mm、13.1mm、13.2mm、13.3mm、13.4mm、13.5mm、13.6mm、13.7mm、13.8mm、13.9mm、14mm、14.1mm、14.2mm、14.3mm、14.4mm、14.5mm、14.6mm、14.7mm、14.8mm、14.9mm或15mm。
[0814]
制剂可包含在以下范围内的组氨酸:0
‑
0.5mm、0.1
‑
0.6mm、0.2
‑
0.7mm、0.3
‑
0.8mm、0.4
‑
0.9mm、0.5
‑
1mm、0.6
‑
1.1mm、0.7
‑
1.2mm、0.8
‑
1.3mm、0.9
‑
1.4mm、1
‑
1.5mm、1.1
‑
1.6mm、1.2
‑
1.7mm、1.3
‑
1.8mm、1.4
‑
1.9mm、1.5
‑
2mm、1.6
‑
2.1mm、1.7
‑
2.2mm、1.8
‑
2.3mm、1.9
‑
2.4mm、2
‑
2.5mm、2.1
‑
2.6mm、2.2
‑
2.7mm、2.3
‑
2.8mm、2.4
‑
2.9mm、2.5
‑
3mm、2.6
‑
3.1mm、2.7
‑
3.2mm、2.8
‑
3.3mm、2.9
‑
3.4mm、3
‑
3.5mm、3.1
‑
3.6mm、3.2
‑
3.7mm、3.3
‑
3.8mm、3.4
‑
3.9mm、3.5
‑
4mm、3.6
‑
4.1mm、3.7
‑
4.2mm、3.8
‑
4.3mm、3.9
‑
4.4mm、4
‑
4.5mm、4.1
‑
4.6mm、4.2
‑
4.7mm、4.3
‑
4.8mm、4.4
‑
4.9mm、4.5
‑
5mm、4.6
‑
5.1mm、4.7
‑
5.2mm、4.8
‑
5.3mm、4.9
‑
5.4mm、5
‑
5.5mm、5.1
‑
5.6mm、5.2
‑
5.7mm、5.3
‑
5.8mm、5.4
‑
5.9mm、5.5
‑
6mm、5.6
‑
6.1mm、5.7
‑
6.2mm、5.8
‑
6.3mm、5.9
‑
6.4mm、6
‑
6.5mm、6.1
‑
6.6mm、6.2
‑
6.7mm、6.3
‑
6.8mm、6.4
‑
6.9mm、6.5
‑
7mm、6.6
‑
7.1mm、6.7
‑
7.2mm、6.8
‑
7.3mm、6.9
‑
7.4mm、7
‑
7.5mm、7.1
‑
7.6mm、7.2
‑
7.7mm、7.3
‑
7.8mm、7.4
‑
7.9mm、7.5
‑
8mm、7.6
‑
8.1mm、7.7
‑
8.2mm、7.8
‑
8.3mm、7.9
‑
8.4mm、8
‑
8.5mm、8.1
‑
8.6mm、8.2
‑
8.7mm、8.3
‑
8.8mm、8.4
‑
8.9mm、8.5
‑
9mm、8.6
‑
9.1mm、8.7
‑
9.2mm、8.8
‑
9.3mm、8.9
‑
9.4mm、9
‑
9.5mm、9.1
‑
9.6mm、9.2
‑
9.7mm、9.3
‑
9.8mm、9.4
‑
9.9mm、9.5
‑
10mm、9.6
‑
10.1mm、9.7
‑
10.2mm、9.8
‑
10.3mm、9.9
‑
10.4mm、10
‑
10.5mm、10.1
‑
10.6mm、10.2
‑
10.7mm、10.3
‑
10.8mm、10.4
‑
10.9mm、10.5
‑
11mm、10.6
‑
11.1mm、10.7
‑
11.2mm、10.8
‑
11.3mm、10.9
‑
11.4mm、11
‑
11.5mm、11.1
‑
11.6mm、11.2
‑
11.7mm、11.3
‑
11.8mm、11.4
‑
11.9mm、11.5
‑
12mm、11.6
‑
12.1mm、11.7
‑
12.2mm、11.8
‑
12.3mm、11.9
‑
12.4mm、12
‑
12.5mm、12.1
‑
12.6mm、12.2
‑
12.7mm、12.3
‑
12.8mm、12.4
‑
12.9mm、12.5
‑
13mm、12.6
‑
13.1mm、12.7
‑
13.2mm、12.8
‑
13.3mm、12.9
‑
13.4mm、13
‑
13.5mm、13.1
‑
13.6mm、13.2
‑
13.7mm、13.3
‑
13.8mm、13.4
‑
13.9mm、13.5
‑
14mm、13.6
‑
14.1mm、13.7
‑
14.2mm、13.8
‑
14.3mm、13.9
‑
14.4mm、14
‑
14.5mm、14.1
‑
14.6mm、14.2
‑
14.7mm、14.3
‑
14.8mm、14.4
‑
14.9mm、14.5
‑
15mm、0
‑
1mm、1
‑
2mm、2
‑
3mm、3
‑
4mm、4
‑
5mm、5
‑
6mm、6
‑
7mm、7
‑
8mm、8
‑
9mm、9
‑
10mm、10
‑
11mm、11
‑
12mm、12
‑
13mm、13
‑
14mm、14
‑
15mm、15
‑
16mm、0
‑
2mm、1
‑
3mm、2
‑
4mm、3
‑
5mm、4
‑
6mm、5
‑
7mm、6
‑
8mm、7
‑
9mm、8
‑
10mm、9
‑
11mm、10
‑
12mm、11
‑
13mm、12
‑
14mm、13
‑
15mm、0
‑
3mm、1
‑
4mm、2
‑
5mm、3
‑
6mm、4
‑
7mm、5
‑
8mm、6
‑
9mm、7
‑
10mm、8
‑
11mm、9
‑
12mm、10
‑
13mm、11
‑
14mm、12
‑
15mm、0
‑
4mm、1
‑
5mm、2
‑
6mm、3
‑
7mm、4
‑
8mm、5
‑
9mm、6
‑
10mm、7
‑
11mm、8
‑
12mm、9
‑
13mm、10
‑
14mm、11
‑
15mm、0
‑
5mm、1
‑
6mm、2
‑
7mm、3
‑
8mm、4
‑
9mm、5
‑
10mm、6
‑
11mm、7
‑
12mm、8
‑
13mm、9
‑
14mm、10
‑
15mm、0
‑
6mm、1
‑
7mm、2
‑
8mm、3
‑
9mm、4
‑
10mm、5
‑
11mm、6
‑
12mm、7
‑
13mm、8
‑
14mm、9
‑
15mm、0
‑
7mm、1
‑
8mm、2
‑
9mm、3
‑
10mm、4
‑
11mm、5
‑
12mm、6
‑
13mm、7
‑
14mm、8
‑
15mm、0
‑
8mm、1
‑
9mm、2
‑
10mm、3
‑
11mm、4
‑
12mm、5
‑
13mm、6
‑
14mm、7
‑
15mm、0
‑
9mm、1
‑
10mm、2
‑
11mm、3
‑
12mm、4
‑
13mm、5
‑
14mm、6
‑
15mm、0
‑
10mm、1
‑
11mm、2
‑
12mm、3
‑
13mm、4
‑
14mm、5
‑
15mm、0
‑
11mm、1
‑
12mm、2
‑
13mm、3
‑
14mm、4
‑
15mm、0
‑
12mm、1
‑
13mm、2
‑
14mm、3
‑
15mm、0
‑
13mm、1
‑
14mm、2
‑
15mm、0
‑
14mm、1
‑
15mm或0
‑
15mm。
[0815]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
10mm的组氨酸。
[0816]
在某些实施方案中,制剂可包含2
‑
12mm的组氨酸。
[0817]
在某些实施方案中,制剂可包含10mm的组氨酸。
[0818]
精氨酸
[0819]
在某些实施方案中,制剂中的组分中的至少一者为精氨酸。
[0820]
在某些实施方案中,精氨酸的浓度可为但不限于1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm、25mm、26mm、27mm、28mm、29mm、30mm、31mm、32mm、33mm、34mm、35mm、36mm、37mm、38mm、39mm、40mm、41mm、42mm、43mm、44mm、45mm、46mm、47mm、48mm、49mm、50mm、51mm、52mm、53mm、54mm、55mm、56mm、57mm、58mm、59mm、60mm、61mm、62mm、63mm、64mm、65mm、66mm、67mm、68mm、69mm、70mm、71mm、72mm、73mm、74mm、75mm、76mm、77mm、78mm、79mm、80mm、81mm、82mm、83mm、84mm、85mm、86mm、87mm、88mm、89mm、90mm、91mm、92mm、93mm、94mm、95mm、96mm、97mm、98mm、99mm或100mm。
[0821]
制剂可包含在以下范围内的精氨酸:0
‑
5mm、1
‑
5mm、2
‑
5mm、3
‑
5mm、4
‑
5mm、0
‑
10mm、1
‑
10mm、2
‑
10mm、3
‑
10mm、4
‑
10mm、5
‑
10mm、6
‑
10mm、7
‑
10mm、8
‑
10mm、9
‑
10mm、0
‑
25mm、1
‑
25mm、2
‑
25mm、3
‑
25mm、4
‑
25mm、5
‑
25mm、6
‑
25mm、7
‑
25mm、8
‑
25mm、9
‑
25mm、10
‑
25mm、11
‑
25mm、12
‑
25mm、13
‑
25mm、14
‑
25mm、15
‑
25mm、16
‑
25mm、17
‑
25mm、18
‑
25mm、19
‑
25mm、20
‑
25mm、21
‑
25mm、22
‑
25mm、23
‑
25mm、24
‑
25mm、0
‑
50mm、1
‑
50mm、2
‑
50mm、3
‑
50mm、4
‑
50mm、5
‑
50mm、6
‑
50mm、7
‑
50mm、8
‑
50mm、9
‑
50mm、10
‑
50mm、11
‑
50mm、12
‑
50mm、13
‑
50mm、14
‑
50mm、15
‑
50mm、16
‑
50mm、17
‑
50mm、18
‑
50mm、19
‑
50mm、20
‑
50mm、21
‑
50mm、22
‑
50mm、23
‑
50mm、24
‑
50mm、25
‑
50mm、26
‑
50mm、27
‑
50mm、28
‑
50mm、29
‑
50mm、30
‑
50mm、31
‑
50mm、32
‑
50mm、33
‑
50mm、34
‑
50mm、35
‑
50mm、36
‑
50mm、37
‑
50mm、38
‑
50mm、39
‑
50mm、40
‑
50mm、41
‑
50mm、42
‑
50mm、43
‑
50mm、44
‑
50mm、45
‑
50mm、46
‑
50mm、47
‑
50mm、48
‑
50mm、49
‑
50mm、0
‑
75mm、1
‑
75mm、2
‑
75mm、3
‑
75mm、4
‑
75mm、5
‑
75mm、6
‑
75mm、7
‑
75mm、8
‑
75mm、9
‑
75mm、10
‑
75mm、11
‑
75mm、12
‑
75mm、13
‑
75mm、14
‑
75mm、15
‑
75mm、16
‑
75mm、17
‑
75mm、18
‑
75mm、19
‑
75mm、20
‑
75mm、21
‑
75mm、22
‑
75mm、23
‑
75mm、24
‑
75mm、25
‑
75mm、26
‑
75mm、27
‑
75mm、28
‑
75mm、29
‑
75mm、30
‑
75mm、31
‑
75mm、32
‑
75mm、33
‑
75mm、34
‑
75mm、35
‑
75mm、36
‑
75mm、37
‑
75mm、38
‑
75mm、39
‑
75mm、40
‑
75mm、41
‑
75mm、42
‑
75mm、43
‑
75mm、44
‑
75mm、45
‑
75mm、46
‑
75mm、47
‑
75mm、48
‑
75mm、49
‑
75mm、50
‑
75mm、51
‑
75mm、52
‑
75mm、53
‑
75mm、54
‑
75mm、55
‑
75mm、56
‑
75mm、57
‑
75mm、58
‑
75mm、59
‑
75mm、60
‑
75mm、61
‑
75mm、62
‑
75mm、63
‑
75mm、64
‑
75mm、65
‑
75mm、66
‑
75mm、67
‑
75mm、68
‑
75mm、69
‑
75mm、70
‑
75mm、71
‑
75mm、72
‑
75mm、73
‑
75mm、74
‑
75mm、50
‑
100mm、60
‑
100mm、75
‑
100mm、80
‑
100mm或90
‑
100mm。
[0822]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
75mm的精氨酸。
[0823]
在某些实施方案中,制剂可包含50
‑
100mm的精氨酸。
[0824]
在某些实施方案中,制剂可包含75mm的精氨酸。
[0825]
盐酸
[0826]
在某些实施方案中,制剂中的组分中的至少一者为盐酸。
[0827]
在某些实施方案中,制剂中的盐酸的浓度可为但不限于0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3mm、3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、3.5mm、3.6mm、3.7mm、3.8mm、3.9mm、4mm、4.1mm、4.2mm、4.3mm、4.4mm、4.5mm、4.6mm、4.7mm、4.8mm、4.9mm、5mm、5.1mm、5.2mm、5.3mm、5.4mm、5.5mm、5.6mm、5.7mm、5.8mm、5.9mm、6mm、6.1mm、6.2mm、6.3mm、6.4mm、6.5mm、6.6mm、6.7mm、6.8mm、6.9mm、7mm、7.1mm、7.2mm、7.3mm、7.4mm、7.5mm、7.6mm、7.7mm、7.8mm、7.9mm、8mm、8.1mm、8.2mm、8.3mm、8.4mm、8.5mm、8.6mm、8.7mm、8.8mm、8.9mm、9mm、9.1mm、9.2mm、9.3mm、9.4mm、9.5mm、9.6mm、9.7mm、9.8mm、9.9mm、10mm、10.1mm、10.2mm、10.3mm、10.4mm、10.5mm、10.6mm、10.7mm、10.8mm、10.9mm、11mm、11.1mm、11.2mm、11.3mm、11.4mm、11.5mm、11.6mm、11.7mm、11.8mm、11.9mm、12mm、12.1mm、12.2mm、12.3mm、12.4mm、12.5mm、12.6mm、12.7mm、12.8mm、12.9mm、13mm、13.1mm、13.2mm、13.3mm、13.4mm、13.5mm、13.6mm、13.7mm、13.8mm、13.9mm、14mm、14.1mm、14.2mm、14.3mm、14.4mm、14.5mm、14.6mm、14.7mm、14.8mm、14.9mm或15mm。
[0828]
制剂可包含在以下范围内的盐酸:0
‑
0.5mm、0.1
‑
0.6mm、0.2
‑
0.7mm、0.3
‑
0.8mm、0.4
‑
0.9mm、0.5
‑
1mm、0.6
‑
1.1mm、0.7
‑
1.2mm、0.8
‑
1.3mm、0.9
‑
1.4mm、1
‑
1.5mm、1.1
‑
1.6mm、1.2
‑
1.7mm、1.3
‑
1.8mm、1.4
‑
1.9mm、1.5
‑
2mm、1.6
‑
2.1mm、1.7
‑
2.2mm、1.8
‑
2.3mm、1.9
‑
2.4mm、2
‑
2.5mm、2.1
‑
2.6mm、2.2
‑
2.7mm、2.3
‑
2.8mm、2.4
‑
2.9mm、2.5
‑
3mm、2.6
‑
3.1mm、2.7
‑
3.2mm、2.8
‑
3.3mm、2.9
‑
3.4mm、3
‑
3.5mm、3.1
‑
3.6mm、3.2
‑
3.7mm、3.3
‑
3.8mm、3.4
‑
3.9mm、3.5
‑
4mm、3.6
‑
4.1mm、3.7
‑
4.2mm、3.8
‑
4.3mm、3.9
‑
4.4mm、4
‑
4.5mm、4.1
‑
4.6mm、4.2
‑
4.7mm、4.3
‑
4.8mm、4.4
‑
4.9mm、4.5
‑
5mm、4.6
‑
5.1mm、4.7
‑
5.2mm、4.8
‑
5.3mm、4.9
‑
5.4mm、5
‑
5.5mm、5.1
‑
5.6mm、5.2
‑
5.7mm、5.3
‑
5.8mm、5.4
‑
5.9mm、5.5
‑
6mm、5.6
‑
6.1mm、5.7
‑
6.2mm、5.8
‑
6.3mm、5.9
‑
6.4mm、6
‑
6.5mm、6.1
‑
6.6mm、6.2
‑
6.7mm、6.3
‑
6.8mm、6.4
‑
6.9mm、6.5
‑
7mm、6.6
‑
7.1mm、6.7
‑
7.2mm、6.8
‑
7.3mm、6.9
‑
7.4mm、7
‑
7.5mm、7.1
‑
7.6mm、7.2
‑
7.7mm、7.3
‑
7.8mm、7.4
‑
7.9mm、7.5
‑
8mm、7.6
‑
8.1mm、7.7
‑
8.2mm、7.8
‑
8.3mm、7.9
‑
8.4mm、8
‑
8.5mm、8.1
‑
8.6mm、8.2
‑
8.7mm、8.3
‑
8.8mm、8.4
‑
8.9mm、8.5
‑
9mm、8.6
‑
9.1mm、8.7
‑
9.2mm、8.8
‑
9.3mm、8.9
‑
9.4mm、9
‑
9.5mm、9.1
‑
9.6mm、9.2
‑
9.7mm、9.3
‑
9.8mm、9.4
‑
9.9mm、9.5
‑
10mm、9.6
‑
10.1mm、
9.7
‑
10.2mm、9.8
‑
10.3mm、9.9
‑
10.4mm、10
‑
10.5mm、10.1
‑
10.6mm、10.2
‑
10.7mm、10.3
‑
10.8mm、10.4
‑
10.9mm、10.5
‑
11mm、10.6
‑
11.1mm、10.7
‑
11.2mm、10.8
‑
11.3mm、10.9
‑
11.4mm、11
‑
11.5mm、11.1
‑
11.6mm、11.2
‑
11.7mm、11.3
‑
11.8mm、11.4
‑
11.9mm、11.5
‑
12mm、11.6
‑
12.1mm、11.7
‑
12.2mm、11.8
‑
12.3mm、11.9
‑
12.4mm、12
‑
12.5mm、12.1
‑
12.6mm、12.2
‑
12.7mm、12.3
‑
12.8mm、12.4
‑
12.9mm、12.5
‑
13mm、12.6
‑
13.1mm、12.7
‑
13.2mm、12.8
‑
13.3mm、12.9
‑
13.4mm、13
‑
13.5mm、13.1
‑
13.6mm、13.2
‑
13.7mm、13.3
‑
13.8mm、13.4
‑
13.9mm、13.5
‑
14mm、13.6
‑
14.1mm、13.7
‑
14.2mm、13.8
‑
14.3mm、13.9
‑
14.4mm、14
‑
14.5mm、14.1
‑
14.6mm、14.2
‑
14.7mm、14.3
‑
14.8mm、14.4
‑
14.9mm、14.5
‑
15mm、0
‑
1mm、1
‑
2mm、2
‑
3mm、3
‑
4mm、4
‑
5mm、5
‑
6mm、6
‑
7mm、7
‑
8mm、8
‑
9mm、9
‑
10mm、10
‑
11mm、11
‑
12mm、12
‑
13mm、13
‑
14mm、14
‑
15mm、15
‑
16mm、0
‑
2mm、1
‑
3mm、2
‑
4mm、3
‑
5mm、4
‑
6mm、5
‑
7mm、6
‑
8mm、7
‑
9mm、8
‑
10mm、9
‑
11mm、10
‑
12mm、11
‑
13mm、12
‑
14mm、13
‑
15mm、0
‑
3mm、1
‑
4mm、2
‑
5mm、3
‑
6mm、4
‑
7mm、5
‑
8mm、6
‑
9mm、7
‑
10mm、8
‑
11mm、9
‑
12mm、10
‑
13mm、11
‑
14mm、12
‑
15mm、0
‑
4mm、1
‑
5mm、2
‑
6mm、3
‑
7mm、4
‑
8mm、5
‑
9mm、6
‑
10mm、7
‑
11mm、8
‑
12mm、9
‑
13mm、10
‑
14mm、11
‑
15mm、0
‑
5mm、1
‑
6mm、2
‑
7mm、3
‑
8mm、4
‑
9mm、5
‑
10mm、6
‑
11mm、7
‑
12mm、8
‑
13mm、9
‑
14mm、10
‑
15mm、0
‑
6mm、1
‑
7mm、2
‑
8mm、3
‑
9mm、4
‑
10mm、5
‑
11mm、6
‑
12mm、7
‑
13mm、8
‑
14mm、9
‑
15mm、0
‑
7mm、1
‑
8mm、2
‑
9mm、3
‑
10mm、4
‑
11mm、5
‑
12mm、6
‑
13mm、7
‑
14mm、8
‑
15mm、0
‑
8mm、1
‑
9mm、2
‑
10mm、3
‑
11mm、4
‑
12mm、5
‑
13mm、6
‑
14mm、7
‑
15mm、0
‑
9mm、1
‑
10mm、2
‑
11mm、3
‑
12mm、4
‑
13mm、5
‑
14mm、6
‑
15mm、0
‑
10mm、1
‑
11mm、2
‑
12mm、3
‑
13mm、4
‑
14mm、5
‑
15mm、0
‑
11mm、1
‑
12mm、2
‑
13mm、3
‑
14mm、4
‑
15mm、0
‑
12mm、1
‑
13mm、2
‑
14mm、3
‑
15mm、0
‑
13mm、1
‑
14mm、2
‑
15mm、0
‑
14mm、1
‑
15mm或0
‑
15mm。
[0829]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
10mm的盐酸。
[0830]
在某些实施方案中,制剂可包含6.2
‑
6.3mm的盐酸。
[0831]
在某些实施方案中,制剂可包含8.9
‑
9mm的盐酸。
[0832]
在某些实施方案中,制剂可包含6.2mm的盐酸。
[0833]
在某些实施方案中,制剂可包含6.3mm的盐酸。
[0834]
在某些实施方案中,制剂可包含8.9mm的盐酸。
[0835]
在某些实施方案中,制剂可包含9mm的盐酸。
[0836]
糖
[0837]
在某些实施方案中,制剂可包含至少一种糖和/或糖替代物。
[0838]
在某些实施方案中,制剂可包含至少一种糖和/或糖替代物以增加制剂的稳定性。稳定性的增加可为过程内池提供更长的保持时间,提供更长“储存期限”,增加溶液中aav颗粒的浓度(例如,制剂能够具有较高浓度aav颗粒而无raav析出溶液)和/或减少制剂中的聚集的产生或形成。
[0839]
在某些实施方案中,制剂中包括至少一种糖和/或糖替代物可使制剂的稳定性提高1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%,或超过95%、1
‑
5%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%、5
‑
30%、5
‑
35%、5
‑
40%、5
‑
45%、5
‑
50%、5
‑
55%、5
‑
60%、5
‑
65%、5
‑
70%、5
‑
75%、5
‑
80%、5
‑
85%、5
‑
90%、5
‑
95%、10
‑
20%、10
‑
25%、10
‑
30%、10
‑
35%、10
‑
40%、10
‑
45%、10
‑
50%、10
‑
55%、10
‑
60%、10
‑
65%、10
‑
70%、10
‑
75%、10
‑
80%、10
‑
85%、10
‑
90%、10
‑
95%、15
‑
25%、15
‑
30%、15
‑
35%、15
‑
40%、15
‑
45%、15
‑
50%、15
‑
55%、15
‑
60%、15
‑
65%、15
‑
70%、
15
‑
75%、15
‑
80%、15
‑
85%、15
‑
90%、15
‑
95%、20
‑
30%、20
‑
35%、20
‑
40%、20
‑
45%、20
‑
50%、20
‑
55%、20
‑
60%、20
‑
65%、20
‑
70%、20
‑
75%、20
‑
80%、20
‑
85%、20
‑
90%、20
‑
95%、25
‑
35%、25
‑
40%、25
‑
45%、25
‑
50%、25
‑
55%、25
‑
60%、25
‑
65%、25
‑
70%、25
‑
75%、25
‑
80%、25
‑
85%、25
‑
90%、25
‑
95%、30
‑
40%、30
‑
45%、30
‑
50%、30
‑
55%、30
‑
60%、30
‑
65%、30
‑
70%、30
‑
75%、30
‑
80%、30
‑
85%、30
‑
90%、30
‑
95%、35
‑
45%、35
‑
50%、35
‑
55%、35
‑
60%、35
‑
65%、35
‑
70%、35
‑
75%、35
‑
80%、35
‑
85%、35
‑
90%、35
‑
95%、40
‑
50%、40
‑
55%、40
‑
60%、40
‑
65%、40
‑
70%、40
‑
75%、40
‑
80%、40
‑
85%、40
‑
90%、40
‑
95%、45
‑
55%、45
‑
60%、45
‑
65%、45
‑
70%、45
‑
75%、45
‑
80%、45
‑
85%、45
‑
90%、45
‑
95%、50
‑
60%、50
‑
65%、50
‑
70%、50
‑
75%、50
‑
80%、50
‑
85%、50
‑
90%、50
‑
95%、55
‑
65%、55
‑
70%、55
‑
75%、55
‑
80%、55
‑
85%、55
‑
90%、55
‑
95%、60
‑
70%、60
‑
75%、60
‑
80%、60
‑
85%、60
‑
90%、60
‑
95%、65
‑
75%、65
‑
80%、65
‑
85%、65
‑
90%、65
‑
95%、70
‑
80%、70
‑
85%、70
‑
90%、70
‑
95%、75
‑
85%、75
‑
90%、75
‑
95%、80
‑
90%、80
‑
95%或90
‑
95%,相较于不具有糖和/或糖替代物的相同制剂。
[0840]
在某些实施方案中,糖和/或糖替代物与磷酸盐缓冲剂组合使用来提高稳定性。糖和/或糖替代物与磷酸酯黄油的组合可使稳定性提高1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%,或超过95%、1
‑
5%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%、5
‑
30%、5
‑
35%、5
‑
40%、5
‑
45%、5
‑
50%、5
‑
55%、5
‑
60%、5
‑
65%、5
‑
70%、5
‑
75%、5
‑
80%、5
‑
85%、5
‑
90%、5
‑
95%、10
‑
20%、10
‑
25%、10
‑
30%、10
‑
35%、10
‑
40%、10
‑
45%、10
‑
50%、10
‑
55%、10
‑
60%、10
‑
65%、10
‑
70%、10
‑
75%、10
‑
80%、10
‑
85%、10
‑
90%、10
‑
95%、15
‑
25%、15
‑
30%、15
‑
35%、15
‑
40%、15
‑
45%、15
‑
50%、15
‑
55%、15
‑
60%、15
‑
65%、15
‑
70%、15
‑
75%、15
‑
80%、15
‑
85%、15
‑
90%、15
‑
95%、20
‑
30%、20
‑
35%、20
‑
40%、20
‑
45%、20
‑
50%、20
‑
55%、20
‑
60%、20
‑
65%、20
‑
70%、20
‑
75%、20
‑
80%、20
‑
85%、20
‑
90%、20
‑
95%、25
‑
35%、25
‑
40%、25
‑
45%、25
‑
50%、25
‑
55%、25
‑
60%、25
‑
65%、25
‑
70%、25
‑
75%、25
‑
80%、25
‑
85%、25
‑
90%、25
‑
95%、30
‑
40%、30
‑
45%、30
‑
50%、30
‑
55%、30
‑
60%、30
‑
65%、30
‑
70%、30
‑
75%、30
‑
80%、30
‑
85%、30
‑
90%、30
‑
95%、35
‑
45%、35
‑
50%、35
‑
55%、35
‑
60%、35
‑
65%、35
‑
70%、35
‑
75%、35
‑
80%、35
‑
85%、35
‑
90%、35
‑
95%、40
‑
50%、40
‑
55%、40
‑
60%、40
‑
65%、40
‑
70%、40
‑
75%、40
‑
80%、40
‑
85%、40
‑
90%、40
‑
95%、45
‑
55%、45
‑
60%、45
‑
65%、45
‑
70%、45
‑
75%、45
‑
80%、45
‑
85%、45
‑
90%、45
‑
95%、50
‑
60%、50
‑
65%、50
‑
70%、50
‑
75%、50
‑
80%、50
‑
85%、50
‑
90%、50
‑
95%、55
‑
65%、55
‑
70%、55
‑
75%、55
‑
80%、55
‑
85%、55
‑
90%、55
‑
95%、60
‑
70%、60
‑
75%、60
‑
80%、60
‑
85%、60
‑
90%、60
‑
95%、65
‑
75%、65
‑
80%、65
‑
85%、65
‑
90%、65
‑
95%、70
‑
80%、70
‑
85%、70
‑
90%、70
‑
95%、75
‑
85%、75
‑
90%、75
‑
95%、80
‑
90%、80
‑
95%或90
‑
95%,相较于不具有糖和/或糖替代物的相同制剂。作为一个非限制性实例,糖为蔗糖。作为另一个非限制性实例,糖为海藻糖。作为另一个非限制性实例,糖替代物为山梨糖醇。
[0841]
在某些实施方案中,制剂的保持时间可增加1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%,或超过95%、1
‑
5%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%、5
‑
30%、5
‑
35%、5
‑
40%、5
‑
45%、5
‑
50%、5
‑
55%、5
‑
60%、5
‑
65%、5
‑
70%、5
‑
75%、5
‑
80%、5
‑
85%、5
‑
90%、5
‑
95%、10
‑
20%、
10
‑
25%、10
‑
30%、10
‑
35%、10
‑
40%、10
‑
45%、10
‑
50%、10
‑
55%、10
‑
60%、10
‑
65%、10
‑
70%、10
‑
75%、10
‑
80%、10
‑
85%、10
‑
90%、10
‑
95%、15
‑
25%、15
‑
30%、15
‑
35%、15
‑
40%、15
‑
45%、15
‑
50%、15
‑
55%、15
‑
60%、15
‑
65%、15
‑
70%、15
‑
75%、15
‑
80%、15
‑
85%、15
‑
90%、15
‑
95%、20
‑
30%、20
‑
35%、20
‑
40%、20
‑
45%、20
‑
50%、20
‑
55%、20
‑
60%、20
‑
65%、20
‑
70%、20
‑
75%、20
‑
80%、20
‑
85%、20
‑
90%、20
‑
95%、25
‑
35%、25
‑
40%、25
‑
45%、25
‑
50%、25
‑
55%、25
‑
60%、25
‑
65%、25
‑
70%、25
‑
75%、25
‑
80%、25
‑
85%、25
‑
90%、25
‑
95%、30
‑
40%、30
‑
45%、30
‑
50%、30
‑
55%、30
‑
60%、30
‑
65%、30
‑
70%、30
‑
75%、30
‑
80%、30
‑
85%、30
‑
90%、30
‑
95%、35
‑
45%、35
‑
50%、35
‑
55%、35
‑
60%、35
‑
65%、35
‑
70%、35
‑
75%、35
‑
80%、35
‑
85%、35
‑
90%、35
‑
95%、40
‑
50%、40
‑
55%、40
‑
60%、40
‑
65%、40
‑
70%、40
‑
75%、40
‑
80%、40
‑
85%、40
‑
90%、40
‑
95%、45
‑
55%、45
‑
60%、45
‑
65%、45
‑
70%、45
‑
75%、45
‑
80%、45
‑
85%、45
‑
90%、45
‑
95%、50
‑
60%、50
‑
65%、50
‑
70%、50
‑
75%、50
‑
80%、50
‑
85%、50
‑
90%、50
‑
95%、55
‑
65%、55
‑
70%、55
‑
75%、55
‑
80%、55
‑
85%、55
‑
90%、55
‑
95%、60
‑
70%、60
‑
75%、60
‑
80%、60
‑
85%、60
‑
90%、60
‑
95%、65
‑
75%、65
‑
80%、65
‑
85%、65
‑
90%、65
‑
95%、70
‑
80%、70
‑
85%、70
‑
90%、70
‑
95%、75
‑
85%、75
‑
90%、75
‑
95%、80
‑
90%、80
‑
95%或90
‑
95%,相较于不具有糖和/或糖替代物的相同制剂。
[0842]
在某些实施方案中,制剂的储存期限可增加1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%,或超过95%、1
‑
5%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%、5
‑
30%、5
‑
35%、5
‑
40%、5
‑
45%、5
‑
50%、5
‑
55%、5
‑
60%、5
‑
65%、5
‑
70%、5
‑
75%、5
‑
80%、5
‑
85%、5
‑
90%、5
‑
95%、10
‑
20%、10
‑
25%、10
‑
30%、10
‑
35%、10
‑
40%、10
‑
45%、10
‑
50%、10
‑
55%、10
‑
60%、10
‑
65%、10
‑
70%、10
‑
75%、10
‑
80%、10
‑
85%、10
‑
90%、10
‑
95%、15
‑
25%、15
‑
30%、15
‑
35%、15
‑
40%、15
‑
45%、15
‑
50%、15
‑
55%、15
‑
60%、15
‑
65%、15
‑
70%、15
‑
75%、15
‑
80%、15
‑
85%、15
‑
90%、15
‑
95%、20
‑
30%、20
‑
35%、20
‑
40%、20
‑
45%、20
‑
50%、20
‑
55%、20
‑
60%、20
‑
65%、20
‑
70%、20
‑
75%、20
‑
80%、20
‑
85%、20
‑
90%、20
‑
95%、25
‑
35%、25
‑
40%、25
‑
45%、25
‑
50%、25
‑
55%、25
‑
60%、25
‑
65%、25
‑
70%、25
‑
75%、25
‑
80%、25
‑
85%、25
‑
90%、25
‑
95%、30
‑
40%、30
‑
45%、30
‑
50%、30
‑
55%、30
‑
60%、30
‑
65%、30
‑
70%、30
‑
75%、30
‑
80%、30
‑
85%、30
‑
90%、30
‑
95%、35
‑
45%、35
‑
50%、35
‑
55%、35
‑
60%、35
‑
65%、35
‑
70%、35
‑
75%、35
‑
80%、35
‑
85%、35
‑
90%、35
‑
95%、40
‑
50%、40
‑
55%、40
‑
60%、40
‑
65%、40
‑
70%、40
‑
75%、40
‑
80%、40
‑
85%、40
‑
90%、40
‑
95%、45
‑
55%、45
‑
60%、45
‑
65%、45
‑
70%、45
‑
75%、45
‑
80%、45
‑
85%、45
‑
90%、45
‑
95%、50
‑
60%、50
‑
65%、50
‑
70%、50
‑
75%、50
‑
80%、50
‑
85%、50
‑
90%、50
‑
95%、55
‑
65%、55
‑
70%、55
‑
75%、55
‑
80%、55
‑
85%、55
‑
90%、55
‑
95%、60
‑
70%、60
‑
75%、60
‑
80%、60
‑
85%、60
‑
90%、60
‑
95%、65
‑
75%、65
‑
80%、65
‑
85%、65
‑
90%、65
‑
95%、70
‑
80%、70
‑
85%、70
‑
90%、70
‑
95%、75
‑
85%、75
‑
90%、75
‑
95%、80
‑
90%、80
‑
95%或90
‑
95%,相较于不具有糖和/或糖替代物的相同制剂。储存期限可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时,或1、2、3、4周,或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个月,或1、2、3、4、5、6、7或超过7年。
[0843]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度可提高1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、
90%、95%,或超过95%、1
‑
5%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%、5
‑
30%、5
‑
35%、5
‑
40%、5
‑
45%、5
‑
50%、5
‑
55%、5
‑
60%、5
‑
65%、5
‑
70%、5
‑
75%、5
‑
80%、5
‑
85%、5
‑
90%、5
‑
95%、10
‑
20%、10
‑
25%、10
‑
30%、10
‑
35%、10
‑
40%、10
‑
45%、10
‑
50%、10
‑
55%、10
‑
60%、10
‑
65%、10
‑
70%、10
‑
75%、10
‑
80%、10
‑
85%、10
‑
90%、10
‑
95%、15
‑
25%、15
‑
30%、15
‑
35%、15
‑
40%、15
‑
45%、15
‑
50%、15
‑
55%、15
‑
60%、15
‑
65%、15
‑
70%、15
‑
75%、15
‑
80%、15
‑
85%、15
‑
90%、15
‑
95%、20
‑
30%、20
‑
35%、20
‑
40%、20
‑
45%、20
‑
50%、20
‑
55%、20
‑
60%、20
‑
65%、20
‑
70%、20
‑
75%、20
‑
80%、20
‑
85%、20
‑
90%、20
‑
95%、25
‑
35%、25
‑
40%、25
‑
45%、25
‑
50%、25
‑
55%、25
‑
60%、25
‑
65%、25
‑
70%、25
‑
75%、25
‑
80%、25
‑
85%、25
‑
90%、25
‑
95%、30
‑
40%、30
‑
45%、30
‑
50%、30
‑
55%、30
‑
60%、30
‑
65%、30
‑
70%、30
‑
75%、30
‑
80%、30
‑
85%、30
‑
90%、30
‑
95%、35
‑
45%、35
‑
50%、35
‑
55%、35
‑
60%、35
‑
65%、35
‑
70%、35
‑
75%、35
‑
80%、35
‑
85%、35
‑
90%、35
‑
95%、40
‑
50%、40
‑
55%、40
‑
60%、40
‑
65%、40
‑
70%、40
‑
75%、40
‑
80%、40
‑
85%、40
‑
90%、40
‑
95%、45
‑
55%、45
‑
60%、45
‑
65%、45
‑
70%、45
‑
75%、45
‑
80%、45
‑
85%、45
‑
90%、45
‑
95%、50
‑
60%、50
‑
65%、50
‑
70%、50
‑
75%、50
‑
80%、50
‑
85%、50
‑
90%、50
‑
95%、55
‑
65%、55
‑
70%、55
‑
75%、55
‑
80%、55
‑
85%、55
‑
90%、55
‑
95%、60
‑
70%、60
‑
75%、60
‑
80%、60
‑
85%、60
‑
90%、60
‑
95%、65
‑
75%、65
‑
80%、65
‑
85%、65
‑
90%、65
‑
95%、70
‑
80%、70
‑
85%、70
‑
90%、70
‑
95%、75
‑
85%、75
‑
90%、75
‑
95%、80
‑
90%、80
‑
95%或90
‑
95%,相较于不具有糖和/或糖替代物的相同制剂。
[0844]
在某些实施方案中,由于添加糖和/或糖替代物,制剂或制剂中的聚集物的产生可降低1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%,或超过95%、1
‑
5%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%、5
‑
30%、5
‑
35%、5
‑
40%、5
‑
45%、5
‑
50%、5
‑
55%、5
‑
60%、5
‑
65%、5
‑
70%、5
‑
75%、5
‑
80%、5
‑
85%、5
‑
90%、5
‑
95%、10
‑
20%、10
‑
25%、10
‑
30%、10
‑
35%、10
‑
40%、10
‑
45%、10
‑
50%、10
‑
55%、10
‑
60%、10
‑
65%、10
‑
70%、10
‑
75%、10
‑
80%、10
‑
85%、10
‑
90%、10
‑
95%、15
‑
25%、15
‑
30%、15
‑
35%、15
‑
40%、15
‑
45%、15
‑
50%、15
‑
55%、15
‑
60%、15
‑
65%、15
‑
70%、15
‑
75%、15
‑
80%、15
‑
85%、15
‑
90%、15
‑
95%、20
‑
30%、20
‑
35%、20
‑
40%、20
‑
45%、20
‑
50%、20
‑
55%、20
‑
60%、20
‑
65%、20
‑
70%、20
‑
75%、20
‑
80%、20
‑
85%、20
‑
90%、20
‑
95%、25
‑
35%、25
‑
40%、25
‑
45%、25
‑
50%、25
‑
55%、25
‑
60%、25
‑
65%、25
‑
70%、25
‑
75%、25
‑
80%、25
‑
85%、25
‑
90%、25
‑
95%、30
‑
40%、30
‑
45%、30
‑
50%、30
‑
55%、30
‑
60%、30
‑
65%、30
‑
70%、30
‑
75%、30
‑
80%、30
‑
85%、30
‑
90%、30
‑
95%、35
‑
45%、35
‑
50%、35
‑
55%、35
‑
60%、35
‑
65%、35
‑
70%、35
‑
75%、35
‑
80%、35
‑
85%、35
‑
90%、35
‑
95%、40
‑
50%、40
‑
55%、40
‑
60%、40
‑
65%、40
‑
70%、40
‑
75%、40
‑
80%、40
‑
85%、40
‑
90%、40
‑
95%、45
‑
55%、45
‑
60%、45
‑
65%、45
‑
70%、45
‑
75%、45
‑
80%、45
‑
85%、45
‑
90%、45
‑
95%、50
‑
60%、50
‑
65%、50
‑
70%、50
‑
75%、50
‑
80%、50
‑
85%、50
‑
90%、50
‑
95%、55
‑
65%、55
‑
70%、55
‑
75%、55
‑
80%、55
‑
85%、55
‑
90%、55
‑
95%、60
‑
70%、60
‑
75%、60
‑
80%、60
‑
85%、60
‑
90%、60
‑
95%、65
‑
75%、65
‑
80%、65
‑
85%、65
‑
90%、65
‑
95%、70
‑
80%、70
‑
85%、70
‑
90%、70
‑
95%、75
‑
85%、75
‑
90%、75
‑
95%、80
‑
90%、80
‑
95%或90
‑
95%,相较于不具有糖和/或糖替代物的相同制剂。
[0845]
在某些实施方案中,由于添加糖和/或糖替代物,制剂或聚集物的产生可为1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、
70%、75%、80%、85%、90%、95%,或超过95%、1
‑
5%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%、5
‑
30%、5
‑
35%、5
‑
40%、5
‑
45%、5
‑
50%、5
‑
55%、5
‑
60%、5
‑
65%、5
‑
70%、5
‑
75%、5
‑
80%、5
‑
85%、5
‑
90%、5
‑
95%、10
‑
20%、10
‑
25%、10
‑
30%、10
‑
35%、10
‑
40%、10
‑
45%、10
‑
50%、10
‑
55%、10
‑
60%、10
‑
65%、10
‑
70%、10
‑
75%、10
‑
80%、10
‑
85%、10
‑
90%、10
‑
95%、15
‑
25%、15
‑
30%、15
‑
35%、15
‑
40%、15
‑
45%、15
‑
50%、15
‑
55%、15
‑
60%、15
‑
65%、15
‑
70%、15
‑
75%、15
‑
80%、15
‑
85%、15
‑
90%、15
‑
95%、20
‑
30%、20
‑
35%、20
‑
40%、20
‑
45%、20
‑
50%、20
‑
55%、20
‑
60%、20
‑
65%、20
‑
70%、20
‑
75%、20
‑
80%、20
‑
85%、20
‑
90%、20
‑
95%、25
‑
35%、25
‑
40%、25
‑
45%、25
‑
50%、25
‑
55%、25
‑
60%、25
‑
65%、25
‑
70%、25
‑
75%、25
‑
80%、25
‑
85%、25
‑
90%、25
‑
95%、30
‑
40%、30
‑
45%、30
‑
50%、30
‑
55%、30
‑
60%、30
‑
65%、30
‑
70%、30
‑
75%、30
‑
80%、30
‑
85%、30
‑
90%、30
‑
95%、35
‑
45%、35
‑
50%、35
‑
55%、35
‑
60%、35
‑
65%、35
‑
70%、35
‑
75%、35
‑
80%、35
‑
85%、35
‑
90%、35
‑
95%、40
‑
50%、40
‑
55%、40
‑
60%、40
‑
65%、40
‑
70%、40
‑
75%、40
‑
80%、40
‑
85%、40
‑
90%、40
‑
95%、45
‑
55%、45
‑
60%、45
‑
65%、45
‑
70%、45
‑
75%、45
‑
80%、45
‑
85%、45
‑
90%、45
‑
95%、50
‑
60%、50
‑
65%、50
‑
70%、50
‑
75%、50
‑
80%、50
‑
85%、50
‑
90%、50
‑
95%、55
‑
65%、55
‑
70%、55
‑
75%、55
‑
80%、55
‑
85%、55
‑
90%、55
‑
95%、60
‑
70%、60
‑
75%、60
‑
80%、60
‑
85%、60
‑
90%、60
‑
95%、65
‑
75%、65
‑
80%、65
‑
85%、65
‑
90%、65
‑
95%、70
‑
80%、70
‑
85%、70
‑
90%、70
‑
95%、75
‑
85%、75
‑
90%、75
‑
95%、80
‑
90%、80
‑
95%或90
‑
95%,如通过本领域中已知的方法(例如通过dls测量)所测定并且相较于不具有糖和/或糖替代物的相同制剂。作为一个非限制性实例,通过向制剂中添加至少一种糖和/或糖替代物使制剂的聚集低于2%。可通过本领域中已知的方法去除额外聚集物。
[0846]
在某些实施方案中,制剂可包含以下量的糖和/或糖替代物:0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%、5%、5.1%、5.2%、5.3%、5.4%、5.5%、5.6%、5.7%、5.8%、5.9%、6%、6.1%、6.2%、6.3%、6.4%、6.5%、6.6%、6.7%、6.8%、6.9%、7%、7.1%、7.2%、7.3%、7.4%、7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%或10%w/v。
[0847]
在某些实施方案中,制剂可包含在以下范围内的糖和/或糖替代物:0
‑
1%、0.1
‑
1%、0.2
‑
1%、0.3
‑
1%、0.4
‑
1%、0.5
‑
1%、0.6
‑
1%、0.7
‑
1%、0.8
‑
1%、0.9
‑
1%、0
‑
1.5%、0.1
‑
1.5%、0.2
‑
1.5%、0.3
‑
1.5%、0.4
‑
1.5%、0.5
‑
1.5%、0.6
‑
1.5%、0.7
‑
1.5%、0.8
‑
1.5%、0.9
‑
1.5%、1
‑
1.5%、1.1
‑
1.5%、1.2
‑
1.5%、1.3
‑
1.5%、1.4
‑
1.5%、0
‑
2%、0.1
‑
2%、0.2
‑
2%、0.3
‑
2%、0.4
‑
2%、0.5
‑
2%、0.6
‑
2%、0.7
‑
2%、0.8
‑
2%、0.9
‑
2%、1
‑
2%、1.1
‑
2%、1.2
‑
2%、1.3
‑
2%、1.4
‑
2%、1.5
‑
2%、1.6
‑
2%、1.7
‑
2%、1.8
‑
2%、1.9
‑
2%、0
‑
2.5%、0.1
‑
2.5%、0.2
‑
2.5%、0.3
‑
2.5%、0.4
‑
2.5%、0.5
‑
2.5%、0.6
‑
2.5%、0.7
‑
2.5%、0.8
‑
2.5%、0.9
‑
2.5%、1
‑
2.5%、1.1
‑
2.5%、1.2
‑
2.5%、1.3
‑
2.5%、1.4
‑
2.5%、1.5
‑
2.5%、1.6
‑
2.5%、1.7
‑
2.5%、1.8
‑
2.5%、1.9
‑
2.5%、2
‑
2.5%、2.1
‑
2.5%、2.2
‑
2.5%、2.3
‑
2.5%、2.4
‑
2.5%、0
‑
3%、0.1
‑
3%、0.2
‑
3%、0.3
‑
3%、0.4
‑
3%、0.5
‑
3%、0.6
‑
3%、
0.7
‑
3%、0.8
‑
3%、0.9
‑
3%、1
‑
3%、1.1
‑
3%、1.2
‑
3%、1.3
‑
3%、1.4
‑
3%、1.5
‑
3%、1.6
‑
3%、1.7
‑
3%、1.8
‑
3%、1.9
‑
3%、2
‑
3%、2.1
‑
3%、2.2
‑
3%、2.3
‑
3%、2.4
‑
3%、2.5
‑
3%、2.6
‑
3%、2.7
‑
3%、2.8
‑
3%、2.9
‑
3%、0
‑
3.5%、0.1
‑
3.5%、0.2
‑
3.5%、0.3
‑
3.5%、0.4
‑
3.5%、0.5
‑
3.5%、0.6
‑
3.5%、0.7
‑
3.5%、0.8
‑
3.5%、0.9
‑
3.5%、1
‑
3.5%、1.1
‑
3.5%、1.2
‑
3.5%、1.3
‑
3.5%、1.4
‑
3.5%、1.5
‑
3.5%、1.6
‑
3.5%、1.7
‑
3.5%、1.8
‑
3.5%、1.9
‑
3.5%、2
‑
3.5%、2.1
‑
3.5%、2.2
‑
3.5%、2.3
‑
3.5%、2.4
‑
3.5%、2.5
‑
3.5%、2.6
‑
3.5%、2.7
‑
3.5%、2.8
‑
3.5%、2.9
‑
3.5%、3
‑
3.5%、3.1
‑
3.5%、3.2
‑
3.5%、3.3
‑
3.5%、3.4
‑
3.5%、0
‑
4%、0.1
‑
4%、0.2
‑
4%、0.3
‑
4%、0.4
‑
4%、0.5
‑
4%、0.6
‑
4%、0.7
‑
4%、0.8
‑
4%、0.9
‑
4%、1
‑
4%、1.1
‑
4%、1.2
‑
4%、1.3
‑
4%、1.4
‑
4%、1.5
‑
4%、1.6
‑
4%、1.7
‑
4%、1.8
‑
4%、1.9
‑
4%、2
‑
4%、2.1
‑
4%、2.2
‑
4%、2.3
‑
4%、2.4
‑
4%、2.5
‑
4%、2.6
‑
4%、2.7
‑
4%、2.8
‑
4%、2.9
‑
4%、3
‑
4%、3.1
‑
4%、3.2
‑
4%、3.3
‑
4%、3.4
‑
4%、3.5
‑
4%、3.6
‑
4%、3.7
‑
4%、3.8
‑
4%、3.9
‑
4%、0
‑
4.5%、0.1
‑
4.5%、0.2
‑
4.5%、0.3
‑
4.5%、0.4
‑
4.5%、0.5
‑
4.5%、0.6
‑
4.5%、0.7
‑
4.5%、0.8
‑
4.5%、0.9
‑
4.5%、1
‑
4.5%、1.1
‑
4.5%、1.2
‑
4.5%、1.3
‑
4.5%、1.4
‑
4.5%、1.5
‑
4.5%、1.6
‑
4.5%、1.7
‑
4.5%、1.8
‑
4.5%、1.9
‑
4.5%、2
‑
4.5%、2.1
‑
4.5%、2.2
‑
4.5%、2.3
‑
4.5%、2.4
‑
4.5%、2.5
‑
4.5%、2.6
‑
4.5%、2.7
‑
4.5%、2.8
‑
4.5%、2.9
‑
4.5%、3
‑
4.5%、3.1
‑
4.5%、3.2
‑
4.5%、3.3
‑
4.5%、3.4
‑
4.5%、3.5
‑
4.5%、3.6
‑
4.5%、3.7
‑
4.5%、3.8
‑
4.5%、3.9
‑
4.5%、4
‑
4.5%、4.1
‑
4.5%、4.2
‑
4.5%、4.3
‑
4.5%、4.4
‑
4.5%、0
‑
5%、0.1
‑
5%、0.2
‑
5%、0.3
‑
5%、0.4
‑
5%、0.5
‑
5%、0.6
‑
5%、0.7
‑
5%、0.8
‑
5%、0.9
‑
5%、1
‑
5%、1.1
‑
5%、1.2
‑
5%、1.3
‑
5%、1.4
‑
5%、1.5
‑
5%、1.6
‑
5%、1.7
‑
5%、1.8
‑
5%、1.9
‑
5%、2
‑
5%、2.1
‑
5%、2.2
‑
5%、2.3
‑
5%、2.4
‑
5%、2.5
‑
5%、2.6
‑
5%、2.7
‑
5%、2.8
‑
5%、2.9
‑
5%、3
‑
5%、3.1
‑
5%、3.2
‑
5%、3.3
‑
5%、3.4
‑
5%、3.5
‑
5%、3.6
‑
5%、3.7
‑
5%、3.8
‑
5%、3.9
‑
5%、4
‑
5%、4.1
‑
5%、4.2
‑
5%、4.3
‑
5%、4.4
‑
5%、4.5
‑
5%、4.6
‑
5%、4.7
‑
5%、4.8
‑
5%、4.9
‑
5%、0
‑
5.5%、0.1
‑
5.5%、0.2
‑
5.5%、0.3
‑
5.5%、0.4
‑
5.5%、0.5
‑
5.5%、0.6
‑
5.5%、0.7
‑
5.5%、0.8
‑
5.5%、0.9
‑
5.5%、1
‑
5.5%、1.1
‑
5.5%、1.2
‑
5.5%、1.3
‑
5.5%、1.4
‑
5.5%、1.5
‑
5.5%、1.6
‑
5.5%、1.7
‑
5.5%、1.8
‑
5.5%、1.9
‑
5.5%、2
‑
5.5%、2.1
‑
5.5%、2.2
‑
5.5%、2.3
‑
5.5%、2.4
‑
5.5%、2.5
‑
5.5%、2.6
‑
5.5%、2.7
‑
5.5%、2.8
‑
5.5%、2.9
‑
5.5%、3
‑
5.5%、3.1
‑
5.5%、3.2
‑
5.5%、3.3
‑
5.5%、3.4
‑
5.5%、3.5
‑
5.5%、3.6
‑
5.5%、3.7
‑
5.5%、3.8
‑
5.5%、3.9
‑
5.5%、4
‑
5.5%、4.1
‑
5.5%、4.2
‑
5.5%、4.3
‑
5.5%、4.4
‑
5.5%、4.5
‑
5.5%、4.6
‑
5.5%、4.7
‑
5.5%、4.8
‑
5.5%、4.9
‑
5.5%、5
‑
5.5%、5.1
‑
5.5%、5.2
‑
5.5%、5.3
‑
5.5%、5.4
‑
5.5%、0
‑
6%、0.1
‑
6%、0.2
‑
6%、0.3
‑
6%、0.4
‑
6%、0.5
‑
6%、0.6
‑
6%、0.7
‑
6%、0.8
‑
6%、0.9
‑
6%、1
‑
6%、1.1
‑
6%、1.2
‑
6%、1.3
‑
6%、1.4
‑
6%、1.5
‑
6%、1.6
‑
6%、1.7
‑
6%、1.8
‑
6%、1.9
‑
6%、2
‑
6%、2.1
‑
6%、2.2
‑
6%、2.3
‑
6%、2.4
‑
6%、2.5
‑
6%、2.6
‑
6%、2.7
‑
6%、2.8
‑
6%、2.9
‑
6%、3
‑
6%、3.1
‑
6%、3.2
‑
6%、3.3
‑
6%、3.4
‑
6%、3.5
‑
6%、3.6
‑
6%、3.7
‑
6%、3.8
‑
6%、3.9
‑
6%、4
‑
6%、4.1
‑
6%、4.2
‑
6%、4.3
‑
6%、4.4
‑
6%、4.5
‑
6%、4.6
‑
6%、4.7
‑
6%、4.8
‑
6%、4.9
‑
6%、5
‑
6%、5.1
‑
6%、5.2
‑
6%、5.3
‑
6%、5.4
‑
6%、5.5
‑
6%、5.6
‑
6%、5.7
‑
6%、5.8
‑
6%、5.9
‑
6%、0
‑
6.5%、0.1
‑
6.5%、0.2
‑
6.5%、0.3
‑
6.5%、0.4
‑
6.5%、0.5
‑
6.5%、0.6
‑
6.5%、0.7
‑
6.5%、0.8
‑
6.5%、0.9
‑
6.5%、1
‑
6.5%、1.1
‑
6.5%、1.2
‑
6.5%、1.3
‑
6.5%、1.4
‑
6.5%、1.5
‑
6.5%、1.6
‑
6.5%、1.7
‑
6.5%、1.8
‑
6.5%、1.9
‑
6.5%、2
‑
6.5%、2.1
‑
6.5%、2.2
‑
6.5%、2.3
‑
6.5%、2.4
‑
6.5%、2.5
‑
6.5%、2.6
‑
6.5%、2.7
‑
6.5%、2.8
‑
6.5%、2.9
‑
6.5%、3
‑
6.5%、3.1
‑
6.5%、3.2
‑
6.5%、3.3
‑
6.5%、3.4
‑
6.5%、3.5
‑
6.5%、3.6
‑
6.5%、3.7
‑
6.5%、3.8
‑
6.5%、3.9
‑
6.5%、4
‑
6.5%、4.1
‑
6.5%、4.2
‑
6.5%、4.3
‑
6.5%、4.4
‑
6.5%、4.5
‑
6.5%、4.6
‑
6.5%、4.7
‑
6.5%、4.8
‑
6.5%、4.9
‑
6.5%、5
‑
6.5%、5.1
‑
6.5%、5.2
‑
6.5%、5.3
‑
6.5%、5.4
‑
6.5%、5.5
‑
6.5%、5.6
‑
6.5%、5.7
‑
6.5%、5.8
‑
6.5%、5.9
‑
6.5%、6
‑
6.5%、6.1
‑
6.5%、6.2
‑
6.5%、6.3
‑
6.5%、6.4
‑
6.5%、0
‑
7%、0.1
‑
7%、0.2
‑
7%、0.3
‑
7%、0.4
‑
7%、0.5
‑
7%、0.6
‑
7%、0.7
‑
7%、0.8
‑
7%、0.9
‑
7%、1
‑
7%、1.1
‑
7%、1.2
‑
7%、1.3
‑
7%、1.4
‑
7%、1.5
‑
7%、1.6
‑
7%、1.7
‑
7%、1.8
‑
7%、1.9
‑
7%、2
‑
7%、2.1
‑
7%、2.2
‑
7%、2.3
‑
7%、2.4
‑
7%、2.5
‑
7%、2.6
‑
7%、2.7
‑
7%、2.8
‑
7%、2.9
‑
7%、3
‑
7%、3.1
‑
7%、3.2
‑
7%、3.3
‑
7%、3.4
‑
7%、3.5
‑
7%、3.6
‑
7%、3.7
‑
7%、3.8
‑
7%、3.9
‑
7%、4
‑
7%、4.1
‑
7%、4.2
‑
7%、4.3
‑
7%、4.4
‑
7%、4.5
‑
7%、4.6
‑
7%、4.7
‑
7%、4.8
‑
7%、4.9
‑
7%、5
‑
7%、5.1
‑
7%、5.2
‑
7%、5.3
‑
7%、5.4
‑
7%、5.5
‑
7%、5.6
‑
7%、5.7
‑
7%、5.8
‑
7%、5.9
‑
7%、6
‑
7%、6.1
‑
7%、6.2
‑
7%、6.3
‑
7%、6.4
‑
7%、6.5
‑
7%、6.6
‑
7%、6.7
‑
7%、6.8
‑
7%、6.9
‑
7%、0
‑
7.5%、0.1
‑
7.5%、0.2
‑
7.5%、0.3
‑
7.5%、0.4
‑
7.5%、0.5
‑
7.5%、0.6
‑
7.5%、0.7
‑
7.5%、0.8
‑
7.5%、0.9
‑
7.5%、1
‑
7.5%、1.1
‑
7.5%、1.2
‑
7.5%、1.3
‑
7.5%、1.4
‑
7.5%、1.5
‑
7.5%、1.6
‑
7.5%、1.7
‑
7.5%、1.8
‑
7.5%、1.9
‑
7.5%、2
‑
7.5%、2.1
‑
7.5%、2.2
‑
7.5%、2.3
‑
7.5%、2.4
‑
7.5%、2.5
‑
7.5%、2.6
‑
7.5%、2.7
‑
7.5%、2.8
‑
7.5%、2.9
‑
7.5%、3
‑
7.5%、3.1
‑
7.5%、3.2
‑
7.5%、3.3
‑
7.5%、3.4
‑
7.5%、3.5
‑
7.5%、3.6
‑
7.5%、3.7
‑
7.5%、3.8
‑
7.5%、3.9
‑
7.5%、4
‑
7.5%、4.1
‑
7.5%、4.2
‑
7.5%、4.3
‑
7.5%、4.4
‑
7.5%、4.5
‑
7.5%、4.6
‑
7.5%、4.7
‑
7.5%、4.8
‑
7.5%、4.9
‑
7.5%、5
‑
7.5%、5.1
‑
7.5%、5.2
‑
7.5%、5.3
‑
7.5%、5.4
‑
7.5%、5.5
‑
7.5%、5.6
‑
7.5%、5.7
‑
7.5%、5.8
‑
7.5%、5.9
‑
7.5%、6
‑
7.5%、6.1
‑
7.5%、6.2
‑
7.5%、6.3
‑
7.5%、6.4
‑
7.5%、6.5
‑
7.5%、6.6
‑
7.5%、6.7
‑
7.5%、6.8
‑
7.5%、6.9
‑
7.5%、7
‑
7.5%、7.1
‑
7.5%、7.2
‑
7.5%、7.3
‑
7.5%、7.4
‑
7.5%、0
‑
8%、0.1
‑
8%、0.2
‑
8%、0.3
‑
8%、0.4
‑
8%、0.5
‑
8%、0.6
‑
8%、0.7
‑
8%、0.8
‑
8%、0.9
‑
8%、1
‑
8%、1.1
‑
8%、1.2
‑
8%、1.3
‑
8%、1.4
‑
8%、1.5
‑
8%、1.6
‑
8%、1.7
‑
8%、1.8
‑
8%、1.9
‑
8%、2
‑
8%、2.1
‑
8%、2.2
‑
8%、2.3
‑
8%、2.4
‑
8%、2.5
‑
8%、2.6
‑
8%、2.7
‑
8%、2.8
‑
8%、2.9
‑
8%、3
‑
8%、3.1
‑
8%、3.2
‑
8%、3.3
‑
8%、3.4
‑
8%、3.5
‑
8%、3.6
‑
8%、3.7
‑
8%、3.8
‑
8%、3.9
‑
8%、4
‑
8%、4.1
‑
8%、4.2
‑
8%、4.3
‑
8%、4.4
‑
8%、4.5
‑
8%、4.6
‑
8%、4.7
‑
8%、4.8
‑
8%、4.9
‑
8%、5
‑
8%、5.1
‑
8%、5.2
‑
8%、5.3
‑
8%、5.4
‑
8%、5.5
‑
8%、5.6
‑
8%、5.7
‑
8%、5.8
‑
8%、5.9
‑
8%、6
‑
8%、6.1
‑
8%、6.2
‑
8%、6.3
‑
8%、6.4
‑
8%、6.5
‑
8%、6.6
‑
8%、6.7
‑
8%、6.8
‑
8%、6.9
‑
8%、7
‑
8%、7.1
‑
8%、7.2
‑
8%、7.3
‑
8%、7.4
‑
8%、7.5
‑
8%、7.6
‑
8%、7.7
‑
8%、7.8
‑
8%、7.9
‑
8%、0
‑
8.5%、0.1
‑
8.5%、0.2
‑
8.5%、0.3
‑
8.5%、0.4
‑
8.5%、0.5
‑
8.5%、0.6
‑
8.5%、0.7
‑
8.5%、0.8
‑
8.5%、0.9
‑
8.5%、1
‑
8.5%、1.1
‑
8.5%、1.2
‑
8.5%、1.3
‑
8.5%、1.4
‑
8.5%、1.5
‑
8.5%、1.6
‑
8.5%、1.7
‑
8.5%、1.8
‑
8.5%、1.9
‑
8.5%、2
‑
8.5%、2.1
‑
8.5%、2.2
‑
8.5%、2.3
‑
8.5%、2.4
‑
8.5%、2.5
‑
8.5%、2.6
‑
8.5%、2.7
‑
8.5%、2.8
‑
8.5%、2.9
‑
8.5%、3
‑
8.5%、3.1
‑
8.5%、3.2
‑
8.5%、3.3
‑
8.5%、3.4
‑
8.5%、3.5
‑
8.5%、3.6
‑
8.5%、3.7
‑
8.5%、3.8
‑
8.5%、3.9
‑
8.5%、4
‑
8.5%、4.1
‑
8.5%、4.2
‑
8.5%、4.3
‑
8.5%、4.4
‑
8.5%、4.5
‑
8.5%、4.6
‑
8.5%、4.7
‑
8.5%、4.8
‑
8.5%、4.9
‑
8.5%、5
‑
8.5%、5.1
‑
8.5%、5.2
‑
8.5%、5.3
‑
8.5%、5.4
‑
8.5%、5.5
‑
8.5%、5.6
‑
8.5%、5.7
‑
8.5%、5.8
‑
8.5%、5.9
‑
8.5%、6
‑
8.5%、6.1
‑
8.5%、6.2
‑
8.5%、6.3
‑
8.5%、6.4
‑
8.5%、6.5
‑
8.5%、6.6
‑
8.5%、6.7
‑
8.5%、6.8
‑
8.5%、6.9
‑
8.5%、7
‑
8.5%、7.1
‑
8.5%、7.2
‑
8.5%、7.3
‑
8.5%、7.4
‑
8.5%、7.5
‑
8.5%、7.6
‑
8.5%、7.7
‑
8.5%、7.8
‑
8.5%、7.9
‑
8.5%、8
‑
8.5%、8.1
‑
8.5%、8.2
‑
8.5%、8.3
‑
8.5%、8.4
‑
8.5%、0
‑
9%、0.1
‑
9%、0.2
‑
9%、0.3
‑
9%、0.4
‑
9%、0.5
‑
9%、0.6
‑
9%、0.7
‑
9%、0.8
‑
9%、0.9
‑
9%、1
‑
9%、1.1
‑
9%、1.2
‑
9%、1.3
‑
9%、1.4
‑
9%、1.5
‑
9%、1.6
‑
9%、1.7
‑
9%、1.8
‑
9%、1.9
‑
9%、2
‑
9%、2.1
‑
9%、2.2
‑
9%、2.3
‑
9%、2.4
‑
9%、2.5
‑
9%、2.6
‑
9%、2.7
‑
9%、2.8
‑
9%、2.9
‑
9%、3
‑
9%、3.1
‑
9%、3.2
‑
9%、3.3
‑
9%、3.4
‑
9%、3.5
‑
9%、3.6
‑
9%、3.7
‑
9%、3.8
‑
9%、3.9
‑
9%、4
‑
9%、4.1
‑
9%、4.2
‑
9%、4.3
‑
9%、4.4
‑
9%、4.5
‑
9%、4.6
‑
9%、4.7
‑
9%、4.8
‑
9%、4.9
‑
9%、5
‑
9%、5.1
‑
9%、5.2
‑
9%、5.3
‑
9%、5.4
‑
9%、5.5
‑
9%、5.6
‑
9%、5.7
‑
9%、5.8
‑
9%、5.9
‑
9%、6
‑
9%、6.1
‑
9%、6.2
‑
9%、6.3
‑
9%、6.4
‑
9%、6.5
‑
9%、6.6
‑
9%、6.7
‑
9%、6.8
‑
9%、6.9
‑
9%、7
‑
9%、7.1
‑
9%、7.2
‑
9%、7.3
‑
9%、7.4
‑
9%、7.5
‑
9%、7.6
‑
9%、7.7
‑
9%、7.8
‑
9%、7.9
‑
9%、8
‑
9%、8.1
‑
9%、8.2
‑
9%、8.3
‑
9%、8.4
‑
9%、8.5
‑
9%、8.6
‑
9%、8.7
‑
9%、8.8
‑
9%、8.9
‑
9%、0
‑
9.5%、0.1
‑
9.5%、0.2
‑
9.5%、0.3
‑
9.5%、0.4
‑
9.5%、0.5
‑
9.5%、0.6
‑
9.5%、0.7
‑
9.5%、0.8
‑
9.5%、0.9
‑
9.5%、1
‑
9.5%、1.1
‑
9.5%、1.2
‑
9.5%、1.3
‑
9.5%、1.4
‑
9.5%、1.5
‑
9.5%、1.6
‑
9.5%、1.7
‑
9.5%、1.8
‑
9.5%、1.9
‑
9.5%、2
‑
9.5%、2.1
‑
9.5%、2.2
‑
9.5%、2.3
‑
9.5%、2.4
‑
9.5%、2.5
‑
9.5%、2.6
‑
9.5%、2.7
‑
9.5%、2.8
‑
9.5%、2.9
‑
9.5%、3
‑
9.5%、3.1
‑
9.5%、3.2
‑
9.5%、3.3
‑
9.5%、3.4
‑
9.5%、3.5
‑
9.5%、3.6
‑
9.5%、3.7
‑
9.5%、3.8
‑
9.5%、3.9
‑
9.5%、4
‑
9.5%、4.1
‑
9.5%、4.2
‑
9.5%、4.3
‑
9.5%、4.4
‑
9.5%、4.5
‑
9.5%、4.6
‑
9.5%、4.7
‑
9.5%、4.8
‑
9.5%、4.9
‑
9.5%、5
‑
9.5%、5.1
‑
9.5%、5.2
‑
9.5%、5.3
‑
9.5%、5.4
‑
9.5%、5.5
‑
9.5%、5.6
‑
9.5%、5.7
‑
9.5%、5.8
‑
9.5%、5.9
‑
9.5%、6
‑
9.5%、6.1
‑
9.5%、6.2
‑
9.5%、6.3
‑
9.5%、6.4
‑
9.5%、6.5
‑
9.5%、6.6
‑
9.5%、6.7
‑
9.5%、6.8
‑
9.5%、6.9
‑
9.5%、7
‑
9.5%、7.1
‑
9.5%、7.2
‑
9.5%、7.3
‑
9.5%、7.4
‑
9.5%、7.5
‑
9.5%、7.6
‑
9.5%、7.7
‑
9.5%、7.8
‑
9.5%、7.9
‑
9.5%、8
‑
9.5%、8.1
‑
9.5%、8.2
‑
9.5%、8.3
‑
9.5%、8.4
‑
9.5%、8.5
‑
9.5%、8.6
‑
9.5%、8.7
‑
9.5%、8.8
‑
9.5%、8.9
‑
9.5%、9
‑
9.5%、9.1
‑
9.5%、9.2
‑
9.5%、9.3
‑
9.5%、9.4
‑
9.5%、0
‑
10%、0.1
‑
10%、0.2
‑
10%、0.3
‑
10%、0.4
‑
10%、0.5
‑
10%、0.6
‑
10%、0.7
‑
10%、0.8
‑
10%、0.9
‑
10%、1
‑
10%、1.1
‑
10%、1.2
‑
10%、1.3
‑
10%、1.4
‑
10%、1.5
‑
10%、1.6
‑
10%、1.7
‑
10%、1.8
‑
10%、1.9
‑
10%、2
‑
10%、2.1
‑
10%、2.2
‑
10%、2.3
‑
10%、2.4
‑
10%、2.5
‑
10%、2.6
‑
10%、2.7
‑
10%、2.8
‑
10%、2.9
‑
10%、3
‑
10%、3.1
‑
10%、3.2
‑
10%、3.3
‑
10%、3.4
‑
10%、3.5
‑
10%、3.6
‑
10%、3.7
‑
10%、3.8
‑
10%、3.9
‑
10%、4
‑
10%、4.1
‑
10%、4.2
‑
10%、4.3
‑
10%、4.4
‑
10%、4.5
‑
10%、4.6
‑
10%、4.7
‑
10%、4.8
‑
10%、4.9
‑
10%、5
‑
10%、5.1
‑
10%、5.2
‑
10%、5.3
‑
10%、5.4
‑
10%、5.5
‑
10%、5.6
‑
10%、5.7
‑
10%、5.8
‑
10%、5.9
‑
10%、6
‑
10%、6.1
‑
10%、6.2
‑
10%、6.3
‑
10%、6.4
‑
10%、6.5
‑
10%、6.6
‑
10%、6.7
‑
10%、6.8
‑
10%、6.9
‑
10%、7
‑
10%、7.1
‑
10%、7.2
‑
10%、7.3
‑
10%、7.4
‑
10%、7.5
‑
10%、7.6
‑
10%、7.7
‑
10%、7.8
‑
10%、7.9
‑
10%、8
‑
10%、8.1
‑
10%、8.2
‑
10%、8.3
‑
10%、8.4
‑
10%、8.5
‑
10%、8.6
‑
10%、8.7
‑
10%、8.8
‑
10%、8.9
‑
10%、9
‑
10%、9.1
‑
10%、9.2
‑
10%、9.3
‑
10%、9.4
‑
10%、9.5
‑
10%、9.6
‑
10%、9.7
‑
10%、9.8
‑
10%或9.9
‑
10%w/v。
[0848]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
10%w/v的糖和/或糖替代物。
[0849]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
9%w/v的糖和/或糖替代物。
[0850]
在某些实施方案中,制剂可包含1%w/v的糖和/或糖替代物。
[0851]
在某些实施方案中,制剂可包含2%w/v的糖和/或糖替代物。
[0852]
在某些实施方案中,制剂可包含3%w/v的糖和/或糖替代物。
[0853]
在某些实施方案中,制剂可包含4%w/v的糖和/或糖替代物。
[0854]
在某些实施方案中,制剂可包含5%w/v的糖和/或糖替代物。
[0855]
在某些实施方案中,制剂可包含6%w/v的糖和/或糖替代物。
[0856]
在某些实施方案中,制剂可包含7%w/v的糖和/或糖替代物。
[0857]
在某些实施方案中,制剂可包含8%w/v的糖和/或糖替代物。
[0858]
在某些实施方案中,制剂可包含9%w/v的糖和/或糖替代物。
[0859]
在某些实施方案中,制剂可包含10%w/v的糖和/或糖替代物。
[0860]
在某些实施方案中,本文所述的药物组合物的制剂可包含双糖。可用于本文所述的制剂中合适的双糖可包含蔗糖、乳油糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、壳二糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、β,β
‑
海藻糖、α,β
‑
海藻糖、槐二糖、海带二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、巴拉金糖、龙胆二酬糖(gentiobiulose)、甘露二糖、蜜二糖、车前二糖、芸香糖、芦丁酮糖和木二糖。用于制剂中的双糖(w/v)的浓度可在1%
‑
15%之间,例如在1%
‑
5%之间、在3%
‑
6%之间、在5%
‑
8%之间、在7%
‑
10%之间或在10%
‑
15%之间。
[0861]
在某些实施方案中,本文所述的药物组合物的制剂可包含糖醇。作为一个非限制性实例,可用于本文所述的制剂中的糖醇可包含山梨糖醇。用于制剂中的糖醇(w/v)的浓度可在1%
‑
15%之间,例如在1%
‑
5%之间、在3%
‑
6%之间、在5%
‑
8%之间、在7%
‑
10%之间或在10%
‑
15%之间。
[0862]
蔗糖
[0863]
在某些实施方案中,制剂可包含至少一种糖,其为双糖,例如但不限于蔗糖。
[0864]
在某些实施方案中,制剂可包含以下量的蔗糖:0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%、5%、5.1%、5.2%、5.3%、5.4%、5.5%、5.6%、5.7%、5.8%、5.9%、6%、6.1%、6.2%、6.3%、6.4%、6.5%、6.6%、6.7%、6.8%、6.9%、7%、7.1%、7.2%、7.3%、7.4%、7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%或10%w/v。
[0865]
在某些实施方案中,制剂可包含在以下范围内的蔗糖:0
‑
1%、0.1
‑
1%、0.2
‑
1%、0.3
‑
1%、0.4
‑
1%、0.5
‑
1%、0.6
‑
1%、0.7
‑
1%、0.8
‑
1%、0.9
‑
1%、0
‑
1.5%、0.1
‑
1.5%、0.2
‑
1.5%、0.3
‑
1.5%、0.4
‑
1.5%、0.5
‑
1.5%、0.6
‑
1.5%、0.7
‑
1.5%、0.8
‑
1.5%、0.9
‑
1.5%、1
‑
1.5%、1.1
‑
1.5%、1.2
‑
1.5%、1.3
‑
1.5%、1.4
‑
1.5%、0
‑
2%、0.1
‑
2%、0.2
‑
2%、0.3
‑
2%、0.4
‑
2%、0.5
‑
2%、0.6
‑
2%、0.7
‑
2%、0.8
‑
2%、0.9
‑
2%、1
‑
2%、1.1
‑
2%、1.2
‑
2%、1.3
‑
2%、1.4
‑
2%、1.5
‑
2%、1.6
‑
2%、1.7
‑
2%、1.8
‑
2%、1.9
‑
2%、0
‑
2.5%、0.1
‑
2.5%、0.2
‑
2.5%、0.3
‑
2.5%、0.4
‑
2.5%、0.5
‑
2.5%、0.6
‑
2.5%、0.7
‑
2.5%、0.8
‑
2.5%、
0.9
‑
2.5%、1
‑
2.5%、1.1
‑
2.5%、1.2
‑
2.5%、1.3
‑
2.5%、1.4
‑
2.5%、1.5
‑
2.5%、1.6
‑
2.5%、1.7
‑
2.5%、1.8
‑
2.5%、1.9
‑
2.5%、2
‑
2.5%、2.1
‑
2.5%、2.2
‑
2.5%、2.3
‑
2.5%、2.4
‑
2.5%、0
‑
3%、0.1
‑
3%、0.2
‑
3%、0.3
‑
3%、0.4
‑
3%、0.5
‑
3%、0.6
‑
3%、0.7
‑
3%、0.8
‑
3%、0.9
‑
3%、1
‑
3%、1.1
‑
3%、1.2
‑
3%、1.3
‑
3%、1.4
‑
3%、1.5
‑
3%、1.6
‑
3%、1.7
‑
3%、1.8
‑
3%、1.9
‑
3%、2
‑
3%、2.1
‑
3%、2.2
‑
3%、2.3
‑
3%、2.4
‑
3%、2.5
‑
3%、2.6
‑
3%、2.7
‑
3%、2.8
‑
3%、2.9
‑
3%、0
‑
3.5%、0.1
‑
3.5%、0.2
‑
3.5%、0.3
‑
3.5%、0.4
‑
3.5%、0.5
‑
3.5%、0.6
‑
3.5%、0.7
‑
3.5%、0.8
‑
3.5%、0.9
‑
3.5%、1
‑
3.5%、1.1
‑
3.5%、1.2
‑
3.5%、1.3
‑
3.5%、1.4
‑
3.5%、1.5
‑
3.5%、1.6
‑
3.5%、1.7
‑
3.5%、1.8
‑
3.5%、1.9
‑
3.5%、2
‑
3.5%、2.1
‑
3.5%、2.2
‑
3.5%、2.3
‑
3.5%、2.4
‑
3.5%、2.5
‑
3.5%、2.6
‑
3.5%、2.7
‑
3.5%、2.8
‑
3.5%、2.9
‑
3.5%、3
‑
3.5%、3.1
‑
3.5%、3.2
‑
3.5%、3.3
‑
3.5%、3.4
‑
3.5%、0
‑
4%、0.1
‑
4%、0.2
‑
4%、0.3
‑
4%、0.4
‑
4%、0.5
‑
4%、0.6
‑
4%、0.7
‑
4%、0.8
‑
4%、0.9
‑
4%、1
‑
4%、1.1
‑
4%、1.2
‑
4%、1.3
‑
4%、1.4
‑
4%、1.5
‑
4%、1.6
‑
4%、1.7
‑
4%、1.8
‑
4%、1.9
‑
4%、2
‑
4%、2.1
‑
4%、2.2
‑
4%、2.3
‑
4%、2.4
‑
4%、2.5
‑
4%、2.6
‑
4%、2.7
‑
4%、2.8
‑
4%、2.9
‑
4%、3
‑
4%、3.1
‑
4%、3.2
‑
4%、3.3
‑
4%、3.4
‑
4%、3.5
‑
4%、3.6
‑
4%、3.7
‑
4%、3.8
‑
4%、3.9
‑
4%、0
‑
4.5%、0.1
‑
4.5%、0.2
‑
4.5%、0.3
‑
4.5%、0.4
‑
4.5%、0.5
‑
4.5%、0.6
‑
4.5%、0.7
‑
4.5%、0.8
‑
4.5%、0.9
‑
4.5%、1
‑
4.5%、1.1
‑
4.5%、1.2
‑
4.5%、1.3
‑
4.5%、1.4
‑
4.5%、1.5
‑
4.5%、1.6
‑
4.5%、1.7
‑
4.5%、1.8
‑
4.5%、1.9
‑
4.5%、2
‑
4.5%、2.1
‑
4.5%、2.2
‑
4.5%、2.3
‑
4.5%、2.4
‑
4.5%、2.5
‑
4.5%、2.6
‑
4.5%、2.7
‑
4.5%、2.8
‑
4.5%、2.9
‑
4.5%、3
‑
4.5%、3.1
‑
4.5%、3.2
‑
4.5%、3.3
‑
4.5%、3.4
‑
4.5%、3.5
‑
4.5%、3.6
‑
4.5%、3.7
‑
4.5%、3.8
‑
4.5%、3.9
‑
4.5%、4
‑
4.5%、4.1
‑
4.5%、4.2
‑
4.5%、4.3
‑
4.5%、4.4
‑
4.5%、0
‑
5%、0.1
‑
5%、0.2
‑
5%、0.3
‑
5%、0.4
‑
5%、0.5
‑
5%、0.6
‑
5%、0.7
‑
5%、0.8
‑
5%、0.9
‑
5%、1
‑
5%、1.1
‑
5%、1.2
‑
5%、1.3
‑
5%、1.4
‑
5%、1.5
‑
5%、1.6
‑
5%、1.7
‑
5%、1.8
‑
5%、1.9
‑
5%、2
‑
5%、2.1
‑
5%、2.2
‑
5%、2.3
‑
5%、2.4
‑
5%、2.5
‑
5%、2.6
‑
5%、2.7
‑
5%、2.8
‑
5%、2.9
‑
5%、3
‑
5%、3.1
‑
5%、3.2
‑
5%、3.3
‑
5%、3.4
‑
5%、3.5
‑
5%、3.6
‑
5%、3.7
‑
5%、3.8
‑
5%、3.9
‑
5%、4
‑
5%、4.1
‑
5%、4.2
‑
5%、4.3
‑
5%、4.4
‑
5%、4.5
‑
5%、4.6
‑
5%、4.7
‑
5%、4.8
‑
5%、4.9
‑
5%、0
‑
5.5%、0.1
‑
5.5%、0.2
‑
5.5%、0.3
‑
5.5%、0.4
‑
5.5%、0.5
‑
5.5%、0.6
‑
5.5%、0.7
‑
5.5%、0.8
‑
5.5%、0.9
‑
5.5%、1
‑
5.5%、1.1
‑
5.5%、1.2
‑
5.5%、1.3
‑
5.5%、1.4
‑
5.5%、1.5
‑
5.5%、1.6
‑
5.5%、1.7
‑
5.5%、1.8
‑
5.5%、1.9
‑
5.5%、2
‑
5.5%、2.1
‑
5.5%、2.2
‑
5.5%、2.3
‑
5.5%、2.4
‑
5.5%、2.5
‑
5.5%、2.6
‑
5.5%、2.7
‑
5.5%、2.8
‑
5.5%、2.9
‑
5.5%、3
‑
5.5%、3.1
‑
5.5%、3.2
‑
5.5%、3.3
‑
5.5%、3.4
‑
5.5%、3.5
‑
5.5%、3.6
‑
5.5%、3.7
‑
5.5%、3.8
‑
5.5%、3.9
‑
5.5%、4
‑
5.5%、4.1
‑
5.5%、4.2
‑
5.5%、4.3
‑
5.5%、4.4
‑
5.5%、4.5
‑
5.5%、4.6
‑
5.5%、4.7
‑
5.5%、4.8
‑
5.5%、4.9
‑
5.5%、5
‑
5.5%、5.1
‑
5.5%、5.2
‑
5.5%、5.3
‑
5.5%、5.4
‑
5.5%、0
‑
6%、0.1
‑
6%、0.2
‑
6%、0.3
‑
6%、0.4
‑
6%、0.5
‑
6%、0.6
‑
6%、0.7
‑
6%、0.8
‑
6%、0.9
‑
6%、1
‑
6%、1.1
‑
6%、1.2
‑
6%、1.3
‑
6%、1.4
‑
6%、1.5
‑
6%、1.6
‑
6%、1.7
‑
6%、1.8
‑
6%、1.9
‑
6%、2
‑
6%、2.1
‑
6%、2.2
‑
6%、2.3
‑
6%、2.4
‑
6%、2.5
‑
6%、2.6
‑
6%、2.7
‑
6%、2.8
‑
6%、2.9
‑
6%、3
‑
6%、3.1
‑
6%、3.2
‑
6%、3.3
‑
6%、3.4
‑
6%、3.5
‑
6%、3.6
‑
6%、3.7
‑
6%、3.8
‑
6%、3.9
‑
6%、4
‑
6%、4.1
‑
6%、4.2
‑
6%、4.3
‑
6%、4.4
‑
6%、4.5
‑
6%、4.6
‑
6%、4.7
‑
6%、4.8
‑
6%、4.9
‑
6%、5
‑
6%、5.1
‑
6%、5.2
‑
6%、5.3
‑
6%、5.4
‑
6%、5.5
‑
6%、5.6
‑
6%、5.7
‑
6%、5.8
‑
6%、5.9
‑
6%、0
‑
6.5%、
0.1
‑
6.5%、0.2
‑
6.5%、0.3
‑
6.5%、0.4
‑
6.5%、0.5
‑
6.5%、0.6
‑
6.5%、0.7
‑
6.5%、0.8
‑
6.5%、0.9
‑
6.5%、1
‑
6.5%、1.1
‑
6.5%、1.2
‑
6.5%、1.3
‑
6.5%、1.4
‑
6.5%、1.5
‑
6.5%、1.6
‑
6.5%、1.7
‑
6.5%、1.8
‑
6.5%、1.9
‑
6.5%、2
‑
6.5%、2.1
‑
6.5%、2.2
‑
6.5%、2.3
‑
6.5%、2.4
‑
6.5%、2.5
‑
6.5%、2.6
‑
6.5%、2.7
‑
6.5%、2.8
‑
6.5%、2.9
‑
6.5%、3
‑
6.5%、3.1
‑
6.5%、3.2
‑
6.5%、3.3
‑
6.5%、3.4
‑
6.5%、3.5
‑
6.5%、3.6
‑
6.5%、3.7
‑
6.5%、3.8
‑
6.5%、3.9
‑
6.5%、4
‑
6.5%、4.1
‑
6.5%、4.2
‑
6.5%、4.3
‑
6.5%、4.4
‑
6.5%、4.5
‑
6.5%、4.6
‑
6.5%、4.7
‑
6.5%、4.8
‑
6.5%、4.9
‑
6.5%、5
‑
6.5%、5.1
‑
6.5%、5.2
‑
6.5%、5.3
‑
6.5%、5.4
‑
6.5%、5.5
‑
6.5%、5.6
‑
6.5%、5.7
‑
6.5%、5.8
‑
6.5%、5.9
‑
6.5%、6
‑
6.5%、6.1
‑
6.5%、6.2
‑
6.5%、6.3
‑
6.5%、6.4
‑
6.5%、0
‑
7%、0.1
‑
7%、0.2
‑
7%、0.3
‑
7%、0.4
‑
7%、0.5
‑
7%、0.6
‑
7%、0.7
‑
7%、0.8
‑
7%、0.9
‑
7%、1
‑
7%、1.1
‑
7%、1.2
‑
7%、1.3
‑
7%、1.4
‑
7%、1.5
‑
7%、1.6
‑
7%、1.7
‑
7%、1.8
‑
7%、1.9
‑
7%、2
‑
7%、2.1
‑
7%、2.2
‑
7%、2.3
‑
7%、2.4
‑
7%、2.5
‑
7%、2.6
‑
7%、2.7
‑
7%、2.8
‑
7%、2.9
‑
7%、3
‑
7%、3.1
‑
7%、3.2
‑
7%、3.3
‑
7%、3.4
‑
7%、3.5
‑
7%、3.6
‑
7%、3.7
‑
7%、3.8
‑
7%、3.9
‑
7%、4
‑
7%、4.1
‑
7%、4.2
‑
7%、4.3
‑
7%、4.4
‑
7%、4.5
‑
7%、4.6
‑
7%、4.7
‑
7%、4.8
‑
7%、4.9
‑
7%、5
‑
7%、5.1
‑
7%、5.2
‑
7%、5.3
‑
7%、5.4
‑
7%、5.5
‑
7%、5.6
‑
7%、5.7
‑
7%、5.8
‑
7%、5.9
‑
7%、6
‑
7%、6.1
‑
7%、6.2
‑
7%、6.3
‑
7%、6.4
‑
7%、6.5
‑
7%、6.6
‑
7%、6.7
‑
7%、6.8
‑
7%、6.9
‑
7%、0
‑
7.5%、0.1
‑
7.5%、0.2
‑
7.5%、0.3
‑
7.5%、0.4
‑
7.5%、0.5
‑
7.5%、0.6
‑
7.5%、0.7
‑
7.5%、0.8
‑
7.5%、0.9
‑
7.5%、1
‑
7.5%、1.1
‑
7.5%、1.2
‑
7.5%、1.3
‑
7.5%、1.4
‑
7.5%、1.5
‑
7.5%、1.6
‑
7.5%、1.7
‑
7.5%、1.8
‑
7.5%、1.9
‑
7.5%、2
‑
7.5%、2.1
‑
7.5%、2.2
‑
7.5%、2.3
‑
7.5%、2.4
‑
7.5%、2.5
‑
7.5%、2.6
‑
7.5%、2.7
‑
7.5%、2.8
‑
7.5%、2.9
‑
7.5%、3
‑
7.5%、3.1
‑
7.5%、3.2
‑
7.5%、3.3
‑
7.5%、3.4
‑
7.5%、3.5
‑
7.5%、3.6
‑
7.5%、3.7
‑
7.5%、3.8
‑
7.5%、3.9
‑
7.5%、4
‑
7.5%、4.1
‑
7.5%、4.2
‑
7.5%、4.3
‑
7.5%、4.4
‑
7.5%、4.5
‑
7.5%、4.6
‑
7.5%、4.7
‑
7.5%、4.8
‑
7.5%、4.9
‑
7.5%、5
‑
7.5%、5.1
‑
7.5%、5.2
‑
7.5%、5.3
‑
7.5%、5.4
‑
7.5%、5.5
‑
7.5%、5.6
‑
7.5%、5.7
‑
7.5%、5.8
‑
7.5%、5.9
‑
7.5%、6
‑
7.5%、6.1
‑
7.5%、6.2
‑
7.5%、6.3
‑
7.5%、6.4
‑
7.5%、6.5
‑
7.5%、6.6
‑
7.5%、6.7
‑
7.5%、6.8
‑
7.5%、6.9
‑
7.5%、7
‑
7.5%、7.1
‑
7.5%、7.2
‑
7.5%、7.3
‑
7.5%、7.4
‑
7.5%、0
‑
8%、0.1
‑
8%、0.2
‑
8%、0.3
‑
8%、0.4
‑
8%、0.5
‑
8%、0.6
‑
8%、0.7
‑
8%、0.8
‑
8%、0.9
‑
8%、1
‑
8%、1.1
‑
8%、1.2
‑
8%、1.3
‑
8%、1.4
‑
8%、1.5
‑
8%、1.6
‑
8%、1.7
‑
8%、1.8
‑
8%、1.9
‑
8%、2
‑
8%、2.1
‑
8%、2.2
‑
8%、2.3
‑
8%、2.4
‑
8%、2.5
‑
8%、2.6
‑
8%、2.7
‑
8%、2.8
‑
8%、2.9
‑
8%、3
‑
8%、3.1
‑
8%、3.2
‑
8%、3.3
‑
8%、3.4
‑
8%、3.5
‑
8%、3.6
‑
8%、3.7
‑
8%、3.8
‑
8%、3.9
‑
8%、4
‑
8%、4.1
‑
8%、4.2
‑
8%、4.3
‑
8%、4.4
‑
8%、4.5
‑
8%、4.6
‑
8%、4.7
‑
8%、4.8
‑
8%、4.9
‑
8%、5
‑
8%、5.1
‑
8%、5.2
‑
8%、5.3
‑
8%、5.4
‑
8%、5.5
‑
8%、5.6
‑
8%、5.7
‑
8%、5.8
‑
8%、5.9
‑
8%、6
‑
8%、6.1
‑
8%、6.2
‑
8%、6.3
‑
8%、6.4
‑
8%、6.5
‑
8%、6.6
‑
8%、6.7
‑
8%、6.8
‑
8%、6.9
‑
8%、7
‑
8%、7.1
‑
8%、7.2
‑
8%、7.3
‑
8%、7.4
‑
8%、7.5
‑
8%、7.6
‑
8%、7.7
‑
8%、7.8
‑
8%、7.9
‑
8%、0
‑
8.5%、0.1
‑
8.5%、0.2
‑
8.5%、0.3
‑
8.5%、0.4
‑
8.5%、0.5
‑
8.5%、0.6
‑
8.5%、0.7
‑
8.5%、0.8
‑
8.5%、0.9
‑
8.5%、1
‑
8.5%、1.1
‑
8.5%、1.2
‑
8.5%、1.3
‑
8.5%、1.4
‑
8.5%、1.5
‑
8.5%、1.6
‑
8.5%、1.7
‑
8.5%、1.8
‑
8.5%、1.9
‑
8.5%、2
‑
8.5%、2.1
‑
8.5%、2.2
‑
8.5%、2.3
‑
8.5%、2.4
‑
8.5%、2.5
‑
8.5%、2.6
‑
8.5%、2.7
‑
8.5%、2.8
‑
8.5%、2.9
‑
8.5%、3
‑
8.5%、3.1
‑
8.5%、3.2
‑
8.5%、3.3
‑
8.5%、3.4
‑
8.5%、3.5
‑
8.5%、3.6
‑
8.5%、3.7
‑
8.5%、3.8
‑
8.5%、3.9
‑
8.5%、4
‑
8.5%、4.1
‑
8.5%、4.2
‑
8.5%、4.3
‑
8.5%、4.4
‑
8.5%、4.5
‑
8.5%、4.6
‑
8.5%、4.7
‑
8.5%、4.8
‑
8.5%、4.9
‑
8.5%、5
‑
8.5%、5.1
‑
8.5%、5.2
‑
8.5%、5.3
‑
8.5%、5.4
‑
8.5%、5.5
‑
8.5%、5.6
‑
8.5%、5.7
‑
8.5%、5.8
‑
8.5%、5.9
‑
8.5%、6
‑
8.5%、6.1
‑
8.5%、6.2
‑
8.5%、6.3
‑
8.5%、6.4
‑
8.5%、6.5
‑
8.5%、6.6
‑
8.5%、6.7
‑
8.5%、6.8
‑
8.5%、6.9
‑
8.5%、7
‑
8.5%、7.1
‑
8.5%、7.2
‑
8.5%、7.3
‑
8.5%、7.4
‑
8.5%、7.5
‑
8.5%、7.6
‑
8.5%、7.7
‑
8.5%、7.8
‑
8.5%、7.9
‑
8.5%、8
‑
8.5%、8.1
‑
8.5%、8.2
‑
8.5%、8.3
‑
8.5%、8.4
‑
8.5%、0
‑
9%、0.1
‑
9%、0.2
‑
9%、0.3
‑
9%、0.4
‑
9%、0.5
‑
9%、0.6
‑
9%、0.7
‑
9%、0.8
‑
9%、0.9
‑
9%、1
‑
9%、1.1
‑
9%、1.2
‑
9%、1.3
‑
9%、1.4
‑
9%、1.5
‑
9%、1.6
‑
9%、1.7
‑
9%、1.8
‑
9%、1.9
‑
9%、2
‑
9%、2.1
‑
9%、2.2
‑
9%、2.3
‑
9%、2.4
‑
9%、2.5
‑
9%、2.6
‑
9%、2.7
‑
9%、2.8
‑
9%、2.9
‑
9%、3
‑
9%、3.1
‑
9%、3.2
‑
9%、3.3
‑
9%、3.4
‑
9%、3.5
‑
9%、3.6
‑
9%、3.7
‑
9%、3.8
‑
9%、3.9
‑
9%、4
‑
9%、4.1
‑
9%、4.2
‑
9%、4.3
‑
9%、4.4
‑
9%、4.5
‑
9%、4.6
‑
9%、4.7
‑
9%、4.8
‑
9%、4.9
‑
9%、5
‑
9%、5.1
‑
9%、5.2
‑
9%、5.3
‑
9%、5.4
‑
9%、5.5
‑
9%、5.6
‑
9%、5.7
‑
9%、5.8
‑
9%、5.9
‑
9%、6
‑
9%、6.1
‑
9%、6.2
‑
9%、6.3
‑
9%、6.4
‑
9%、6.5
‑
9%、6.6
‑
9%、6.7
‑
9%、6.8
‑
9%、6.9
‑
9%、7
‑
9%、7.1
‑
9%、7.2
‑
9%、7.3
‑
9%、7.4
‑
9%、7.5
‑
9%、7.6
‑
9%、7.7
‑
9%、7.8
‑
9%、7.9
‑
9%、8
‑
9%、8.1
‑
9%、8.2
‑
9%、8.3
‑
9%、8.4
‑
9%、8.5
‑
9%、8.6
‑
9%、8.7
‑
9%、8.8
‑
9%、8.9
‑
9%、0
‑
9.5%、0.1
‑
9.5%、0.2
‑
9.5%、0.3
‑
9.5%、0.4
‑
9.5%、0.5
‑
9.5%、0.6
‑
9.5%、0.7
‑
9.5%、0.8
‑
9.5%、0.9
‑
9.5%、1
‑
9.5%、1.1
‑
9.5%、1.2
‑
9.5%、1.3
‑
9.5%、1.4
‑
9.5%、1.5
‑
9.5%、1.6
‑
9.5%、1.7
‑
9.5%、1.8
‑
9.5%、1.9
‑
9.5%、2
‑
9.5%、2.1
‑
9.5%、2.2
‑
9.5%、2.3
‑
9.5%、2.4
‑
9.5%、2.5
‑
9.5%、2.6
‑
9.5%、2.7
‑
9.5%、2.8
‑
9.5%、2.9
‑
9.5%、3
‑
9.5%、3.1
‑
9.5%、3.2
‑
9.5%、3.3
‑
9.5%、3.4
‑
9.5%、3.5
‑
9.5%、3.6
‑
9.5%、3.7
‑
9.5%、3.8
‑
9.5%、3.9
‑
9.5%、4
‑
9.5%、4.1
‑
9.5%、4.2
‑
9.5%、4.3
‑
9.5%、4.4
‑
9.5%、4.5
‑
9.5%、4.6
‑
9.5%、4.7
‑
9.5%、4.8
‑
9.5%、4.9
‑
9.5%、5
‑
9.5%、5.1
‑
9.5%、5.2
‑
9.5%、5.3
‑
9.5%、5.4
‑
9.5%、5.5
‑
9.5%、5.6
‑
9.5%、5.7
‑
9.5%、5.8
‑
9.5%、5.9
‑
9.5%、6
‑
9.5%、6.1
‑
9.5%、6.2
‑
9.5%、6.3
‑
9.5%、6.4
‑
9.5%、6.5
‑
9.5%、6.6
‑
9.5%、6.7
‑
9.5%、6.8
‑
9.5%、6.9
‑
9.5%、7
‑
9.5%、7.1
‑
9.5%、7.2
‑
9.5%、7.3
‑
9.5%、7.4
‑
9.5%、7.5
‑
9.5%、7.6
‑
9.5%、7.7
‑
9.5%、7.8
‑
9.5%、7.9
‑
9.5%、8
‑
9.5%、8.1
‑
9.5%、8.2
‑
9.5%、8.3
‑
9.5%、8.4
‑
9.5%、8.5
‑
9.5%、8.6
‑
9.5%、8.7
‑
9.5%、8.8
‑
9.5%、8.9
‑
9.5%、9
‑
9.5%、9.1
‑
9.5%、9.2
‑
9.5%、9.3
‑
9.5%、9.4
‑
9.5%、0
‑
10%、0.1
‑
10%、0.2
‑
10%、0.3
‑
10%、0.4
‑
10%、0.5
‑
10%、0.6
‑
10%、0.7
‑
10%、0.8
‑
10%、0.9
‑
10%、1
‑
10%、1.1
‑
10%、1.2
‑
10%、1.3
‑
10%、1.4
‑
10%、1.5
‑
10%、1.6
‑
10%、1.7
‑
10%、1.8
‑
10%、1.9
‑
10%、2
‑
10%、2.1
‑
10%、2.2
‑
10%、2.3
‑
10%、2.4
‑
10%、2.5
‑
10%、2.6
‑
10%、2.7
‑
10%、2.8
‑
10%、2.9
‑
10%、3
‑
10%、3.1
‑
10%、3.2
‑
10%、3.3
‑
10%、3.4
‑
10%、3.5
‑
10%、3.6
‑
10%、3.7
‑
10%、3.8
‑
10%、3.9
‑
10%、4
‑
10%、4.1
‑
10%、4.2
‑
10%、4.3
‑
10%、4.4
‑
10%、4.5
‑
10%、4.6
‑
10%、4.7
‑
10%、4.8
‑
10%、4.9
‑
10%、5
‑
10%、5.1
‑
10%、5.2
‑
10%、5.3
‑
10%、5.4
‑
10%、5.5
‑
10%、5.6
‑
10%、5.7
‑
10%、5.8
‑
10%、5.9
‑
10%、6
‑
10%、6.1
‑
10%、6.2
‑
10%、6.3
‑
10%、6.4
‑
10%、6.5
‑
10%、6.6
‑
10%、6.7
‑
10%、6.8
‑
10%、6.9
‑
10%、7
‑
10%、7.1
‑
10%、7.2
‑
10%、7.3
‑
10%、7.4
‑
10%、7.5
‑
10%、7.6
‑
10%、7.7
‑
10%、7.8
‑
10%、7.9
‑
10%、8
‑
10%、8.1
‑
10%、8.2
‑
10%、8.3
‑
10%、8.4
‑
10%、8.5
‑
10%、8.6
‑
10%、8.7
‑
10%、8.8
‑
10%、8.9
‑
10%、9
‑
10%、9.1
‑
10%、9.2
‑
10%、9.3
‑
10%、9.4
‑
10%、9.5
‑
10%、9.6
‑
10%、9.7
‑
10%、9.8
‑
10%或9.9
‑
10%w/v。
[0866]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
10%w/v的蔗糖。
[0867]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
9%w/v的蔗糖。
[0868]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
8%w/v的蔗糖。
[0869]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
7%w/v的蔗糖。
[0870]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
6%w/v的蔗糖。
[0871]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
5%w/v的蔗糖。
[0872]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
4%w/v的蔗糖。
[0873]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
3%w/v的蔗糖。
[0874]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
2%w/v的蔗糖。
[0875]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
1%w/v的蔗糖。
[0876]
在某些实施方案中,制剂可包含1%w/v的蔗糖。
[0877]
在某些实施方案中,制剂可包含2%w/v的蔗糖。
[0878]
在某些实施方案中,制剂可包含3%w/v的蔗糖。
[0879]
在某些实施方案中,制剂可包含4%w/v的蔗糖。
[0880]
在某些实施方案中,制剂可包含5%w/v的蔗糖。
[0881]
在某些实施方案中,制剂可包含6%w/v的蔗糖。
[0882]
在某些实施方案中,制剂可包含7%w/v的蔗糖。
[0883]
在某些实施方案中,制剂可包含8%w/v的蔗糖。
[0884]
在某些实施方案中,制剂可包含9%w/v的蔗糖。
[0885]
在某些实施方案中,制剂可包含10%w/v的蔗糖。
[0886]
海藻糖
[0887]
在某些实施方案中,制剂可包含至少一种糖,其为双糖,例如但不限于海藻糖。
[0888]
在某些实施方案中,制剂可包含以下量的海藻糖:0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%、5%、5.1%、5.2%、5.3%、5.4%、5.5%、5.6%、5.7%、5.8%、5.9%、6%、6.1%、6.2%、6.3%、6.4%、6.5%、6.6%、6.7%、6.8%、6.9%、7%、7.1%、7.2%、7.3%、7.4%、7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%或10%w/v。
[0889]
在某些实施方案中,制剂可包含在以下范围内的海藻糖:0
‑
1%、0.1
‑
1%、0.2
‑
1%、0.3
‑
1%、0.4
‑
1%、0.5
‑
1%、0.6
‑
1%、0.7
‑
1%、0.8
‑
1%、0.9
‑
1%、0
‑
1.5%、0.1
‑
1.5%、0.2
‑
1.5%、0.3
‑
1.5%、0.4
‑
1.5%、0.5
‑
1.5%、0.6
‑
1.5%、0.7
‑
1.5%、0.8
‑
1.5%、0.9
‑
1.5%、1
‑
1.5%、1.1
‑
1.5%、1.2
‑
1.5%、1.3
‑
1.5%、1.4
‑
1.5%、0
‑
2%、0.1
‑
2%、0.2
‑
2%、0.3
‑
2%、0.4
‑
2%、0.5
‑
2%、0.6
‑
2%、0.7
‑
2%、0.8
‑
2%、0.9
‑
2%、1
‑
2%、1.1
‑
2%、1.2
‑
2%、1.3
‑
2%、1.4
‑
2%、1.5
‑
2%、1.6
‑
2%、1.7
‑
2%、1.8
‑
2%、1.9
‑
2%、0
‑
2.5%、0.1
‑
2.5%、0.2
‑
2.5%、0.3
‑
2.5%、0.4
‑
2.5%、0.5
‑
2.5%、0.6
‑
2.5%、0.7
‑
2.5%、0.8
‑
2.5%、0.9
‑
2.5%、1
‑
2.5%、1.1
‑
2.5%、1.2
‑
2.5%、1.3
‑
2.5%、1.4
‑
2.5%、1.5
‑
2.5%、1.6
‑
2.5%、1.7
‑
2.5%、1.8
‑
2.5%、1.9
‑
2.5%、2
‑
2.5%、2.1
‑
2.5%、2.2
‑
2.5%、2.3
‑
2.5%、2.4
‑
2.5%、0
‑
3%、0.1
‑
3%、0.2
‑
3%、0.3
‑
3%、0.4
‑
3%、0.5
‑
3%、0.6
‑
3%、0.7
‑
3%、0.8
‑
3%、0.9
‑
3%、1
‑
3%、1.1
‑
3%、1.2
‑
3%、1.3
‑
3%、1.4
‑
3%、1.5
‑
3%、1.6
‑
3%、1.7
‑
3%、1.8
‑
3%、1.9
‑
3%、2
‑
3%、2.1
‑
3%、2.2
‑
3%、2.3
‑
3%、2.4
‑
3%、2.5
‑
3%、2.6
‑
3%、2.7
‑
3%、2.8
‑
3%、2.9
‑
3%、0
‑
3.5%、0.1
‑
3.5%、0.2
‑
3.5%、0.3
‑
3.5%、0.4
‑
3.5%、0.5
‑
3.5%、0.6
‑
3.5%、0.7
‑
3.5%、0.8
‑
3.5%、0.9
‑
3.5%、1
‑
3.5%、1.1
‑
3.5%、1.2
‑
3.5%、1.3
‑
3.5%、1.4
‑
3.5%、1.5
‑
3.5%、1.6
‑
3.5%、1.7
‑
3.5%、1.8
‑
3.5%、1.9
‑
3.5%、2
‑
3.5%、2.1
‑
3.5%、2.2
‑
3.5%、2.3
‑
3.5%、2.4
‑
3.5%、2.5
‑
3.5%、2.6
‑
3.5%、2.7
‑
3.5%、2.8
‑
3.5%、2.9
‑
3.5%、3
‑
3.5%、3.1
‑
3.5%、3.2
‑
3.5%、3.3
‑
3.5%、3.4
‑
3.5%、0
‑
4%、0.1
‑
4%、0.2
‑
4%、0.3
‑
4%、0.4
‑
4%、0.5
‑
4%、0.6
‑
4%、0.7
‑
4%、0.8
‑
4%、0.9
‑
4%、1
‑
4%、1.1
‑
4%、1.2
‑
4%、1.3
‑
4%、1.4
‑
4%、1.5
‑
4%、1.6
‑
4%、1.7
‑
4%、1.8
‑
4%、1.9
‑
4%、2
‑
4%、2.1
‑
4%、2.2
‑
4%、2.3
‑
4%、2.4
‑
4%、2.5
‑
4%、2.6
‑
4%、2.7
‑
4%、2.8
‑
4%、2.9
‑
4%、3
‑
4%、3.1
‑
4%、3.2
‑
4%、3.3
‑
4%、3.4
‑
4%、3.5
‑
4%、3.6
‑
4%、3.7
‑
4%、3.8
‑
4%、3.9
‑
4%、0
‑
4.5%、0.1
‑
4.5%、0.2
‑
4.5%、0.3
‑
4.5%、0.4
‑
4.5%、0.5
‑
4.5%、0.6
‑
4.5%、0.7
‑
4.5%、0.8
‑
4.5%、0.9
‑
4.5%、1
‑
4.5%、1.1
‑
4.5%、1.2
‑
4.5%、1.3
‑
4.5%、1.4
‑
4.5%、1.5
‑
4.5%、1.6
‑
4.5%、1.7
‑
4.5%、1.8
‑
4.5%、1.9
‑
4.5%、2
‑
4.5%、2.1
‑
4.5%、2.2
‑
4.5%、2.3
‑
4.5%、2.4
‑
4.5%、2.5
‑
4.5%、2.6
‑
4.5%、2.7
‑
4.5%、2.8
‑
4.5%、2.9
‑
4.5%、3
‑
4.5%、3.1
‑
4.5%、3.2
‑
4.5%、3.3
‑
4.5%、3.4
‑
4.5%、3.5
‑
4.5%、3.6
‑
4.5%、3.7
‑
4.5%、3.8
‑
4.5%、3.9
‑
4.5%、4
‑
4.5%、4.1
‑
4.5%、4.2
‑
4.5%、4.3
‑
4.5%、4.4
‑
4.5%、0
‑
5%、0.1
‑
5%、0.2
‑
5%、0.3
‑
5%、0.4
‑
5%、0.5
‑
5%、0.6
‑
5%、0.7
‑
5%、0.8
‑
5%、0.9
‑
5%、1
‑
5%、1.1
‑
5%、1.2
‑
5%、1.3
‑
5%、1.4
‑
5%、1.5
‑
5%、1.6
‑
5%、1.7
‑
5%、1.8
‑
5%、1.9
‑
5%、2
‑
5%、2.1
‑
5%、2.2
‑
5%、2.3
‑
5%、2.4
‑
5%、2.5
‑
5%、2.6
‑
5%、2.7
‑
5%、2.8
‑
5%、2.9
‑
5%、3
‑
5%、3.1
‑
5%、3.2
‑
5%、3.3
‑
5%、3.4
‑
5%、3.5
‑
5%、3.6
‑
5%、3.7
‑
5%、3.8
‑
5%、3.9
‑
5%、4
‑
5%、4.1
‑
5%、4.2
‑
5%、4.3
‑
5%、4.4
‑
5%、4.5
‑
5%、4.6
‑
5%、4.7
‑
5%、4.8
‑
5%、4.9
‑
5%、0
‑
5.5%、0.1
‑
5.5%、0.2
‑
5.5%、0.3
‑
5.5%、0.4
‑
5.5%、0.5
‑
5.5%、0.6
‑
5.5%、0.7
‑
5.5%、0.8
‑
5.5%、0.9
‑
5.5%、1
‑
5.5%、1.1
‑
5.5%、1.2
‑
5.5%、1.3
‑
5.5%、1.4
‑
5.5%、1.5
‑
5.5%、1.6
‑
5.5%、1.7
‑
5.5%、1.8
‑
5.5%、1.9
‑
5.5%、2
‑
5.5%、2.1
‑
5.5%、2.2
‑
5.5%、2.3
‑
5.5%、2.4
‑
5.5%、2.5
‑
5.5%、2.6
‑
5.5%、2.7
‑
5.5%、2.8
‑
5.5%、2.9
‑
5.5%、3
‑
5.5%、3.1
‑
5.5%、3.2
‑
5.5%、3.3
‑
5.5%、3.4
‑
5.5%、3.5
‑
5.5%、3.6
‑
5.5%、3.7
‑
5.5%、3.8
‑
5.5%、3.9
‑
5.5%、4
‑
5.5%、4.1
‑
5.5%、4.2
‑
5.5%、4.3
‑
5.5%、4.4
‑
5.5%、4.5
‑
5.5%、4.6
‑
5.5%、4.7
‑
5.5%、4.8
‑
5.5%、4.9
‑
5.5%、5
‑
5.5%、5.1
‑
5.5%、5.2
‑
5.5%、5.3
‑
5.5%、5.4
‑
5.5%、0
‑
6%、0.1
‑
6%、0.2
‑
6%、0.3
‑
6%、0.4
‑
6%、0.5
‑
6%、0.6
‑
6%、0.7
‑
6%、0.8
‑
6%、0.9
‑
6%、1
‑
6%、1.1
‑
6%、1.2
‑
6%、1.3
‑
6%、1.4
‑
6%、1.5
‑
6%、1.6
‑
6%、1.7
‑
6%、1.8
‑
6%、1.9
‑
6%、2
‑
6%、2.1
‑
6%、2.2
‑
6%、2.3
‑
6%、2.4
‑
6%、2.5
‑
6%、2.6
‑
6%、2.7
‑
6%、2.8
‑
6%、2.9
‑
6%、3
‑
6%、3.1
‑
6%、3.2
‑
6%、3.3
‑
6%、3.4
‑
6%、3.5
‑
6%、3.6
‑
6%、3.7
‑
6%、3.8
‑
6%、3.9
‑
6%、4
‑
6%、4.1
‑
6%、4.2
‑
6%、4.3
‑
6%、4.4
‑
6%、4.5
‑
6%、4.6
‑
6%、4.7
‑
6%、4.8
‑
6%、4.9
‑
6%、5
‑
6%、5.1
‑
6%、5.2
‑
6%、5.3
‑
6%、5.4
‑
6%、5.5
‑
6%、5.6
‑
6%、5.7
‑
6%、5.8
‑
6%、5.9
‑
6%、0
‑
6.5%、0.1
‑
6.5%、0.2
‑
6.5%、0.3
‑
6.5%、0.4
‑
6.5%、0.5
‑
6.5%、0.6
‑
6.5%、0.7
‑
6.5%、0.8
‑
6.5%、0.9
‑
6.5%、1
‑
6.5%、1.1
‑
6.5%、1.2
‑
6.5%、1.3
‑
6.5%、1.4
‑
6.5%、1.5
‑
6.5%、1.6
‑
6.5%、1.7
‑
6.5%、1.8
‑
6.5%、1.9
‑
6.5%、2
‑
6.5%、2.1
‑
6.5%、2.2
‑
6.5%、2.3
‑
6.5%、2.4
‑
6.5%、2.5
‑
6.5%、2.6
‑
6.5%、2.7
‑
6.5%、2.8
‑
6.5%、2.9
‑
6.5%、3
‑
6.5%、3.1
‑
6.5%、3.2
‑
6.5%、3.3
‑
6.5%、3.4
‑
6.5%、3.5
‑
6.5%、3.6
‑
6.5%、3.7
‑
6.5%、3.8
‑
6.5%、3.9
‑
6.5%、4
‑
6.5%、4.1
‑
6.5%、4.2
‑
6.5%、4.3
‑
6.5%、4.4
‑
6.5%、4.5
‑
6.5%、4.6
‑
6.5%、4.7
‑
6.5%、4.8
‑
6.5%、4.9
‑
6.5%、5
‑
6.5%、5.1
‑
6.5%、5.2
‑
6.5%、5.3
‑
6.5%、5.4
‑
6.5%、5.5
‑
6.5%、5.6
‑
6.5%、5.7
‑
6.5%、5.8
‑
6.5%、5.9
‑
6.5%、6
‑
6.5%、6.1
‑
6.5%、6.2
‑
6.5%、6.3
‑
6.5%、6.4
‑
6.5%、0
‑
7%、0.1
‑
7%、0.2
‑
7%、0.3
‑
7%、0.4
‑
7%、0.5
‑
7%、0.6
‑
7%、0.7
‑
7%、0.8
‑
7%、0.9
‑
7%、1
‑
7%、1.1
‑
7%、1.2
‑
7%、1.3
‑
7%、1.4
‑
7%、1.5
‑
7%、1.6
‑
7%、1.7
‑
7%、1.8
‑
7%、1.9
‑
7%、2
‑
7%、2.1
‑
7%、2.2
‑
7%、2.3
‑
7%、2.4
‑
7%、2.5
‑
7%、2.6
‑
7%、2.7
‑
7%、2.8
‑
7%、2.9
‑
7%、3
‑
7%、3.1
‑
7%、3.2
‑
7%、3.3
‑
7%、3.4
‑
7%、3.5
‑
7%、3.6
‑
7%、3.7
‑
7%、3.8
‑
7%、3.9
‑
7%、4
‑
7%、4.1
‑
7%、4.2
‑
7%、4.3
‑
7%、4.4
‑
7%、4.5
‑
7%、4.6
‑
7%、4.7
‑
7%、4.8
‑
7%、4.9
‑
7%、5
‑
7%、5.1
‑
7%、5.2
‑
7%、5.3
‑
7%、5.4
‑
7%、5.5
‑
7%、5.6
‑
7%、5.7
‑
7%、5.8
‑
7%、5.9
‑
7%、6
‑
7%、6.1
‑
7%、6.2
‑
7%、6.3
‑
7%、6.4
‑
7%、6.5
‑
7%、6.6
‑
7%、6.7
‑
7%、6.8
‑
7%、6.9
‑
7%、0
‑
7.5%、0.1
‑
7.5%、0.2
‑
7.5%、0.3
‑
7.5%、0.4
‑
7.5%、0.5
‑
7.5%、0.6
‑
7.5%、0.7
‑
7.5%、0.8
‑
7.5%、0.9
‑
7.5%、1
‑
7.5%、1.1
‑
7.5%、1.2
‑
7.5%、1.3
‑
7.5%、1.4
‑
7.5%、1.5
‑
7.5%、1.6
‑
7.5%、1.7
‑
7.5%、1.8
‑
7.5%、1.9
‑
7.5%、2
‑
7.5%、2.1
‑
7.5%、2.2
‑
7.5%、2.3
‑
7.5%、2.4
‑
7.5%、2.5
‑
7.5%、2.6
‑
7.5%、2.7
‑
7.5%、2.8
‑
7.5%、2.9
‑
7.5%、3
‑
7.5%、3.1
‑
7.5%、3.2
‑
7.5%、3.3
‑
7.5%、3.4
‑
7.5%、3.5
‑
7.5%、3.6
‑
7.5%、3.7
‑
7.5%、3.8
‑
7.5%、3.9
‑
7.5%、4
‑
7.5%、4.1
‑
7.5%、4.2
‑
7.5%、4.3
‑
7.5%、4.4
‑
7.5%、4.5
‑
7.5%、4.6
‑
7.5%、4.7
‑
7.5%、4.8
‑
7.5%、4.9
‑
7.5%、5
‑
7.5%、5.1
‑
7.5%、5.2
‑
7.5%、5.3
‑
7.5%、5.4
‑
7.5%、5.5
‑
7.5%、5.6
‑
7.5%、5.7
‑
7.5%、5.8
‑
7.5%、5.9
‑
7.5%、6
‑
7.5%、6.1
‑
7.5%、6.2
‑
7.5%、6.3
‑
7.5%、6.4
‑
7.5%、6.5
‑
7.5%、6.6
‑
7.5%、6.7
‑
7.5%、6.8
‑
7.5%、6.9
‑
7.5%、7
‑
7.5%、7.1
‑
7.5%、7.2
‑
7.5%、7.3
‑
7.5%、7.4
‑
7.5%、0
‑
8%、0.1
‑
8%、0.2
‑
8%、0.3
‑
8%、0.4
‑
8%、0.5
‑
8%、0.6
‑
8%、0.7
‑
8%、0.8
‑
8%、0.9
‑
8%、1
‑
8%、1.1
‑
8%、1.2
‑
8%、1.3
‑
8%、1.4
‑
8%、1.5
‑
8%、1.6
‑
8%、1.7
‑
8%、1.8
‑
8%、1.9
‑
8%、2
‑
8%、2.1
‑
8%、2.2
‑
8%、2.3
‑
8%、2.4
‑
8%、2.5
‑
8%、2.6
‑
8%、2.7
‑
8%、2.8
‑
8%、2.9
‑
8%、3
‑
8%、3.1
‑
8%、3.2
‑
8%、3.3
‑
8%、3.4
‑
8%、3.5
‑
8%、3.6
‑
8%、3.7
‑
8%、3.8
‑
8%、3.9
‑
8%、4
‑
8%、4.1
‑
8%、4.2
‑
8%、4.3
‑
8%、4.4
‑
8%、4.5
‑
8%、4.6
‑
8%、4.7
‑
8%、4.8
‑
8%、4.9
‑
8%、5
‑
8%、5.1
‑
8%、5.2
‑
8%、5.3
‑
8%、5.4
‑
8%、5.5
‑
8%、5.6
‑
8%、5.7
‑
8%、5.8
‑
8%、5.9
‑
8%、6
‑
8%、6.1
‑
8%、6.2
‑
8%、6.3
‑
8%、6.4
‑
8%、6.5
‑
8%、6.6
‑
8%、6.7
‑
8%、6.8
‑
8%、6.9
‑
8%、7
‑
8%、7.1
‑
8%、7.2
‑
8%、7.3
‑
8%、7.4
‑
8%、7.5
‑
8%、7.6
‑
8%、7.7
‑
8%、7.8
‑
8%、7.9
‑
8%、0
‑
8.5%、0.1
‑
8.5%、0.2
‑
8.5%、0.3
‑
8.5%、0.4
‑
8.5%、0.5
‑
8.5%、0.6
‑
8.5%、0.7
‑
8.5%、0.8
‑
8.5%、0.9
‑
8.5%、1
‑
8.5%、1.1
‑
8.5%、1.2
‑
8.5%、1.3
‑
8.5%、1.4
‑
8.5%、1.5
‑
8.5%、1.6
‑
8.5%、1.7
‑
8.5%、1.8
‑
8.5%、1.9
‑
8.5%、2
‑
8.5%、2.1
‑
8.5%、2.2
‑
8.5%、2.3
‑
8.5%、2.4
‑
8.5%、2.5
‑
8.5%、2.6
‑
8.5%、2.7
‑
8.5%、
2.8
‑
8.5%、2.9
‑
8.5%、3
‑
8.5%、3.1
‑
8.5%、3.2
‑
8.5%、3.3
‑
8.5%、3.4
‑
8.5%、3.5
‑
8.5%、3.6
‑
8.5%、3.7
‑
8.5%、3.8
‑
8.5%、3.9
‑
8.5%、4
‑
8.5%、4.1
‑
8.5%、4.2
‑
8.5%、4.3
‑
8.5%、4.4
‑
8.5%、4.5
‑
8.5%、4.6
‑
8.5%、4.7
‑
8.5%、4.8
‑
8.5%、4.9
‑
8.5%、5
‑
8.5%、5.1
‑
8.5%、5.2
‑
8.5%、5.3
‑
8.5%、5.4
‑
8.5%、5.5
‑
8.5%、5.6
‑
8.5%、5.7
‑
8.5%、5.8
‑
8.5%、5.9
‑
8.5%、6
‑
8.5%、6.1
‑
8.5%、6.2
‑
8.5%、6.3
‑
8.5%、6.4
‑
8.5%、6.5
‑
8.5%、6.6
‑
8.5%、6.7
‑
8.5%、6.8
‑
8.5%、6.9
‑
8.5%、7
‑
8.5%、7.1
‑
8.5%、7.2
‑
8.5%、7.3
‑
8.5%、7.4
‑
8.5%、7.5
‑
8.5%、7.6
‑
8.5%、7.7
‑
8.5%、7.8
‑
8.5%、7.9
‑
8.5%、8
‑
8.5%、8.1
‑
8.5%、8.2
‑
8.5%、8.3
‑
8.5%、8.4
‑
8.5%、0
‑
9%、0.1
‑
9%、0.2
‑
9%、0.3
‑
9%、0.4
‑
9%、0.5
‑
9%、0.6
‑
9%、0.7
‑
9%、0.8
‑
9%、0.9
‑
9%、1
‑
9%、1.1
‑
9%、1.2
‑
9%、1.3
‑
9%、1.4
‑
9%、1.5
‑
9%、1.6
‑
9%、1.7
‑
9%、1.8
‑
9%、1.9
‑
9%、2
‑
9%、2.1
‑
9%、2.2
‑
9%、2.3
‑
9%、2.4
‑
9%、2.5
‑
9%、2.6
‑
9%、2.7
‑
9%、2.8
‑
9%、2.9
‑
9%、3
‑
9%、3.1
‑
9%、3.2
‑
9%、3.3
‑
9%、3.4
‑
9%、3.5
‑
9%、3.6
‑
9%、3.7
‑
9%、3.8
‑
9%、3.9
‑
9%、4
‑
9%、4.1
‑
9%、4.2
‑
9%、4.3
‑
9%、4.4
‑
9%、4.5
‑
9%、4.6
‑
9%、4.7
‑
9%、4.8
‑
9%、4.9
‑
9%、5
‑
9%、5.1
‑
9%、5.2
‑
9%、5.3
‑
9%、5.4
‑
9%、5.5
‑
9%、5.6
‑
9%、5.7
‑
9%、5.8
‑
9%、5.9
‑
9%、6
‑
9%、6.1
‑
9%、6.2
‑
9%、6.3
‑
9%、6.4
‑
9%、6.5
‑
9%、6.6
‑
9%、6.7
‑
9%、6.8
‑
9%、6.9
‑
9%、7
‑
9%、7.1
‑
9%、7.2
‑
9%、7.3
‑
9%、7.4
‑
9%、7.5
‑
9%、7.6
‑
9%、7.7
‑
9%、7.8
‑
9%、7.9
‑
9%、8
‑
9%、8.1
‑
9%、8.2
‑
9%、8.3
‑
9%、8.4
‑
9%、8.5
‑
9%、8.6
‑
9%、8.7
‑
9%、8.8
‑
9%、8.9
‑
9%、0
‑
9.5%、0.1
‑
9.5%、0.2
‑
9.5%、0.3
‑
9.5%、0.4
‑
9.5%、0.5
‑
9.5%、0.6
‑
9.5%、0.7
‑
9.5%、0.8
‑
9.5%、0.9
‑
9.5%、1
‑
9.5%、1.1
‑
9.5%、1.2
‑
9.5%、1.3
‑
9.5%、1.4
‑
9.5%、1.5
‑
9.5%、1.6
‑
9.5%、1.7
‑
9.5%、1.8
‑
9.5%、1.9
‑
9.5%、2
‑
9.5%、2.1
‑
9.5%、2.2
‑
9.5%、2.3
‑
9.5%、2.4
‑
9.5%、2.5
‑
9.5%、2.6
‑
9.5%、2.7
‑
9.5%、2.8
‑
9.5%、2.9
‑
9.5%、3
‑
9.5%、3.1
‑
9.5%、3.2
‑
9.5%、3.3
‑
9.5%、3.4
‑
9.5%、3.5
‑
9.5%、3.6
‑
9.5%、3.7
‑
9.5%、3.8
‑
9.5%、3.9
‑
9.5%、4
‑
9.5%、4.1
‑
9.5%、4.2
‑
9.5%、4.3
‑
9.5%、4.4
‑
9.5%、4.5
‑
9.5%、4.6
‑
9.5%、4.7
‑
9.5%、4.8
‑
9.5%、4.9
‑
9.5%、5
‑
9.5%、5.1
‑
9.5%、5.2
‑
9.5%、5.3
‑
9.5%、5.4
‑
9.5%、5.5
‑
9.5%、5.6
‑
9.5%、5.7
‑
9.5%、5.8
‑
9.5%、5.9
‑
9.5%、6
‑
9.5%、6.1
‑
9.5%、6.2
‑
9.5%、6.3
‑
9.5%、6.4
‑
9.5%、6.5
‑
9.5%、6.6
‑
9.5%、6.7
‑
9.5%、6.8
‑
9.5%、6.9
‑
9.5%、7
‑
9.5%、7.1
‑
9.5%、7.2
‑
9.5%、7.3
‑
9.5%、7.4
‑
9.5%、7.5
‑
9.5%、7.6
‑
9.5%、7.7
‑
9.5%、7.8
‑
9.5%、7.9
‑
9.5%、8
‑
9.5%、8.1
‑
9.5%、8.2
‑
9.5%、8.3
‑
9.5%、8.4
‑
9.5%、8.5
‑
9.5%、8.6
‑
9.5%、8.7
‑
9.5%、8.8
‑
9.5%、8.9
‑
9.5%、9
‑
9.5%、9.1
‑
9.5%、9.2
‑
9.5%、9.3
‑
9.5%、9.4
‑
9.5%、0
‑
10%、0.1
‑
10%、0.2
‑
10%、0.3
‑
10%、0.4
‑
10%、0.5
‑
10%、0.6
‑
10%、0.7
‑
10%、0.8
‑
10%、0.9
‑
10%、1
‑
10%、1.1
‑
10%、1.2
‑
10%、1.3
‑
10%、1.4
‑
10%、1.5
‑
10%、1.6
‑
10%、1.7
‑
10%、1.8
‑
10%、1.9
‑
10%、2
‑
10%、2.1
‑
10%、2.2
‑
10%、2.3
‑
10%、2.4
‑
10%、2.5
‑
10%、2.6
‑
10%、2.7
‑
10%、2.8
‑
10%、2.9
‑
10%、3
‑
10%、3.1
‑
10%、3.2
‑
10%、3.3
‑
10%、3.4
‑
10%、3.5
‑
10%、3.6
‑
10%、3.7
‑
10%、3.8
‑
10%、3.9
‑
10%、4
‑
10%、4.1
‑
10%、4.2
‑
10%、4.3
‑
10%、4.4
‑
10%、4.5
‑
10%、4.6
‑
10%、4.7
‑
10%、4.8
‑
10%、4.9
‑
10%、5
‑
10%、5.1
‑
10%、5.2
‑
10%、5.3
‑
10%、5.4
‑
10%、5.5
‑
10%、5.6
‑
10%、5.7
‑
10%、5.8
‑
10%、5.9
‑
10%、6
‑
10%、6.1
‑
10%、6.2
‑
10%、6.3
‑
10%、6.4
‑
10%、6.5
‑
10%、6.6
‑
10%、6.7
‑
10%、6.8
‑
10%、6.9
‑
10%、7
‑
10%、7.1
‑
10%、7.2
‑
10%、7.3
‑
10%、7.4
‑
10%、7.5
‑
10%、7.6
‑
10%、7.7
‑
10%、7.8
‑
10%、7.9
‑
10%、
8
‑
10%、8.1
‑
10%、8.2
‑
10%、8.3
‑
10%、8.4
‑
10%、8.5
‑
10%、8.6
‑
10%、8.7
‑
10%、8.8
‑
10%、8.9
‑
10%、9
‑
10%、9.1
‑
10%、9.2
‑
10%、9.3
‑
10%、9.4
‑
10%、9.5
‑
10%、9.6
‑
10%、9.7
‑
10%、9.8
‑
10%或9.9
‑
10%w/v。
[0890]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
10%w/v的海藻糖。
[0891]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
9%w/v的海藻糖。
[0892]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
8%w/v的海藻糖。
[0893]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
7%w/v的海藻糖。
[0894]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
6%w/v的海藻糖。
[0895]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
5%w/v的海藻糖。
[0896]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
4%w/v的海藻糖。
[0897]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
3%w/v的海藻糖。
[0898]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
2%w/v的海藻糖。
[0899]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
1%w/v的海藻糖。
[0900]
在某些实施方案中,制剂可包含1%w/v的海藻糖。
[0901]
在某些实施方案中,制剂可包含2%w/v的海藻糖。
[0902]
在某些实施方案中,制剂可包含3%w/v的海藻糖。
[0903]
在某些实施方案中,制剂可包含4%w/v的海藻糖。
[0904]
在某些实施方案中,制剂可包含5%w/v的海藻糖。
[0905]
在某些实施方案中,制剂可包含6%w/v的海藻糖。
[0906]
在某些实施方案中,制剂可包含7%w/v的海藻糖。
[0907]
在某些实施方案中,制剂可包含8%w/v的海藻糖。
[0908]
在某些实施方案中,制剂可包含9%w/v的海藻糖。
[0909]
在某些实施方案中,制剂可包含10%w/v的海藻糖。
[0910]
山梨糖醇
[0911]
在某些实施方案中,制剂可包含至少一种糖替代物(例如糖醇),其为山梨糖醇。
[0912]
在某些实施方案中,制剂可包含以下量的山梨糖醇:0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%、5%、5.1%、5.2%、5.3%、5.4%、5.5%、5.6%、5.7%、5.8%、5.9%、6%、6.1%、6.2%、6.3%、6.4%、6.5%、6.6%、6.7%、6.8%、6.9%、7%、7.1%、7.2%、7.3%、7.4%、7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%或10%w/v。
[0913]
在某些实施方案中,制剂可包含在以下范围内的山梨糖醇:0
‑
1%、0.1
‑
1%、0.2
‑
1%、0.3
‑
1%、0.4
‑
1%、0.5
‑
1%、0.6
‑
1%、0.7
‑
1%、0.8
‑
1%、0.9
‑
1%、0
‑
1.5%、0.1
‑
1.5%、0.2
‑
1.5%、0.3
‑
1.5%、0.4
‑
1.5%、0.5
‑
1.5%、0.6
‑
1.5%、0.7
‑
1.5%、0.8
‑
1.5%、0.9
‑
1.5%、1
‑
1.5%、1.1
‑
1.5%、1.2
‑
1.5%、1.3
‑
1.5%、1.4
‑
1.5%、0
‑
2%、0.1
‑
2%、0.2
‑
2%、0.3
‑
2%、0.4
‑
2%、0.5
‑
2%、0.6
‑
2%、0.7
‑
2%、0.8
‑
2%、0.9
‑
2%、1
‑
2%、1.1
‑
2%、
1.2
‑
2%、1.3
‑
2%、1.4
‑
2%、1.5
‑
2%、1.6
‑
2%、1.7
‑
2%、1.8
‑
2%、1.9
‑
2%、0
‑
2.5%、0.1
‑
2.5%、0.2
‑
2.5%、0.3
‑
2.5%、0.4
‑
2.5%、0.5
‑
2.5%、0.6
‑
2.5%、0.7
‑
2.5%、0.8
‑
2.5%、0.9
‑
2.5%、1
‑
2.5%、1.1
‑
2.5%、1.2
‑
2.5%、1.3
‑
2.5%、1.4
‑
2.5%、1.5
‑
2.5%、1.6
‑
2.5%、1.7
‑
2.5%、1.8
‑
2.5%、1.9
‑
2.5%、2
‑
2.5%、2.1
‑
2.5%、2.2
‑
2.5%、2.3
‑
2.5%、2.4
‑
2.5%、0
‑
3%、0.1
‑
3%、0.2
‑
3%、0.3
‑
3%、0.4
‑
3%、0.5
‑
3%、0.6
‑
3%、0.7
‑
3%、0.8
‑
3%、0.9
‑
3%、1
‑
3%、1.1
‑
3%、1.2
‑
3%、1.3
‑
3%、1.4
‑
3%、1.5
‑
3%、1.6
‑
3%、1.7
‑
3%、1.8
‑
3%、1.9
‑
3%、2
‑
3%、2.1
‑
3%、2.2
‑
3%、2.3
‑
3%、2.4
‑
3%、2.5
‑
3%、2.6
‑
3%、2.7
‑
3%、2.8
‑
3%、2.9
‑
3%、0
‑
3.5%、0.1
‑
3.5%、0.2
‑
3.5%、0.3
‑
3.5%、0.4
‑
3.5%、0.5
‑
3.5%、0.6
‑
3.5%、0.7
‑
3.5%、0.8
‑
3.5%、0.9
‑
3.5%、1
‑
3.5%、1.1
‑
3.5%、1.2
‑
3.5%、1.3
‑
3.5%、1.4
‑
3.5%、1.5
‑
3.5%、1.6
‑
3.5%、1.7
‑
3.5%、1.8
‑
3.5%、1.9
‑
3.5%、2
‑
3.5%、2.1
‑
3.5%、2.2
‑
3.5%、2.3
‑
3.5%、2.4
‑
3.5%、2.5
‑
3.5%、2.6
‑
3.5%、2.7
‑
3.5%、2.8
‑
3.5%、2.9
‑
3.5%、3
‑
3.5%、3.1
‑
3.5%、3.2
‑
3.5%、3.3
‑
3.5%、3.4
‑
3.5%、0
‑
4%、0.1
‑
4%、0.2
‑
4%、0.3
‑
4%、0.4
‑
4%、0.5
‑
4%、0.6
‑
4%、0.7
‑
4%、0.8
‑
4%、0.9
‑
4%、1
‑
4%、1.1
‑
4%、1.2
‑
4%、1.3
‑
4%、1.4
‑
4%、1.5
‑
4%、1.6
‑
4%、1.7
‑
4%、1.8
‑
4%、1.9
‑
4%、2
‑
4%、2.1
‑
4%、2.2
‑
4%、2.3
‑
4%、2.4
‑
4%、2.5
‑
4%、2.6
‑
4%、2.7
‑
4%、2.8
‑
4%、2.9
‑
4%、3
‑
4%、3.1
‑
4%、3.2
‑
4%、3.3
‑
4%、3.4
‑
4%、3.5
‑
4%、3.6
‑
4%、3.7
‑
4%、3.8
‑
4%、3.9
‑
4%、0
‑
4.5%、0.1
‑
4.5%、0.2
‑
4.5%、0.3
‑
4.5%、0.4
‑
4.5%、0.5
‑
4.5%、0.6
‑
4.5%、0.7
‑
4.5%、0.8
‑
4.5%、0.9
‑
4.5%、1
‑
4.5%、1.1
‑
4.5%、1.2
‑
4.5%、1.3
‑
4.5%、1.4
‑
4.5%、1.5
‑
4.5%、1.6
‑
4.5%、1.7
‑
4.5%、1.8
‑
4.5%、1.9
‑
4.5%、2
‑
4.5%、2.1
‑
4.5%、2.2
‑
4.5%、2.3
‑
4.5%、2.4
‑
4.5%、2.5
‑
4.5%、2.6
‑
4.5%、2.7
‑
4.5%、2.8
‑
4.5%、2.9
‑
4.5%、3
‑
4.5%、3.1
‑
4.5%、3.2
‑
4.5%、3.3
‑
4.5%、3.4
‑
4.5%、3.5
‑
4.5%、3.6
‑
4.5%、3.7
‑
4.5%、3.8
‑
4.5%、3.9
‑
4.5%、4
‑
4.5%、4.1
‑
4.5%、4.2
‑
4.5%、4.3
‑
4.5%、4.4
‑
4.5%、0
‑
5%、0.1
‑
5%、0.2
‑
5%、0.3
‑
5%、0.4
‑
5%、0.5
‑
5%、0.6
‑
5%、0.7
‑
5%、0.8
‑
5%、0.9
‑
5%、1
‑
5%、1.1
‑
5%、1.2
‑
5%、1.3
‑
5%、1.4
‑
5%、1.5
‑
5%、1.6
‑
5%、1.7
‑
5%、1.8
‑
5%、1.9
‑
5%、2
‑
5%、2.1
‑
5%、2.2
‑
5%、2.3
‑
5%、2.4
‑
5%、2.5
‑
5%、2.6
‑
5%、2.7
‑
5%、2.8
‑
5%、2.9
‑
5%、3
‑
5%、3.1
‑
5%、3.2
‑
5%、3.3
‑
5%、3.4
‑
5%、3.5
‑
5%、3.6
‑
5%、3.7
‑
5%、3.8
‑
5%、3.9
‑
5%、4
‑
5%、4.1
‑
5%、4.2
‑
5%、4.3
‑
5%、4.4
‑
5%、4.5
‑
5%、4.6
‑
5%、4.7
‑
5%、4.8
‑
5%、4.9
‑
5%、0
‑
5.5%、0.1
‑
5.5%、0.2
‑
5.5%、0.3
‑
5.5%、0.4
‑
5.5%、0.5
‑
5.5%、0.6
‑
5.5%、0.7
‑
5.5%、0.8
‑
5.5%、0.9
‑
5.5%、1
‑
5.5%、1.1
‑
5.5%、1.2
‑
5.5%、1.3
‑
5.5%、1.4
‑
5.5%、1.5
‑
5.5%、1.6
‑
5.5%、1.7
‑
5.5%、1.8
‑
5.5%、1.9
‑
5.5%、2
‑
5.5%、2.1
‑
5.5%、2.2
‑
5.5%、2.3
‑
5.5%、2.4
‑
5.5%、2.5
‑
5.5%、2.6
‑
5.5%、2.7
‑
5.5%、2.8
‑
5.5%、2.9
‑
5.5%、3
‑
5.5%、3.1
‑
5.5%、3.2
‑
5.5%、3.3
‑
5.5%、3.4
‑
5.5%、3.5
‑
5.5%、3.6
‑
5.5%、3.7
‑
5.5%、3.8
‑
5.5%、3.9
‑
5.5%、4
‑
5.5%、4.1
‑
5.5%、4.2
‑
5.5%、4.3
‑
5.5%、4.4
‑
5.5%、4.5
‑
5.5%、4.6
‑
5.5%、4.7
‑
5.5%、4.8
‑
5.5%、4.9
‑
5.5%、5
‑
5.5%、5.1
‑
5.5%、5.2
‑
5.5%、5.3
‑
5.5%、5.4
‑
5.5%、0
‑
6%、0.1
‑
6%、0.2
‑
6%、0.3
‑
6%、0.4
‑
6%、0.5
‑
6%、0.6
‑
6%、0.7
‑
6%、0.8
‑
6%、0.9
‑
6%、1
‑
6%、1.1
‑
6%、1.2
‑
6%、1.3
‑
6%、1.4
‑
6%、1.5
‑
6%、1.6
‑
6%、1.7
‑
6%、1.8
‑
6%、1.9
‑
6%、2
‑
6%、2.1
‑
6%、2.2
‑
6%、2.3
‑
6%、2.4
‑
6%、2.5
‑
6%、2.6
‑
6%、2.7
‑
6%、2.8
‑
6%、2.9
‑
6%、3
‑
6%、3.1
‑
6%、3.2
‑
6%、3.3
‑
6%、3.4
‑
6%、3.5
‑
6%、3.6
‑
6%、3.7
‑
6%、3.8
‑
6%、3.9
‑
6%、4
‑
6%、4.1
‑
6%、
4.2
‑
6%、4.3
‑
6%、4.4
‑
6%、4.5
‑
6%、4.6
‑
6%、4.7
‑
6%、4.8
‑
6%、4.9
‑
6%、5
‑
6%、5.1
‑
6%、5.2
‑
6%、5.3
‑
6%、5.4
‑
6%、5.5
‑
6%、5.6
‑
6%、5.7
‑
6%、5.8
‑
6%、5.9
‑
6%、0
‑
6.5%、0.1
‑
6.5%、0.2
‑
6.5%、0.3
‑
6.5%、0.4
‑
6.5%、0.5
‑
6.5%、0.6
‑
6.5%、0.7
‑
6.5%、0.8
‑
6.5%、0.9
‑
6.5%、1
‑
6.5%、1.1
‑
6.5%、1.2
‑
6.5%、1.3
‑
6.5%、1.4
‑
6.5%、1.5
‑
6.5%、1.6
‑
6.5%、1.7
‑
6.5%、1.8
‑
6.5%、1.9
‑
6.5%、2
‑
6.5%、2.1
‑
6.5%、2.2
‑
6.5%、2.3
‑
6.5%、2.4
‑
6.5%、2.5
‑
6.5%、2.6
‑
6.5%、2.7
‑
6.5%、2.8
‑
6.5%、2.9
‑
6.5%、3
‑
6.5%、3.1
‑
6.5%、3.2
‑
6.5%、3.3
‑
6.5%、3.4
‑
6.5%、3.5
‑
6.5%、3.6
‑
6.5%、3.7
‑
6.5%、3.8
‑
6.5%、3.9
‑
6.5%、4
‑
6.5%、4.1
‑
6.5%、4.2
‑
6.5%、4.3
‑
6.5%、4.4
‑
6.5%、4.5
‑
6.5%、4.6
‑
6.5%、4.7
‑
6.5%、4.8
‑
6.5%、4.9
‑
6.5%、5
‑
6.5%、5.1
‑
6.5%、5.2
‑
6.5%、5.3
‑
6.5%、5.4
‑
6.5%、5.5
‑
6.5%、5.6
‑
6.5%、5.7
‑
6.5%、5.8
‑
6.5%、5.9
‑
6.5%、6
‑
6.5%、6.1
‑
6.5%、6.2
‑
6.5%、6.3
‑
6.5%、6.4
‑
6.5%、0
‑
7%、0.1
‑
7%、0.2
‑
7%、0.3
‑
7%、0.4
‑
7%、0.5
‑
7%、0.6
‑
7%、0.7
‑
7%、0.8
‑
7%、0.9
‑
7%、1
‑
7%、1.1
‑
7%、1.2
‑
7%、1.3
‑
7%、1.4
‑
7%、1.5
‑
7%、1.6
‑
7%、1.7
‑
7%、1.8
‑
7%、1.9
‑
7%、2
‑
7%、2.1
‑
7%、2.2
‑
7%、2.3
‑
7%、2.4
‑
7%、2.5
‑
7%、2.6
‑
7%、2.7
‑
7%、2.8
‑
7%、2.9
‑
7%、3
‑
7%、3.1
‑
7%、3.2
‑
7%、3.3
‑
7%、3.4
‑
7%、3.5
‑
7%、3.6
‑
7%、3.7
‑
7%、3.8
‑
7%、3.9
‑
7%、4
‑
7%、4.1
‑
7%、4.2
‑
7%、4.3
‑
7%、4.4
‑
7%、4.5
‑
7%、4.6
‑
7%、4.7
‑
7%、4.8
‑
7%、4.9
‑
7%、5
‑
7%、5.1
‑
7%、5.2
‑
7%、5.3
‑
7%、5.4
‑
7%、5.5
‑
7%、5.6
‑
7%、5.7
‑
7%、5.8
‑
7%、5.9
‑
7%、6
‑
7%、6.1
‑
7%、6.2
‑
7%、6.3
‑
7%、6.4
‑
7%、6.5
‑
7%、6.6
‑
7%、6.7
‑
7%、6.8
‑
7%、6.9
‑
7%、0
‑
7.5%、0.1
‑
7.5%、0.2
‑
7.5%、0.3
‑
7.5%、0.4
‑
7.5%、0.5
‑
7.5%、0.6
‑
7.5%、0.7
‑
7.5%、0.8
‑
7.5%、0.9
‑
7.5%、1
‑
7.5%、1.1
‑
7.5%、1.2
‑
7.5%、1.3
‑
7.5%、1.4
‑
7.5%、1.5
‑
7.5%、1.6
‑
7.5%、1.7
‑
7.5%、1.8
‑
7.5%、1.9
‑
7.5%、2
‑
7.5%、2.1
‑
7.5%、2.2
‑
7.5%、2.3
‑
7.5%、2.4
‑
7.5%、2.5
‑
7.5%、2.6
‑
7.5%、2.7
‑
7.5%、2.8
‑
7.5%、2.9
‑
7.5%、3
‑
7.5%、3.1
‑
7.5%、3.2
‑
7.5%、3.3
‑
7.5%、3.4
‑
7.5%、3.5
‑
7.5%、3.6
‑
7.5%、3.7
‑
7.5%、3.8
‑
7.5%、3.9
‑
7.5%、4
‑
7.5%、4.1
‑
7.5%、4.2
‑
7.5%、4.3
‑
7.5%、4.4
‑
7.5%、4.5
‑
7.5%、4.6
‑
7.5%、4.7
‑
7.5%、4.8
‑
7.5%、4.9
‑
7.5%、5
‑
7.5%、5.1
‑
7.5%、5.2
‑
7.5%、5.3
‑
7.5%、5.4
‑
7.5%、5.5
‑
7.5%、5.6
‑
7.5%、5.7
‑
7.5%、5.8
‑
7.5%、5.9
‑
7.5%、6
‑
7.5%、6.1
‑
7.5%、6.2
‑
7.5%、6.3
‑
7.5%、6.4
‑
7.5%、6.5
‑
7.5%、6.6
‑
7.5%、6.7
‑
7.5%、6.8
‑
7.5%、6.9
‑
7.5%、7
‑
7.5%、7.1
‑
7.5%、7.2
‑
7.5%、7.3
‑
7.5%、7.4
‑
7.5%、0
‑
8%、0.1
‑
8%、0.2
‑
8%、0.3
‑
8%、0.4
‑
8%、0.5
‑
8%、0.6
‑
8%、0.7
‑
8%、0.8
‑
8%、0.9
‑
8%、1
‑
8%、1.1
‑
8%、1.2
‑
8%、1.3
‑
8%、1.4
‑
8%、1.5
‑
8%、1.6
‑
8%、1.7
‑
8%、1.8
‑
8%、1.9
‑
8%、2
‑
8%、2.1
‑
8%、2.2
‑
8%、2.3
‑
8%、2.4
‑
8%、2.5
‑
8%、2.6
‑
8%、2.7
‑
8%、2.8
‑
8%、2.9
‑
8%、3
‑
8%、3.1
‑
8%、3.2
‑
8%、3.3
‑
8%、3.4
‑
8%、3.5
‑
8%、3.6
‑
8%、3.7
‑
8%、3.8
‑
8%、3.9
‑
8%、4
‑
8%、4.1
‑
8%、4.2
‑
8%、4.3
‑
8%、4.4
‑
8%、4.5
‑
8%、4.6
‑
8%、4.7
‑
8%、4.8
‑
8%、4.9
‑
8%、5
‑
8%、5.1
‑
8%、5.2
‑
8%、5.3
‑
8%、5.4
‑
8%、5.5
‑
8%、5.6
‑
8%、5.7
‑
8%、5.8
‑
8%、5.9
‑
8%、6
‑
8%、6.1
‑
8%、6.2
‑
8%、6.3
‑
8%、6.4
‑
8%、6.5
‑
8%、6.6
‑
8%、6.7
‑
8%、6.8
‑
8%、6.9
‑
8%、7
‑
8%、7.1
‑
8%、7.2
‑
8%、7.3
‑
8%、7.4
‑
8%、7.5
‑
8%、7.6
‑
8%、7.7
‑
8%、7.8
‑
8%、7.9
‑
8%、0
‑
8.5%、0.1
‑
8.5%、0.2
‑
8.5%、0.3
‑
8.5%、0.4
‑
8.5%、0.5
‑
8.5%、0.6
‑
8.5%、0.7
‑
8.5%、0.8
‑
8.5%、0.9
‑
8.5%、1
‑
8.5%、1.1
‑
8.5%、1.2
‑
8.5%、1.3
‑
8.5%、1.4
‑
8.5%、1.5
‑
8.5%、1.6
‑
8.5%、1.7
‑
8.5%、1.8
‑
8.5%、1.9
‑
8.5%、2
‑
8.5%、2.1
‑
8.5%、2.2
‑
8.5%、2.3
‑
8.5%、2.4
‑
8.5%、2.5
‑
8.5%、2.6
‑
8.5%、2.7
‑
8.5%、2.8
‑
8.5%、2.9
‑
8.5%、3
‑
8.5%、3.1
‑
8.5%、3.2
‑
8.5%、3.3
‑
8.5%、3.4
‑
8.5%、3.5
‑
8.5%、3.6
‑
8.5%、3.7
‑
8.5%、3.8
‑
8.5%、3.9
‑
8.5%、4
‑
8.5%、4.1
‑
8.5%、4.2
‑
8.5%、4.3
‑
8.5%、4.4
‑
8.5%、4.5
‑
8.5%、4.6
‑
8.5%、4.7
‑
8.5%、4.8
‑
8.5%、4.9
‑
8.5%、5
‑
8.5%、5.1
‑
8.5%、5.2
‑
8.5%、5.3
‑
8.5%、5.4
‑
8.5%、5.5
‑
8.5%、5.6
‑
8.5%、5.7
‑
8.5%、5.8
‑
8.5%、5.9
‑
8.5%、6
‑
8.5%、6.1
‑
8.5%、6.2
‑
8.5%、6.3
‑
8.5%、6.4
‑
8.5%、6.5
‑
8.5%、6.6
‑
8.5%、6.7
‑
8.5%、6.8
‑
8.5%、6.9
‑
8.5%、7
‑
8.5%、7.1
‑
8.5%、7.2
‑
8.5%、7.3
‑
8.5%、7.4
‑
8.5%、7.5
‑
8.5%、7.6
‑
8.5%、7.7
‑
8.5%、7.8
‑
8.5%、7.9
‑
8.5%、8
‑
8.5%、8.1
‑
8.5%、8.2
‑
8.5%、8.3
‑
8.5%、8.4
‑
8.5%、0
‑
9%、0.1
‑
9%、0.2
‑
9%、0.3
‑
9%、0.4
‑
9%、0.5
‑
9%、0.6
‑
9%、0.7
‑
9%、0.8
‑
9%、0.9
‑
9%、1
‑
9%、1.1
‑
9%、1.2
‑
9%、1.3
‑
9%、1.4
‑
9%、1.5
‑
9%、1.6
‑
9%、1.7
‑
9%、1.8
‑
9%、1.9
‑
9%、2
‑
9%、2.1
‑
9%、2.2
‑
9%、2.3
‑
9%、2.4
‑
9%、2.5
‑
9%、2.6
‑
9%、2.7
‑
9%、2.8
‑
9%、2.9
‑
9%、3
‑
9%、3.1
‑
9%、3.2
‑
9%、3.3
‑
9%、3.4
‑
9%、3.5
‑
9%、3.6
‑
9%、3.7
‑
9%、3.8
‑
9%、3.9
‑
9%、4
‑
9%、4.1
‑
9%、4.2
‑
9%、4.3
‑
9%、4.4
‑
9%、4.5
‑
9%、4.6
‑
9%、4.7
‑
9%、4.8
‑
9%、4.9
‑
9%、5
‑
9%、5.1
‑
9%、5.2
‑
9%、5.3
‑
9%、5.4
‑
9%、5.5
‑
9%、5.6
‑
9%、5.7
‑
9%、5.8
‑
9%、5.9
‑
9%、6
‑
9%、6.1
‑
9%、6.2
‑
9%、6.3
‑
9%、6.4
‑
9%、6.5
‑
9%、6.6
‑
9%、6.7
‑
9%、6.8
‑
9%、6.9
‑
9%、7
‑
9%、7.1
‑
9%、7.2
‑
9%、7.3
‑
9%、7.4
‑
9%、7.5
‑
9%、7.6
‑
9%、7.7
‑
9%、7.8
‑
9%、7.9
‑
9%、8
‑
9%、8.1
‑
9%、8.2
‑
9%、8.3
‑
9%、8.4
‑
9%、8.5
‑
9%、8.6
‑
9%、8.7
‑
9%、8.8
‑
9%、8.9
‑
9%、0
‑
9.5%、0.1
‑
9.5%、0.2
‑
9.5%、0.3
‑
9.5%、0.4
‑
9.5%、0.5
‑
9.5%、0.6
‑
9.5%、0.7
‑
9.5%、0.8
‑
9.5%、0.9
‑
9.5%、1
‑
9.5%、1.1
‑
9.5%、1.2
‑
9.5%、1.3
‑
9.5%、1.4
‑
9.5%、1.5
‑
9.5%、1.6
‑
9.5%、1.7
‑
9.5%、1.8
‑
9.5%、1.9
‑
9.5%、2
‑
9.5%、2.1
‑
9.5%、2.2
‑
9.5%、2.3
‑
9.5%、2.4
‑
9.5%、2.5
‑
9.5%、2.6
‑
9.5%、2.7
‑
9.5%、2.8
‑
9.5%、2.9
‑
9.5%、3
‑
9.5%、3.1
‑
9.5%、3.2
‑
9.5%、3.3
‑
9.5%、3.4
‑
9.5%、3.5
‑
9.5%、3.6
‑
9.5%、3.7
‑
9.5%、3.8
‑
9.5%、3.9
‑
9.5%、4
‑
9.5%、4.1
‑
9.5%、4.2
‑
9.5%、4.3
‑
9.5%、4.4
‑
9.5%、4.5
‑
9.5%、4.6
‑
9.5%、4.7
‑
9.5%、4.8
‑
9.5%、4.9
‑
9.5%、5
‑
9.5%、5.1
‑
9.5%、5.2
‑
9.5%、5.3
‑
9.5%、5.4
‑
9.5%、5.5
‑
9.5%、5.6
‑
9.5%、5.7
‑
9.5%、5.8
‑
9.5%、5.9
‑
9.5%、6
‑
9.5%、6.1
‑
9.5%、6.2
‑
9.5%、6.3
‑
9.5%、6.4
‑
9.5%、6.5
‑
9.5%、6.6
‑
9.5%、6.7
‑
9.5%、6.8
‑
9.5%、6.9
‑
9.5%、7
‑
9.5%、7.1
‑
9.5%、7.2
‑
9.5%、7.3
‑
9.5%、7.4
‑
9.5%、7.5
‑
9.5%、7.6
‑
9.5%、7.7
‑
9.5%、7.8
‑
9.5%、7.9
‑
9.5%、8
‑
9.5%、8.1
‑
9.5%、8.2
‑
9.5%、8.3
‑
9.5%、8.4
‑
9.5%、8.5
‑
9.5%、8.6
‑
9.5%、8.7
‑
9.5%、8.8
‑
9.5%、8.9
‑
9.5%、9
‑
9.5%、9.1
‑
9.5%、9.2
‑
9.5%、9.3
‑
9.5%、9.4
‑
9.5%、0
‑
10%、0.1
‑
10%、0.2
‑
10%、0.3
‑
10%、0.4
‑
10%、0.5
‑
10%、0.6
‑
10%、0.7
‑
10%、0.8
‑
10%、0.9
‑
10%、1
‑
10%、1.1
‑
10%、1.2
‑
10%、1.3
‑
10%、1.4
‑
10%、1.5
‑
10%、1.6
‑
10%、1.7
‑
10%、1.8
‑
10%、1.9
‑
10%、2
‑
10%、2.1
‑
10%、2.2
‑
10%、2.3
‑
10%、2.4
‑
10%、2.5
‑
10%、2.6
‑
10%、2.7
‑
10%、2.8
‑
10%、2.9
‑
10%、3
‑
10%、3.1
‑
10%、3.2
‑
10%、3.3
‑
10%、3.4
‑
10%、3.5
‑
10%、3.6
‑
10%、3.7
‑
10%、3.8
‑
10%、3.9
‑
10%、4
‑
10%、4.1
‑
10%、4.2
‑
10%、4.3
‑
10%、4.4
‑
10%、4.5
‑
10%、4.6
‑
10%、4.7
‑
10%、4.8
‑
10%、4.9
‑
10%、5
‑
10%、5.1
‑
10%、5.2
‑
10%、5.3
‑
10%、5.4
‑
10%、5.5
‑
10%、5.6
‑
10%、5.7
‑
10%、5.8
‑
10%、5.9
‑
10%、6
‑
10%、6.1
‑
10%、6.2
‑
10%、6.3
‑
10%、6.4
‑
10%、6.5
‑
10%、6.6
‑
10%、6.7
‑
10%、6.8
‑
10%、6.9
‑
10%、7
‑
10%、7.1
‑
10%、7.2
‑
10%、7.3
‑
10%、7.4
‑
10%、7.5
‑
10%、7.6
‑
10%、7.7
‑
10%、7.8
‑
10%、7.9
‑
10%、8
‑
10%、8.1
‑
10%、8.2
‑
10%、8.3
‑
10%、8.4
‑
10%、8.5
‑
10%、8.6
‑
10%、8.7
‑
10%、8.8
‑
10%、8.9
‑
10%、9
‑
10%、9.1
‑
10%、9.2
‑
10%、9.3
‑
10%、9.4
‑
10%、9.5
‑
10%、9.6
‑
10%、9.7
‑
10%、9.8
‑
10%或9.9
‑
10%w/v。
[0914]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
10%w/v的山梨糖醇。
[0915]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
9%w/v的山梨糖醇。
[0916]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
8%w/v的山梨糖醇。
[0917]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
7%w/v的山梨糖醇。
[0918]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
6%w/v的山梨糖醇。
[0919]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
5%w/v的山梨糖醇。
[0920]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
4%w/v的山梨糖醇。
[0921]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
3%w/v的山梨糖醇。
[0922]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
2%w/v的山梨糖醇。
[0923]
在某些实施方案中,制剂可包含0
‑
1%w/v的山梨糖醇。
[0924]
在某些实施方案中,制剂可包含1%w/v的山梨糖醇。
[0925]
在某些实施方案中,制剂可包含2%w/v的山梨糖醇。
[0926]
在某些实施方案中,制剂可包含3%w/v的山梨糖醇。
[0927]
在某些实施方案中,制剂可包含4%w/v的山梨糖醇。
[0928]
在某些实施方案中,制剂可包含5%w/v的山梨糖醇。
[0929]
在某些实施方案中,制剂可包含6%w/v的山梨糖醇。
[0930]
在某些实施方案中,制剂可包含7%w/v的山梨糖醇。
[0931]
在某些实施方案中,制剂可包含8%w/v的山梨糖醇。
[0932]
在某些实施方案中,制剂可包含9%w/v的山梨糖醇。
[0933]
在某些实施方案中,制剂可包含10%w/v的山梨糖醇。
[0934]
表面活性剂
[0935]
在某些实施方案中,本文所述的药物组合物的制剂可包含表面活性剂。表面活性剂可帮助控制悬浮培养物中的剪切力。本文所用的表面活性剂可为阴离子型、两性离子型或非离子型表面活性剂,并且可包含本领域中已知适用于药物制剂中的表面活性剂。
[0936]
阴离子型表面活性剂的实例包括但不限于硫酸盐、磺酸盐、磷酸酯和羧酸盐。
[0937]
非离子型表面活性剂的实例包括但不限于乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、烷基苯酚乙氧基化物(例如壬苯醇醚、triton x
‑
100)、脂肪酸乙氧基化物、乙氧基化胺和/或脂肪酸酰胺(例如,聚乙氧基化牛脂胺、椰油酰胺单乙醇胺、椰油酰胺二乙醇胺)、环氧乙烷/环氧丙烷共聚物(例如,泊洛沙姆如f
‑
68或f
‑
127)、脂肪酸和多元醇的酯、脂肪酸烷醇酰胺、乙氧基化脂族酸、乙氧基化脂族醇、乙氧基化山梨糖醇脂肪酸酯、乙氧基化甘油酯、具有edta的乙氧基化嵌段共聚物(乙烯二胺四乙酸)、乙氧基化环醚加合物、乙氧基化酰胺和咪唑啉加合物、乙氧基化胺加合物、乙氧基化硫醇加合物、与烷基苯酚的乙氧基化缩合物、乙氧基化的基于氮的疏水物、乙氧基化聚氧丙烯、聚合硅酮、氟化表面活性剂和可聚合表面活性剂。
[0938]
两性离子型表面活性剂的实例包括但不限于烷基酰胺基甜菜碱和其胺氧化物、烷
基甜菜碱和其胺氧化物、磺基甜菜碱、羟基磺基甜菜碱、两性甘氨酸盐、两性丙酸盐、平衡两性聚羧基甘氨酸盐和烷基聚氨基甘氨酸盐。蛋白质具有根据ph而带电荷或不带电荷的能力;因此,在正确ph下,蛋白质,优选pi为约8至9,例如经修饰牛血清白蛋白或胰凝乳蛋白酶,可充当两性离子表面活性剂。需要时可使用表面活性剂的各种混合物。
[0939]
共聚物
[0940]
在某些实施方案中,制剂中的组分中的至少一者为共聚物。
[0941]
在某些实施方案中,制剂可包含浓度为0.00001%、0.0001%、0.001%、0.01%、0.1%或1%w/v的至少一种共聚物。
[0942]
在某些实施方案中,制剂可包含在以下范围内的至少一种共聚物:0.00001%
‑
0.0001%、0.00001%
‑
0.001%、0.00001%
‑
0.01%、0.00001%
‑
0.1%、0.00001%
‑
1%、0.0001%
‑
0.001%、0.0001%
‑
0.01%、0.0001%
‑
0.1%、0.0001%
‑
1%、0.001%
‑
0.01%、0.001%
‑
0.1%、0.001%
‑
1%、0.01%
‑
0.1%、0.01%
‑
1%或0.1
‑
1%w/v。
[0943]
在某些实施方案中,制剂可包含0.001%w/v共聚物。
[0944]
在某些实施方案中,共聚物为环氧乙烷/环氧丙烷共聚物。
[0945]
在某些实施方案中,制剂可包含浓度为0.00001%、0.0001%、0.001%、0.01%、0.1%或1%w/v的至少一种环氧乙烷/环氧丙烷共聚物。
[0946]
在某些实施方案中,制剂可包含在以下范围内的至少一种环氧乙烷/环氧丙烷共聚物:0.00001%
‑
0.0001%、0.00001%
‑
0.001%、0.00001%
‑
0.01%、0.00001%
‑
0.1%、0.00001%
‑
1%、0.0001%
‑
0.001%、0.0001%
‑
0.01%、0.0001%
‑
0.1%、0.0001%
‑
1%、0.001%
‑
0.01%、0.001%
‑
0.1%、0.001%
‑
1%、0.01%
‑
0.1%、0.01%
‑
1%或0.1
‑
1%w/v。
[0947]
在某些实施方案中,制剂可包含0.001%w/v环氧乙烷/环氧丙烷共聚物。
[0948]
在某些实施方案中,制剂可包含至少一种环氧乙烷/丙烯共聚物,其为泊洛沙姆(poloxamer)。在某些实施方案中,制剂可包含浓度为0.00001%、0.0001%、0.001%、0.01%、0.1%或1%w/v的泊洛沙姆。
[0949]
在某些实施方案中,制剂可包含在以下范围内的泊洛沙姆:0.00001%
‑
0.0001%、0.00001%
‑
0.001%、0.00001%
‑
0.01%、0.00001%
‑
0.1%、0.00001%
‑
1%、0.0001%
‑
0.001%、0.0001%
‑
0.01%、0.0001%
‑
0.1%、0.0001%
‑
1%、0.001%
‑
0.01%、0.001%
‑
0.1%、0.001%
‑
1%、0.01%
‑
0.1%、0.01%
‑
1%或0.1
‑
1%w/v。
[0950]
在某些实施方案中,制剂可包含0.001%w/v泊洛沙姆。
[0951]
在某些实施方案中,制剂可包含至少一种环氧乙烷/丙烯共聚物,其为泊洛沙姆188。在某些实施方案中,制剂可包含浓度为0.00001%、0.0001%、0.001%、0.01%、0.1%或1%w/v的泊洛沙姆188。
[0952]
在某些实施方案中,制剂可包含在以下范围内的泊洛沙姆188:0.00001%
‑
0.0001%、0.00001%
‑
0.001%、0.00001%
‑
0.01%、0.00001%
‑
0.1%、0.00001%
‑
1%、0.0001%
‑
0.001%、0.0001%
‑
0.01%、0.0001%
‑
0.1%、0.0001%
‑
1%、0.001%
‑
0.01%、0.001%
‑
0.1%、0.001%
‑
1%、0.01%
‑
0.1%、0.01%
‑
1%或0.1
‑
1%w/v.
[0953]
在某些实施方案中,制剂可包含0.001%
‑
0.1w/v泊洛沙姆188。
[0954]
在某些实施方案中,制剂可包含至少一种环氧乙烷/环氧丙烷共聚物,其为f
‑
68。在某些实施方案中,制剂可包含浓度为0.00001%、0.0001%、0.001%、
0.01%、0.1%或1%w/v的f
‑
68。
[0955]
在某些实施方案中,制剂可包含在以下范围内的f
‑
68:0.00001%
‑
0.0001%、0.00001%
‑
0.001%、0.00001%
‑
0.01%、0.00001%
‑
0.1%、0.00001%
‑
1%、0.0001%
‑
0.001%、0.0001%
‑
0.01%、0.0001%
‑
0.1%、0.0001%
‑
1%、0.001%
‑
0.01%、0.001%
‑
0.1%、0.001%
‑
1%、0.01%
‑
0.1%、0.01%
‑
1%或0.1
‑
1%w/v。
[0956]
在某些实施方案中,制剂可包含0.001%
‑
0.1%w/vf
‑
68。在某些实施方案中,制剂可包含0.001%w/vf
‑
68。
[0957]
制剂特性
[0958]
在某些实施方案中,制剂已被优化以具有特定ph、重量渗透摩尔浓度、浓度、aav颗粒浓度和/或aav颗粒总剂量。
[0959]
ph
[0960]
在某些实施方案中,制剂可针对特定ph进行优化。在某些实施方案中,制剂可包含ph缓冲剂(在本文中也称为“缓冲剂”),其为弱酸或弱碱,当用于制剂中时甚至在将另一种酸或碱添加至制剂中之后,将制剂的ph保持在所选择值附近。制剂的ph可为但不限于0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9和14。
[0961]
在某些实施方案中,制剂可针对特定ph范围进行优化。ph范围可为但不限于0
‑
4、1
‑
5、2
‑
6、3
‑
7、4
‑
8、5
‑
9、6
‑
10、7
‑
11、8
‑
12、9
‑
13、10
‑
14、0
‑
1.5、1
‑
2.5、2
‑
3.5、3
‑
4.5、4
‑
5.5、5
‑
6.5、6
‑
7.5、7
‑
8.5、8
‑
9.5、9
‑
10.5、10
‑
11.5、11
‑
12.5、12
‑
13.5、0
‑
1、1
‑
2、2
‑
3、3
‑
4、4
‑
5、5
‑
6、6
‑
7、7
‑
8、8
‑
9、9
‑
10、10
‑
11、11
‑
12、12
‑
13、13
‑
14、0
‑
0.5、0.5
‑
1、1
‑
1.5、1.5
‑
2、2
‑
2.5、2.5
‑
3、3
‑
3.5、3.5
‑
4、4
‑
4.5、4.5
‑
5、5
‑
5.5、5.5
‑
6、6
‑
6.5、6.5
‑
7、7
‑
7.5、7.2
‑
8.2、7.2
‑
7.6、7.3
‑
7.7、7.5
‑
8、7.8
‑
8.2、8
‑
8.5、8.5
‑
9、9
‑
9.5、9.5
‑
10、10
‑
10.5、10.5
‑
11、11
‑
11.5、11.5
‑
12、12
‑
12.5、12.5
‑
13、13
‑
13.5或13.5
‑
14。
[0962]
在某些实施方案中,制剂的ph在6与8.5之间。
[0963]
在某些实施方案中,制剂的ph在7与8.5之间。
[0964]
在某些实施方案中,制剂的ph在7与7.6之间。
[0965]
在某些实施方案中,制剂的ph为7。
[0966]
在某些实施方案中,制剂的ph为7.1。
[0967]
在某些实施方案中,制剂的ph为7.2。
[0968]
在某些实施方案中,制剂的ph为7.3。
[0969]
在某些实施方案中,制剂的ph为7.4。
[0970]
在某些实施方案中,制剂的ph为7.5。
[0971]
在某些实施方案中,制剂的ph为7.6。
[0972]
在某些实施方案中,制剂的ph为7.7。
[0973]
在某些实施方案中,制剂的ph为7.8。
[0974]
在某些实施方案中,制剂的ph为7.9。
[0975]
在某些实施方案中,制剂的ph为8。
[0976]
在某些实施方案中,制剂的ph为8.1。
[0977]
在某些实施方案中,制剂的ph为8.2。
[0978]
在某些实施方案中,制剂的ph为8.3。
[0979]
在某些实施方案中,制剂的ph为8.4。
[0980]
在某些实施方案中,制剂的ph为8.5。
[0981]
在某些实施方案中,当制剂在5℃下时测定ph。
[0982]
在某些实施方案中,当制剂在25℃下时测定ph。
[0983]
合适的缓冲剂可包括但不限于tris hcl、tris碱、磷酸钠(磷酸一钠和/或磷酸二钠)、磷酸钾(磷酸一钾和/或磷酸二钾)、组氨酸、硼酸、柠檬酸、甘氨酸hepes(4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸)和mops(3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸)。
[0984]
制剂中的缓冲剂的浓度可为1
‑
50mm、1
‑
25mm、5
‑
30mm、5
‑
20mm、5
‑
15mm、10
‑
40mm或15
‑
30mm。制剂中的缓冲剂的浓度可为约1mm、5mm、7.5mm、10mm、12.5mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm或50mm。
[0985]
在某些实施方案中,制剂可包括但不限于磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)。作为一个非限制性实例,pbs可包含氯化钠、氯化钾、磷酸二钠、磷酸一钾和蒸馏水。在一些情况下,pbs不含钾或镁。在其他情况下,pbs含有钙和镁。
[0986]
在某些实施方案中,用于本文所述的药物组合物的制剂的缓冲剂可包含磷酸钠(磷酸一钠和/或磷酸二钠)。作为一个非限制性实例,磷酸钠可调节至7.4
±
0.2范围内的ph值(在5℃下)。在某些实施方案中,用于本文所述的药物组合物的制剂的缓冲剂可包含tris碱。tris碱可用盐酸调节至7.1与9.1范围内的任何ph。作为一个非限制性实例,用于本文所述的制剂的tris碱可调节至8.0
±
0.2。作为一个非限制性实例,用于本文所述的制剂的tris碱可调节至7.5
±
0.2。
[0987]
重量渗透摩尔浓度
[0988]
在某些实施方案中,制剂可针对特定重量渗透摩尔浓度进行优化。制剂的重量渗透摩尔浓度可为但不限于350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500mosm/kg(毫摩尔/kg)。
[0989]
在某些实施方案中,制剂可针对特定重量渗透摩尔浓度范围进行优化。范围可为
但不限于350
‑
360、360
‑
370、370
‑
380、380
‑
390、390
‑
400、400
‑
410、410
‑
420、420
‑
430、430
‑
440、440
‑
450、450
‑
460、460
‑
470、470
‑
480、480
‑
490、490
‑
500、350
‑
370、360
‑
380、370
‑
390、380
‑
400、390
‑
410、400
‑
420、410
‑
430、420
‑
440、430
‑
450、440
‑
460、450
‑
470、460
‑
480、470
‑
490、480
‑
500、350
‑
375、375
‑
400、400
‑
425、425
‑
450、450
‑
475、475
‑
500、350
‑
380、360
‑
390、370
‑
400、380
‑
410、390
‑
420、400
‑
430、410
‑
440、420
‑
450、430
‑
460、440
‑
470、450
‑
480、460
‑
490、470
‑
500、350
‑
390、360
‑
400、370
‑
410、380
‑
420、390
‑
430、400
‑
440、410
‑
450、420
‑
460、430
‑
470、440
‑
480、450
‑
490、460
‑
500、350
‑
400、360
‑
410、370
‑
420、380
‑
430、390
‑
440、400
‑
450、410
‑
460、420
‑
470、430
‑
480、440
‑
490、450
‑
500、350
‑
410、360
‑
420、370
‑
430、380
‑
440、390
‑
450、400
‑
460、410
‑
470、420
‑
480、430
‑
490、440
‑
500、350
‑
420、360
‑
430、370
‑
440、380
‑
450、390
‑
460、400
‑
470、410
‑
480、420
‑
490、430
‑
500、350
‑
430、360
‑
440、370
‑
450、380
‑
460、390
‑
470、400
‑
480、410
‑
490、420
‑
500、350
‑
440、360
‑
450、370
‑
460、380
‑
470、390
‑
480、400
‑
490、410
‑
500、350
‑
450、360
‑
460、370
‑
470、380
‑
480、390
‑
490、400
‑
500、350
‑
460、360
‑
470、370
‑
480、380
‑
490、390
‑
500、350
‑
470、360
‑
480、370
‑
490、380
‑
500、350
‑
480、360
‑
490、370
‑
500、350
‑
490、360
‑
500或350
‑
500mosm/kg。
[0990]
在某些实施方案中,制剂的重量渗透摩尔浓度在350
‑
500mosm/kg之间。
[0991]
在某些实施方案中,制剂的重量渗透摩尔浓度在400
‑
500mosm/kg之间。
[0992]
在某些实施方案中,制剂的重量渗透摩尔浓度在400
‑
480mosm/kg之间。
[0993]
在某些实施方案中,重量渗透摩尔浓度为395mosm/kg。
[0994]
在某些实施方案中,重量渗透摩尔浓度为413mosm/kg。
[0995]
在某些实施方案中,重量渗透摩尔浓度为420mosm/kg。
[0996]
在某些实施方案中,重量渗透摩尔浓度为432mosm/kg。
[0997]
在某些实施方案中,重量渗透摩尔浓度为447mosm/kg。
[0998]
在某些实施方案中,重量渗透摩尔浓度为450mosm/kg。
[0999]
在某些实施方案中,重量渗透摩尔浓度为452mosm/kg。
[1000]
在某些实施方案中,重量渗透摩尔浓度为459mosm/kg。
[1001]
在某些实施方案中,重量渗透摩尔浓度为472mosm/kg。
[1002]
在某些实施方案中,重量渗透摩尔浓度为490mosm/kg。
[1003]
在某些实施方案中,重量渗透摩尔浓度为496mosm/kg。
[1004]
aav颗粒的浓度
[1005]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度可在约1
×
106vg/ml与约1
×
10
16
vg/ml之间。如本文所用,“vg/ml”表示载体基因组(vg)/毫升(ml)。vg/ml也可描述基因组拷贝/毫升或dna酶抗性颗粒/毫升。
[1006]
在某些实施方案中,制剂可包含以下量的aav颗粒浓度:约1
×
106、2
×
106、3
×
106、4
×
106、5
×
106、6
×
106、7
×
106、8
×
106、9
×
106、1
×
107、2
×
107、3
×
107、4
×
107、5
×
107、6
×
107、7
×
107、8
×
107、9
×
107、1
×
108、2
×
108、3
×
108、4
×
108、5
×
108、6
×
108、7
×
108、8
×
108、9
×
108、1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
、5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
、9
×
10
10
、1
×
10
11
、2
×
10
11
、2.1
×
10
11
、2.2
×
10
11
、2.3
×
10
11
、2.4
×
10
11
、2.5
×
10
11
、2.6
×
10
11
、2.7
×
10
11
、2.8
×
10
11
、2.9
×
10
11
、3
×
10
11
、4
×
10
11
、5
×
10
11
、6
×
10
11
、7
×
10
11
、7.1
×
10
11
、7.2
×
10
11
、7.3
×
10
11
、7.4
×
10
11
、7.5
×
10
11
、7.6
×
10
11
、7.7
×
10
11
、7.8
×
10
11
、7.9
×
10
11
、8
×
10
11
、9
×
10
11
、1
×
10
12
、1.1
×
10
12
、1.2
×
10
12
、1.3
×
10
12
、1.4
×
10
12
、1.5
×
10
12
、1.6
×
10
12
、1.7
×
10
12
、1.8
×
10
12
、1.9
×
10
12
、2
×
10
12
、2.1
×
10
12
、2.2
×
10
12
、2.3
×
10
12
、2.4
×
10
12
、2.5
×
10
12
、2.6
×
10
12
、2.7
×
10
12
、2.8
×
10
12
、2.9
×
10
12
、3
×
10
12
、4
×
10
12
、4.1
×
10
12
、4.2
×
10
12
、4.3
×
10
12
、4.4
×
10
12
、4.5
×
10
12
、4.6
×
10
12
、4.7
×
10
12
、4.8
×
10
12
、4.9
×
10
12
、5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、7.1
×
10
12
、7.2
×
10
12
、7.3
×
10
12
、7.4
×
10
12
、7.5
×
10
12
、7.6
×
10
12
、7.7
×
10
12
、7.8
×
10
12
、7.9
×
10
12
、8
×
10
12
、8.1
×
10
12
、8.2
×
10
12
、8.3
×
10
12
、8.4
×
10
12
、8.5
×
10
12
、8.6
×
10
12
、8.7
×
10
12
、8.8
×
10
12
、8.9
×
10
12
、9
×
10
12
、1
×
10
13
、1.1
×
10
13
、1.2
×
10
13
、1.3
×
10
13
、1.4
×
10
13
、1.5
×
10
13
、1.6
×
10
13
、1.7
×
10
13
、1.8
×
10
13
、1.9
×
10
13
、2
×
10
13
、2.1
×
10
13
、2.2
×
10
13
、2.3
×
10
13
、2.4
×
10
13
、2.5
×
10
13
、2.6
×
10
13
、2.7
×
10
13
、2.8
×
10
13
、2.9
×
10
13
、3
×
10
13
、3.1
×
10
13
、3.2
×
10
13
、3.3
×
10
13
、3.4
×
10
13
、3.5
×
10
13
、3.6
×
10
13
、3.7
×
10
13
、3.8
×
10
13
、3.9
×
10
13
、4
×
10
13
、5
×
10
13
、6
×
10
13
、6.7
×
10
13
、7
×
10
13
、8
×
10
13
、9
×
10
13
、1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
、2
×
10
15
、3
×
10
15
、4
×
10
15
、5
×
10
15
、6
×
10
15
、7
×
10
15
、8
×
10
15
、9
×
10
15
或1
×
10
16
vg/ml。
[1007]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度在1
×
10
11
与5
×
10
13
之间、在1
×
10
12
与5
×
10
12
之间、在2
×
10
12
与1
×
10
13
之间、在5
×
10
12
与1
×
10
13
之间、在1
×
10
13
与2
×
10
13
之间、在2
×
10
13
与3
×
10
13
之间、在2
×
10
13
与2.5
×
10
13
之间、在2.5
×
10
13
与3
×
10
13
之间或不超过5
×
10
13
vg/ml。
[1008]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为2.7
×
10
11
vg/ml。
[1009]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为9
×
10
11
vg/ml。
[1010]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为1.2
×
10
12
vg/ml。
[1011]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为2.7
×
10
12
vg/ml。
[1012]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为4
×
10
12
vg/ml。
[1013]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为6
×
10
12
vg/ml。
[1014]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为7.9
×
10
12
vg/ml。
[1015]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为8
×
10
12
vg/ml。
[1016]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为1
×
10
13
vg/ml。
[1017]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为1.8
×
10
13
vg/ml。
[1018]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为2.2
×
10
13
vg/ml。
[1019]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为2.7
×
10
13
vg/ml。
[1020]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为3.5
×
10
13
vg/ml。
[1021]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为2.7
‑
3.5
×
10
13
vg/ml。
[1022]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为7.0
×
10
13
vg/ml。
[1023]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度为5.0
×
10
12
vg/ml。
[1024]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的浓度可在约1
×
106个总衣壳/ml与约1
×
10
16
个总衣壳/ml之间。在某些实施方案中,递送可包含以下浓度的组合物:约1
×
106、2
×
106、3
×
106、4
×
106、5
×
106、6
×
106、7
×
106、8
×
106、9
×
106、1
×
107、2
×
107、3
×
107、4
×
107、5
×
107、6
×
107、7
×
107、8
×
107、9
×
107、1
×
108、2
×
108、3
×
108、4
×
108、5
×
108、6
×
108、7
×
108、8
×
108、9
×
108、1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、
1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
、5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
、9
×
10
10
、1
×
10
11
、2
×
10
11
、3
×
10
11
、4
×
10
11
、5
×
10
11
、6
×
10
11
、7
×
10
11
、8
×
10
11
、9
×
10
11
、1
×
10
12
、1.1
×
10
12
、1.2
×
10
12
、1.3
×
10
12
、1.4
×
10
12
、1.5
×
10
12
、1.6
×
10
12
、1.7
×
10
12
、1.8
×
10
12
、1.9
×
10
12
、2
×
10
12
、2.1
×
10
12
、2.2
×
10
12
、2.3
×
10
12
、2.4
×
10
12
、2.5
×
10
12
、2.6
×
10
12
、2.7
×
10
12
、2.8
×
10
12
、2.9
×
10
12
、3
×
10
12
、3.1
×
10
12
、3.2
×
10
12
、3.3
×
10
12
、3.4
×
10
12
、3.5
×
10
12
、3.6
×
10
12
、3.7
×
10
12
、3.8
×
10
12
、3.9
×
10
12
、4
×
10
12
、4.1
×
10
12
、4.2
×
10
12
、4.3
×
10
12
、4.4
×
10
12
、4.5
×
10
12
、4.6
×
10
12
、4.7
×
10
12
、4.8
×
10
12
、4.9
×
10
12
、5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、8
×
10
12
、9
×
10
12
、1
×
10
13
、2
×
10
13
、2.1
×
10
13
、2.2
×
10
13
、2.3
×
10
13
、2.4
×
10
13
、2.5
×
10
13
、2.6
×
10
13
、2.7
×
10
13
、2.8
×
10
13
、2.9
×
10
13
、3
×
10
13
、4
×
10
13
、5
×
10
13
、6
×
10
13
、6.7
×
10
13
、7
×
10
13
、8
×
10
13
、9
×
10
13
、1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
、2
×
10
15
、3
×
10
15
、4
×
10
15
、5
×
10
15
、6
×
10
15
、7
×
10
15
、8
×
10
15
、9
×
10
15
或1
×
10
16
个总衣壳/ml。
[1025]
aav颗粒的总剂量
[1026]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的总剂量可在约1
×
106vg与约1
×
10
16
vg之间。在某些实施方案中,制剂可包含以下aav颗粒的总剂量:约1
×
106、2
×
106、3
×
106、4
×
106、5
×
106、6
×
106、7
×
106、8
×
106、9
×
106、1
×
107、2
×
107、3
×
107、4
×
107、5
×
107、6
×
107、7
×
107、8
×
107、9
×
107、1
×
108、2
×
108、3
×
108、4
×
108、5
×
108、6
×
108、7
×
108、8
×
108、9
×
108、1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
、5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
、9
×
10
10
、1
×
10
11
、2
×
10
11
、2.1
×
10
11
、2.2
×
10
11
、2.3
×
10
11
、2.4
×
10
11
、2.5
×
10
11
、2.6
×
10
11
、2.7
×
10
11
、2.8
×
10
11
、2.9
×
10
11
、3
×
10
11
、4
×
10
11
、5
×
10
11
、6
×
10
11
、7
×
10
11
、7.1
×
10
11
、7.2
×
10
11
、7.3
×
10
11
、7.4
×
10
11
、7.5
×
10
11
、7.6
×
10
11
、7.7
×
10
11
、7.8
×
10
11
、7.9
×
10
11
、8
×
10
11
、9
×
10
11
、1
×
10
12
、1.1
×
10
12
、1.2
×
10
12
、1.3
×
10
12
、1.4
×
10
12
、1.5
×
10
12
、1.6
×
10
12
、1.7
×
10
12
、1.8
×
10
12
、1.9
×
10
12
、2
×
10
12
、2.1
×
10
12
、2.2
×
10
12
、2.3
×
10
12
、2.4
×
10
12
、2.5
×
10
12
、2.6
×
10
12
、2.7
×
10
12
、2.8
×
10
12
、2.9
×
10
12
、3
×
10
12
、4
×
10
12
、4.1
×
10
12
、4.2
×
10
12
、4.3
×
10
12
、4.4
×
10
12
、4.5
×
10
12
、4.6
×
10
12
、4.7
×
10
12
、4.8
×
10
12
、4.9
×
10
12
、5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、7.1
×
10
12
、7.2
×
10
12
、7.3
×
10
12
、7.4
×
10
12
、7.5
×
10
12
、7.6
×
10
12
、7.7
×
10
12
、7.8
×
10
12
、7.9
×
10
12
、8
×
10
12
、8.1
×
10
12
、8.2
×
10
12
、8.3
×
10
12
、8.4
×
10
12
、8.5
×
10
12
、8.6
×
10
12
、8.7
×
10
12
、8.8
×
10
12
、8.9
×
10
12
、9
×
10
12
、1
×
10
13
、1.1
×
10
13
、1.2
×
10
13
、1.3
×
10
13
、1.4
×
10
13
、1.5
×
10
13
、1.6
×
10
13
、1.7
×
10
13
、1.8
×
10
13
、1.9
×
10
13
、2
×
10
13
、2.1
×
10
13
、2.2
×
10
13
、2.3
×
10
13
、2.4
×
10
13
、2.5
×
10
13
、2.6
×
10
13
、2.7
×
10
13
、2.8
×
10
13
、2.9
×
10
13
、3
×
10
13
、3.1
×
10
13
、3.2
×
10
13
、3.3
×
10
13
、3.4
×
10
13
、3.5
×
10
13
、3.6
×
10
13
、3.7
×
10
13
、3.8
×
10
13
、3.9
×
10
13
、4
×
10
13
、5
×
10
13
、6
×
10
13
、6.7
×
10
13
、7
×
10
13
、8
×
10
13
、9
×
10
13
、1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
、2
×
10
15
、3
×
10
15
、4
×
10
15
、5
×
10
15
、6
×
10
15
、7
×
10
15
、8
×
10
15
、9
×
10
15
或1
×
10
16
vg。
[1027]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的总剂量在1
×
10
11
与5
×
10
13
vg之间。
[1028]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的总剂量在1
×
10
11
与2
×
10
14
vg之间。
[1029]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的总剂量为1.4
×
10
11
vg。
[1030]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的总剂量为4.5
×
10
11
vg。
[1031]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的总剂量为6.8
×
10
11
vg。
[1032]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的总剂量为1.4
×
10
12
vg。
[1033]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的总剂量为2.2
×
10
12
vg。
[1034]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的总剂量为4.6
×
10
11
vg。
[1035]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的总剂量为9.2
×
10
12
vg。
[1036]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的总剂量为1.0
×
10
13
vg。
[1037]
在某些实施方案中,制剂中的aav颗粒的总剂量为2.3
×
10
13
vg。
[1038]
示例性制剂
[1039]
下文描述本公开的示例性、非限制性制剂。制剂可包含aav颗粒制剂。表7呈现本公开的某些示例性制剂的组分和特性的概述。每个制剂可任选地包含0.001%
‑
0.1%(w/v)的泊洛沙姆188(例如普洛尼克)。
[1040]
表7.示例性制剂
[1041][1042]
在某些实施方案中,制剂可包含磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、蔗糖和任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。在某些实施方案中,制剂可包含10mm磷酸钠、1.5mm磷酸钾、100mm氯化钠、5%w/v蔗糖和任选地泊洛沙姆188(缓冲液ph为7.5)。在某些实施方案中,制剂可包含10mm磷酸钠、1.5mm磷酸钾、220mm氯化钠、5%w/v蔗糖和任选地泊洛沙姆188(缓冲液ph为7.5)。在某些实施方案中,制剂可包含10mm磷酸钠、1.5mm磷酸钾、100mm氯化钠、7%w/v蔗糖和任选地泊洛沙姆188(缓冲液ph为7.5)。
[1043]
在某些实施方案中,制剂可包含磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、氯化钾、蔗糖或海藻糖和
任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。
[1044]
在某些实施方案中,制剂可包含磷酸钾、氯化钠、氯化钾、组氨酸、糖和任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。
[1045]
在某些实施方案中,制剂可包含氯化钠、氯化钾、蔗糖、tris和任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。
[1046]
在某些实施方案中,制剂可包含氯化钠、氯化钾、蔗糖、tris、盐酸和任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。
[1047]
在某些实施方案中,制剂可包含氯化钠、蔗糖、tris和任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。
[1048]
在某些实施方案中,制剂可包含氯化钠、蔗糖、tris、氯化镁和任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。
[1049]
在某些实施方案中,制剂可包含氯化钠、蔗糖、tris、精氨酸和任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。
[1050]
在某些实施方案中,制剂可包含氯化钠、山梨糖醇、tris和任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。
[1051]
在某些实施方案中,制剂可包含氯化钠、蔗糖、组氨酸和任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。
[1052]
在某些实施方案中,制剂可包含氯化钠、蔗糖和任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。在某些实施方案中,制剂可包含105mm氯化钠、5%(w/v)蔗糖和任选地共聚物如泊洛沙姆188。在某些实施方案中,制剂可包含95mm氯化钠、5%(w/v)蔗糖和任选地共聚物如泊洛沙姆188。在某些实施方案中,制剂可包含220mm氯化钠、5%(w/v)蔗糖和任选地共聚物如泊洛沙姆188。
[1053]
在某些实施方案中,制剂可包含磷酸钾、蔗糖、tris和任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。
[1054]
在某些实施方案中,制剂可包含氯化钾、蔗糖、tris和任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。
[1055]
在某些实施方案中,制剂可包含氯化钠、tris和任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。在某些实施方案中,制剂可包含100mm氯化钠、20mm tris和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为8.0)。在某些实施方案中,制剂可包含220mm氯化钠、20mm tris和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为7.0
‑
8.0)。在某些实施方案中,制剂可包含290mm氯化钠、20mm tris和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为8.0)。在某些实施方案中,制剂可包含305mm氯化钠、20mm tris和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为8.0)。在某些实施方案中,制剂可包含2m氯化钠、20mm tris和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为8.0)。在某些实施方案中,制剂可包含170mm氯化钠、40mm tris和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为8.5)。在某些实施方案中,制剂可包含2m氯化钠、1m tris和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为7.5)。
[1056]
在某些实施方案中,制剂可包含氯化钠、tris双丙烷和任选地共聚物如泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)。在某些实施方案中,制剂可包含200mm氯化钠、50mm tris双丙烷和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为9.0)。
[1057]
在某些实施方案中,制剂可包含磷酸钠、氯化钠和任选地共聚物如泊洛沙姆188。在某些实施方案中,制剂可包含10mm磷酸钠、180mm氯化钠和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为7.3)。在某些实施方案中,制剂可包含10mm磷酸钠、180mm氯化钠和0.001%w/v泊洛沙姆188(混合物ph为7.3)。在某些实施方案中,制剂可包含20mm磷酸钠、350mm氯化钠和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为7.4)。在某些实施方案中,制剂可包含50mm磷酸钠、350mm氯化钠和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为7.4)。
[1058]
在某些实施方案中,制剂可包含磷酸钠、磷酸钾、氯化钾、氯化钠和任选地共聚物如泊洛沙姆188。在某些实施方案中,制剂可包含10mm磷酸钠、2mm磷酸钾、2.7mm氯化钾、192mm氯化钠和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为7.5)。
[1059]
在某些实施方案中,制剂可包含柠檬酸钠、氯化钠和任选地共聚物如泊洛沙姆188。在某些实施方案中,制剂可包含20mm柠檬酸钠、1m氯化钠和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为6.0)。在某些实施方案中,制剂可包含10mm柠檬酸钠、350mm氯化钠和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为6.0)。在某些实施方案中,制剂可包含20mm柠檬酸钠、350mm氯化钠和任选地共聚物如泊洛沙姆188(混合物ph为3.0)。
[1060]
在某些实施方案中,制剂可包含pbs。在某些实施方案中,制剂可包含pbs和糖和/或糖替代物。制剂可包含3
‑
5%(w/v)的糖和/或糖替代物,以提高制剂的稳定性。作为一个非限制性实例,制剂为pbs和3%(w/v)蔗糖(vyform30)。作为另一个非限制性实例,制剂为pbs和5%(w/v)蔗糖(vyform31)。作为另一个非限制性实例,制剂为pbs和7%(w/v)蔗糖。在某些实施方案中,本公开的aav颗粒可与环氧乙烷/环氧丙烷共聚物(也称为普洛尼克或泊洛沙姆)在pbs中组合配制。
[1061]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒可在具有3%(w/v)蔗糖和0.001%
‑
0.1%(w/v)泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)的pbs中配制。
[1062]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒可在具有5%(w/v)蔗糖和0.001%
‑
0.1%(w/v)泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)的pbs中配制。
[1063]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒可在具有ph为约7.0的0.001%
‑
0.1%(w/v)泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)的pbs中配制。
[1064]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒可在具有ph为约7.3的0.001%
‑
0.1%(w/v)泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)的pbs中配制。
[1065]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒可在具有ph为约7.4的0.001%
‑
0.1%(w/v)泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)的pbs中配制。
[1066]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒可在包含氯化钠、磷酸钠和环氧乙烷/环氧丙烷共聚物的溶液中配制。
[1067]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒可在包含95mm氯化钠、5mm磷酸氢二钠、5mm磷酸二氢钠、1.5mm磷酸钾、7%w/v蔗糖和.001%泊洛沙姆188(例如普洛尼克f
‑
68)的溶液中配制。
[1068]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒可在ph为约7.3的包含约180mm氯化钠、约10mm磷酸钠和约0.001%泊洛沙姆188的溶液中配制。最终溶液中的氯化钠的浓度可为150mm
‑
200mm。作为非限制性实例,最终溶液中的氯化钠的浓度可为150mm、160mm、170mm、180mm、190mm或200mm。最终溶液中的磷酸钠的浓度可为1mm至50mm。作为非限制性实例,最
终溶液中的磷酸钠的浓度可为1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm或50mm。泊洛沙姆188(普洛尼克f
‑
68)的浓度可为0.0001%
‑
1%(w/v)。作为非限制性实例,泊洛沙姆188(普洛尼克f
‑
68)的浓度可为0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%或1%(w/v)。最终溶液的ph可为6.8
‑
7.7。最终溶液的ph的非限制性实例包括ph为6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7。
[1069]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒可在ph为约7.4的包含约1.05%(w/v)氯化钠、约0.212%(w/v)磷酸氢二钠七水合物、约0.025%(w/v)磷酸二氢钠单水合物和0.001%(w/v)泊洛沙姆188的溶液中配制。作为一个非限制性实例,这种配制溶液中的aav颗粒的浓度可为约0.001%(w/v)。最终溶液中氯化钠的浓度可为0.1
‑
2.0%(w/v),非限制性实例为0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、0.95%、0.96%、0.97%、0.98%、0.99%、1.00%、1.01%、1.02%、1.03%、1.04%、1.05%、1.06%、1.07%、1.08%、1.09%、1.10%、1.25%、1.5%、1.75%或2%(w/v)。最终溶液中磷酸氢二钠的浓度可为0.100
‑
0.300%(w/v),非限制性实例包括0.100%、0.125%、0.150%、0.175%、0.200%、0.210%、0.211%、0.212%、0.213%、0.214%、0.215%、0.225%、0.250%、0.275%、0.300%(w/v)。最终溶液中磷酸二氢钠的浓度可为0.010%
‑
0.050%(w/v),非限制性实例为0.010%、0.015%、0.020%、0.021%、0.022%、0.023%、0.024%、0.025%、0.026%、0.027%、0.028%、0.029%、0.030%、0.035%、0.040%、0.045%或0.050%(w/v)。泊洛沙姆188(普洛尼克f
‑
68)的浓度可为0.0001%
‑
1%(w/v)。作为非限制性实例,泊洛沙姆188(普洛尼克f
‑
68))的浓度可为0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%或1%(w/v)。最终溶液的ph可为6.8
‑
7.7。最终溶液的ph的非限制性实例包括ph为6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7。
[1070]
在某些实施方案中,制剂包含具有以下cas(化学文摘社)登记号的组分:7647
‑
14
‑
15(氯化钠)、7782
‑
85
‑
6(磷酸氢二钠七水合物)、10049
‑
21
‑
5(磷酸二氢钠单水合物)和9003
‑
11
‑
6(泊洛沙姆188)。
[1071]
可注射制剂
[1072]
可根据已知技术使用合适的分散剂、湿润剂和/或悬浮剂来配制可注射制剂,例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂可为无毒肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液,例如呈1,3
‑
丁二醇中的溶液形式。在可接受的媒介物和溶剂中,可采用的有水、林格氏溶液(ringer's solution)、u.s.p.和等渗氯化钠溶液。无菌、不挥发性油常规地用作溶剂或悬浮培养基。出于此目的,可采用任何温和的不挥发性油,包含合成单甘油酯或二甘油酯。例如油酸的脂肪酸可用于制备可注射剂。
[1073]
可注射制剂可例如通过经由细菌截留过滤器过滤和/或通过并入灭菌剂来进行灭菌,呈可在使用之前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射培养基中的无菌固体组合物形式。
[1074]
为了延长活性成分的作用,常常期望减缓来自皮下或肌肉内注射剂的活性成分的吸收。这可通过使用具有不良水溶性的结晶或非晶形物质的液体悬浮液来实现。活性成分的吸收速率取决于溶解速率,而溶解速率又可取决于晶体大小和结晶形式。或者,肠胃外施用的药物形式的延迟吸收是通过将药物溶解或悬浮于油性媒介物中来实现。通过在可生物降解的聚合物(例如聚丙交酯
‑
聚乙交酯)中形成药物的微胶囊化基质来制得可注射储槽形
式。视药物与聚合物的比率和所采用特定聚合物的性质而定,可控制药物释放速率。其他生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。通过将药物包覆于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储槽式可注射制剂。
[1075]
储槽制剂
[1076]
在本公开的某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂是在储槽中配制以用于缓释。一般来说,靶向具体器官或组织(“目标组织”)用于施用。
[1077]
在本公开的某些实施方案中,本公开的药物组合物、aav颗粒制剂在空间上保留于目标组织内或附近。提供了将药物组合物、aav颗粒制剂提供至哺乳动物受试者的目标组织的方法,所述方法通过使目标组织(其包含一个或多个目标细胞)与药物组合物、aav颗粒制剂在使其基本上保留于目标组织中,意指至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或超过99.99%的组合物保留于目标组织中的条件下接触。有利地,保留率通过测量进入一个或多个目标细胞的药物组合物、aav颗粒制剂的量来测定。举例来说,向受试者施用至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或大于99.99%的药物组合物、aav颗粒制剂在施用后存在于细胞内一段时间。
[1078]
本公开的某些方面涉及将本公开的药物组合物、aav颗粒制剂提供至哺乳动物受试者的目标组织的方法,所述方法通过使目标组织(包含一个或多个目标细胞)与药物组合物、aav颗粒制剂在使其基本上保留于此类目标组织中的条件下接触。药物组合物、aav颗粒包含足够多的活性成分以使得在至少一个目标细胞中产生所关注的作用。
[1079]
iv.施用
[1080]
施用
[1081]
本公开提供了向有需要的受试者施用根据本公开的aav颗粒的方法。在某些实施方案中,可向受试者施用配制aav颗粒以用于治疗各种疾病、病症和/或疾患。在某些实施方案中,aav颗粒可以治疗有效量向受试者施用,以减少受试者的疾病的症状(例如使用已知评估方法测定)。
[1082]
本公开提供了一种向细胞或组织递送本公开的aav颗粒的方法,所述方法包括使所述细胞或组织与所述aav颗粒接触或使所述细胞或组织与包含所述aav颗粒的制剂接触,或者使所述细胞或组织与所述组合物(包含药物组合物)中的任一者接触。向细胞或组织递送aav颗粒的方法可体外、离体或体内实现。
[1083]
本公开提供了一种向受试者(包括哺乳动物受试者)递送本公开的aav颗粒的方法,所述方法包括向所述受试者施用所述aav颗粒,或者向所述受试者施用包含所述aav颗粒的制剂,或者向所述受试者施用所述组合物(包括药物组合物)中的任一者。
[1084]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒和制剂可通过产生治疗有效结果的任何递送途径施用。这些途径包括但不限于经肠(至肠道中)、胃肠内、硬膜外(至硬脑膜中)、经口(通过口腔)、透皮、脑内(至大脑中)、脑室内(至脑室中)、软膜下(在软膜与cns实质之间)、颈动脉内(至颈动脉内)、上表皮(施用于皮肤上)、皮内(至皮肤自身中)、皮下(在皮肤下)、经鼻施用(经由鼻)、静脉内(至静脉中)、静脉内团注、静脉内滴注、动脉内(至动脉中)、全身性、肌肉内(至肌肉中)、心内(至心脏中)、骨内输注(至骨髓中)、鞘内(至脊髓管中)、实质内(组织或器官的主体,例如脑、脊髓等)、腹膜内(输注或注射至腹膜中)、膀胱内输注、玻璃体
内(经由眼睛)、海绵窦内注射(至病理性腔体中)、腔内(至阴茎底部中)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、透皮(扩散穿过完整皮肤以用于全身性分布)、透粘膜(扩散穿过粘膜)、经阴道、吹入(吸引)、舌下、唇下、灌肠、滴眼剂(至结膜上)或滴耳剂中,经耳(耳内或通过耳朵)、颊内(朝向脸颊)、结膜、皮肤、牙齿(至一个或多个牙齿)、电渗透、子宫颈内、窦内、气管内、体外、血液透析、穿透、间质、腹内、羊膜内、关节内、胆囊内、支气管内、囊内、软骨内(在软骨内)、尾内(在马尾内)、脑池内(在小脑延髓池内)、角膜内(在角膜内)、牙冠内、冠状动脉内(在冠状动脉内)、阴茎海绵体内(在阴茎海绵体的可扩张空间内)、椎间盘内(在椎间盘内)、管内(在腺管内)、十二指肠内(在十二指肠内)、硬膜内(在硬膜内或在硬膜下)、表皮(至表层)、食道内(至食道)、胃内(在胃内)、齿龈内(在齿龈内)、回肠内(在小肠远程部分内)、病灶内(在局部病变内或直接引入局部病变)、管腔内(在管内腔内)、淋巴管内(在淋巴内)、髓内(在骨骼的骨髓腔内)、脑脊膜内(在脑膜内)、心肌内(在心肌内)、眼内(在眼睛内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(在肺部或其支气管内)、窦内(在鼻或眶周窦内)、脊柱内(在脊柱内)、滑膜内(在关节的滑液腔内)、腱内(在肌腱内)、睾丸内(在睾丸内)、鞘内(在任何水平的脑脊髓轴的脑脊髓液内)、胸腔内(在胸腔内)、小管内(在器官的小管内)、瘤内(在肿瘤内)、鼓室内(在中耳内)、血管内(在血管内)、脑室内(在脑室内)、离子导入疗法(通过电流使可溶性盐离子迁移到人体组织中)、冲洗(沐浴或冲洗开放的伤口或体腔)、喉部(直接在喉上)、鼻胃管(通过鼻进入胃)、密闭包扎法(局部途径施用,然后由遮盖所述区域的包扎覆盖)、经眼(至眼外)、口咽(直接至口腔和咽)、肠胃外、经皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、经直肠、呼吸(呼吸道内,通过经口或经鼻吸入以实现局部或全身作用)、眼球后(脑桥后方或眼球后方)、软组织、蛛膜下、结膜下、粘膜下、局部、经胎盘(经由或穿过胎盘)、经气管(穿过气管壁)、经鼓膜(穿过或经由鼓腔)、输尿管(至输尿管)、尿道(至尿道)、阴道、骶管阻滞(caudal block)、诊断、神经阻滞、胆道灌注、心肌灌注、光除去法和脊髓。
[1085]
在某些实施方案中,组合物可以允许其穿过血脑屏障、血管屏障或其他上皮屏障的方式来施用。本公开的aav颗粒可以任何合适形式施用,可以液体溶液或悬浮液形式、以适合液体溶液或适合悬浮于液体溶液中的固体形式施用。aav颗粒可使用任何适当的并且药学上可接受的赋形剂来进行配制。在某些实施方案中,向有需要的受试者经静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、实质内、鞘内和/或脑室内施用本公开组合物,使配制aav颗粒通过血脑屏障和血液脊髓屏障中的一者或两者。
[1086]
本公开提供了向有需要的受试者的cns施用根据本公开的aav颗粒的方法。在某些实施方案中,aav颗粒可以治疗有效量向受试者的cns施用,以减少受试者的神经疾病症状,如使用已知评估方法所测定。
[1087]
在某些实施方案中,经由全身性施用向受试者的中枢神经系统施用包含本公开的配制aav颗粒的组合物。在某些实施方案中,全身性施用为静脉内注射。
[1088]
在某些实施方案中,经由脑实质内注射向受试者的中枢神经系统施用包含本公开的配制aav颗粒的组合物。实质内注射的非限制性实例包括丘脑内、纹状体内(例如核壳内)、海马内或靶向内嗅皮质。
[1089]
在某些实施方案中,施用至cns中经由多次(例如超过一次)施用、途径和/或位置。此类施用可为依序或同时的。在某些实施方案中,经由超过一种途径,例如实质内注射和鞘
内注射向受试者的中枢神经系统中施用。
[1090]
在某些实施方案中,施用是经由多次(例如超过一次)施用、途径和/或位置。此类施用可为依序或同时的。
[1091]
在某些实施方案中,可将本公开的配制aav颗粒递送至特定类型的靶向细胞中,包括但不限于海马神经元、皮质神经元、运动神经元或内嗅神经元;神经胶质细胞,包含少突神经胶质细胞、星形胶质细胞和微神经胶质细胞;和/或神经元周围的其他细胞,例如t细胞。
[1092]
在某些实施方案中,本公开的配制aav颗粒或药物组合物可使用美国专利第8,999,948号或国际公开第wo2014178863号中所述的用于治疗疾病的方法来施用或递送,所述文件的内容通过引用整体并入本文。
[1093]
在某些实施方案中,本公开的配制aav颗粒或药物组合物可使用美国申请第20150126590号中所述的用于在阿尔茨海默病或其他神经退行性疾患中递送基因疗法的方法来施用或递送,所述美国申请的内容通过引用整体并入本文。
[1094]
在某些实施方案中,本公开的配制aav颗粒或药物组合物可使用如美国专利第6,436,708号和第8,946,152号以及国际公开第wo2015168666号中所述的用于递送cns基因疗法的方法来施用或递送,所述文件的内容通过引用整体并入本文。
[1095]
在某些实施方案中,本公开的配制aav颗粒或药物组合物可使用欧洲专利申请第ep2678433号中所述的aav颗粒用于递送蛋白质的方法来施用或递送,所述欧洲专利申请的内容通过引用整体并入本文。
[1096]
在某些实施方案中,本公开的配制aav颗粒或药物组合物可使用美国专利第us6,211,163号中所述的用于向血流递送dna的方法施用或递送,所述美国专利的内容通过引用整体并入本文。
[1097]
在某些实施方案中,本公开的配制aav颗粒或药物组合物可使用美国专利第7,588,757号中所述的用于向中枢神经系统递送有效负载的方法来施用或递送,所述美国专利的内容通过引用整体并入本文。
[1098]
在某些实施方案中,本公开的配制aav颗粒或药物组合物可使用美国专利第us 8,283,151号中所述的用于递送有效负载的方法来施用或递送,所述美国专利的内容通过引用整体并入本文。
[1099]
在某些实施方案中,本公开的配制aav颗粒或药物组合物可使用国际专利公开第wo2001089583号中所述的使用谷氨酸脱羧酶(gad)递送载体来递送有效负载的方法来施用或递送,所述国际专利公开的内容通过引用整体并入本文。
[1100]
在某些实施方案中,本公开的配制aav颗粒或药物组合物可使用国际专利公开第wo2012057363号中所述的用于向神经细胞递送有效负载的方法施用或递送,所述国际专利公开的内容通过引用整体并入本文。
[1101]
在某些实施方案中,本公开的配制aav颗粒或药物组合物可使用国际专利申请第pct/us2018/042391号中所述的用于向神经细胞递送有效负载的方法施用或递送,所述国际专利申请的内容通过引用整体并入本文。
[1102]
在某些实施方案中,本公开的配制aav颗粒或药物组合物可使用美国专利第6,506,379号中所述的用于通过肌肉内递送途径递送有效负载的方法来施用或递送;所述美
国专利的内容通过引用整体并入本文。肌肉内施用的非限制性实例包括静脉内注射或皮下注射。
[1103]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可通过经口施用来递送。经口施用的非限制性实例包括消化道施用和颊内施用。
[1104]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可通过眼内递送途径来递送。眼内施用的非限制性实例包括玻璃体内注射。
[1105]
在某些实施方案中,aav颗粒可通过外周注射向受试者施用。外周注射的非限制性实例包括腹膜内、肌肉内、静脉内、结膜或关节注射。本领域中公开,外周施用aav颗粒可转运至中枢神经系统,例如转运至运动神经元(例如美国专利公开第20100240739号和第20100130594号;其中每一者的内容通过引用整体并入本文)。
[1106]
在某些实施方案中,aav颗粒制剂可通过注射至csf通路中来递送。递送至csf通路的非限制性实例包括鞘内和脑室内施用。
[1107]
在某些实施方案中,aav颗粒制剂可通过全身性递送来递送。作为一个非限制性实例,全身性递送可通过血管内施用实现。
[1108]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可通过颅内递送向受试者施用(参见例如美国专利第8,119,611号;其内容通过引用整体并入本文)。
[1109]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可通过注射施用。作为一个非限制性实例,本公开的aav颗粒可通过注射向受试者施用。
[1110]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可通过肌肉注射施用。作为一个非限制性实例,本公开的aav颗粒可通过肌肉施用向受试者施用。
[1111]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可通过肌肉内施用来施用。作为一个非限制性实例,本公开的aav颗粒可通过肌肉内施用向受试者施用。
[1112]
在某些实施方案中,向受试者施用本公开的aav颗粒并转导受试者的肌肉。
[1113]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可经由实质内注射来施用。作为一个非限制性实例,本公开的aav颗粒可通过实质内施用向受试者施用。
[1114]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可通过静脉内施用来施用。在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可经由单次剂量静脉内递送来施用。作为一个非限制性实例,单次剂量静脉内递送可为一次治疗。在基因疗法的情况下,单次剂量静脉内递送可对受试者产生持久缓解。缓解可持续数分钟,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59分钟或超过59分钟;持续数小时,例如但不限于1、2、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48小时或超过48小时;持续数天,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31天或超过31天;持续数周,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16周或超过16周;持续数月,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个月或超过24个月;持续数年,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15年或超过15年。
[1115]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可经由静脉内递送至drg伤害感受性神经元来施用。在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可经由单次剂量静脉内递送至drg伤害感受性神经元来施用。作为一个非限制性实例,单次剂量静脉内递送可为一次治疗。缓解可持续数分钟,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59分钟或超过59分钟;持续数小时,例如但不限于1、2、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48小时或超过48小时;持续数天,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31天或超过31天;持续数周,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16周或超过16周;持续数月,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个月或超过24个月;持续数年,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15年或超过15年。
[1116]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可经鞘内施用,例如通过鞘内注射来施用。在某些实施方案中,aav颗粒制剂可以治疗有效量向小脑延髓池施用以转导脊髓运动神经元和/或星形胶质细胞。作为一个非限制性实例,aav颗粒制剂可经鞘内施用。在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可经由单次剂量鞘内注射来施用。作为一个非限制性实例,单次剂量鞘内注射可为一次治疗并且单次剂量鞘内注射可对受试者产生持久缓解。缓解可持续数分钟,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59分钟或超过59分钟;持续数小时,例如但不限于1、2、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48小时或超过48小时;持续数天,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31天或超过31天;持续数周,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16周或超过16周;持续数月,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个月或超过24个月;持续数年,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15年或超过15年。
[1117]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可经由鞘内注射至drg伤害感受性神经元来施用。在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可经由单次剂量鞘内注射至drg伤害感受性神经元来施用。作为一个非限制性实例,单次剂量鞘内注射可为一次治疗。在基因疗法的情况下,单次剂量鞘内注射可对受试者产生持久缓解。缓解可持续数分钟,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59分钟或超过59分钟;持续数小时,例如但不限于1、2、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48小时或超过48小时;持续数天,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31天或超过31天;持续数周,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16周或超过16周;持续数月,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个月或超过24个月;持续数年,例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15年或超过15年。
[1118]
在某些实施方案中,本文所述的配制aav颗粒经由c1处的鞘内(it)输注施用。输注可持续1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15小时或超过15小时。
[1119]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可通过实质内注射来施用。在某些实施方案中,配制aav颗粒可以治疗有效量向小脑延髓池施用以转导脊髓运动神经元和/或星形胶质细胞。
[1120]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可通过实质内注射和鞘内注射来施用。
[1121]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可通过皮下注射施用。
[1122]
在某些实施方案中,aav颗粒制剂可通过直接注射至大脑中来递送。在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可经由纹状体内注射来施用,包括注射至一个或多个壳核中。在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可经由纹状体内注射和本文所述的另一施用途径来施用。
[1123]
在某些实施方案中,aav颗粒制剂可通过超过一种施用途径来递送。作为组合施用的非限制性实例,可通过鞘内和脑室内或通过静脉内和实质内施用来递送aav颗粒。
[1124]
在某些实施方案中,配制aav颗粒可以治疗有效量施用至cns,以改善功能和/或受试者的存活期。作为一个非限制性实例,载体可通过直接输注至纹状体中来施用。
[1125]
在某些实施方案中,配制aav颗粒可以“治疗有效”量(即足以减轻和/或预防与疾病相关的至少一种症状或改善受试者的疾患的量)施用。
[1126]
在某些实施方案中,导管可位于脊椎中超过一个位点处以用于多位点递送。配制aav颗粒可以连续和/或团注输注方式来递送。每个递送部位可采用不同给药方案,或者可对每个递送部位使用相同给药方案。作为一个非限制性实例,递送部位可在子宫颈和腰部区域中。作为另一个非限制性实例,递送部位可在子宫颈区域中。作为另一个非限制性实例,递送部位可在腰部区域中。
[1127]
在某些实施方案中,可在递送本文所述的aav颗粒之前分析受试者的脊椎解剖学和病理学。作为一个非限制性实例,存在脊柱侧弯的受试者的给药方案和/或导管位置可与不存在脊柱侧弯的受试者不同。
[1128]
在某些实施方案中,在配制aav颗粒递送期间,受试者的脊椎的取向可与地面垂直。
[1129]
在另一个实施方案中,在配制aav颗粒递送期间,受试者的脊椎的取向可与地面水平。
[1130]
在某些实施方案中,在配制aav颗粒递送期间,受试者的脊椎可与地面成一定角度。受试者的脊椎与地面的角度可为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或180度。
[1131]
在某些实施方案中,递送方法和持续时间被选择以在脊髓中提供广泛转导。作为一个非限制性实例,鞘内递送用于沿着脊髓的喙部
‑
尾部长度提供广泛转导。作为另一个非限制性实例,沿着脊髓的喙部
‑
尾部长度进行多部位输注可提供较均一的转导。作为又一个非限制性实例,沿着脊髓的喙部
‑
尾部长度长期输注可提供较均一的转导。
[1132]
剂量和方案
[1133]
本公开的医药、诊断或预防性aav颗粒、制剂和组合物可使用对预防、治疗、管理或诊断疾病、病症和/或疾患有效的任何量和任何施用途径向受试者施用。取决于受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用模式、其活动模式等,所需要的准确量将随受试者而变化。受试者可为人类、哺乳动物或动物。根据本公开的组合物通常以单位剂型配制以易于施用和剂量均匀。然而,应理解,本公开的组合物的每天总用量可由主治医师在合理医学判断范围内决定。任何特定个体的特定治疗有效、预防有效或适当诊断剂量水平将取决于多种因素,所述因素包括所治疗的病症和病症的严重程度;所采用特定有效负载的活性;所采用的特定组合物;患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食;施用时间、施用途径和所采用特定aav颗粒的排泄速率;治疗持续时间;与所采用特定aav颗粒组合或同时使用的药物;以及医学领域中众所周知的类似因素。在某些实施方案中,本公开的配制aav颗粒的递送只产生了最少的因配制aav颗粒的递送所致的严重不良事件(serious adverse event,sae)。
[1134]
传统上,为了实现足够高数量的标准治疗剂(确保持久治疗效果),通过重复或延长施用,例如通过多次注射或长期输注来递送多种疗法。然而,这些延长给药方案并不非常适合于某些aav基因治疗模式,例如通过单次剂量范例驱动的模式。归因于配制流体的体积空间有限、对赋形剂数量和效能的严格限制、离子颗粒对cns微环境的影响以及与延长cns治疗相关的手术和临床并发症,延长aav给药方案在cns疾病治疗中可尤其成问题。基因疗法模态的新颖制剂是实现制剂内的足够高浓度的治疗剂所必需的。
[1135]
在某些实施方案中,根据本公开的配制aav颗粒药物组合物可以足以递送约0.0001mg/kg至约100mg/kg、约0.001mg/kg至约0.05mg/kg、约0.005mg/kg至约0.05mg/kg、约0.001mg/kg至约0.005mg/kg、约0.05mg/kg至约0.5mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg或约1mg/kg至约25mg/kg的受试者体重每天一次或多次的剂量水平施用,得到所需治疗、诊断或预防作用。应理解,上文给药浓度可转化为由本领域技术人员施用的每kg的vg或病毒基因组量或总病毒基因组量。
[1136]
在某些实施方案中,根据本公开的配制aav颗粒药物组合物可以约10至约600μl/位点、50至约500μl/位点、100至约400μl/位点、120至约300μl/位点、140至约200μl/位点、约160μl/位点施用。作为非限制性实例,aav颗粒可以50μl/位点和/或150μl/位点施用。
[1137]
在某些实施方案中,向细胞递送根据本公开的组合物包含由[vg/小时=毫升/小时*vg/毫升]定义的递送速率,其中vg为病毒基因组,vg/毫升为组合物浓度,并且毫升/小时为长期递送的速率。
[1138]
在某些实施方案中,向细胞递送根据本公开的组合物可包含在约1
×
106vg与约1
×
10
16
vg之间的总浓度/受试者。在某些实施方案中,递送可包含以下浓度的组合物:约1
×
106、2
×
106、3
×
106、4
×
106、5
×
106、6
×
106、7
×
106、8
×
106、9
×
106、1
×
107、2
×
107、3
×
107、4
×
107、5
×
107、6
×
107、7
×
107、8
×
107、9
×
107、1
×
108、2
×
108、3
×
108、4
×
108、5
×
108、6
×
108、7
×
108、8
×
108、9
×
108、1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
、5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
、9
×
10
10
、1
×
10
11
、2
×
10
11
、2.1
×
10
11
、2.2
×
10
11
、2.3
×
10
11
、2.4
×
10
11
、2.5
×
10
11
、2.6
×
10
11
、2.7
×
10
11
、
2.8
×
10
11
、2.9
×
10
11
、3
×
10
11
、4
×
10
11
、5
×
10
11
、6
×
10
11
、7
×
10
11
、7.1
×
10
11
、7.2
×
10
11
、7.3
×
10
11
、7.4
×
10
11
、7.5
×
10
11
、7.6
×
10
11
、7.7
×
10
11
、7.8
×
10
11
、7.9
×
10
11
、8
×
10
11
、9
×
10
11
、1
×
10
12
、1.1
×
10
12
、1.2
×
10
12
、1.3
×
10
12
、1.4
×
10
12
、1.5
×
10
12
、1.6
×
10
12
、1.7
×
10
12
、1.8
×
10
12
、1.9
×
10
12
、2
×
10
12
、3
×
10
12
、4
×
10
12
、4.1
×
10
12
、4.2
×
10
12
、4.3
×
10
12
、4.4
×
10
12
、4.5
×
10
12
、4.6
×
10
12
、4.7
×
10
12
、4.8
×
10
12
、4.9
×
10
12
、5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、8
×
10
12
、8.1
×
10
12
、8.2
×
10
12
、8.3
×
10
12
、8.4
×
10
12
、8.5
×
10
12
、8.6
×
10
12
、8.7
×
10
12
、8.8
×
10
12
、8.9
×
10
12
、9
×
10
12
、1
×
10
13
、2
×
10
13
、3
×
10
13
、4
×
10
13
、5
×
10
13
、6
×
10
13
、6.7
×
10
13
、7
×
10
13
、8
×
10
13
、9
×
10
13
、1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
、2
×
10
15
、3
×
10
15
、4
×
10
15
、5
×
10
15
、6
×
10
15
、7
×
10
15
、8
×
10
15
、9
×
10
15
或1
×
10
16
vg/受试者或vg/剂量。
[1139]
在某些实施方案中,向细胞递送根据本公开的组合物可包含在约1
×
106vg/kg与约1
×
10
16
vg/kg之间的总浓度/受试者。在某些实施方案中,递送可包含以下浓度的组合物:约1
×
106、2
×
106、3
×
106、4
×
106、5
×
106、6
×
106、7
×
106、8
×
106、9
×
106、1
×
107、2
×
107、3
×
107、4
×
107、5
×
107、6
×
107、7
×
107、8
×
107、9
×
107、1
×
108、2
×
108、3
×
108、4
×
108、5
×
108、6
×
108、7
×
108、8
×
108、9
×
108、1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
、5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
、9
×
10
10
、1
×
10
11
、2
×
10
11
、2.1
×
10
11
、2.2
×
10
11
、2.3
×
10
11
、2.4
×
10
11
、2.5
×
10
11
、2.6
×
10
11
、2.7
×
10
11
、2.8
×
10
11
、2.9
×
10
11
、3
×
10
11
、4
×
10
11
、5
×
10
11
、6
×
10
11
、7
×
10
11
、7.1
×
10
11
、7.2
×
10
11
、7.3
×
10
11
、7.4
×
10
11
、7.5
×
10
11
、7.6
×
10
11
、7.7
×
10
11
、7.8
×
10
11
、7.9
×
10
11
、8
×
10
11
、9
×
10
11
、1
×
10
12
、1.1
×
10
12
、1.2
×
10
12
、1.3
×
10
12
、1.4
×
10
12
、1.5
×
10
12
、1.6
×
10
12
、1.7
×
10
12
、1.8
×
10
12
、1.9
×
10
12
、2
×
10
12
、3
×
10
12
、4
×
10
12
、4.1
×
10
12
、4.2
×
10
12
、4.3
×
10
12
、4.4
×
10
12
、4.5
×
10
12
、4.6
×
10
12
、4.7
×
10
12
、4.8
×
10
12
、4.9
×
10
12
、5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、8
×
10
12
、8.1
×
10
12
、8.2
×
10
12
、8.3
×
10
12
、8.4
×
10
12
、8.5
×
10
12
、8.6
×
10
12
、8.7
×
10
12
、8.8
×
10
12
、8.9
×
10
12
、9
×
10
12
、1
×
10
13
、2
×
10
13
、3
×
10
13
、4
×
10
13
、5
×
10
13
、6
×
10
13
、6.7
×
10
13
、7
×
10
13
、8
×
10
13
、9
×
10
13
、1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
、2
×
10
15
、3
×
10
15
、4
×
10
15
、5
×
10
15
、6
×
10
15
、7
×
10
15
、8
×
10
15
、9
×
10
15
或1
×
10
16
vg/kg。
[1140]
在某些实施方案中,向中枢神经系统(例如实质)的细胞递送配制aav颗粒可包含在约1
×
106vg与约1
×
10
16
vg之间的总剂量。在某些实施方案中,递送可包含以下总剂量:约1
×
106、2
×
106、3
×
106、4
×
106、5
×
106、6
×
106、7
×
106、8
×
106、9
×
106、1
×
107、2
×
107、3
×
107、4
×
107、5
×
107、6
×
107、7
×
107、8
×
107、9
×
107、1
×
108、2
×
108、3
×
108、4
×
108、5
×
108、6
×
108、7
×
108、8
×
108、9
×
108、1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、1
×
10
10
、1.9
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、3.73
×
10
10
、4
×
10
10
、5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
、9
×
10
10
、1
×
10
11
、2
×
10
11
、2.5
×
10
11
、3
×
10
11
、4
×
10
11
、5
×
10
11
、6
×
10
11
、7
×
10
11
、8
×
10
11
、9
×
10
11
、1
×
10
12
、2
×
10
12
、3
×
10
12
、4
×
10
12
、5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、8
×
10
12
、9
×
10
12
、1
×
10
13
、2
×
10
13
、3
×
10
13
、4
×
10
13
、5
×
10
13
、6
×
10
13
、7
×
10
13
、8
×
10
13
、9
×
10
13
、1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
、2
×
10
15
、3
×
10
15
、4
×
10
15
、5
×
10
15
、6
×
10
15
、7
×
10
15
、8
×
10
15
、9
×
10
15
或1
×
10
16
vg。作为一个非限制性实例,总剂量为1
×
10
13
vg。作为另一个非限制性实例,总剂量为2.1
×
10
12
vg。
[1141]
在某些实施方案中,每剂量可施用约105至106个病毒基因组(单位)。
[1142]
在某些实施方案中,向细胞递送根据本公开的组合物可包含在约1
×
106vg/ml与约1
×
10
16
vg/ml之间的总浓度。在某些实施方案中,递送可包含以下浓度的组合物:约1
×
106、2
×
106、3
×
106、4
×
106、5
×
106、6
×
106、7
×
106、8
×
106、9
×
106、1
×
107、2
×
107、3
×
107、4
×
107、5
×
107、6
×
107、7
×
107、8
×
107、9
×
107、1
×
108、2
×
108、3
×
108、4
×
108、5
×
108、6
×
108、7
×
108、8
×
108、9
×
108、1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
、5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
、9
×
10
10
、1
×
10
11
、2
×
10
11
、3
×
10
11
、4
×
10
11
、5
×
10
11
、6
×
10
11
、7
×
10
11
、8
×
10
11
、9
×
10
11
、1
×
10
12
、1.1
×
10
12
、1.2
×
10
12
、1.3
×
10
12
、1.4
×
10
12
、1.5
×
10
12
、1.6
×
10
12
、1.7
×
10
12
、1.8
×
10
12
、1.9
×
10
12
、2
×
10
12
、2.1
×
10
12
、2.2
×
10
12
、2.3
×
10
12
、2.4
×
10
12
、2.5
×
10
12
、2.6
×
10
12
、2.7
×
10
12
、2.8
×
10
12
、2.9
×
10
12
、3
×
10
12
、3.1
×
10
12
、3.2
×
10
12
、3.3
×
10
12
、3.4
×
10
12
、3.5
×
10
12
、3.6
×
10
12
、3.7
×
10
12
、3.8
×
10
12
、3.9
×
10
12
、4
×
10
12
、4.1
×
10
12
、4.2
×
10
12
、4.3
×
10
12
、4.4
×
10
12
、4.5
×
10
12
、4.6
×
10
12
、4.7
×
10
12
、4.8
×
10
12
、4.9
×
10
12
、5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、8
×
10
12
、9
×
10
12
、1
×
10
13
、2
×
10
13
、3
×
10
13
、4
×
10
13
、5
×
10
13
、6
×
10
13
、6.7
×
10
13
、7
×
10
13
、8
×
10
13
、9
×
10
13
、1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
、2
×
10
15
、3
×
10
15
、4
×
10
15
、5
×
10
15
、6
×
10
15
、7
×
10
15
、8
×
10
15
、9
×
10
15
或1
×
10
16
vg/ml。如本文所用,“vg/ml”表示载体基因组(vg)/毫升(ml)。vg/ml也可描述基因组拷贝/毫升或dna酶抗性颗粒/毫升。
[1143]
在某些实施方案中,向细胞递送根据本公开的组合物可包含在约1
×
106总衣壳/ml与约1
×
10
16
总衣壳/ml之间的总浓度。在某些实施方案中,递送可包含以下浓度的组合物:约1
×
106、2
×
106、3
×
106、4
×
106、5
×
106、6
×
106、7
×
106、8
×
106、9
×
106、1
×
107、2
×
107、3
×
107、4
×
107、5
×
107、6
×
107、7
×
107、8
×
107、9
×
107、1
×
108、2
×
108、3
×
108、4
×
108、5
×
108、6
×
108、7
×
108、8
×
108、9
×
108、1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
、5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
、9
×
10
10
、1
×
10
11
、2
×
10
11
、3
×
10
11
、4
×
10
11
、5
×
10
11
、6
×
10
11
、7
×
10
11
、8
×
10
11
、9
×
10
11
、1
×
10
12
、1.1
×
10
12
、1.2
×
10
12
、1.3
×
10
12
、1.4
×
10
12
、1.5
×
10
12
、1.6
×
10
12
、1.7
×
10
12
、1.8
×
10
12
、1.9
×
10
12
、2
×
10
12
、2.1
×
10
12
、2.2
×
10
12
、2.3
×
10
12
、2.4
×
10
12
、2.5
×
10
12
、2.6
×
10
12
、2.7
×
10
12
、2.8
×
10
12
、2.9
×
10
12
、3
×
10
12
、3.1
×
10
12
、3.2
×
10
12
、3.3
×
10
12
、3.4
×
10
12
、3.5
×
10
12
、3.6
×
10
12
、3.7
×
10
12
、3.8
×
10
12
、3.9
×
10
12
、4
×
10
12
、4.1
×
10
12
、4.2
×
10
12
、4.3
×
10
12
、4.4
×
10
12
、4.5
×
10
12
、4.6
×
10
12
、4.7
×
10
12
、4.8
×
10
12
、4.9
×
10
12
、5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、8
×
10
12
、9
×
10
12
、1
×
10
13
、2
×
10
13
、3
×
10
13
、4
×
10
13
、5
×
10
13
、6
×
10
13
、6.7
×
10
13
、7
×
10
13
、8
×
10
13
、9
×
10
13
、1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
、2
×
10
15
、3
×
10
15
、4
×
10
15
、5
×
10
15
、6
×
10
15
、7
×
10
15
、8
×
10
15
、9
×
10
15
或1
×
10
16
总衣壳/ml。
[1144]
在某些实施方案中,向中枢神经系统(例如实质)的细胞递送配制aav颗粒可包含在约1
×
106vg/ml与约1
×
10
16
vg/ml之间的组合物浓度。在某些实施方案中,递送可包含以下浓度的组合物:约1
×
106、2
×
106、3
×
106、4
×
106、5
×
106、6
×
106、7
×
106、8
×
106、9
×
106、1
×
107、2
×
107、3
×
107、4
×
107、5
×
107、6
×
107、7
×
107、8
×
107、9
×
107、1
×
108、2
×
108、3
×
108、4
×
108、5
×
108、6
×
108、7
×
108、8
×
108、9
×
108、1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、
6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
、5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
、9
×
10
10
、1
×
10
11
、2
×
10
11
、3
×
10
11
、4
×
10
11
、5
×
10
11
、6
×
10
11
、7
×
10
11
、8
×
10
11
、9
×
10
11
、1
×
10
12
、2
×
10
12
、3
×
10
12
、4
×
10
12
、5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、8
×
10
12
、9
×
10
12
、1
×
10
13
、2
×
10
13
、3
×
10
13
、4
×
10
13
、5
×
10
13
、6
×
10
13
、7
×
10
13
、8
×
10
13
、9
×
10
13
、1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
、9
×
10
14
、1
×
10
15
、2
×
10
15
、3
×
10
15
、4
×
10
15
、5
×
10
15
、6
×
10
15
、7
×
10
15
、8
×
10
15
、9
×
10
15
或1
×
10
16
vg/ml。在某些实施方案中,递送包含1
×
10
13
vg/ml的组合物浓度。在某些实施方案中,递送包含2.1
×
10
12
vg/ml的组合物浓度。
[1145]
本公开的配制aav颗粒的所需剂量可在单次施用方案中仅递送一次、一天三次、一天两次、一天一次或超过一次。在某些实施方案中,所需剂量可使用多次施用来递送(例如两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)。当采用多次施用时,可使用分次给药方案,例如本文所述的分次给药方案。如本文所用,“分次剂量”是将“单一单位剂量”或每日总剂量分成两个或更多个剂量,例如两次或更多次施用“单一单位剂量”。如本文所用,“单一单位剂量”是以一个剂量/一次性/单一途径/单一接触点施用的任何治疗剂的剂量,即单次施用事件。
[1146]
本公开的配制aav颗粒的所需剂量可以“脉冲剂量”或“连续流”来施用。如本文所用,“脉冲剂量”是以固定频率在一段时间内施用的任何治疗剂的一系列单一单位剂量。如本文所用,“连续流”是以单一途径/单一接触点连续施用一段时间的治疗剂的剂量,即连续施用事件。每日总剂量,即在24小时时间内给予或以处方开具的量,可通过这些方法中的任一者或这些方法的组合或通过适合药物施用的任何其他方法来施用。
[1147]
在某些实施方案中,将本公开的配制aav颗粒递送至受试者为受试者的所关注基因提供了调控活性。调控活性可为受试者的所关注基因的产生增加或受试者的所关注基因的产生降低。调控活性可持续至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年。
[1148]
在某些实施方案中,本公开的配制aav颗粒可使用单次剂量、一次治疗向受试者施用。一次治疗的剂量可通过本领域中已知和/或本文所述的任何方法施用。如本文所用,“一次治疗”是指仅施用一次组合物。如果需要,则可向受试者施用加强剂量以确保达到适当功效。加强剂量可在一次治疗后的以下时间施用:1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年。
[1149]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可经由单次施用途径向受试者递送。
[1150]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可经由多位点施用途径向受试者递送。受试者可在2、3、4、5或超过5个位点处施用。
[1151]
在某些实施方案中,可使用团注向受试者施用本公开的aav颗粒制剂。
[1152]
在某些实施方案中,可在数分钟、数小时或数天的时段使用持续递送向受试者施用本公开的aav颗粒制剂。输注速率可取决于受试者、分布、制剂或另一个递送参数而改变。
[1153]
在某些实施方案中,本文所述的aav颗粒经由壳核和尾状输注施用。作为一个非限制性实例,双重输注提供了广泛的纹状体分布以及额叶和颞叶皮质分布。
[1154]
在某些实施方案中,用于施用本文所述的aav颗粒的受试者和/或剂量效果、施用途径和/或施用体积的选择可使用也称为virchow
‑
robin空间的血管周围间隙(pvs)的成像评估。pvs在其穿孔脑实质并且经脑脊髓液(csf)/间质液填充时包围小动脉和小静脉。pvs在中脑、基底节和半卵圆中心中常见。不希望受理论束缚,pvs可在代谢物的正常清除中起作用并且与较差的认知和包含帕金森病(parkinson's disease)的若干疾病状态相关。pvs的尺寸通常为正常的,但其尺寸在许多疾病状态中增加。potter等人(cerebrovasc dis.2015年1月;39(4):224
‑
231;其内容通过引用整体并入本文)开发出一种分级法,其中他们研究了全范围的pvs并且分级基底节、半卵圆中心和中脑pvs。他们使用mac和lullich等人(j neurol neurosurg psychiatry.2004年11月;75(11):1519
‑
23;其内容通过引用整体并入本文)所使用的pvs的频率和范围,并且potter等人为基底节和半卵圆中心pvs提供5个等级:0(无)、1(1
‑
10)、2(11
‑
20)、3(21
‑
40)和4(>40)并且为中脑pvs提供2个等级:0(非可见)或1(可见)。potter等人提供的评级系统的用户手册可见于:www.sbirc.ed.ac.uk/documents/epvs
‑
rating
‑
scale
‑
user
‑
guide.pdf。
[1155]
组合
[1156]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒制剂可与一种或多种其他治疗剂、预防剂、研究或诊断剂组合使用。“与
……
组合”并不旨在暗示试剂必须同时施用和/或配制成一起递送,但这些递送方法属于本公开的范围内。组合物可与一种或多种其他所需疗法或医疗程序同时、在一种或多种其他所需疗法或医疗程序之前、或在一种或多种其他所需疗法或医疗程序之后施用。一般来说,每个药剂将以针对所述药剂所确定的剂量和/或时间表来施用。在某些实施方案中,本公开涵盖将药物、预防、研究或诊断组合物与可改善其生物可用性、减弱和/或调节其代谢、抑制其排泄和/或调节其在体内的分布的药剂组合递送。
[1157]
可与本公开的配制aav颗粒组合使用的治疗剂可为小分子化合物,其为抗氧化剂、消炎剂、抗细胞凋亡剂、钙调节剂、抗谷氨酸能剂(antiglutamatergic agent)、结构蛋白质抑制剂、参与肌肉功能的化合物和参与金属离子调节的化合物。
[1158]
在某些实施方案中,可与本文所述的配制aav颗粒组合使用的经测试用于治疗疾病的化合物包括但不限于胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐、雷斯替明、加兰他敏);nmda受体拮抗剂,例如美金刚胺;抗精神病药;抗抑郁药;抗惊厥药(例如,用于肌阵挛的丙戊酸钠和左乙拉西坦(levetiracetam));分泌酶抑制剂;淀粉样蛋白聚集抑制剂;铜或锌调节剂;bace抑制剂,例如亚甲基蓝、吩噻嗪、蒽醌、n
‑
苯胺或罗丹明;微管稳定剂,例如nap、紫杉醇或太平洋紫杉醇;激酶或磷酸酶抑制剂,例如靶向gsk3β(锂)或pp2a的酶抑制剂;用aβ肽免疫或多巴胺耗竭剂(例如,用于舞蹈病的丁苯那嗪(tetrabenazine));苯并二氮杂卓(benzodiazepine)(例如,用于肌阵挛、舞蹈病、肌张力不全症、僵硬和/或痉挛的氯硝西泮(clonazepam));多巴胺的氨基酸前体(例如,用于僵硬的左旋多巴(levodopa));骨骼肌松弛剂(例如,用于僵硬和/或痉挛的氯苯胺丁酸(baclofen)、替扎尼定(tizanidine));乙酰胆碱释放在神经肌肉接合点以引起肌肉麻痹的抑制剂(例如,用于睡中磨牙和/或肌张力不全症的肉毒杆菌毒素(botulinum toxin));非典型精神安定剂(例如,用于精神病和/或烦躁易怒的奥氮平(olanzapine)和喹硫平(quetiapine);用于精神病、舞蹈病和/或烦躁易怒
的利培酮(risperidone)、舒必利(sulpiride)和氟哌啶醇(haloperidol);用于耐治疗性精神病的氯氮平;用于具有显著阴性症状的精神病的阿立哌唑(aripiprazole));选择性血清素再吸收抑制剂(ssri)(例如,用于抑郁症、焦虑症、强迫行为和/或烦躁易怒的西它普兰(citalopram)、氟西汀(fluoxetine)、帕罗西汀(paroxetine)、舍曲林(sertraline)、米氮平(mirtazapine)、文拉法辛(venlafaxine));安眠药(例如,用于睡眠
‑
觉醒周期改变的佐匹克隆(xopiclone)和/或唑吡坦(zolpidem));抗惊厥药(例如,用于躁症或轻躁症的丙戊酸钠和卡马西平(carbamazepine))和情绪稳定剂(例如,用于躁症或轻躁症的锂)。
[1159]
在某些实施方案中,神经营养因子可与本公开的配制aav颗粒一起用于组合疗法中。一般来说,神经营养因子定义为促进神经元的存活、生长、分化、增殖和/或成熟或者刺激神经元活性增加的物质。在某些实施方案中,本公开方法还包括将一种或多种营养因子递送至需要治疗的受试者中。营养因子可包括但不限于igf
‑
i、gdnf、bdnf、ctnf、vegf、克力韦灵(colivelin)、扎利罗登(xaliproden)、促甲状腺素释放激素和adnf和其变体。
[1160]
在一个方面,本文所述的配制aav颗粒可与表达神经营养因子的aav颗粒(无论是否配制)共同施用,例如aav
‑
igf
‑
i(参见例如vincent等人,neuromolecular medicine,2004,6,79
‑
85,其内容通过引用整体并入本文)和aav
‑
gdnf(参见例如wang等人,j neurosci.,2002,22,6920
‑
6928,其内容通过引用整体并入本文)。
[1161]
测量和分析
[1162]
从病毒基因组表达有效负载或此类有效负载的下调效应可使用本领域中已知的各种方法测定,例如但不限于免疫化学(例如ihc)、原位杂交(ish)、酶联免疫吸附测定(elisa)、亲和力elisa、elispot、流式细胞术、免疫细胞学、表面等离子体共振分析、动力排除测定、液相色谱
‑
质谱(lcms)、高效液相色谱(hplc)、bca测定、免疫电泳、蛋白质印迹、sds
‑
page、蛋白质免疫沉淀和/或pcr。
[1163]
生物可用性
[1164]
在某些实施方案中,配制成具有如本文所述的递送剂的组合物的aav颗粒可展现其生物可用性与缺乏如本文所述的递送剂的组合物相比增加。如本文所用,术语“生物可用性”是指向哺乳动物施用的给定量的aav颗粒或所表达有效负载的全身可用性。生物可用性可通过测量后续组合物的曲线下面积(auc)或最大血清或血浆浓度(c
max
)来加以评定。auc是沿纵坐标(y轴)的化合物(例如aav颗粒或所表达的有效负载)的血清或血浆浓度相对于沿横坐标(x轴)的时间绘制的曲线的曲线下面积测定值。一般来说,特定化合物的auc可使用本领域普通技术人员已知并且如g.s.banker,modern pharmaceutics,drugs and the pharmaceutical sciences,第72卷,marcel dekker,new york,inc.,1996中所述的方法来加以计算,所述文献的内容通过引用整体并入本文。
[1165]
c
max
值是在向哺乳动物施用aav颗粒后在所述哺乳动物的血清或血浆中实现的aav颗粒或所表达有效负载的最大浓度。c
max
值可使用本领域普通技术人员已知的方法来测量。如本文所用的短语“生物可用性增加”或“药物动力学改善”意指当与如本文所述的递送剂共同施用时,以auc、c
max
或c
min
形式测量的第一aav颗粒或所表达有效负载在哺乳动物中的全身可用性比在不进行此类共同施用时的全身可用性更大。在某些实施方案中,生物可用性可增加至少约2%、至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少
约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或约100%。
[1166]
治疗窗口
[1167]
如本文所用,“治疗窗口”是指治疗活性物质在作用部位引发治疗作用的机率较高的血浆浓度范围或水平范围。在某些实施方案中,如本文所述的aav颗粒制剂的治疗窗口可增加至少约2%、至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或约100%。
[1168]
分布体积
[1169]
如本文所用,术语“分布体积”是指体内含有与血液或血浆中浓度相同的药物总量所需的液体体积:v
分布
等于体内药物量/血液或血浆中的药物浓度。举例来说,对于10mg剂量和10mg/l的血浆浓度,分布体积将为1升。分布体积反映了药物存在于血管外组织中的程度。较大分布体积反映了与血浆质蛋白结合相比,化合物倾向于与组织组分结合。在临床环境中,v
分布
可用于确定实现稳态浓度的负荷剂量。在某些实施方案中,如本文所述的aav颗粒制剂的分布体积可降低至少约2%、至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%。
[1170]
生物学作用
[1171]
在某些实施方案中,向动物递送的aav颗粒制剂的生物学作用可通过分析所述动物中的有效负载表达来分类。有效负载表达可通过分析从施用本公开的aav颗粒制剂的哺乳动物收集的生物样品来测定。举例来说,对于由向哺乳动物递送的aav颗粒编码的蛋白质,50
‑
200pg/ml的蛋白质表达可视为所述哺乳动物中的蛋白质的治疗有效量。
[1172]
v.治疗
[1173]
总则
[1174]
本公开提供了一种治疗哺乳动物受试者(包括人类受试者)的疾病、病症和/或疾患的方法,所述方法包括向所述受试者施用本文所述的病毒颗粒或制剂中的任一者或向所述受试者施用本文所述的所述组合物(包括药物组合物或制剂)中的任一者。
[1175]
在某些实施方案中,向受试者施用配制aav颗粒将不改变潜在疾病病程,但将改善受试者的症状。
[1176]
在某些实施方案中,向受试者预防地施用本公开的病毒颗粒。
[1177]
在某些实施方案中,向具有至少一种本文所述的疾病的受试者施用本公开的病毒颗粒。
[1178]
在某些实施方案中,向受试者施用本公开的病毒颗粒以治疗本文所述的疾病或病症。受试者可具有疾病或病症或者可处于患上疾病或病症的风险下。
[1179]
本公开提供了一种向有需要的受试者(包括人类受试者)施用治疗有效量的本公开aav颗粒来减慢、终止或逆转疾病进展的方法。作为一个非限制性实例,疾病进展可通过本领域技术人员已知的测试或诊断工具来测量。作为另一个非限制性实例,疾病进展可通过受试者的脑部、csf或其他组织的病理学特征的变化来测量。
[1180]
在某些实施方案中,各种非感染性疾病(包括神经疾病)可用本公开的药物组合物来治疗。本公开的aav颗粒,尤其是穿过血脑屏障的aav颗粒,特别适用于治疗各种神经疾病。作为一个非限制性实例,神经疾病可为透明隔缺失、酸性脂肪酶病、酸性麦芽糖酶缺乏症、获得性癫痫样失语、急性播散性脑脊髓炎、注意力不足
‑
过动症(adhd)、艾迪氏瞳孔(adie's pupil)、艾迪氏综合征(adie's syndrome)、肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不全、认知障碍症、艾卡迪综合征(aicardi syndrome)、艾
‑
高二氏综合征病症(aicardi
‑
goutieres syndrome disorder)、aids
‑
神经并发症、亚历山大病(alexander disease)、阿尔珀斯病(alpers'disease)、交替性偏瘫、阿尔茨海默病(alzheimer's disease)、肌萎缩性侧索硬化(als)、无脑(anencephaly)、动脉瘤、安格尔曼氏综合征(angelman syndrome)、血管瘤病、缺氧症、抗磷脂综合征、失语症、失用症、蜘蛛膜囊肿、蛛网膜炎、阿诺德
‑
基亚里畸形(arnold
‑
chiari malformation)、动静脉畸形、亚斯伯格综合征(asperger syndrome)、共济失调、共济失调毛细血管扩张症、共济失调和小脑或脊髓小脑变性、心房微颤和中风、注意力不足
‑
过动症、自闭症谱系障碍、自主功能障碍、背痛、巴特综合征(barth syndrome)、贝敦氏病(batten disease)、贝克氏肌强直(becker'smyotonia)、白塞氏病(behcet's disease)、伯耳氏瘫(bell's palsy)、良性特发性眼睑痉挛、良性局灶性肌萎缩、良性颅内高血压、伯
‑
罗二氏综合征(bernhardt
‑
roth syndrome)、贝瓦克氏病(binswanger's disease)、眼睑痉挛、布
‑
苏二氏综合征(bloch
‑
sulzberger syndrome)、臂丛神经产伤、臂丛神经损伤、布
‑
艾二氏综合征(bradbury
‑
eggleston syndrome)、脑脊柱肿瘤、脑动脉瘤、脑损伤、布
‑
色二氏综合征(brown
‑
sequard syndrome)、延髓肌肉萎缩、脑常染色体显性动脉病伴皮质下梗死和脑白质病(cadasil)、卡纳万病(canavan disease)、腕管综合征、灼性神经痛、海绵状血管瘤(cavernomas)、海绵状血管瘤(cavernous angioma)、海绵状畸形、中央颈髓综合征、中央脊髓综合征、中枢性疼痛综合征、中央脑桥脊髓溶解、头部疾病、神经酰胺酶缺乏、小脑变性、小脑发育不全、脑部动脉瘤、脑部动脉硬化、脑萎缩、脑型脚气病、脑部脑部海绵状血管畸形、脑巨大症、脑部缺氧、脑性麻痹、脑眼面骨骼综合征(cofs)、恰克
‑
马里
‑
杜斯氏病(charcot
‑
marie
‑
tooth disease)、奇阿里畸形(chiari malformation)、脑腱性黄瘤症、舞蹈病、舞蹈型棘细胞增多症、慢性发炎性脱髓鞘多发性神经病(cidp)、慢性直立不耐受、慢性疼痛、第二型柯凯因氏综合征(cockayne syndrome type ii)、科芬
‑
劳里综合征(coffin lowry syndrome)、空洞脑、昏迷、复杂区域疼痛综合征、先天性面瘫综合征、先天性肌无力、先天性肌病、先天性脉管海绵状畸形、皮质基底核退化症、颞动脉炎、颅缝线过早封闭、克里脑炎(cree encephalitis)、库贾氏病(creutzfeldt
‑
jakob disease)、累积性创伤疾病、库欣综合征(cushing's syndrome)、巨细胞包涵体病、巨细胞病毒感染、眼足舞蹈综合征、丹迪
‑
沃克综合征(dandy
‑
walker syndrome)、道森疾病(dawson disease)、狄莫西亚氏综合征(de morsier's syndrome)、德热里纳
‑
克隆普克麻痹(dejerine
‑
klumpke palsy)、痴呆、多发梗塞性痴呆、语意型痴呆、皮质下痴呆、路易体痴呆、齿状小脑共济失调、齿状红核萎缩、皮肌炎、发展性运动障碍、德维克氏综合征(devic's syndrome)、糖尿病神经病变、弥漫性硬化、卓弗综合征(dravet syndrome)、自主神经失调、书写困难、诵读困难、吞咽困难、运用障碍、肌阵挛性小脑协调障碍、进行性小脑协调障碍、肌张力障碍、早期婴儿型癫痫性脑病、空鞍综合征、脑炎、流行性脑炎、脑膨出、脑病、脑病(家族性婴儿)、脑三叉神经血管瘤病、癫痫症、癫痫性半身麻痹、欧
氏麻痹(erb's palsy)、欧
‑
杜二氏(erb
‑
duchenne)和杰琳
‑
克隆普克氏麻痹(dejerine
‑
klumpke palsies)、特发性震颤、髓鞘溶解症、法布里病(fabry disease)、法尔氏综合征(fahr's syndrome)、昏厥、家族性自主神经失调、家族性血管瘤、家族性特发性基底节钙化、家族性周期性麻痹、家族性痉挛性麻痹、法伯病(farber's disease)、热性痉挛、肌肉纤维发育不良、费雪综合征(fisher syndrome)、松软婴儿综合征、足下垂、弗里德希氏共济失调(friedreich's ataxia)、额颞叶型痴呆、高雪氏病(gaucher disease)、全身性神经节苷脂沉积病、格斯特曼综合征(gerstmann'ssyndrome)、杰茨曼
‑
斯脱司勒
‑
史茵克病(gerstmann
‑
straussler
‑
scheinker disease)、巨大轴索神经病、巨细胞动脉炎、巨细胞性包涵体病、球状细胞脑白质营养不良、舌咽神经痛、糖原贮积病、格
‑
巴二氏综合征(guillain
‑
barr
é
syndrome)、霍勒沃顿
‑
斯帕兹病(hallervorden
‑
spatz disease)、头损伤、头痛、持续性半边头痛、面肌痉挛、交叉性偏瘫、遗传性神经病变、遗传性痉挛性截瘫、遗传性共济失调性多发性神经炎、带状疱疹、耳带状疱疹、平山综合征(hirayama syndrome)、福尔摩斯
‑
艾迪综合征(holmes
‑
adie syndrome)、前脑无裂畸形、htlv
‑
1相关脊髓病变、休斯综合征(hughes syndrome)、亨廷顿病、脑内积水、脑积水、正常压力脑积水、脊髓积水、皮质醇增多症、睡眠过度、紧张亢进、低张症、低氧、免疫介导性脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿低张症、婴儿神经轴索性变性、婴儿植烷酸贮积病、婴儿雷夫叙姆病(infantile refsum disease)、婴儿痉挛、发炎性肌病、枕骨裂露脑畸形、肠源性脂肪代谢障碍症、颅内包囊、颅内高血压、伊萨克斯综合征(isaacs'syndrome)、朱伯特综合征(joubert syndrome)、kearns
‑
sayre综合征、肯尼迪病(kennedy's disease)、金斯布尔纳综合征(kinsbourne syndrome)、克莱恩
‑
莱文综合征(kleine
‑
levin syndrome)、克
‑
费二氏综合征(klippel
‑
feil syndrome)、克
‑
特综合征(klippel
‑
trenaunay syndrome,kts)、克鲁尔
‑
布西综合征(kl
ü
ver
‑
bucy syndrome)、科尔萨科夫氏失忆综合征(korsakoff's amnesic syndrome)、克拉培病(krabbe disease)、库格尔伯格
‑
威兰德病(kugelberg
‑
welander disease)、库鲁病(kuru)、兰伯特
‑
伊顿重肌无力综合征(lambert
‑
eaton myasthenic syndrome)、兰道
‑
克莱夫纳综合征(landau
‑
kleffner syndrome)、股外侧皮神经卡陷、外侧延髓综合征、学习障碍、莱氏病(leigh's disease)、雷葛氏综合征(lennox
‑
gastaut syndrome)、莱希
‑
尼亨综合征(lesch
‑
nyhan syndrome)、脑白质营养不良、levine
‑
critchley综合征、路易体性痴呆、脂质贮积病、类脂蛋白沉积症、平脑症、闭锁综合征、葛雷克氏病(lou gehrig's disease)、狼疮
‑
神经性后遗症、莱姆病
‑
神经性并发症、马查多
‑
约瑟夫病(machado
‑
joseph disease)、巨脑(macrencephaly)、巨脑症(megalencephaly)、梅
‑
罗二氏综合征(melkersson
‑
rosenthal syndrome)、脑膜炎、脑膜炎与脑炎、门克斯病(menkes disease)、感觉异常性股痛(meralgia paresthetica)、异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy)、小头畸形(microcephaly)、偏头痛(migraine)、米勒费雪综合征(miller fisher syndrome)、小中风(mini stroke)、粒线体肌病(mitochondrial myopathy)、莫比乌斯综合征(moebius syndrome)、单体肌萎缩(monomelic amyotrophy)、运动神经元疾病(motor neuron diseases)、烟雾病(moyamoya disease)、粘脂贮积病(mucolipidoses)、粘多糖贮积病(mucopolysaccharidoses)、多梗塞性痴呆、多病灶运动神经病、多发性硬化、多发性系统萎缩、多发性系统萎缩伴起立性低血压、肌肉萎缩、先天性肌无力、重症肌无力、脱髓鞘弥漫性硬化、婴儿肌痉挛性脑病、肌阵挛、肌病、先天性肌病、甲状
dystrophy syndrome)、雷夫苏姆氏病(refsum disease)、婴儿雷夫苏姆氏病、重复运动障碍(repetitive motion disorders)、重复使力伤害(repetitive stress injuries)、不宁腿综合征(restless legs syndrome)、逆转录病毒相关脊髓病(retrovirus
‑
associated myelopathy)、瑞特综合征(rett syndrome)、雷氏综合征(reye's syndrome)、风湿性脑炎(rheumatic encephalitis)、雷德二氏综合征(riley
‑
day syndrome)、骶神经根囊肿(sacral nerve root cysts)、圣菲特舞蹈病(saint vitus dance)、唾液腺病毒(salivary gland disease)、山多夫氏病(sandhoff disease)、希尔德病(schilder's disease)、脑裂畸形(schizencephaly)、赛特贝格病(seitelberger disease)、癫痫发作(seizure disorder)、词义性痴呆(semantic dementia)、透明隔
‑
视神经发育不良(septo
‑
optic dysplasia)、婴儿重症肌痉挛癫痫症(severe myoclonic epilepsy of infancy,smei)、婴儿摇晃综合征(shaken baby syndrome)、带状疱疹(shingles)、夏
‑
德综合征(shy
‑
drager syndrome)、休格伦氏综合征(syndrome)、睡眠呼吸中止(sleep apnea)、昏睡病(sleeping sickness)、索托氏综合征(sotos syndrome)、痉挛(spasticity)、脊柱裂(spina bifida)、脊髓梗塞(spinal cord infarction)、脊髓损伤(spinal cord injury)、脊髓肿瘤(spinal cord tumors)、脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)、脊髓小脑萎缩(spinocerebellar atrophy)、脊髓小脑退化(spinocerebellar degeneration)、斯蒂尔
‑
理查德森
‑
奥尔斯泽夫斯基综合征(steele
‑
richardson
‑
olszewski syndrome)、僵人综合征(stiff
‑
person syndrome)、黑质退化(striatonigral degeneration)、中风、斯特奇
‑
韦伯综合征(sturge
‑
weber syndrome)、亚急性硬化性全脑炎(subacute sclerosing panencephalitis)、皮质下动脉硬化脑病(subcortical arteriosclerotic encephalopathy)、短暂性单侧神经痛样(short
‑
lasting,unilateral,neuralgiform,sunct)头痛、吞咽障碍(swallowing disorders)、西德纳姆舞蹈病(sydenham chorea)、晕厥(syncope)、梅毒性脊髓硬化(syphilitic spinal sclerosis)、脊髓空洞积水症(syringohydromyelia)、脊髓空洞病(syringomyelia)、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、脊髓痨(tabes dorsalis)、迟发性运动不能(tardive dyskinesia)、塔洛夫囊肿(tarlov cysts)、泰
‑
萨克斯病(tay
‑
sachs disease)、颞动脉炎(temporal arteritis)、脊髓牵扯综合征(tethered spinal cord syndrome)、汤姆森氏肌强直(thomsen'smyotonia)、胸廓出口综合征(thoracic outlet syndrome)、甲状腺毒性肌病、三叉神经痛(tic douloureux)、托德氏麻痹(todd's paralysis)、妥瑞综合征(tourette syndrome)、暂时性缺血性发作(transient ischemic attack)、传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathies)、横贯性脊髓炎(transverse myelitis)、创伤性脑损伤(traumatic brain injury)、震颤、三叉神经痛(trigeminal neuralgia)、热带痉挛性截瘫(tropical spastic paraparesis)、特洛耶综合征(troyer syndrome)、结节性硬化(tuberous sclerosis)、血管性勃起肿瘤(vascular erectile tumor)、中枢和周边神经系统的血管炎综合征(vasculitis syndromes of the central and peripheral nervous systems)、埃科诺莫病(von economo's disease)、逢希伯
‑
林道病(von hippel
‑
lindau disease,vhl)、冯锐克林氏病(von recklinghausen's disease)、瓦伦伯格氏综合征(wallenberg's syndrome)、韦德尼希
‑
霍夫曼病(werdnig
‑
hoffman disease)、韦尼克
‑
科罗萨科夫综合征(wernicke
‑
korsakoff syndrome)、韦斯特综合征
(west syndrome)、挥鞭症(whiplash)、惠普尔氏病(whipple's disease)、威廉氏综合征(williams syndrome)、威尔森氏病(wilson disease)、伍尔曼氏病(wolman's disease)、x性联脊髓延髓肌肉萎缩(x
‑
linked spinal and bulbar muscular atrophy)。
[1181]
本公开另外提供了一种治疗哺乳动物受试者(包括人类受试者)的神经病症的方法,所述方法包括向所述受试者施用本公开的aav颗粒或药物组合物中的任一者。在某些实施方案中,aav颗粒是穿过血脑屏障的颗粒。在某些实施方案中,根据本文所述的方法治疗的神经病症包括但不限于肌萎缩性侧索硬化(als)、亨廷顿病(hd)、帕金森病(pd)和/或弗里德希氏共济失调(fa)。
[1182]
试剂盒和装置
[1183]
试剂盒
[1184]
在一些实施方案中,本公开提供了多种用于便利地和/或有效地实行本公开的方法的试剂盒。通常,试剂盒将包含足以允许使用者对受试者进行多个治疗和/或进行多个实验的组分量和/或数目。
[1185]
本公开的aav颗粒中的任一者可包含于试剂盒中。在一些实施方案中,试剂盒还可包含用于产生和/或合成本公开的化合物和/或组合物的试剂和/或说明书。在一些实施方案中,试剂盒还可包含一种或多种缓冲剂。在一些实施方案中,本公开的试剂盒可包含用于制造蛋白质或核酸阵列或文库的组分,并且因此可包含例如固体支撑物。
[1186]
在一些实施方案中,试剂盒组分可包装于水性培养基中或以冻干形式包装。所述试剂盒的容器构件通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器,或者可放入组分或优选适宜等分的其他容器构件。在存在超过一种试剂盒组分(标记试剂和标记可包装在一起)的情况下,试剂盒通常还可含有第二、第三或其他额外容器,在其中可分开地置放有额外组分。在一些实施方案中,试剂盒还可包含用于容纳药学上可接受的无菌缓冲液和/或其他稀释剂的第二容器构件。在一些实施方案中,组分的各种组合可包含于一个或多个小瓶中。本公开的试剂盒还可通常包含密封存放以用于商业销售的用于容纳本公开的化合物和/或组合物(例如蛋白质、核酸)的构件和任何其他试剂容器。此类容器可包含固持所需小瓶的注射模制或吹塑模制的塑料容器。
[1187]
在一些实施方案中,试剂盒组分以一种和/或多种液体溶液形式来提供。在一些实施方案中,液体溶液是水溶液,其中无菌水溶液是特别优选的。在一些实施方案中,试剂盒组分可以干粉形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时,此类粉末可通过添加合适体积的溶剂来重配。在一些实施方案中,预想还可在另一个容器构件中提供溶剂。在一些实施方案中,标记染料以干燥粉末形式提供。在一些实施方案中,预期在本公开的试剂盒中提供10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微克或至少或至多那些量的干燥染料。在此类实施方案中,染料然后可重悬于任何合适的溶剂如dmso中。
[1188]
在一些实施方案中,试剂盒可包含用于采用试剂盒组分以及使用未包含于所述试剂盒中的任何其他试剂的说明书。说明书可包含可实施的变化形式。
[1189]
装置
[1190]
在一些实施方案中,可使用递送aav颗粒的装置和头部固定组件向受试者递送aav颗粒。所述头部固定组件可为但不限于由mri interventions出售的任何头部固定组件。作
为一个非限制性实例,头部固定组件可为美国专利第8,099,150号、第8,548,569号和第9,031,636号以及国际专利公开第wo201108495号和第wo2014014585号中所述的组件中的任一者,所述文件中的每一者的内容通过引用整体并入本文。头部固定组件可与mri相容性钻孔器组合使用,例如但不限于国际专利公开第wo2013181008号和美国专利公开第us20130325012号中所述的mri相容性钻孔器,所述文件的内容通过引用整体并入本文。
[1191]
在一些实施方案中,可使用用于将设备定位于受试者上的目标点以递送aav颗粒的方法、系统和/或计算机程序来递送aav颗粒。作为一个非限制性实例,方法、系统和/或计算机程序可为美国专利第8,340,743号中所述的方法、系统和/或计算机程序,所述美国专利的内容通过引用整体并入本文。所述方法可包括:在体内确定目标点和参考点,其中所述目标点和所述参考点限定延伸穿过各点的规划轨迹线(planned trajectory line,ptl);确定可视化平面,其中所述ptl与所述可视化平面在观察点处相交;相对于身体安装引导装置以关于ptl移动,其中所述引导装置不与可视化平面相交;确定引导轴与可视化平面之间的相交点(gpp);以及在可视化平面中使gpp与观察点对准。
[1192]
在一些实施方案中,可使用常规增强型递送装置向受试者递送aav颗粒。使用对流来进行药物靶向递送的非限制性实例描述于美国专利公开第us20100217228号、第us20130035574号和第us20130035660号以及国际专利公开第wo2013019830号和第wo2008144585号中,其中每一者的内容通过引用整体并入本文。
[1193]
在一些实施方案中,可在递送aav颗粒之前、期间和/或之后对受试者成像。成像方法可为本领域中已知和/或本文所述的方法,例如但不限于磁共振成像(mri)。作为一个非限制性实例,成像可用于评估治疗效果。作为另一个非限制性实例,成像可用于辅助递送aav颗粒。
[1194]
在一些实施方案中,可使用mri引导装置来递送aav颗粒。mri引导装置的非限制性实例描述于美国专利第9,055,884号、第9,042,958号、第8,886,288号、第8,768,433号、第8,396,532号、第8,369,930号、第8,374,677号和第8,175,677号以及美国专利申请第us20140024927号中,其中每一者的内容通过引用整体并入本文。作为一个非限制性实例,mri引导装置可能够提供实时数据,例如美国专利第8,886,288号和第8,768,433号中所述的那些数据,所述美国专利中每一者的内容通过引用整体并入本文。作为另一个非限制性实例,mri引导装置或系统可与靶向套管一起使用,例如美国专利第8,175,677号和第8,374,677号中所述的系统,其中每一者的内容通过引用整体并入本文。作为又一个非限制性实例,mri引导装置包含如例如美国专利第9,055,884号和美国专利申请第us20140024927号中所述的用于引导干预装置的轨迹引导框架,所述文件中每一者的内容通过引用整体并入本文。
[1195]
在一些实施方案中,可使用mri相容性端部组件来递送aav颗粒。mri相容性端部组件的非限制性实例描述于美国专利公开第us20140275980号中,其内容通过引用整体并入本文。
[1196]
在一些实施方案中,可使用mri相容性套管来递送aav颗粒。mri相容性套管的非限制性实例包括国际专利公开第wo2011130107号中所教导的那些,所述国际专利公开的内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中,套管或其一部分或与套管相关联的管附接、安装、胶合、贴附或以其他方式可逆地接触手术位点/场周围的组织。在程序的全部或一部分
期间,这种接触可定位和/或稳定在一个位置中。
[1197]
在一些实施方案中,可使用mri相容性导管来递送aav颗粒。mri相容性导管的非限制性实例包括国际专利公开第wo2012116265号、美国专利公开第8,825,133号和美国专利公开第us20140024909号中所教导的导管,所述文件中每一者的内容通过引用整体并入本文。
[1198]
在一些实施方案中,可使用如美国专利公开第us20140276582号和第us20140276614号中所述的具有细长管式主体和隔膜的装置来递送aav颗粒,所述美国专利公开中每一者的内容通过引用整体并入本文。
[1199]
在一些实施方案中,可使用mri相容性定位和/或引导系统来递送aav颗粒,所述系统例如但不限于美国专利公开第us20150223905号和第us20150230871号中所述的那些系统,所述美国专利公开中每一者的内容通过引用整体并入本文。作为一个非限制性实例,mri相容性定位和/或引导系统可包括适宜于对患者进行固定的安装件、被配置以附接至所述安装件以便能够在至少三个维度中可控制地平移的具有内腔的靶向套管、以及被配置以在靶向套管内腔中经由滑道贴合地前进和缩回的细长探针,所述细长探针包含刺激或记录电极中的至少一者。
[1200]
在一些实施方案中,可使用如美国专利公开第us20150031982号和第us20140066750号以及国际专利公开第wo2015057807号和第wo2014039481号中所述的轨迹框架向受试者递送aav颗粒,所述文件中每一者的内容通过引用整体并入本文。
[1201]
在一些实施方案中,可使用基因枪向受试者递送aav颗粒。
[1202]
使用编码蛋白质有效负载的aav颗粒
[1203]
本公开提供了将根据本公开的方法和系统制备的aav颗粒引入至细胞中的方法,所述方法包括以足以出现目标mrna和蛋白质产量增加的量将任何载体引入至所述细胞中。在一些方面,细胞可为肌肉细胞;干细胞;神经元,例如但不限于运动神经元、海马神经元、内嗅神经元、丘脑神经元或皮质神经元;和神经胶质细胞,例如星形胶质细胞或微神经胶质细胞。
[1204]
本公开公开了治疗需要治疗的受试者的与目标蛋白质的功能/存在不足相关的神经疾病的方法。所述方法任选地包括向所述受试者施用治疗有效量的包含本公开的aav颗粒的组合物。作为一个非限制性实例,aav颗粒可增加受试者中的目标基因表达,增大目标蛋白质产生,并因此减少神经疾病的一种或多种症状,使得受试者得到治疗性治疗。
[1205]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒包含编码蛋白质有效负载的核酸,所述aav颗粒包含允许在静脉内施用后穿过血脑屏障传输的aav衣壳。
[1206]
在某些实施方案中,经由全身性施用向受试者的中枢神经系统施用包含本公开的aav颗粒的组合物。在某些实施方案中,全身性施用是静脉内注射。
[1207]
在某些实施方案中,向受试者的中枢神经系统施用包含本公开的aav颗粒的组合物。在某些实施方案中,向受试者组织(例如受试者大脑)施用包含本公开的aav颗粒的组合物。
[1208]
在某些实施方案中,经由脑实质内注射向受试者的中枢神经系统施用包含本公开的aav颗粒的组合物。实质内注射的非限制性实例包括丘脑内、纹状体内、海马内或靶向内嗅皮质。
[1209]
在某些实施方案中,经由脑实质内注射和鞘内注射向受试者的中枢神经系统施用包含本公开的aav颗粒的组合物。
[1210]
在某些实施方案中,可将本公开的aav颗粒递送至特定类型的经靶向细胞中,包括但不限于海马神经元、皮质神经元、运动神经元或内嗅神经元;神经胶质细胞,包含少突神经胶质细胞、星形胶质细胞和微神经胶质细胞;和/或神经元周围的其他细胞,例如t细胞。
[1211]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒可递送至纹状体(例如壳核)和/或皮质中的神经元。
[1212]
在某些实施方案中,可将本公开的aav颗粒用作神经疾病的疗法。
[1213]
在某些实施方案中,可使用本公开的aav颗粒来增加受试者中的目标蛋白质并减少神经疾病的症状。目标蛋白质的增加和/或神经疾病症状的减少可独立地为改变(对目标蛋白质的产生而言为增加并且对神经疾病的症状而言为减少)5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%,或超过95%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%、5
‑
30%、5
‑
35%、5
‑
40%、5
‑
45%、5
‑
50%、5
‑
55%、5
‑
60%、5
‑
65%、5
‑
70%、5
‑
75%、5
‑
80%、5
‑
85%、5
‑
90%、5
‑
95%、10
‑
20%、10
‑
25%、10
‑
30%、10
‑
35%、10
‑
40%、10
‑
45%、10
‑
50%、10
‑
55%、10
‑
60%、10
‑
65%、10
‑
70%、10
‑
75%、10
‑
80%、10
‑
85%、10
‑
90%、10
‑
95%、15
‑
25%、15
‑
30%、15
‑
35%、15
‑
40%、15
‑
45%、15
‑
50%、15
‑
55%、15
‑
60%、15
‑
65%、15
‑
70%、15
‑
75%、15
‑
80%、15
‑
85%、15
‑
90%、15
‑
95%、20
‑
30%、20
‑
35%、20
‑
40%、20
‑
45%、20
‑
50%、20
‑
55%、20
‑
60%、20
‑
65%、20
‑
70%、20
‑
75%、20
‑
80%、20
‑
85%、20
‑
90%、20
‑
95%、25
‑
35%、25
‑
40%、25
‑
45%、25
‑
50%、25
‑
55%、25
‑
60%、25
‑
65%、25
‑
70%、25
‑
75%、25
‑
80%、25
‑
85%、25
‑
90%、25
‑
95%、30
‑
40%、30
‑
45%、30
‑
50%、30
‑
55%、30
‑
60%、30
‑
65%、30
‑
70%、30
‑
75%、30
‑
80%、30
‑
85%、30
‑
90%、30
‑
95%、35
‑
45%、35
‑
50%、35
‑
55%、35
‑
60%、35
‑
65%、35
‑
70%、35
‑
75%、35
‑
80%、35
‑
85%、35
‑
90%、35
‑
95%、40
‑
50%、40
‑
55%、40
‑
60%、40
‑
65%、40
‑
70%、40
‑
75%、40
‑
80%、40
‑
85%、40
‑
90%、40
‑
95%、45
‑
55%、45
‑
60%、45
‑
65%、45
‑
70%、45
‑
75%、45
‑
80%、45
‑
85%、45
‑
90%、45
‑
95%、50
‑
60%、50
‑
65%、50
‑
70%、50
‑
75%、50
‑
80%、50
‑
85%、50
‑
90%、50
‑
95%、55
‑
65%、55
‑
70%、55
‑
75%、55
‑
80%、55
‑
85%、55
‑
90%、55
‑
95%、60
‑
70%、60
‑
75%、60
‑
80%、60
‑
85%、60
‑
90%、60
‑
95%、65
‑
75%、65
‑
80%、65
‑
85%、65
‑
90%、65
‑
95%、70
‑
80%、70
‑
85%、70
‑
90%、70
‑
95%、75
‑
85%、75
‑
90%、75
‑
95%、80
‑
90%、80
‑
95%或90
‑
95%。
[1214]
使用包含rnai多核苷酸的aav颗粒
[1215]
本公开提供了将包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的aav颗粒引入至细胞中的方法,所述方法包括以足以出现目标mrna降解的量将任何载体引入至所述细胞中,由此激活细胞中的目标特异性rnai。在一些方面,细胞可为肌肉细胞;干细胞;神经元,例如但不限于运动神经元、海马神经元、内嗅神经元、丘脑神经元或皮质神经元;和神经胶质细胞,例如星形胶质细胞或微神经胶质细胞。
[1216]
本公开中公开了用于治疗需要治疗的受试者的与目标蛋白质的功能障碍相关的神经疾病的方法。所述方法任选地包括向受试者施用治疗有效量的组合物,所述组合物包含aav颗粒,所述aav颗粒包含编码本公开的sirna分子的核酸序列。作为一个非限制性实例,sirna分子可使受试者中的目标基因表达沉默,抑制目标蛋白质生产,和减少神经疾病的一种或多种症状,使得受试者得到治疗性治疗。
[1217]
在某些实施方案中,包含本公开aav颗粒(包含编码sirna分子的核酸序列)的组合物包含允许在静脉内施用后穿过血脑屏障的aav衣壳。
[1218]
在某些实施方案中,将包含有包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的aav颗粒的组合物施用至受试者的中枢神经系统。在某些实施方案中,将包含有包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的aav颗粒的组合物施用至受试者组织(例如受试者大脑)。
[1219]
在某些实施方案中,将包含有包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的aav颗粒的组合物经由全身性施用施用至受试者的中枢神经系统。在某些实施方案中,全身性施用是静脉内注射。
[1220]
在某些实施方案中,包含有包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的aav颗粒的组合物经由脑实质内注射施用至受试者的中枢神经系统。脑实质内注射的非限制性实例包括丘脑内、纹状体内、海马内或靶向内嗅皮质。
[1221]
在某些实施方案中,将包含有包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的aav颗粒的组合物经由脑实质内注射和鞘内注射施用至受试者的中枢神经系统。
[1222]
在某些实施方案中,可将包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的aav颗粒递送至特定类型的靶向细胞,包括但不限于:海马神经元、皮质神经元、运动神经元或内嗅神经元;神经胶质细胞,包含少突神经胶质细胞、星形胶质细胞和微神经胶质细胞;和/或神经元周围的其他细胞,例如t细胞。
[1223]
在某些实施方案中,可将包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的aav颗粒递送至纹状体和/或皮质中的神经元。
[1224]
在某些实施方案中,包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的aav颗粒可用作神经疾病的疗法。
[1225]
在某些实施方案中,包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的aav颗粒可用作肌萎缩性侧索硬化的疗法。
[1226]
在某些实施方案中,包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的aav颗粒可用作亨廷顿病的疗法。
[1227]
在某些实施方案中,包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的aav颗粒可用作帕金森病的疗法。
[1228]
在某些实施方案中,包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的aav颗粒可用作弗里德希氏共济失调的疗法。
[1229]
在某些实施方案中,包含编码本公开的sirna分子的核酸序列的aav颗粒可用于抑制目标以治疗神经疾病。可将星形胶质细胞中的目标蛋白质抑制5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%,或超过95%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%、5
‑
30%、5
‑
35%、5
‑
40%、5
‑
45%、5
‑
50%、5
‑
55%、5
‑
60%、5
‑
65%、5
‑
70%、5
‑
75%、5
‑
80%、5
‑
85%、5
‑
90%、5
‑
95%、10
‑
20%、10
‑
25%、10
‑
30%、10
‑
35%、10
‑
40%、10
‑
45%、10
‑
50%、10
‑
55%、10
‑
60%、10
‑
65%、10
‑
70%、10
‑
75%、10
‑
80%、10
‑
85%、10
‑
90%、10
‑
95%、15
‑
25%、15
‑
30%、15
‑
35%、15
‑
40%、15
‑
45%、15
‑
50%、15
‑
55%、15
‑
60%、15
‑
65%、15
‑
70%、15
‑
75%、15
‑
80%、15
‑
85%、15
‑
90%、15
‑
95%、20
‑
30%、20
‑
35%、20
‑
40%、20
‑
45%、20
‑
50%、20
‑
55%、20
‑
60%、20
‑
65%、20
‑
70%、20
‑
75%、20
‑
80%、20
‑
85%、20
‑
90%、20
‑
95%、25
‑
35%、25
‑
40%、25
‑
45%、25
‑
50%、25
‑
55%、
25
‑
60%、25
‑
65%、25
‑
70%、25
‑
75%、25
‑
80%、25
‑
85%、25
‑
90%、25
‑
95%、30
‑
40%、30
‑
45%、30
‑
50%、30
‑
55%、30
‑
60%、30
‑
65%、30
‑
70%、30
‑
75%、30
‑
80%、30
‑
85%、30
‑
90%、30
‑
95%、35
‑
45%、35
‑
50%、35
‑
55%、35
‑
60%、35
‑
65%、35
‑
70%、35
‑
75%、35
‑
80%、35
‑
85%、35
‑
90%、35
‑
95%、40
‑
50%、40
‑
55%、40
‑
60%、40
‑
65%、40
‑
70%、40
‑
75%、40
‑
80%、40
‑
85%、40
‑
90%、40
‑
95%、45
‑
55%、45
‑
60%、45
‑
65%、45
‑
70%、45
‑
75%、45
‑
80%、45
‑
85%、45
‑
90%、45
‑
95%、50
‑
60%、50
‑
65%、50
‑
70%、50
‑
75%、50
‑
80%、50
‑
85%、50
‑
90%、50
‑
95%、55
‑
65%、55
‑
70%、55
‑
75%、55
‑
80%、55
‑
85%、55
‑
90%、55
‑
95%、60
‑
70%、60
‑
75%、60
‑
80%、60
‑
85%、60
‑
90%、60
‑
95%、65
‑
75%、65
‑
80%、65
‑
85%、65
‑
90%、65
‑
95%、70
‑
80%、70
‑
85%、70
‑
90%、70
‑
95%、75
‑
85%、75
‑
90%、75
‑
95%、80
‑
90%、80
‑
95%或90
‑
95%。星形胶质细胞中的目标蛋白质可减少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%,或超过95%、5
‑
15%、5
‑
20%、5
‑
25%、5
‑
30%、5
‑
35%、5
‑
40%、5
‑
45%、5
‑
50%、5
‑
55%、5
‑
60%、5
‑
65%、5
‑
70%、5
‑
75%、5
‑
80%、5
‑
85%、5
‑
90%、5
‑
95%、10
‑
20%、10
‑
25%、10
‑
30%、10
‑
35%、10
‑
40%、10
‑
45%、10
‑
50%、10
‑
55%、10
‑
60%、10
‑
65%、10
‑
70%、10
‑
75%、10
‑
80%、10
‑
85%、10
‑
90%、10
‑
95%、15
‑
25%、15
‑
30%、15
‑
35%、15
‑
40%、15
‑
45%、15
‑
50%、15
‑
55%、15
‑
60%、15
‑
65%、15
‑
70%、15
‑
75%、15
‑
80%、15
‑
85%、15
‑
90%、15
‑
95%、20
‑
30%、20
‑
35%、20
‑
40%、20
‑
45%、20
‑
50%、20
‑
55%、20
‑
60%、20
‑
65%、20
‑
70%、20
‑
75%、20
‑
80%、20
‑
85%、20
‑
90%、20
‑
95%、25
‑
35%、25
‑
40%、25
‑
45%、25
‑
50%、25
‑
55%、25
‑
60%、25
‑
65%、25
‑
70%、25
‑
75%、25
‑
80%、25
‑
85%、25
‑
90%、25
‑
95%、30
‑
40%、30
‑
45%、30
‑
50%、30
‑
55%、30
‑
60%、30
‑
65%、30
‑
70%、30
‑
75%、30
‑
80%、30
‑
85%、30
‑
90%、30
‑
95%、35
‑
45%、35
‑
50%、35
‑
55%、35
‑
60%、35
‑
65%、35
‑
70%、35
‑
75%、35
‑
80%、35
‑
85%、35
‑
90%、35
‑
95%、40
‑
50%、40
‑
55%、40
‑
60%、40
‑
65%、40
‑
70%、40
‑
75%、40
‑
80%、40
‑
85%、40
‑
90%、40
‑
95%、45
‑
55%、45
‑
60%、45
‑
65%、45
‑
70%、45
‑
75%、45
‑
80%、45
‑
85%、45
‑
90%、45
‑
95%、50
‑
60%、50
‑
65%、50
‑
70%、50
‑
75%、50
‑
80%、50
‑
85%、50
‑
90%、50
‑
95%、55
‑
65%、55
‑
70%、55
‑
75%、55
‑
80%、55
‑
85%、55
‑
90%、55
‑
95%、60
‑
70%、60
‑
75%、60
‑
80%、60
‑
85%、60
‑
90%、60
‑
95%、65
‑
75%、65
‑
80%、65
‑
85%、65
‑
90%、65
‑
95%、70
‑
80%、70
‑
85%、70
‑
90%、70
‑
95%、75
‑
85%、75
‑
90%、75
‑
95%、80
‑
90%、80
‑
95%或90
‑
95%。
[1230]
在某些实施方案中,向受试者施用本公开的编码sirna的aav颗粒可降低受试者中的目标蛋白质水平。受试者中的,例如但不限于受试者的cns、cns区或cns的特定细胞的目标蛋白质水平可降低约30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%和100%或至少20
‑
30%、20
‑
40%、20
‑
50%、20
‑
60%、20
‑
70%、20
‑
80%、20
‑
90%、20
‑
95%、20
‑
100%、30
‑
40%、30
‑
50%、30
‑
60%、30
‑
70%、30
‑
80%、30
‑
90%、30
‑
95%、30
‑
100%、40
‑
50%、40
‑
60%、40
‑
70%、40
‑
80%、40
‑
90%、40
‑
95%、40
‑
100%、50
‑
60%、50
‑
70%、50
‑
80%、50
‑
90%、50
‑
95%、50
‑
100%、60
‑
70%、60
‑
80%、60
‑
90%、60
‑
95%、60
‑
100%、70
‑
80%、70
‑
90%、70
‑
95%、70
‑
100%、80
‑
90%、80
‑
95%、80
‑
100%、90
‑
95%、90
‑
100%或95
‑
100%。作为一个非限制性实例,aav颗粒可使目标蛋白质的蛋白质水平降低至少50%。作为一个非限制性实例,aav颗粒可使目标蛋白质的蛋白质水平降低至少40%。
[1231]
治疗适应症
[1232]
帕金森病
[1233]
帕金森病(pd)是一种尤其影响大脑黑质的神经系统进行性病症。pd是由于产多巴胺的脑细胞的损失而发展。pd的典型的早期症状包括肢体摇晃或颤抖,例如手、手臂、腿、脚和脸摇晃或颤抖。额外的特征症状是肢体和躯干僵硬,移动缓慢或无法移动,平衡和协调能力减弱,认知改变以及存在精神疾患,例如抑郁症和视幻觉。pd具有家族性和特发性两种形式,并且被认为与遗传和环境原因有关。pd影响全球超过4百万人。在美国,每年鉴定出约60,000个病例。一般来说,pd开始于50岁以后。所述疾患的早期发作形式开始于年龄小于50岁时,而幼发型pd开始于20岁之前。
[1234]
与pd相关的产多巴胺的脑细胞的死亡与α
‑
突触核蛋白的聚集、沉积和功能障碍相关(参见例如marques和outeiro,2012,cell death dis.3:e350;jenner,1989,j neurol neurosurg psychiatry.特别增刊,22
‑
28,和其中的参考文献)。研究表明,α
‑
突触核蛋白在突触前信号传导、膜移行和多巴胺释放和转运调节中起作用。例如呈寡聚物形式的α
‑
突触核蛋白聚集体已被认为是导致神经元功能障碍和死亡的物种。已经在家族性形式的pd中鉴定到α
‑
突触核蛋白基因(snca)的突变,但例如神经毒素的环境因素也会影响α
‑
突触核蛋白聚集。已提出的pd中脑细胞死亡的其他原因是蛋白酶体和溶酶体系统的功能障碍、线粒体活性降低。
[1235]
pd与其他和α
‑
突触核蛋白聚集相关的疾病有关,所述疾病被称为“突触核蛋白病”。所述疾病包括但不限于帕金森病痴呆(pdd)、多发性系统萎缩(msa)、路易体痴呆、幼发型全身性神经轴索性营养不良(哈勒沃登
‑
施帕茨病)、单纯性自主神经衰竭(pure autonomic failure,paf)、神经退化伴脑铁累积1型(nbia
‑
1)以及阿尔茨海默病与帕金森病组合。
[1236]
迄今为止,尚未确定针对pd的治愈性或预防性治疗。多种可用的药物疗法提供症状的缓解。症状性药物治疗的非限制性实例包括:可减少僵硬和移动减慢的卡比多巴(carbidopa)和左旋多巴(levodopa)组合,以及可减少颤抖和僵硬的抗胆碱能剂。其他任选的疗法包括例如大脑深度刺激和手术。但仍然需要能影响潜在病理生理学的疗法。举例来说,靶向α
‑
突触核蛋白或其他pd中与脑细胞死亡相关的蛋白质的抗体可用于预防和/或治疗pd。
[1237]
在某些实施方案中,可使用本公开方法治疗患有pd和其他突触核蛋白病的受试者。在某些实施方案中,可使用本公开方法治疗疑似患上pd和其他突触核蛋白病的受试者。
[1238]
使用本公开所述的病毒颗粒的aav颗粒、药物制剂和方法可用于预防、管理和/或治疗pd。
[1239]
脊髓性肌萎缩
[1240]
脊髓性肌萎缩(sma)是引起婴儿和儿童的臂和腿中的自主性肌肉无力和萎缩的遗传性疾病。sma与存活的运动神经元基因1(smn1)的蛋白质生产异常相关。缺乏蛋白质影响下运动神经元的退化和死亡。典型症状包括四肢和躯干松软,手臂和腿部活动无力,吞咽和进食困难,以及呼吸受损。sma是导致2岁以下儿童死亡的最常见遗传病症。sma影响6,000至10,000人之一。
[1241]
迄今为止,sma尚无治愈方法。可用疗法旨在管理症状和预防额外并发症。此类疗法与例如心脏病、活动管理、呼吸护理和精神健康相关。仍需要影响sma的潜在病理生理学以及相关疾病和病痛的疗法。
[1242]
在某些实施方案中,本公开的aav颗粒和方法可用于治疗患有sma以及相关疾病和病痛的受试者。在某些实施方案中,可使用本公开的方法治疗疑似患上sma或相关疾病和病痛的受试者。
[1243]
使用本公开所述的病毒颗粒的aav颗粒、药物制剂和方法可用于预防、管理和/或治疗sma以及相关疾病和病痛。
[1244]
阿尔茨海默病
[1245]
阿尔茨海默病(ad)是一种使人衰弱的神经退行性疾病并且是影响记忆、思考和行为的最常见形式的痴呆。典型的早期症状是难以记住新学习的信息。随着疾病发展,症状包括迷失方向、睡眠变化、情绪和行为变化、混乱、没有根据的怀疑和最终难以说话、吞咽和行走。全世界目前有超过3500万人患有ad,在未来几十年中,该数字有望翻番。
[1246]
迄今为止,尚未确定针对ad的治愈性或预防性治疗。治疗记忆丧失、行为改变和睡眠改变和减缓ad进展的药物疗法是可用的。然而,这些症状性治疗并不解决潜在病理生理学。
[1247]
在某些实施方案中,本公开的方法可用于治疗患有ad以及相关疾病和病痛的受试者。在某些实施方案中,可使用本公开方法治疗疑似患上ad或相关疾病和病痛的受试者。
[1248]
使用本公开所述的病毒颗粒的aav颗粒、药物制剂和方法可用于预防、管理和/或治疗ad以及相关疾病和病痛。
[1249]
肌萎缩性侧索硬化
[1250]
肌萎缩性侧索硬化(als)也称为路格里克氏病(lou gehrig's disease)或传统运动神经元疾病,是一种快速进行性并且致命的神经疾病。als与上运动神经元和下运动神经元的细胞退化和死亡相关,导致肌肉运动失能,变得虚弱、消瘦,并且失去对随意肌肉运动的控制。早期症状包括手、腿和吞咽肌肉的肌肉无力,最终进展为由于隔膜衰竭而导致无法呼吸。根据疾病控制与预防中心(centers for disease control and prevention,cdc),据估计,als影响了美国12,000
‑
15,000名个体。约5
‑
10%的病例是家族性的。
[1251]
als作为其他非感染性神经退行性疾病已表征为存在折叠异常的蛋白质。家族性als与tar dna结合蛋白43(tdp
‑
43)和rna结合蛋白fus/tls的突变相关。一些蛋白质被鉴定为可减缓als的进展,例如但不限于生长因子,例如胰岛素样生长因子1(igf
‑
1)、神经胶质细胞系衍生生长因子、脑衍生生长因子、血管内皮生长因子和睫状节神经营养因子或促进肌肉生长的生长因子,例如肌肉抑制素。
[1252]
迄今为止,als尚无预防或治愈方法。经fda批准的药物尼鲁唑(niluzole)已被批准用于延长寿命,但对症状没有影响。另外,存在药物和医疗装置可用于耐受与als相关的疼痛和发作。但仍然需要能影响潜在病理生理学的疗法。
[1253]
在某些实施方案中,本公开的方法可用于治疗患有als以及相关疾病和病痛的受试者。在某些实施方案中,可使用本公开方法治疗疑似患上als或相关疾病和病痛的受试者。
[1254]
使用本公开所述的病毒颗粒的aav颗粒、药物制剂和方法可用于预防、管理和/或治疗als以及相关疾病和病痛。
[1255]
亨廷顿病
[1256]
亨廷顿病(hd)是一种罕见的遗传性病症,可引起大脑运动控制区域以及其他区域
中的神经元的退化。所述疾病的典型症状包括动作不受控制(舞蹈病)、姿势异常、协调能力减弱、言语不清以及进食与吞咽困难,并伴随有行为、判断和认知方面的变化。hd是由与亨廷顿蛋白(htt)蛋白质相关的基因中的突变引起的。所述突变引起dna的(cag)区块多次异常重复。hd在美国影响了约30,000名个体。
[1257]
hd的特征在于亨廷顿蛋白(htt)蛋白质的突变,其中聚谷氨酰胺段异常扩增,例如由cag重复序列编码的谷氨酰胺残基的长度的扩增。认为存在所述疾病的扩增临限值为约35
‑
40个残基。hd也与纹状体神经元中通过htt的n末端区域形成的富含β折叠的聚集体相关。扩增和聚集体引起神经元随着hd进展而逐步损失。另外,hd中的细胞死亡与已知诱导细胞凋亡的死亡受体6(dr6)相关。
[1258]
迄今为止,不存在可治愈或预防疾病进展的疗法。可用药物疗法旨在管理症状。举例来说,fda已批准四苯喹嗪(tetrabenezine)用于预防舞蹈病。另外,例如抗精神病药可能有助于控制妄想、幻觉和暴躁(violent outburst)。仍需要影响潜在病理生理学的疗法,例如靶向htt蛋白质、dr6蛋白质和/或其他hd相关蛋白质的抗体疗法。
[1259]
在某些实施方案中,本公开的方法可用于治疗患有hd以及相关疾病和病痛的受试者。在某些实施方案中,可使用本公开方法治疗疑似患上hd或相关疾病和病痛的受试者。
[1260]
使用本公开所述的病毒颗粒的aav颗粒、药物制剂和方法可用于预防、管理和/或治疗hd以及相关疾病和病痛。
[1261]
vi.定义
[1262]
在本公开中的不同位置,以组或范围来公开本公开化合物的替代物或特性。特别预期本公开包含此类组和范围的每一个别成员或其子组合。
[1263]
除非另有说明,否则以下术语和短语具有下文描述的含义。定义本质上不旨在为限制性的并且用以提供本公开的某些方面的更清晰理解。
[1264]
腺相关病毒:如本文所用,术语“腺相关病毒”或“aav”是指依赖病毒属的成员,包含源于其的任何颗粒、序列、基因、蛋白质或组分。
[1265]
aav颗粒:如本文所用,“aav颗粒”是包含衣壳和病毒基因组的病毒,所述病毒基因组具有至少一个有效负载区和至少一个itr区。本公开的aav颗粒可以重组方式生产,并且可基于腺相关病毒(aav)亲本或参考序列。aav颗粒可来源于本文所述或本领域中已知的任何血清型,其包含血清型(即“假模式化”aav)或各种基因组(例如,单链或自互补)的组合。另外,aav颗粒可为复制缺陷型和/或所靶向的。
[1266]
活性:如本文所用,术语“活性”是指事件发生或进行的情况。本公开的组合物可具有活性,并且这种活性可涉及一个或多个生物学事件。
[1267]
施用:如本文所用,术语“施用”是指向受试者提供药剂或组合物。
[1268]
以组合形式施用:如本文所用,术语“以组合形式施用”或“组合施用”意指同时或在一定时间间隔内向受试者施用两种或更多种药剂,使得每种药剂对患者的作用发生重叠。在某些实施方案中,其在彼此的约60、30、15、10、5或1分钟内施用。在某些实施方案中,药剂的施用以在一起足够紧密的程度间隔开以实现组合(例如协同)作用。
[1269]
改善:如本文所用,术语“改善(amelioration/ameliorating)”是指疾患或疾病的至少一种指标的严重程度减轻。举例来说,在神经退化病症的情形下,改善包括神经元损失的减小。
[1270]
动物:如本文所用,术语“动物”是指动物界的任何成员。在某些实施方案中,“动物”是指任何发育阶段的人类。在某些实施方案中,“动物”是指任何发育阶段的非人类动物。在某些实施方案中,非人类动物是哺乳动物(例如,啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物或猪)。在某些实施方案中,动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类和蠕虫。在某些实施方案中,动物是转基因动物、基因工程化动物或克隆。
[1271]
反义链:如本文所用,术语sirna分子的“反义链”或“第一链”或“引导链”是指与所靶向以用于沉默的基因的mrna的约10
‑
50个核苷酸,例如约15
‑
30、16
‑
25、18
‑
23或19
‑
22个核苷酸的链段基本上互补的链。反义链或第一链具有与所需目标mrna序列充分互补以导引目标特异性沉默的序列,例如互补性足以使rnai机制或过程触发对所需目标mrna的破坏。
[1272]
大约:如本文所用,在应用于一个或多个所关注的值时,术语“大约”或“约”是指与所陈述的参考值相似的值。如本文所用,术语“约”意指所列举的值的 /
‑
10%。在某些实施方案中,除非另有说明或另外从上下文显而易见(除了此类数目将超过可能值的100%的情况),否则术语“大约”是指在陈述的参考值的任一方向(大于或小于)落入25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小百分比内的一系列值。
[1273]
与
…
缔合:如本文所用,当关于两个或更多个部分使用时,术语“与
…
缔合”、“缀合”、“连接”、“附接”和“系留”意指所述部分直接或经由一个或多个充当连接剂的额外部分而在物理上彼此缔合或连接,以形成足够稳定的结构以使得所述部分在使用所述结构的条件(例如生理学条件)下保持在物理上缔合。“缔合”不必严格经由直接共价化学键结进行。它还可表示离子键结或氢键结或基于杂化的连接性足够稳定以使得“缔合的”实体保持实体缔合。
[1274]
杆状病毒表达载体(bev):如本文所用,bev是杆状病毒表达载体,即杆状病毒来源的多核苷酸载体。使用bev的系统被称为杆状病毒表达载体系统(bevs)。
[1275]
mbev或修饰bev:如本文所用,修饰bev是杆状病毒来源的表达载体,其已通过以下一者或多者的添加和/或缺失和/或复制和/或倒置而相对于起始bev(野生型或人工的)改变:基因;基因片段;切割位点;限制性位点;序列区域;编码有效负载或所关注基因的序列;或前述的组合。
[1276]
双功能性:如本文所用,术语“双功能性”是指任何能够具有或保持至少两种功能的物质、分子或部分。所述功能会影响相同结果或不同结果。产生功能的结构可相同或不同。
[1277]
biic:如本文所用,biic是杆状病毒感染的昆虫细胞。
[1278]
生物相容性:如本文所用,术语“生物相容性”意指与活的细胞、组织、器官或系统相容,几乎没有损伤、毒性或被免疫系统排斥的风险。
[1279]
生物可降解:如本文所用,术语“生物可降解”意指能够通过活物的作用分解成无害产物。
[1280]
具生物活性:如本文所用,短语“具生物活性”是指任何在生物系统和/或生物体中具有活性的物质的特征。举例来说,当向生物体施用时对所述生物体具有生物学作用的物质视为具生物活性。在特定实施方案中,如果编码有效负载的即使一部分具生物活性或模
拟被视为生物学相关的活性,则可认为本公开的aav颗粒具生物活性。
[1281]
衣壳:如本文所用,术语“衣壳”是指病毒颗粒的蛋白质外壳。
[1282]
密码子优化的:如本文所用,术语“密码子优化的”或“密码子优化”是指修饰核酸序列编码与亲本/参考序列相同的氨基酸序列,但已改变,使得修饰核酸序列的密码子针对在特定系统(例如特定物种或物种群)中的表达优化或改善。作为一个非限制性实例,包含aav衣壳蛋白的核酸序列可经密码子优化以用于在昆虫细胞中或在特定昆虫细胞(例如草地贪夜蛾细胞)中的表达。密码子优化可使用本领域技术人员已知的方法和数据库完成。
[1283]
互补和基本上互补:如本文所用,术语“互补”是指多核苷酸能够彼此形成碱基对。碱基对典型地由反平行多核苷酸链中的核苷酸单位之间的氢键形成。互补多核苷酸链可以沃森
‑
克里克(watson
‑
crick)方式(例如a至t、a至u、c至g),或以允许形成双链体的任何其他方式形成碱基对。如本领域技术人员所知,当使用rna时,与dna不同,视为与腺苷互补的碱基为尿嘧啶而非胸腺嘧啶。然而,除非另有说明,否则当在本公开的上下文中表示为u时,暗示能够取代t。完美互补性或100%互补性是指一条多核苷酸链的每个核苷酸单位可与第二多核苷酸链的核苷酸单位形成氢键的情况。次完美互补是指两条链的一些但并非所有核苷单位可彼此形成氢键的情况。举例来说,对于两种20聚体,如果仅每条链上的两个碱基对可彼此形成氢键,则多核苷酸链展现10%互补性。在同一实例中,如果每条链上的18个碱基对可彼此形成氢键,则多核苷酸链展现90%互补性。如本文所用,术语“基本上互补”意指sirna的序列(例如在反义链中)足以结合所需目标mrna并触发所述目标mrna的rna沉默。
[1284]
化合物:本公开的化合物包含原子的存在于中间化合物或最终化合物中的所有同位素。“同位素”是指具有相同原子数但因为原子核中的中子数不同而具有不同质量数的原子。举例来说,氢的同位素包括氚和氘。
[1285]
本公开化合物和盐可通过常规方法与溶剂或水分子组合制备以形成溶剂化物和水合物。
[1286]
条件性活性:如本文所用,术语“条件性活性”是指野生型多肽的突变体或变体,其中突变体或变体的活性在生理条件下比亲本多肽大或小。此外,条件性活性多肽在异常条件下相较于亲本多肽具有增加或减小的活性。条件性活性多肽在正常生理条件或异常条件下可以可逆地或不可逆地不活化。
[1287]
保守:如本文所用,术语“保守”是指多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基分别在所比较两个或更多个序列的相同位置中未发生改变。相对保守的核苷酸或氨基酸是与序列中其他地方出现的核苷酸或氨基酸相比而言较相关的序列中的保守核苷酸或氨基酸。
[1288]
在某些实施方案中,如果两个或更多个序列是彼此100%同一,则将其称为“完全保守的”。在某些实施方案中,如果两个或更多个序列是彼此至少70%同一、至少80%同一、至少90%同一或至少95%同一,则将其称为“高度保守的”。在某些实施方案中,如果两个或更多个序列是彼此约70%同一、约80%同一、约90%同一、约95%、约98%或约99%同一,则将其称为“高度保守的”。在某些实施方案中,如果两个或更多个序列是彼此至少30%同一、至少40%同一、至少50%同一、至少60%同一、至少70%同一、至少80%同一、至少90%同一或至少95%同一,则将其称为“保守的”。在某些实施方案中,如果两个或更多个序列是彼此约30%同一、约40%同一、约50%同一、约60%同一、约70%同一、约80%同一、约90%同一、
约95%同一、约98%同一或约99%同一,则将其称为“保守的”。序列的保守可适用于多核苷酸或多肽的整个长度或可适用于其一部分、区域或特征。
[1289]
控制元件:如本文所用,“控制元件”、“调控控制元件”或“调控序列”是指提供接受者细胞中的编码序列的复制、转录和翻译的启动子区、多聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控域、复制起点、内部核糖体进入位点(“ires”)、增强子等。这些控制元件并非全部都需要始终存在,只要所选编码序列能够在适当的宿主细胞中进行复制、转录和/或翻译即可。
[1290]
控制释放:如本文所用,术语“控制释放”是指符合特定释放模式以实现治疗结果的药物组合物或化合物释放曲线。
[1291]
细胞生长抑制:如本文所用,“细胞生长抑制”是指抑制、减少、抑止细胞(例如,哺乳动物细胞(例如,人类细胞))、细菌、病毒、真菌、原虫、寄生虫、朊病毒或其组合的生长、分裂或倍增。
[1292]
细胞毒性:如本文所用,“细胞毒性”是指将细胞(例如,哺乳动物细胞(例如,人类细胞))、细菌、病毒、真菌、原虫、寄生虫、朊病毒或其组合杀死或对其造成有害、有毒或致命影响。
[1293]
递送:如本文所用,“递送”是指递送aav颗粒、化合物、物质、实体、部分、货物或有效负载的动作或方式。
[1294]
递送剂:如本文所用,“递送剂”是指任何至少部分地有助于将aav颗粒体内递送至靶向细胞的物质。
[1295]
去稳定:如本文所用,术语“去稳定”、“去稳定化”或“去稳定化区域”意指使某个区域或分子的稳定性小于相同区域或分子的起始、野生型或原生形式。
[1296]
可检测标记:如本文所用,“可检测标记”是指一种或多种与另一实体附接、并入另一实体中或与另一实体缔合的标记物、信号或部分,所述另一实体容易通过本领域中已知的方法检测,所述方法包括射线照相术、荧光、化学发光、酶活性、吸光度等。可检测标记包括放射性同位素、荧光团、发色团、酶、染料、金属离子、配体(例如生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素和半抗原)、量子点等。可检测标记可位于本文所公开的肽或蛋白质中的任何位置。它们可在氨基酸、肽或蛋白质内,或位于n末端或c末端。
[1297]
消化:如本文所用,术语“消化”意指分裂成较小的碎片或组分。在提及多肽或蛋白质时,消化引起肽的产生。
[1298]
远端:如本文所用,术语“远端”意指位于远离中心或远离所关注的点或区域处。
[1299]
给药方案:如本文所用,“给药方案”是施用时程或由医师确定的治疗、预防或缓解性照护方案。
[1300]
囊封:如本文所用,术语“囊封”意指围封、包围或包覆。
[1301]
工程化:如本文所用,当本公开的实施方案被设计以具有与起始点、野生型或原生分子不同的特征或特性(无论结构上或化学上)时,所述实施方案被“工程化”。
[1302]
有效量:如本文所用,术语药剂的“有效量”是足以实现有益的或所需的结果,例如临床结果的量,并且因此“有效量”取决于其应用情形。举例来说,在施用治疗癌症的药剂的情况下,药剂的有效量是例如相较于在未施用药剂的情况下所获得的反应,足以对癌症实现如本文中所定义的治疗的量。
[1303]
表达:如本文所用,核酸序列的“表达”是指以下事件中的一者或多者:(1)从dna序列产生rna模板(例如,通过转录);(2)处理rna转录物(例如,通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'端处理);(3)将rna翻译成多肽或蛋白质;以及(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
[1304]
特征(feature):如本文所用,“特征”是指特征(characteristic)、特性或独特要素。
[1305]
制剂:如本文所用,“制剂”包含至少一种aav颗粒和递送剂或赋形剂。
[1306]
片段:如本文所用,“片段”是指一部分。举例来说,蛋白质的片段可包含通过使从培养细胞分离的全长蛋白质消化而获得的多肽。
[1307]
功能性:如本文所用,“功能性”生物分子是展现出某种特性和/或活性的生物分子形式,其以所述特性和/或活性为特征。
[1308]
基因表达:术语“基因表达”是指核酸序列进行成功转录并且在大部分情况下进行成功翻译以产生蛋白质或肽的过程。为了清楚起见,在提及测量“基因表达”时,这应该理解为意指测量可针对核酸转录产物,例如对rna或mrna,或针对氨基酸翻译产物,例如多肽或肽。测量rna、mrna、多肽和肽的量或含量的方法是本领域中众所周知的。
[1309]
同源性:如本文所用,术语“同源性”是指聚合分子之间,例如多核苷酸分子(例如dna分子和/或rna分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在某些实施方案中,如果聚合分子的序列为至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一或类似,则将聚合分子视为彼此“同源”。术语“同源”必然是指在至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。根据本公开,如果对于至少约20个氨基酸的至少一个延伸部,两个多核苷酸序列编码的多肽为至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至99%,则将两个多核苷酸序列视为同源。在某些实施方案中,同源多核苷酸序列的特征在于编码具有至少4
‑
5个特别指定的氨基酸的延伸段的能力。对于长度小于60个核苷酸的多核苷酸序列,同源性由编码具有至少4
‑
5个特别指定的氨基酸的延伸段的能力来确定。根据本公开,如果对于至少约20个氨基酸的至少一个延伸部,蛋白质为至少约50%、60%、70%、80%或90%同一,则将两个蛋白质序列视为同源。
[1310]
异源区:如本文所用,术语“异源区”是指不认为是同源区的区域。
[1311]
同源区:如本文所用,术语“同源区”是指在位置、结构、进化起源、特征、形式或功能方面类似的区域。
[1312]
同一性:如本文所用,术语“同一性”是指聚合分子之间,例如多核苷酸分子(例如dna分子和/或rna分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。举例来说,两个多核苷酸序列的同一性百分比的计算可通过出于最佳比较目的而比对两个序列来进行(例如,可将空位引入第一和第二核酸序列中的一者或两者中以便最佳比对并且出于比较目的可忽略非同一序列)。在某些实施方案中,出于比较目的比对的序列长度是参考序列长度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。然后比较在相应核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时,则所述分子在所述位置上同一。考虑到为进行两个序列的最佳比对而需要引入的空位数目和每个空位的长度,所述两个序列之间的同一性百分比与所述序列共有的同一位置的数目有关。可使用数学算法来实现序列比较和两个序列之间的百分比同一性测定。举例来说,两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用例如以下中所述的方法来
测定:computational molecular biology,lesk,a.m.编,oxford university press,new york,1988;biocomputing:informatics and genome projects,smith,d.w.编,academic press,new york,1993;sequence analysis in molecular biology,von heinje,g.,academic press,1987;computer analysis of sequence data,part i,griffin,a.m.和griffin,h.g.编,humana press,new jersey,1994;以及sequence analysis primer,gribskov,m.和devereux,j.编,m stockton press,new york,1991;所述文献的内容各自通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。举例来说,两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用meyers和miller(cabios,1989,4:11
‑
17)的算法来确定,所述算法已并入使用pam120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4的align程序(2.0版)中。或者,两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用gcg软件包中的gap程序,使用nwsgapdna.cmp矩阵来测定。通常用于测定序列之间的同一性百分比的方法包括但不限于carillo,h.和lipman,d.,siam j applied math.,48:1073(1988)中公开的方法;其内容通过引用并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。用于测定同一性的技术编码于公开可用的计算机程序中。用以确定两个序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于gcg程序包(devereux,j.等人,nucleic acids research,12(1),387(1984))、blastp、blastn和fasta(altschul,s.f.等人,j.molec.biol.,215,403(1990))。
[1313]
抑制基因表达:如本文所用,短语“抑制基因表达”意指引起基因表达产物的量减少。表达产物可为转录自基因的rna(例如mrna)或翻译自mrna的多肽,所述mrna从基因转录。通常,mrna水平的降低引起从其翻译的多肽的水平降低。表达水平可使用测量mrna或蛋白质的标准技术来确定。
[1314]
体外:如本文所用,术语“体外”是指发生在人工环境中(例如试管或反应容器中、细胞培养物中、皮氏培养皿中等)而非发生在生物体(例如动物、植物或微生物)内的事件。
[1315]
体内:如本文所用,术语“体内”是指发生在生物体(例如动物、植物、或微生物或其细胞或组织)内的事件。
[1316]
分离的:如本文所用,术语“分离的”是指物质或实体已与至少一些与其缔合(无论是在自然界中或在实验环境中)的组分分离。分离物质关于其已缔合的物质的纯度水平可不同。分离的物质和/或实体可与其最初缔合的其他组分的至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%或更多分离。在某些实施方案中,分离药剂为超过约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或超过约99%纯度。如本文所用,如果物质基本上不含其他组分,则所述物质是“纯的”。如本文所用,术语“基本上分离”意指物质从形成或检测所述物质的环境基本上分离。部分分离可包含例如富含本公开的物质或aav颗粒的组合物。实质性分离可包含含有至少约50重量%、至少约60重量%、至少约70重量%、至少约80重量%、至少约90重量%、至少约95重量%、至少约97重量%或至少约99重量%的本公开化合物或其盐的组合物。用于分离化合物和其盐的方法是本领域中的常规方法。
[1317]
接头:如本文所用,“接头”是指连接两个分子的分子或分子组。接头可为连接编码两种不同多肽的两个核酸序列的核酸序列。接头可被翻译或可不被翻译。接头可为可切割接头。
[1318]
微rna(mirna)结合位点:如本文所用,微rna(mirna)结合位点表示核酸转录物中
至少由mirna的“种子”区域结合的核苷酸位置或区域。
[1319]
修饰的:如本文所用,术语“修饰的”是指改变本公开的分子的状态或结构。分子可以包括化学上、结构上和功能上的许多方式修饰。如本文所用,当本公开的实施方案具有或拥有与起始点、野生型或原生分子不同的特征或特性(无论结构上或化学上)时,所述实施方案是“修饰的”。
[1320]
突变:如本文所用,术语“突变”是指基因结构的任何变化,所述变化产生可传递至后代的变体(也称为“突变体”)形式。基因突变可由dna中的单碱基的交替、或者基因或染色体的较大部分的缺失、插入或重排引起。
[1321]
天然存在:如本文所用,“天然存在”或“野生型”意指存在于自然界中而没有人工辅助或人手的参与。
[1322]
非人类脊椎动物:如本文所用,“非人类脊椎动物”包括除了智人(homo sapiens)之外的所有脊椎动物,包括野生和家养物种。非人类脊椎动物的实例包括但不限于哺乳动物,例如羊驼、爪哇牛(banteng)、野牛、骆驼、猫、家牛、鹿、狗、驴、大额牛(gayal)、山羊、天竺鼠、马、骆马、骡、猪、兔、驯鹿、绵羊、水牛和牦牛(yak)。
[1323]
核酸:如本文所用,术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指由以下构成的任何核酸聚合物:聚脱氧核糖核苷酸(含有2
‑
脱氧
‑
d
‑
核糖)、或聚核糖核苷酸(含有d
‑
核糖)、或本身为嘌呤或嘧啶碱基或修饰的嘌呤或嘧啶碱基的n糖苷的任何其他类型的多核苷酸。在术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间不存在预期长度区别,并且这些术语将可互换使用。这些术语仅指分子的初级结构。因此,这些术语包含双链和单链dna以及双链和单链rna。
[1324]
脱靶:如本文所用,“脱靶”是指对任何一个或多个目标、基因或细胞转录物的任何非预期作用。
[1325]
开放阅读框:如本文所用,“开放阅读框”或“orf”是指除了阅读框的末端以外,在给定阅读框内不含终止密码子的序列。
[1326]
可操作地连接:如本文所用,短语“可操作地连接”是指在两个或更多个分子、构建体、转录物、实体、部分等之间的功能性连接。作为一个非限制性实例,当启动子序列控制和/或调控核苷酸序列的转录时,启动子“可操作地连接”至核苷酸序列。
[1327]
患者:如本文所用,“患者”是指可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、即将接受治疗的受试者,或受到经过训练的专业人员针对特定疾病或疾患的照护的受试者。
[1328]
有效负载:如本文所用,“有效负载”或“有效负载区”是指一个或多个由病毒基因组编码或在病毒基因组内编码的多核苷酸或多核苷酸区或此类多核苷酸或多核苷酸区的表达产物,例如转基因、编码多肽或多元多肽的多核苷酸或调节核酸或调控核酸。
[1329]
有效负载构建体:如本文所用,“有效负载构建体”是包含多核苷酸区的一个或多个载体构建体,所述多核苷酸区编码或包含在一侧或两侧上侧接有反向末端重复(itr)序列的有效负载。有效负载构建体呈递在病毒生产细胞中复制的模板,以产生治疗性病毒基因组。
[1330]
有效负载构建体载体:如本文所用,“有效负载构建体载体”是编码或包含有效负载构建体和用于在细菌细胞中复制和表达有效负载构建体的调节区的载体。
[1331]
有效负载构建体表达载体:如本文所用,“有效负载构建体表达载体”是编码或包
含有效负载构建体并且还包含一个或多个编码或包含用于在病毒复制细胞中进行病毒表达的组分的多核苷酸区域的载体。
[1332]
肽:如本文所用,“肽”小于或等于50个氨基酸长,例如为约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
[1333]
药学上可接受:短语“药学上可接受”在本文中用于指在合理医学判断范围内,适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症,与合理益处/风险比相匹配的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[1334]
药学上可接受的赋形剂:如本文所用,短语“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述的化合物以外的任何成分(例如,能够悬浮或溶解活性化合物的媒介物)并且其特性为在患者中基本上无毒且非炎性。赋形剂可包括例如:抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(颜料)、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、芳香剂、助滑剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合用水。示例性赋形剂包括但不限于:丁基化羟基甲苯(bht)、碳酸钙、磷酸钙(二元)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶凝化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羟基乙酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素a、维生素e、维生素c和木糖醇。
[1335]
药学上可接受的盐:本公开还包含本文所述的化合物的药学上可接受的盐。如本文所用,“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物,其中母体化合物通过将现有酸或碱部分转化为其盐形式(例如通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)来修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(例如胺)的无机酸盐或有机酸盐;酸性残基(例如羧酸)的碱金属盐或有机盐;等等。代表性酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2
‑
羟基
‑
乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2
‑
萘磺酸盐、烟碱酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3
‑
苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、丁二酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等,以及无毒性铵、季铵和胺阳离子,其包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括由例如无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。一般来说,可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当碱或酸于水中或有机溶剂中,或两者的混合物中反应来制备此类盐;一般来说,可使用非水性介质,如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列表见于remington's pharmaceutical sciences,第17版,mack publishing company,easton,pa.,1985,第1418页,pharmaceutical salts:properties,
selection,and use,p.h.stahl和c.g.wermuth(编),wiley
‑
vch,2008,和berge等人,journal of pharmaceutical science,66,1
‑
19(1977)中,所述文献的内容各自通过引用整体并入本文,只要其不与本公开相冲突即可。
[1336]
药学上可接受的溶剂化物:如本文所用,术语“药学上可接受的溶剂化物”意指本公开化合物,其中合适的溶剂的分子被并入晶格中。合适的溶剂在所施用的剂量下是生理学上可耐受的。举例来说,溶剂化物可通过从包含有机溶剂、水或其混合物的溶液结晶、重结晶或沉淀来制备。合适的溶剂的实例是乙醇、水(例如单水合物、二水合物和三水合物)、n
‑
甲基吡咯烷酮(nmp)、二甲亚砜(dmso)、n,n'
‑
二甲基甲酰胺(dmf)、n,n'
‑
二甲基乙酰胺(dmac)、1,3
‑
二甲基
‑2‑
咪唑烷酮(dmeu)、1,3
‑
二甲基
‑
3,4,5,6
‑
四氢
‑2‑
(1h)嘧啶酮(dmpu)、乙腈(acn)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2
‑
吡咯烷酮、苯甲酸苯甲酯等。当水为溶剂时,溶剂化物被称作“水合物”。
[1337]
药物动力学:如本文所用,“药物动力学”是指分子或化合物在涉及确定向活生物体施用的物质的结局时的任何一种或多种特性。药物动力学分成若干领域,包括吸收、分布、代谢和排泄的程度和速率。这通常称为adme,其中:(a)吸收是物质进入血液循环的过程;(d)分布是物质在整个体液和身体组织中的分散或扩散;(m)代谢(或生物转化)是母体化合物转化成子体代谢物的不可逆转化;和(e)排泄(或消除)是指从身体消除物质。在罕见情况下,一些药物在身体组织中不可逆地聚积。
[1338]
物理化学:如本文所用,“物理化学”意指具有或涉及物理和/或化学性质。
[1339]
预防(preventing):如本文所用,术语“预防(preventing或prevention)”是指部分或完全地延迟感染、疾病、病症和/或疾患的发作;部分或完全地延迟特定感染、疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征或临床表现的发作;部分或完全地延迟特定感染、疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征或表现的发作;部分或完全地延迟感染、特定疾病、病症和/或疾患的进展;和/或降低患上与感染、疾病、病症和/或疾患相关的病变的风险。
[1340]
增生:如本文所用,术语“增生”意指生长、扩增或增加或引起快速生长、扩增或增加。“增殖性”意指具有增殖能力。“抗增殖性”意指具有与增殖特性相对或相反的特性。
[1341]
预防性:如本文所用,“预防性”是指用于预防疾病扩散的治疗或作用疗程。
[1342]
预防(prophylaxis):如本文所用,“预防”是指为维持健康并预防疾病扩散而采用的措施。
[1343]
所关注的蛋白质:如本文所用,术语“所关注的蛋白质”或“所需蛋白质”包含本文提供的蛋白质和其片段、突变体、变体和改变形式。
[1344]
近端:如本文所用,术语“近端”意指位于较靠近中心或所关注的点或区域处。
[1345]
纯化的:如本文所用,“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”、“纯化(purification)”意指从非所需组分、材料污物、混杂物或缺陷品变得基本上纯的或干净的。“纯化的”是指纯的状态。“纯化”是指变纯的过程。
[1346]
区域(region):如本文所用,术语“区域”是指区(zone)或一般区域(area)。在某些实施方案中,当提及蛋白质或蛋白质模块时,区域可包含沿着蛋白质或蛋白质模块的线性氨基酸序列,或者可包含三维区域、表位和/或表位簇。在某些实施方案中,区域包含末端区域。如本文所用,术语“末端区域”是指位于给定药剂的端部或末端处的区域。当提及蛋白质
时,末端区域可包含n末端和/或c末端。n末端是指包含具有自由氨基的氨基酸的蛋白质末端。c末端是指包含具有游离羧基的氨基酸的蛋白质末端。因此,n末端和/或c末端区域可以包含n末端和/或c末端以及周围的氨基酸。在某些实施方案中,n末端和/或c末端区域包含约3个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约40个氨基酸、约10个氨基酸至约50个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸和/或至少100个氨基酸。在某些实施方案中,n末端区域可包含任何长度的氨基酸,其包含n末端但不包含c末端。在某些实施方案中,c末端区域可包含任何长度的氨基酸,其包含c末端但不包含n末端。
[1347]
在某些实施方案中,当提及多核苷酸时,区域可包含沿着多核苷酸的线性核酸序列,或者可包含三维区域、二级结构或三级结构。在某些实施方案中,区域包含末端区域。如本文所用,术语“末端区域”是指位于给定药剂的端部或末端处的区域。当提及多核苷酸时,末端区域可包含5'末端和3'末端。5'末端是指包含具有游离磷酸酯基团的核酸的多核苷酸末端。3'末端是指包含具有自由羟基的核酸的多核苷酸末端。5'和3'区可因此包含5'末端和3'末端以及周围核酸。在某些实施方案中,5'末端和3'末端区域包含约9个核酸至约90个核酸、约15个核酸至约120个核酸、约30个核酸至约150个核酸、约60个核酸至约300个核酸和/或至少300个核酸。在某些实施方案中,5'区可包含任何长度的核酸,其包含5'末端但不包含3'末端。在某些实施方案中,3'区域可包含任何长度的核酸,其包含3'末端但不包含5'末端。
[1348]
rna或rna分子:如本文所用,术语“rna”或“rna分子”或“核糖核酸分子”是指核糖核苷酸的聚合物;术语“dna”或“dna分子”或“脱氧核糖核酸分子”是指脱氧核糖核苷酸的聚合物。dna和rna可分别例如通过dna复制和dna转录天然合成;或者化学合成。dna和rna可为单链(即分别为ssrna或ssdna)或多链(例如双链,即分别为dsrna和dsdna)。如本文所用,术语“mrna”或“信使rna”是指编码一种或多种多肽链的氨基酸序列的单链rna。
[1349]
rna干扰或rnai:如本文所用,术语“rna干扰”或“rnai”是指由rna分子介导的引起相应蛋白质编码基因的表达受到抑制或干扰或“沉默”的序列特异性调控机制。已在许多类型的生物体中观测到rnai,所述生物体包括植物、动物和真菌。rnai出现在天然去除外源rna(例如病毒rna)的细胞中。天然rnai经由从游离dsrna切割的片段前进,其将降解机制引导至其他相似rna序列。rnai受rna诱导沉默复合物(rna
‑
induced silencing complex;risc)控制并且由细胞质中的短/小dsrna分子起始,其中它们与催化risc组分阿尔戈(argonaute)相互作用。可将dsrna分子外源地引入细胞中。外源性dsrna通过激活核糖核酸酶蛋白质dicer起始rnai,所述dicer结合并切割dsrna以产生具有21
‑
25个碱基对的双链片段,其中若干未配对突出碱基位于每个端。这些短双链片段被称为小干扰rna(sirna)。
[1350]
样品:如本文所用,术语“样品”或“生物样品”是指其组织、细胞或组成部分的子组(例如,体液,包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊髓液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液)。样品还可包含由完整生物体或其组织、细胞或组成部分的子组或其级分或部分制备的匀浆、溶胞物或提取物,包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液,皮肤、呼吸道、肠道和生殖泌尿道的外部切片,泪液、唾液、乳汁、血球、肿瘤、器官。样品进一步指培养基,例如营养培养液或凝胶,其可含有细胞组分,例如蛋白质或核酸分子。
[1351]
自互补病毒颗粒:如本文所用,“自互补病毒颗粒”是包含至少两种组分的颗粒,这两种组分是蛋白质衣壳和封入衣壳内的编码自互补基因组的多核苷酸序列。
[1352]
有义链:如本文所用,术语sirna分子的“有义链”或“第二链”或“随从链”是指与反义链或第一链互补的链。sirna分子的反义链与有义链杂交,形成双链体结构。如本文所用,“sirna双链体”包含sirna链,所述sirna链具有与具有靶向以用于沉默的基因的mrna的约10
‑
50个核苷酸的部分的足够互补性,和具有足够互补性以形成具有另一sirna链的双链体的sirna链。
[1353]
短干扰rna或sirna:如本文所用,术语“短干扰rna”、“小干扰rna”或“sirna”是指包含在约5
‑
60个之间的能够导引或介导rnai的核苷酸(或核苷酸类似物)的rna分子(或rna类似物)。在某些实施方案中,sirna分子包含约15
‑
30个核苷酸或核苷酸类似物,例如约16
‑
25个核苷酸(或核苷酸类似物)、约18
‑
23个核苷酸(或核苷酸类似物)、约19
‑
22个核苷酸(或核苷酸类似物)(例如19、20、21或22个核苷酸或核苷酸类似物)、约19
‑
25个核苷酸(或核苷酸类似物),和约19
‑
24个核苷酸(或核苷酸类似物)。术语“短”sirna是指包含5
‑
23个核苷酸,例如21个核苷酸(或核苷酸类似物),例如19、20、21或22个核苷酸的sirna。术语“长”sirna是指包含24
‑
60个核苷酸,例如约24
‑
25个核苷酸,例如23、24、25或26个核苷酸的sirna。短sirna在一些情况下可包含少于19个核苷酸,例如16、17或18个核苷酸、或少至5个核苷酸,其条件为较短的sirna保留介导rnai的能力。同样地,长sirna在一些情况下可包含超过26个核苷酸,例如27、28、29、30、35、40、45、50、55或甚至60个核苷酸,其条件为较长sirna保留介导rnai或翻译阻遏而不需进一步处理(例如酶促处理)为短sirna的能力。sirna可为单链rna分子(ss
‑
sirna)或包含有义链和反义链的双链rna分子(ds
‑
sirna),有义链与反义链杂合形成称为sirna双链体的双链体结构。
[1354]
信号序列:如本文所用,短语“信号序列”是指可导引蛋白质的转运或定位的序列。
[1355]
单一单位剂量:如本文所用,“单一单位剂量”是以一个剂量/一次性/单个途径/单个接触点中施用的任何治疗剂的剂量,即单次施用事件。在某些实施方案中,单一单位剂量以离散剂型(例如片剂、胶囊、贴片、装药注射器、小瓶等)提供。
[1356]
类似性:如本文所用,术语“类似性”是指聚合分子之间,例如多核苷酸分子(例如dna分子和/或rna分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。聚合物分子彼此的相似性百分比的计算可以与同一性百分比的计算相同的方式进行,但在计算相似性百分比时要考虑如本领域中所理解的保守性取代。
[1357]
分次剂量:如本文所用,“分次剂量”是将单一单位剂量或每日总剂量分成两个或更多个剂量。
[1358]
稳定的:如本文所用,“稳定的”是指化合物足够稳固以经受住从反应混合物中分离得到适用纯度,并且在某些实施方案中能够配制成有效治疗剂。
[1359]
稳定的:如本文所用,术语“使
……
稳定”、“稳定的”、“稳定区域”意指使之稳定或变得稳定。
[1360]
受试者:如本文所用,术语“受试者”或“患者”是指可例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的向其施用根据本公开的组合物的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如哺乳动物,例如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类和人类)和/或植物。受试者或患者可能寻求或需要治疗,需要治疗,正在接受治疗,将接受治疗,或由针对特定疾病或疾患的经培训的专业人员监护。
[1361]
基本上:如本文所用,术语“基本上”是指展现出总的或接近总的程度或等级的所
关注的特征或特性的定性状况。生物领域中的普通技术人员应理解生物和化学现象很少(如果曾经)进行完全和/或继续进行至完全或获得或避免绝对结果。因而,本文使用术语“基本上”以获得许多生物和化学现象中所固有的完整性的潜在缺乏。
[1362]
基本上相等:如本文所用,在其与各剂量之间的时间差异相关时,所述术语意指加/减2%。
[1363]
基本上同时:如本文所用并且在其与多个剂量相关时,所述术语意指在2秒内。
[1364]
患有:“患有”疾病、病症和/或疾患的受试者已诊断具有所述疾病、病症和/或疾患或呈现其一种或多种症状。
[1365]
易患:“易患”疾病、病症和/或疾患的个体尚未诊断具有所述疾病、病症和/或疾患和/或可能未展现其症状,但具有患上疾病或其症状的倾向。在某些实施方案中,易患疾病、病症和/或疾患(例如癌症)的个体的特征可为以下中的一者或多者:(1)与疾病、病症和/或疾患显现相关的基因突变;(2)与疾病、病症和/或疾患显现相关的基因多形性;(3)与疾病、病症和/或疾患相关的蛋白质和/或核酸的表达和/或活性增加和/或减少;(4)与疾病、病症和/或疾患显现相关的习惯和/或生活方式;(5)疾病、病症和/或疾患的家族病史;和(6)暴露于与疾病、病症和/或疾患显现相关的微生物和/或被所述微生物感染。在某些实施方案中,易患疾病、病症和/或疾患的个体将出现所述疾病、病症和/或疾患。在某些实施方案中,易患疾病、病症和/或疾患的个体将不出现所述疾病、病症和/或疾患。
[1366]
持续释放:如本文所用,术语“持续释放”是指药物组合物或化合物在某段特定时间内的释放曲线符合一定释放速率。
[1367]
合成:术语“合成”意指通过人手产生、制备和/或制造。本公开的多核苷酸或多肽或其他分子的合成可为化学合成或酶促合成。
[1368]
靶向:如本文所用,“靶向”意指设计和选择将与靶核酸杂交并且诱导所需作用的核酸序列的过程。
[1369]
靶向细胞:如本文所用,“靶向细胞”是指任何一个或多个所关注的细胞。细胞可发现于体外、体内、原位或生物体的组织或器官中。生物体可为动物,例如哺乳动物、人类或人类患者。
[1370]
末端区域:如本文所用,术语“末端区域”是指连接的核苷或氨基酸区域(分别为多核苷酸或多肽)的5'或3'端上的区域。
[1371]
末端优化:当提及核酸时,术语“末端优化”意指核酸的末端区域相较于原生或野生型末端区域以一些方式改善,例如经密码子优化。
[1372]
治疗剂:术语“治疗剂”是指当向受试者施用时,具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引起所需生物学和/或药理学作用的任何药剂。
[1373]
治疗有效量:如本文所用,术语“治疗有效量”意指当向患有或易患感染、疾病、病症和/或疾患的受试者施用时,足以治疗所述感染、疾病、病症和/或疾患,改善其症状、诊断其、预防其和/或推迟其发作的待递送的药剂(例如核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量。在某些实施方案中,治疗有效量将以单次剂量提供。在某些实施方案中,治疗有效量以包含多个剂量的给药方案施用。本领域技术人员应了解,在某些实施方案中,如果单位剂型包含在作为此类给药方案的一部分施用时有效的量,则所述单位剂型可视为包含治疗有效量的特定药剂或实体。
[1374]
治疗有效结果:如本文所用,术语“治疗有效结果”意指在具有或易患感染、疾病、病症和/或疾患的受试者中足以治疗所述感染、疾病、病症和/或疾患、改善其症状、对其进行诊断、预防和/或延迟其发作的结果。
[1375]
每日总剂量:如本文所用,“每日总剂量”是在24小时时段内给予或以处方开具的量。其可以单一单位剂量形式进行施用。
[1376]
转染:如本文所用,术语“转染”是指将外源性核酸引入细胞中的方法。转染方法包括但不限于化学方法、物理治疗和阳离子型脂质或混合物。
[1377]
治疗:如本文所用,术语“治疗”是指部分或完全地缓解、改善、改进、减轻特定感染、疾病、病症和/或疾患、延迟其发作、抑制其进展、减小其严重程度和/或降低其一种或多种症状或特征的发生率。举例来说,“治疗”癌症可指抑制肿瘤的存活、生长和/或扩散。出于降低显现与某种疾病、病症和/或疾患相关的病变的风险的目的,可向未展现所述疾病、病症和/或疾患的病征的受试者和/或向仅展现所述疾病、病症和/或疾患的早期病征的受试者施用治疗。
[1378]
未修饰:如本文所用,“未修饰”是指任何尚未以任何方式改变前的物质、化合物或分子。未修饰可指但并不始终指生物分子的野生型或原生形式。分子可进行一系列修饰,由此,每个修饰分子可充当后续修饰的“未修饰”的起始分子。
[1379]
载体:如本文所用,“载体”是转运、转导或以其他方式充当异源分子的载体的任何分子或部分。本公开的载体可以重组方式产生,并且可基于和/或可包含腺相关病毒(aav)亲本或参考序列。此类亲本或参考aav序列可充当用于对载体进行工程化的原始、第二、第三或后续序列。在非限制性实例中,此类亲本或参考aav序列可包含以下序列中的任何一者或多者:编码多肽或多元多肽的多核苷酸序列,所述序列可为野生型或从野生型修饰,并且所述序列可编码蛋白质、蛋白质域或蛋白质的一个或多个亚基的全长或部分序列;包含调节性或调控性核酸的多核苷酸,所述序列可为野生型或从野生型修饰;以及转基因,其可从野生型序列修饰或可不从野生型序列修饰。这些aav序列可充当一个或多个密码子(在核酸水平上)或氨基酸(在多肽水平上)的“供体”序列或一个或多个密码子(在核酸水平上)或氨基酸(在多肽水平上)的“受体”序列。
[1380]
病毒基因组:如本文所用,“病毒基因组”或“载体基因组”是指囊封于aav颗粒中的核酸序列。
[1381]
vii.等效物和范围
[1382]
仅使用常规实验,本领域技术人员将认识到或能够确定根据本文所述的本公开的特定实施方案的许多等效物。本公开的范围不旨在限于以上描述,而是如所附权利要求书中所阐述。
[1383]
在权利要求书中,除非相反地指示或另外从上下文显而易见,否则例如“一个”、“一种”和“所述”的冠词可意指一或大于一。除非相反地指示或以其他方式从上下文显而易见,否则如果一个、超过一个或所有组成员存在于给定产物或工艺中、用于给定产物或工艺中或以其他方式与给定产物或工艺相关,则在所述组的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求或描述被视为满足。本公开包含组中恰好一个成员存在于、用于给定产物或工艺中或者另外与给定产物或工艺相关的实施方案。本公开包含超过一个或所有的组成员存在于、用于给定产物或工艺中或者以其他方式与给定产物或工艺有关的实施方案。
[1384]
还应注意,术语“包含”旨在为开放的并且容许但不需要包括额外要素或步骤。当本文中使用术语“包含”时,因此还涵盖和公开术语“由
……
组成”。
[1385]
在给出范围的情况下,包含端点。此外,应理解,除非另有指示或以其他方式从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见,否则表示为范围的值可在本公开的不同实施方案中采用所陈述范围内的任何特定值或子范围,除非上下文另外明确规定,否则精确到所述范围下限的单位的十分之一。
[1386]
另外,应理解,属于现有技术内的本公开的任何特定实施方案可从任何一个或多个权利要求中明确排除。因为认为此类实施方案是本领域普通技术人员已知的,所以排除所述实施方案,即使未在本文中明确地阐述排除。出于任何原因,无论是否与现有技术的存在有关,本公开的组合物的任何特定实施方案(例如任何抗生素、治疗或活性成分;任何生产方法;任何使用方法;等)可从任何一个或多个权利要求中排除。
[1387]
应理解,已使用的文字为描述性而非限制性文字,并且可在不偏离本公开在其较广泛方面的真实范围和精神的情况下,在所附权利要求的范围内作出改变。
[1388]
尽管已经相对于所述的若干实施方案以一定的长度和一些特殊性描述了本公开,但并非意味着本公开应受限于任何此类细节或实施方案或任何特定实施方案,而是应该参考所附权利要求进行解释,以便鉴于现有技术提供对此类权利要求的尽可能最广泛的解释,并因此有效地涵盖本公开的预期范围。
[1389]
所有公开、专利申请、专利和所提及的其他参考文献均通过引用整体并入本文。倘若有冲突,以本说明书(包含定义)为准。另外,章节标题、材料、方法和实施例仅为说明性的而不旨在为限制性的。
[1390]
viii.实施例
[1391]
实施例1.生产源rep/cap biic(a)
[1392]
cp bev池
[1393]
将一小瓶的sf9 cb在125ml摇瓶中解冻(37℃,使用水浴,1
‑
5分钟,直至冰晶消散),然后稀释至19
‑
20ml工作体积的hyclone sfx昆虫细胞培养基中。在27℃下在第一扩增(p0,3
‑
4天)中温育摇瓶(135rpm振荡,0%v/v的co2),直至sf9细胞混合物的细胞密度扩增至4.0
×
106个细胞/毫升。
[1394]
然后使用较大摇瓶接种细胞混合物并经由多个额外扩增步骤扩增,每个扩增步骤的目标输出密度为4.0
×
106个细胞/毫升,以允许后续扩增步骤的恒定接种密度为0.5
‑
1.5
×
106个细胞/毫升。在27℃下在135rpm振荡(≤2l工作体积)或90rpm振荡(>2l工作体积)下完成扩增持续3
‑
5天(0%v/v的co2)。完成以下额外扩增:(i)在1.0l烧瓶中扩增至200ml工作体积;以及(ii)在3l烧瓶中扩增至1000ml工作体积。
[1395]
通过将5μg rep/cap杆粒材料与375μl wfi水组合来制备rep/cap转染混合物。将稀释的杆粒混合物与30μl promega fugene hd(转染剂)和另外345μl wfi水组合,并且然后在27℃下温育15分钟以提供转染混合液。
[1396]
将25ml扩增sf9细胞混合物接种至125ml烧瓶(1.0
×
106个细胞/毫升接种浓度)中并扩增至目标感染密度为2.5
‑
4.0
×
106个细胞/毫升。将转染混合液添加至125ml烧瓶中并在27℃下温育5
‑
7天(0%v/v的co2,135rpm搅拌)。将所得混合物在50ml锥形管中离心5分钟,并且收集含有p1 bev的上清液并与其他p1 bev上清液合并。将p1 bev池储存在5℃下。
[1397]
将扩增sf9细胞混合物接种至cellstar 6孔细胞聚苯乙烯培养板中(2ml/孔,0.5
‑
1.0
×
106个细胞/毫升接种浓度),轻轻摇动以均匀分布细胞,接着在27℃下温育90分钟(0%v/v的co2,0rpm搅拌)。用hyclone sfx昆虫细胞培养基将p1 bev连续稀释至目标稀释度为1.0
×
107bev/毫升,并且然后在轻轻摇动下将1ml稀释p1 bev混合物添加至每个孔中,以均匀分布p1 bev。在27℃下温育感染混合物90分钟(0%v/v的co2,0rpm搅拌)。
[1398]
琼脂糖凝胶通过将4%w/v琼脂糖与life technologies sf
‑
900培养基覆盖液以1:3组合(在70℃下熔融琼脂糖,冷却至37℃进行组合)来制备。然后向每个孔中添加2ml琼脂糖覆盖液,并且将板维持在室温下15
‑
20分钟,以使琼脂糖凝胶硬化。然后在27℃下温育覆盖板5
‑
14天(0%v/v的co2,0rpm搅拌),直至观察到斑块形成。经由测试和斑块检查处理每个孔中的斑块,以提供用于克隆斑块纯化的单一斑块(即单一斑块扩增)。使用sf9细胞混合物扩增单一斑块并在27℃下温育3
‑
5天(0%v/v的co2,0rpm搅拌)。使用在50ml锥形管中离心5分钟来收获所得cp1 bev并将含有cp1 bev的上清液收集到cp1 bev池中。
[1399]
bev感染/biic生产
[1400]
使用较大摇瓶接种sf9细胞混合物并经由多个扩增步骤扩增,每个扩增步骤的目标输出密度为4.0
×
106个细胞/毫升,以允许后续扩增步骤的恒定接种密度为0.5
‑
1.0
×
106个细胞/毫升。在27℃下在135rpm振荡(≤2l工作体积)或90rpm振荡(>2l工作体积)下扩增3
‑
5天(0%v/v的co2)。完成以下扩增:(i)在1.0l烧瓶中扩增至200ml工作体积;(ii)在3l烧瓶中扩增至1000ml工作体积以及(iii)在5l烧瓶中扩增至2500ml工作体积,最终输出密度为2.0
×
106个细胞/毫升。
[1401]
将200ml扩增sf9细胞混合物接种至1.0l烧瓶中(1.0
×
106个细胞/毫升接种密度)并扩增至活感染细胞密度≥2.0
×
106个细胞/毫升,然后用0.01moi的cp1 bev感染。然后将感染细胞温育并在27℃下扩增48
‑
80小时(0%v/v的co2,135rpm),直至细胞达到≥2.0
×
106个细胞/毫升(vcd)、细胞直径≥16.5μm和细胞存活率≥75%。通过减速离心(聚丙烯离心管,5分钟)收获感染细胞并使细胞团块以4.0
×
107细胞/毫升重悬于hyclone sfx昆虫细胞培养基中,接着添加300mm海藻糖、14%v/v dmso和额外sfx培养基,得到目标vcd为2.0
×
106个细胞/毫升。将rep/cap源biic等分到2ml或5ml冷冻小瓶中,并使用控制速率冷冻器冷冻降至≤
‑
65℃,然后储存在
‑
80℃下或ln2蒸气中。
[1402]
实施例2.生产源转基因biic(a)
[1403]
根据实施例1生产转基因源biic,其中转基因杆粒材料代替rep/cap杆粒材料用于p1 bev生产。
[1404]
实施例3.生产源rep/cap biic(b)
[1405]
cp bev池
[1406]
将一小瓶的sf9 cb在125ml摇瓶中解冻(37℃,使用水浴,1
‑
5分钟,直至冰晶消散),然后稀释至40ml工作体积的hyclone sfx昆虫细胞培养基中。使摇瓶温育第一扩增(p0,3
‑
4天),直至sf9细胞混合物的细胞密度扩增至4.0
×
106个细胞/毫升。
[1407]
然后使用较大摇瓶接种培养物并经由多个额外扩增步骤扩增,每个扩增步骤的目标输出密度为4.0
×
106个细胞/毫升,以允许后续扩增步骤的恒定接种密度为0.5
‑
1.0
×
106个细胞/毫升。在27℃下扩增3
‑
5天并包括:(i)在1.0l烧瓶中扩增至200ml工作体积(p1);以及(ii)在3l烧瓶中扩增至1000ml工作体积(p2)。
[1408]
rep/cap转染混合物通过将30μg rep/cap杆粒材料与0.6ml thermofisher grace的昆虫培养基(转染培养基)组合来制备。将稀释杆粒混合物与30μl thermofisher cellfectin ii试剂(转染剂)和额外0.6ml转染培养基组合,接着在18
‑
25℃下温育25
‑
35分钟,然后用4.8ml转染培养基进一步稀释,得到转染混合液。
[1409]
将60ml扩增sf9细胞混合物接种至125ml烧瓶中并使其扩增至1.0
×
106个细胞/毫升接种浓度。然后将sf9细胞混合物接种至6孔细胞培养板中(2ml/孔,1.0
×
106个细胞/毫升接种浓度)。向每个孔中添加1ml转染混合液,并且将板在27℃下温育4
‑
5小时。向每个孔中添加2ml hyclone sfx昆虫细胞培养基,然后将板在27℃下温育3
‑
4天。将所得混合物在50ml锥形管中离心5分钟,并且收集含有p1 bev的上清液并与其他p1 bev上清液合并。将p1 bev池储存在4
‑
8℃下。
[1410]
将扩增sf9细胞混合物在轻轻摇动下接种至6孔细胞培养板(2ml/孔,0.5
‑
1.0细胞/毫升接种浓度)中以均匀分布细胞,接着在27℃下温育90分钟。用hyclone sfx昆虫细胞培养基将p1 bev连续稀释至目标稀释度为1.0
‑
5.0
×
107bev,并且然后在轻轻摇动下将1ml稀释p1 bev混合物添加至每个孔中,以均匀分布p1 bev。在27℃下温育感染混合物90分钟。
[1411]
琼脂糖凝胶通过将4%w/v琼脂糖1:3与life technologies sf
‑
900覆盖液组合来制备。向每个孔中添加琼脂糖覆盖液,并且将板维持在室温下15
‑
20分钟,以使琼脂糖凝胶硬化。然后在27℃下温育覆盖板10天,直至观察到斑块形成。经由测试和斑块检查处理每个孔中的斑块,以提供用于克隆斑块纯化的单一斑块(即单一斑块扩增)。使用120ml池的sf9细胞混合物在500ml烧瓶中扩增单一斑块,在27℃下温育4天。使用在50ml锥形管中离心5分钟收获所得cp2 bev并将含有cp2 bev的上清液收集到cp2 bev池中。
[1412]
bev感染/biic生产
[1413]
将sf9细胞混合物在5l烧瓶中接种并经由多个扩增步骤扩增至3000ml工作体积,最终感染密度为1.0
×
106个细胞/毫升。然后用0.01moi的cp2 bev感染扩增的sf9细胞混合物。将感染细胞在27℃下温育并扩增48
‑
36小时,然后通过减速离心(聚丙烯离心管,5分钟)并以2.0
×
107个细胞/毫升重悬于hyclone sfx昆虫细胞培养基中,接着添加300mm海藻糖、14%v/v dmso和额外sfx培养基收获,得到目标vcd为2.0
×
106个细胞/毫升。将rep/cap源biic等分到2ml或5ml冷冻小瓶中,并使用控制速率冷冻器冷冻降至≤
‑
65℃,然后储存在
‑
80℃下或ln2蒸气中。
[1414]
实施例4.生产源转基因biic(b)
[1415]
根据实施例3生产转基因源biic,其中转基因杆粒材料代替rep/cap杆粒材料用于p1 bev生产。
[1416]
实施例5.从源biic生产感染biic
[1417]
将一小瓶的sf9 9f4 cb在125ml摇瓶中解冻(37℃,使用水浴,1
‑
5分钟,直至冰晶消散),然后稀释至20ml工作体积的esf
‑
af培养基中。在27℃下在未加湿的环境空气、温度调节恒温箱中温育摇瓶(100rpm振荡,2英寸轨道直径),直至细胞密度扩增至5.0
‑
8.0
×
106个细胞/毫升之间。
[1418]
然后使用较大摇瓶接种培养物并经由多个额外扩增步骤扩增,每个扩增步骤的目标输出密度为5.0
‑
8.0
×
106个细胞/毫升,以允许后续扩增步骤的恒定接种密度为1.0
‑
1.5
×
106个细胞/毫升。在27℃下在100rpm振荡(≤2l工作体积)或80rpm振荡(>2l工作体积)下
扩增3
‑
5天。
[1419]
完成以下额外扩增:(i)在500ml烧瓶中扩增至100ml工作体积;(ii)在1.0l烧瓶中扩增至400ml工作体积;(iii)在3l烧瓶中扩增至1500ml工作体积;以及(iv)在两个5l生产型烧瓶(rep/cap生产型烧瓶和转基因生产型烧瓶)中的每一者中扩增至2500ml工作体积。
[1420]
温育rep/cap生产型烧瓶直至细胞浓度扩增至1.8
‑
2.5
×
106个细胞/毫升,并且然后用rep/cap源biic感染(sf9与biic感染比率为1.0
×
104个细胞与细胞(c/c),等同于1.0
×
105(v/v)感染比率)。将感染细胞温育72小时(目标细胞直径≥19.0μm,细胞培养物密度目标≥3.0
×
106个细胞/毫升),然后通过减速离心(聚丙烯离心管,在4.0℃下5分钟)并使细胞团块以2.0
×
107个细胞/毫升重悬于50%2x冷冻培养基(858ml/l esf
‑
af培养基,140ml/l二甲亚砜,113ml/l海藻糖,二水合物)和50%esf
‑
af培养基中。将rep/cap感染biic的重悬培养物等分到2ml或5ml冷冻小瓶中并储存于ln2蒸气中。
[1421]
温育转基因生产型烧瓶直至细胞浓度扩增至1.8
‑
2.5
×
106个细胞/毫升,并且然后用转基因源biic感染(sf9与biic感染比率为1.0
×
104个细胞与细胞(c/c),等同于1.0
×
105(v/v)感染比率)。将感染细胞温育96
‑
100小时(目标细胞直径≥19.0μm,细胞培养物密度目标≥3.0
×
106个细胞/毫升),然后通过减速离心(聚丙烯离心管,在4.0℃下5分钟)并使细胞团块以2.0
×
107个细胞/毫升重悬于50%2x冷冻培养基(858ml/l esf
‑
af培养基,140ml/l二甲亚砜,113ml/l海藻糖,二水合物)和50%esf
‑
af培养基中。将转基因感染biic的重悬培养物等分到2ml或5ml冷冻小瓶中并储存于ln2蒸气中。
[1422]
实施例6.上游
‑
生产批量颗粒池(a)
[1423]
将一小瓶的sf9 9f4 cb的在125ml摇瓶中解冻(37℃,使用水浴,1
‑
5分钟,直至冰晶消散),然后稀释至20ml工作体积的esf
‑
af培养基中。在27℃下,在第一扩增中使摇瓶在未加湿的环境空气、温度调节恒温箱中温育约48小时(130
‑
150rpm振荡,25mm轨道直径),直至细胞密度扩增至5.0
‑
8.0
×
106个细胞/毫升之间。
[1424]
然后使用较大摇瓶接种培养物并经由多个额外扩增步骤扩增,每个扩增步骤的目标输出密度为5.0
×
106‑
1.0
×
107个细胞/毫升,以允许后续扩增步骤的恒定目标接种密度为1.0
‑
1.5
×
106个细胞/毫升。在27℃下在130
‑
150rpm振荡(≤400ml工作体积)或100
‑
120rpm振荡(>400ml工作体积)下扩增3
‑
5天。
[1425]
完成以下额外扩增:(i)在250或500ml烧瓶中扩增至100ml工作体积;(ii)在1.0l烧瓶中扩增至400ml工作体积;(iii)在3l烧瓶中扩增至1500ml工作体积;以及(iv)在两个5l烧瓶(5000ml总工作体积)中的每一者中扩增至2500ml工作体积。
[1426]
将扩增培养混合物转移至50l ge wave生物反应器(0.25ml/min固定空气喷射,按需供氧至40%溶解o2,20rpm摇动、9
°
摇动角度、250ml/min空气入口)中进行额外扩增(在27℃下,3
‑
5天),至25l工作体积,目标输出密度为5.0
‑
8.0
×
106个细胞/毫升。然后将培养基接种至搅拌槽ge xcellerax生物反应器中(68rpm搅拌,0.5ml/min固定空气喷射,按需级联氧气至40%溶解o2,0.5ml/min顶部空间流动速率),并扩增(n
‑
1生物反应器步骤,在27℃下2
‑
3天)至125l工作体积,目标输出密度为1.5
‑
2.0
×
106个细胞/毫升。
[1427]
将培养混合物接种至单用途生产型生物反应器中,接种密度为0.8
‑
1.5
×
106个细胞/毫升和200l工作体积。将培养基在生物反应器(6w/m3叶轮,0.8ml/min固定空气喷射,按需级联氧气至40%溶解o2,0.8ml/min顶部空间流动速率)中进一步扩增至200l工作体积中
ge wave生物反应器(0.25ml/min固定空气喷射,按需供氧至40%溶解o2,20rpm摇动至多9
°
角度)中进行额外扩增(在27℃下3
‑
5天),至25l工作体积,目标输出密度为3.0
×
106个细胞/毫升。
[1440]
将培养基再次外加10%w/v普洛尼克f
‑
68(2.045v/v峰值)并且然后接种至ge 250l xcellerax生物反应器中,接种密度为0.8
×
106个细胞/毫升和125l工作体积(hyclone sfx昆虫细胞培养基)。培养基在生物反应器中扩增2
‑
4天(按需级联氧气至40%溶解o2,1l/min空气覆盖,27℃容器温度,60℃通风口加热器温度,向下混合器方向80rpm),至200l工作体积中的3.0
×
106个细胞/毫升。
[1441]
然后用rep/cap感染biic和转基因感染biic共感染生物反应器中的细胞(1:1biic比率,5.0
×
103sf9:biic比率)。将感染细胞温育5
‑
7天并且收获批量收获物经由下游处理进行溶胞和处理。
[1442]
经由扩增和生物反应步骤中的每一者获取样品,以在整个上游工艺中监测细胞密度和存活率。
[1443]
实施例8.上游
‑
生产批量颗粒池(c)
[1444]
将一小瓶的sf9 9f4 cb在125ml摇瓶中解冻(37℃,使用水浴,1
‑
5分钟,直至冰晶消散),然后稀释至20ml工作体积的esf
‑
af培养基中。在第一扩增中,在27℃下在未加湿的环境空气、温度调节恒温箱中温育摇瓶(100rpm振荡,2英寸轨道直径),直至细胞密度扩增至5.0
‑
8.0
×
106个细胞/毫升之间。
[1445]
然后使用较大摇瓶接种培养物并经由多个额外扩增步骤扩增,每个扩增步骤的目标输出密度为4.0
‑
5.0
×
106个细胞/毫升,以允许后续扩增步骤的恒定接种密度为0.5
×
106个细胞/毫升。在27℃下在100rpm振荡(≤2l工作体积)或80rpm振荡(>2l工作体积)下完成扩增持续3
‑
5天。
[1446]
完成以下额外扩增:(i)在1l烧瓶中扩增至200ml工作体积;(ii)在3l烧瓶中扩增至1000ml工作体积;以及(iii)在5l烧瓶中扩增至3000ml工作体积。
[1447]
将5l扩增培养混合物外加10%w/v普洛尼克f
‑
68(2.045v/v峰值),然后转移至50l ge wave生物反应器(0.25ml/min固定空气喷射,按需供氧至40%溶解o2,20rpm摇动至9
°
角度)中进行额外扩增(在27℃下3
‑
5天),至25l工作体积,目标输出密度为3.0
×
106个细胞/毫升。
[1448]
培养基再次外加10%w/v普洛尼克f
‑
68(2.5v/v峰值)并且然后接种至thermofisher 250l hyperforma生物反应器中,接种密度为1.0
‑
2.0
×
106个细胞/毫升和125l工作体积(hyclone sfx昆虫细胞培养基)。培养基在生物反应器中扩增2
‑
3天(按需级联氧气至40%溶解o2,0.25l/min空气喷射,7l/min空气覆盖、27℃容器温度,65℃通风口加热器温度,60rpm混合器),直至200l工作体积中的2.5
‑
2.75
×
106个细胞/毫升。
[1449]
然后用rep/cap感染biic(1:250k v/v)和转基因感染biic(1:50kv/v)共感染生物反应器中的细胞。将感染细胞温育1
‑
2天并且收获批量收获物以经由下游处理进行溶胞和处理。
[1450]
经由扩增和生物反应步骤中的每一者获取样品,以在整个上游工艺中监测细胞密度和存活率。
[1451]
实施例9.下游
‑
细胞溶胞
[1452]
通过添加0.2m精氨酸hcl(ph 7.5,11.43%v/v),接着10%triton x
‑
100表面活性剂(2.86%v/v,最终溶胞混合物中的0.25%w/v triton x
‑
100),接着benzonase核酸酶(i级,99%纯度,10u/ml)和最后2m tris碱在生产型生物反应器中的批量收获物上起始化学性溶胞,得到溶胞ph为6.9
‑
7.1。溶胞混合物在37℃下以6w/m3搅拌保持4.0
‑
6.0小时,直至产生粗溶胞物池。使粗溶胞物池达到室温并在进一步处理之前无菌取样。
[1453]
在一个替代方案中,通过添加0.2m精氨酸hcl(ph 7.5,11.43%v/v),接着10%triton x
‑
100表面活性剂(5.3%v/v,最终溶胞混合物中的0.5%w/v triton x
‑
100)在生产型生物反应器中的200l批量收获物上起始化学性溶胞,得到溶胞ph为6.8
‑
7.5。溶胞混合物在27℃下以6w/m3搅拌保持4.0
‑
6.0小时,直至产生粗溶胞物池。
[1454]
在一个替代方案中,通过添加2m tris碱(得到溶胞ph为6.9
‑
7.1),接着添加0.2m精氨酸hcl(ph 7.5,30kg 1.18kg/l),然后sartorius denarase核酸酶(5u/ml),和最后20%triton x
‑
100表面活性剂在pbs背景(3.25%kg 1.00kg/l)中在生产型生物反应器(225l工作体积)中的批量收获物上起始化学性溶胞。溶胞混合物在37℃下以60rpm搅拌保持3
‑
4小时,直至产生粗溶胞物池。
[1455]
在一个替代方案中,通过添加10%triton x
‑
100表面活性剂(2.57%v/v峰值),接着benzonase核酸酶(i级,99%纯度,10u/ml)在生产型生物反应器中的批量收获物上起始化学性溶胞。溶胞混合物在37℃下在搅拌下保持6
‑
12小时,直至产生粗溶胞物池。
[1456]
在一个替代方案中,使用0.5m精氨酸或精氨酸hcl代替0.2m精氨酸hcl。
[1457]
实施例10.下游
‑
深层过滤
[1458]
来自化学性溶胞的粗溶胞物池经由深层过滤使用emd millipore millistak
pod过滤器(d0hc培养基系列)(≤250l/m2负载挑战,150
‑
200lmh负载通量)处理,压差低于30psid并且入口压力低于50psig。使用20mm磷酸钠、350mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68(混合物ph为7.4)使过滤回收冲洗液通过深层过滤器,并且将经冲洗回收物添加至深层过滤池中。
[1459]
在一个替代方案中,经由深层过滤使用emd millipore millistak
pod过滤器(c0sp培养基系列)处理来自化学性溶胞的粗溶胞物池(≤250l/m2负载挑战)。
[1460]
在一个替代方案中,回收冲洗液(10
‑
20l/m2负载挑战,150
‑
200lmh负载通量)使用50mm磷酸钠、350mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68(混合物ph为7.4)。在一个替代方案中,回收冲洗液(9
‑
12l/m2负载挑战)使用pbs。
[1461]
实施例11.下游
‑
0.2μm过滤
[1462]
来自深层过滤的深层过滤池经由0.2μm过滤处理,其使用emd millipore express shc xl10 0.5/0.2μm过滤器(≤250l/m2负载挑战,300lmh负载通量),压差低于72.5psid、入口压力低于80psig和背压低于29psig。使用20mm磷酸钠、350mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68(混合物ph为7.4)使过滤回收冲洗液通过0.2μm过滤器,并且将冲洗回收物添加至0.2μm过滤池中。所得0.2μm过滤池外加5m nacl(7.0
‑
7.5%v/v)并保持1
‑
2天,形成澄清溶胞物池。将澄清溶胞物池储存在2
‑
8℃下。
[1463]
在一个替代方案中,0.2μm过滤使用sartorius sartopore 2xlg,0.8/0.2μm过滤器,具有300l/m2负载挑战。在另一替代方案中,0.2μm过滤包含回收冲洗液,其使用50mm磷酸钠、350mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68(混合物ph为7.4)。
[1464]
实施例12.下游
‑
亲和色谱
[1465]
经由亲和色谱(afc)使用ge avb琼脂糖hp柱树脂(3.0
‑
3.5l柱体积)处理来自深层过滤和0.2μm过滤的澄清溶胞物池。用20mm磷酸钠、350mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68的混合物(混合物ph为7.4)平衡柱树脂(3
‑
7柱体积(cv),150cm/hr)。然后在18
‑
25℃下使柱树脂负载澄清溶胞物池(≤5.0
×
10
13
vg/ml
‑
r负载挑战),然后用20mm磷酸钠、350mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68的混合物(混合物ph为7.4)冲洗(1
‑
3cv,150cm/hr)。接着用20mm柠檬酸钠、1m氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68的混合物(混合物ph为6.0)第一次洗涤柱树脂(5cv,150cm/hr);并且用10mm柠檬酸钠、350mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68的混合物(混合物ph为6.0)再次洗涤柱树脂(5cv,150cm/hr)。然后使用20mm柠檬酸钠、350mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68的混合物(混合物ph为3.0)从柱树脂洗脱过滤产物(2
‑
3cv,150cm/hr),目标洗脱池为2.5
‑
3.0cv。
[1466]
用0.5m tris碱和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68中和所得洗脱池(8
‑
12%v/v,最终目标ph为8.0)。然后经由0.2μm过滤使用emd millipore express shc xl6000 0.5/0.2μm过滤器处理中和洗脱池(≤1000l/m2负载挑战,≤30psi,≤400l/m2/hr流动速率),得到afc池(也称为avb池),工作池体积为8.5
‑
9.0l。
[1467]
在一个替代方案中,将澄清溶胞物池外加5m nacl(7.53%v/v),然后经由亲和色谱法处理。
[1468]
在一个替代方案中,用50mm磷酸钠、350mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68的混合物(混合物ph为7.4)平衡柱树脂(5
‑
7cv,150cm/hr)并冲洗(2cv,150cm/hr)。
[1469]
在一个替代方案中,在第一洗涤步骤和第二洗涤步骤之前不冲洗柱树脂。
[1470]
在一个替代方案中,用2m tris碱和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68中和所得洗脱池(3.0%v/v峰值,目标最终ph为8.0
‑
8.5)。
[1471]
在一个替代方案中,经由afc使用poros aavx或poros aav9树脂处理澄清溶胞物池,用甘氨酸代替柠檬酸盐进行洗脱。在一个替代方案中,洗涤溶液包含150mm氯化钠而非350mm氯化钠。在一个替代方案中,洗涤溶液包含0mm氯化钠而非350mm氯化钠。
[1472]
在一个替代方案中,经由afc使用poros aav9树脂处理澄清溶胞物池(≤5.0
×
10
13
vg/ml
‑
r负载挑战,4分钟滞留),如上文所公开的第一次洗涤和包含50mm柠檬酸钠、350mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68的混合物(混合物ph为5.5)的第二次洗涤,接着包含200mm甘氨酸的洗脱混合物(ph 2)。
[1473]
在一个替代方案中,使用甘氨酸代替柠檬酸盐进行洗脱。在一个替代方案中,洗涤溶液包含150mm氯化钠而非350mm氯化钠。在一个替代方案中,洗涤溶液包含0mm氯化钠而非350mm氯化钠。
[1474]
在一个替代方案中,经由疏水相互作用色谱(hic)在以下条件下处理澄清溶胞物池:目标操作负载为5%的在2m硫酸铵、0.001%f68(ph 7)中的批量aav药物产品;目标负载挑战为约2.5
‑
10.0
×
10
12
vg/ml
‑
r;用2m硫酸铵、50mm tris、.001%f68(ph 7.75)平衡;以及用250mm硫酸铵、50mm tris、.001%f68(ph 7.75)洗脱。在一个替代方案中,澄清溶胞物池在以下条件下经由疏水相互作用色谱(hic)处理:目标操作负载为5%的在1m硫酸铵、0.001%f68(ph 7)中的批量aav药物产品;目标负载挑战为约2.5
‑
10.0
×
10
12
vg/ml
‑
r;用1m硫酸铵、50mm tris、.001%f68(ph 7.75)平衡;以及用250mm硫酸铵、50mm tris、.001%f68
(ph 7.75)洗脱。所用hic树脂为tosoh ppg 600m、tosoh苯基650m、tosoh丁基650m或poros苯甲基hic。
[1475]
实施例13.下游
‑
离子交换色谱
[1476]
使用sartorius sartobind q膜(150ml膜体积,结合和洗脱模式)经由阴离子交换色谱(aex)处理经中和afc/avb池。用20mm tris、2m氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68的第一混合物(混合物ph为8.0),以及然后20mm tris、100mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68的第二混合物(混合物ph为8.0)平衡aex膜(20膜体积(mv),5
‑
7mv/min)。用300
‑
320%v/v的20mm tris和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68(混合物ph为8.0)通过1:4稀释负载调节afc池,目标池电导率为10ms/cm和目标池ph为8.0。然后在18
‑
25℃和5mv/min下使aex膜系统负载稀释的afc池(4.0
×
10
13
vg/ml
‑
r负载挑战)。用20mm tris、100mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68的混合物(混合物ph为8.0)冲洗系统(20mv,5mv/min)。然后用20mm tris、220mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68的混合物(混合物ph为8.0)从aex膜系统(20mv,5mv/min)洗脱产物,收集全部洗脱。然后经由0.2μm过滤使用emd millipore express shcxl150过滤器(≤1000l/m2负载挑战,≤30psi)处理aex洗脱池,得到aex池,工作池体积为1.5
‑
2.0l。
[1477]
在一个替代方案中,使用millipore fractogel tmae hicap(m)穿流膜树脂经由aex处理中和的afc/avb池。装入aex膜并用20mm tris、2m氯化钠和0.001%w/v普洛尼克pluronic f
‑
68的第一混合物(混合物ph为8.0),以及然后40mm tris、170mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克pluronic f
‑
68的第二混合物(混合物ph为8.5)平衡(5cv,150cm/hr)。通过100
‑
110%v/v峰值10mm tris和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68(混合物ph为8.0
‑
8.5)对afc池进行负载调节,目标池电导率为17ms/cm(用5m nacl调节)并且目标池ph为8.5(用2m tris碱调节)。然后在18
‑
25℃下使aex膜系统负载调节的afc池(1.0
‑
5.0
×
10
13
vg/ml
‑
r负载挑战)。用40mm tris、170mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68的混合物(混合物ph为8.5)冲洗和洗脱系统(2cv,150cm/hr),收集全部洗脱。然后经由0.2μm过滤使用emd millipore express shcxl150过滤器(≤1000l/m2负载挑战,≤30psi)处理aex洗脱池,得到aex池。
[1478]
在一个替代方案中,使用ge q sepharose hp膜树脂经由aex处理中和的afc/avb池。用50mm bis
‑
tris丙烷、200mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68的混合物(混合物ph为9.0)平衡aex膜(5
‑
20mv,150cm/hr)。用0.5mm bis
‑
tris丙烷和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68对afc池进行负载调节至ph为9.0,接着用100mm bis
‑
tris丙烷、20mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68(混合物ph为9.0)以1:1稀释。然后在18
‑
25℃和150cm/hr下使aex膜系统负载稀释的afc池(≤1.0
×
10
14
vg/mlr负载挑战)。用50bis
‑
tris丙烷、200mm氯化钠和0.001%w/v普洛尼克f
‑
68的混合物(混合物ph为9.0)冲洗和洗脱系统(3cv,150cm/hr)。用10%v/v峰值的1m tris、2m nacl和0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68(混合物ph为ph 7.5)中和aex洗脱池。然后经由0.2μm过滤使用emd millipore express sh cxl150过滤器(≤1000l/m2负载挑战,≤30psi)处理aex洗脱池,得到aex池。
[1479]
在一个替代方案中,使用sartorius sartobind stic膜经由aex处理中和的afc/avb池(每250l批次<2.5l膜体积,结合和洗脱模式,≤1.0
×
10
14
vg/mlr负载挑战)。用20mm磷酸钠、50mm氯化钠和0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68的混合物(混合物ph为6.8)冲洗和洗脱系统。在一个替代方案中,经由aex处理来自深层过滤(实施例10)和0.2μm过滤(实施例11)的澄清溶胞物池,然后经由亲和色谱(afc)处理(实施例12)。
[1480]
在一个替代方案中,使用poros xs膜树脂经由阳离子交换色谱(cex)处理中和的afc/avb池。向cex膜装入1m nacl(6
‑
10cv,500cm/hr),然后用20mm tris、100mm nacl和0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68(混合物ph为8.5)平衡。用2m tris碱将afc池负载调节至ph为8.5,接着用wfi水稀释至目标池电导率为15ms/cm,然后接着添加0.001%w/v的1%普洛尼克f
‑
68。然后将cex膜系统负载稀释的afc池(≤1.0
×
10
14
vg/ml
‑
r负载挑战,3.3分钟滞留)。用20mm tris和0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68(混合物ph为8.5)洗涤系统(6cv,3.3分钟滞留);接着用20mm tris、290mm nacl和0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68(混合物ph为8.5)第一次洗脱(10cv,≤500cm/hr);并且然后用20mm tris、305mm nacl和0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68(混合物ph为ph 8.5)第二次洗脱(10cv,≤500cm/hr)。用1m乙酸将cex洗脱池中和至混合物ph为7.0。然后使用emd millipore express shc xl150过滤器(50l/m2负载挑战)经由0.2μm过滤处理aex洗脱池,得到cex池作为aex池等效物。
[1481]
在一个替代方案中,使用poros hq膜树脂(3.4ml cv)经由aex处理中和的afc/avb池,ph 7.8
‑
8.2下的目标池电导率为16
‑
20ms/cm。在一个替代方案中,使用以下参数经由aex处理中和的afc/avb池:靶向负载挑战为约1
×
10
13
vgs/ml
‑
r,目标负载电导率为<5
‑
6ms/cm,负载ph为8
‑
10,用氯化钠和乙酸钠盐洗脱ph为8
‑
10。在一个替代方案中,使用nuvia aprime 4a膜经由多模态色谱(mmc)处理中和的afc/avb池,其使用以下参数:靶向负载挑战为约1
×
10
13
vgs/ml
‑
r,目标负载电导率为<5
‑
6ms/cm,负载ph为8
‑
10,用氯化钠和乙酸钠盐洗脱ph为8
‑
10。在一个替代方案中,使用9.5或更高的ph经由aex或mmc处理中和的afc/avb池。
[1482]
实施例14.下游
‑
tff过滤
[1483]
使用spectrum mpes hollow fiber tff系统(0.5mm纤维id,100kda mwco,20
‑
30l/m2负载挑战,4
‑
5psi tmp,2000sec
‑1剪切)经由切向流过滤(tff)处理中和的aex池。tff系统首先用wfi水冲洗(20l/m2),然后用0.1m naoh消毒(20l/m2,保持45分钟),然后用包含20mm tris、220mm氯化钠和0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68的aex洗脱缓冲液(ph 8.0)平衡(20l/m2),继续进行平衡,直至渗透液和渗余流出物的ph为8.0。使用asahi kasei planova 35n过滤器作为具有恒定压力(12.5l/m2负载挑战,10psi)的单一负载连续流过程经由预tff纳米过滤处理aex池,产生tff负载池。tff负载池外加50%蔗糖混合物(11%v/v),然后使用第一渗滤缓冲液(高盐、低蔗糖)经由第一渗滤(df)步骤(5
‑
6渗滤体积(dv),低剪切)处理,所述第一渗滤缓冲液包含10mm磷酸钠、1.5mm磷酸钾、220mm氯化钠、5%w/v蔗糖和0.001%(w/v)泊洛沙姆188(缓冲液ph为7.5)。产物池的渗滤接着是经由超滤浓缩至目标浓度为7.0
×
10
13
vg/ml(通过ddpcr确认),以及然后使用最终配制缓冲液(低盐、高蔗糖)的第二渗滤步骤(7
‑
8dv,低剪切),所述最终配制缓冲液包含10mm磷酸钠(二元)、1.5mm磷酸钾(一元)、100mm氯化钠、7%w/v蔗糖和0.001%(w/v)泊洛沙姆188(缓冲液ph为7.5)。将包含产物和最终配制缓冲液的渗余物收集到最终tff池中。使用ddpcr过夜分析最终tff池的病毒滴度。
[1484]
使用最终配制缓冲液(低盐、高蔗糖)对tff系统进行回收冲洗(110%v/v的系统滞留,10min再循环),所述最终配制缓冲液包含10mm磷酸钠(二元)、1.5mm磷酸钾(一元)、100mm氯化钠、7%w/v蔗糖和0.001%(w/v)泊洛沙姆188(缓冲液ph为7.5)。分别从最终tff池收集最终tff回收冲洗液。使用ddpcr过夜分析最终tff回收冲洗液的病毒滴度。将最终
tff回收冲洗液添加至最终tff池,得到病毒浓度为3.5
×
10
13
vg/ml的vrf负载池。根据需要添加额外最终配制缓冲液(低盐、高蔗糖),以实现vrf负载池的目标病毒浓度。
[1485]
在一个替代方案中,使用millipore pellicon
‑
3ultracel plctk系统经由tff处理中和的aex池(30kda mwco,2
‑
3l/m2负载挑战)。用20mm tris、290mm氯化钠和0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68平衡tff系统(20l/m2,5分钟接触),继续进行平衡,直至渗透液和渗余流出物的ph为7.0。用20mm tris、290mm氯化钠和0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68将tff负载池稀释至病毒浓度为2.0
‑
3.0
×
10
12
vg/ml。tff负载池未经由预tff纳米过滤处理,而是使用渗滤缓冲液直接处理至渗滤步骤(6dv,5
‑
10psi tmp,10
‑
20psi入口,80lmh)中,所述渗滤缓冲液包含10mm磷酸钠、180mm氯化钠和0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68(混合物ph为7.3)。然后经由超滤(10
‑
20psi入口,80lmh)将池浓缩至目标浓度为5.0
×
10
12
vg/ml。将包含产物和配制缓冲液的渗余物收集到最终tff池中。所述过程不包括第二渗滤步骤或回收冲洗。
[1486]
在一个替代方案中,使用具有pellicon
‑
3盒的millipore ultracel plctk系统经由tff处理中和的aex池(0.57m2,30kda mwco,2
‑
3l/m2负载挑战,6psi tmp,5
‑
10psi入口进料)。tff系统首先用wfi水冲洗(25l/m2),然后用0.25m naoh消毒(25l/m2,保持45分钟),然后用包含40mm tris、170mm氯化钠和0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68的平衡缓冲液(ph 8.5)平衡(25l/m2),继续进行平衡,直至渗透液和渗余流出物的ph为8.5。tff负载池未经由预tff纳米过滤或第一渗滤步骤处理,而是经由超滤(2.6l/min)浓缩至5.0
×
10
12
vg/ml的目标浓度(通过ddpcr确认),并且然后使用包含10mm磷酸钠、180mm氯化钠和0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68的渗滤缓冲液(混合物ph为7.3)进行渗滤步骤(8dv,2.6l/min)。使用相同渗滤缓冲液使tff系统经受回收冲洗(110%v/v的系统滞留,5
‑
10min再循环)。分别从最终tff池收集最终tff回收冲洗液,并且使用emd millipore express shcxl150过滤器(≤1000l/m2负载挑战,≤400l/m2/hr流动速率,≤30psi)经由0.2μm过滤分别处理每个池。将过滤的tff回收冲洗液添加至过滤tff池,然后根据需要用渗滤缓冲液稀释,得到病毒浓度为2.0
‑
6.0
×
10
12
vg/ml的vrf负载池。
[1487]
在一个替代方案中,系统使用具有pellicon
‑
3盒的millipore ultracel plctk(0.57m2,30kda mwco,2
‑
3l/m2负载挑战,进料tmp时25psig,350lmh,7渗滤体积,<6.0
×
10
16
vg/m2负载)。
[1488]
在一个替代方案中,用10mm磷酸钠、2mm磷酸钾、2.7mm氯化钾、192mm氯化钠和0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68的混合物(混合物ph为7.5)平衡tff系统(10
‑
15l/m2)。tff负载池未经由预tff纳米过滤或第一渗滤步骤处理,而是经由超滤(0.5mm纤维id,100kda mwco,60l/m2负载挑战,4
‑
5psi tmp,4000sec
‑1剪切)浓缩至5.0
×
10
12
vg/ml的目标浓度(通过qpcr确认),然后使用渗滤缓冲液进行渗滤步骤(5dv,4
‑
5psi tmp,4000sec
‑1剪切),所述渗滤缓冲液包含10mm磷酸钠、2mm磷酸钾、2.7mm氯化钾、192mm氯化钠、0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68(混合物ph为7.5)。使用包含10mm磷酸钠、2mm磷酸钾、2.7mm氯化钾、192mm氯化钠和0.001%(w/v)普洛尼克f
‑
68的缓冲液对tff系统进行回收冲洗(110%v/v的系统滞留,5min再循环)。将最终tff回收冲洗液添加至最终tff池,得到病毒浓度为3.0
‑
5.0
×
10
12
vg/ml的vrf负载池。
[1489]
实施例15.下游
‑
病毒截留性过滤
[1490]
经由病毒截留性过滤(vrf)使用asahi kasei planova 35n过滤器(50.0
‑
100.0l/
m2负载挑战,10psi)处理vrf负载池,其已经由具有10mm磷酸钠(二元)、1.5mm磷酸钾(一元)、100mm氯化钠、7%w/v蔗糖和0.001%(w/v)泊洛沙姆188的配制缓冲液(缓冲液ph为7.5)的预使用冲洗(10.0l/m2负载挑战,10psi)处理。vrf过滤接着经由0.2μm过滤使用emd millipore express shcxl150过滤器(≤1000l/m2负载挑战,≤30psi)处理,得到vrf池,工作病毒浓度为3.5
‑
5.0
×
10
12
vg/ml。
[1491]
然后经由millipore最终过滤(ff),使用emd millipore无菌millipak 0.22μm处理vrf池(用配制缓冲液预使用冲洗,≥10.0l/m2负载挑战;ff过程≤1000l/m2负载挑战,200lmh负载通量,≤60psi压差,≤75psi入口压力),得到原料药池,工作病毒浓度为3.5
‑
5.0
×
10
12
vg/ml。在2
‑
8℃下,将一部分原料药池储存于封闭于大气的无菌生物处理袋中持续≤1个月。在≤
‑
60℃下,将一部分原料药池储存于封闭于大气的无菌聚丙烯容器中持续≥1个月。
[1492]
在一个替代方案中,vrf过滤器和ff过滤器均用wfi水预使用冲洗(10l/m2,240
‑
300lmh,14psi),接着用10mm磷酸钠、180mm氯化钠和0.001%普洛尼克f68(混合物ph7.3)进行第二次预使用冲洗。
[1493]
在一个替代方案中,vrf过滤器用10mm磷酸钠、2mm磷酸钾、2.7mm氯化钾、192mm氯化钠和0.001%普洛尼克f68的混合物(混合物ph为7.5)预使用冲洗(10
‑
20l/m2)。
[1494]
在一个替代方案中,vrf过滤器为millipore nfr过滤器。
[1495]
实施例16.下游
‑
填充和精整
[1496]
将合并原料药转移至生物安全柜(bsc)中并经由emd millipore millipak gamma gold 0.22μm过滤器(双线无菌级过滤器,≤1000l/m2负载挑战,200lmh负载通量,≤60psi压差,≤75psi入口压力)过滤。经过滤原料药池包含10mm磷酸钠、180mm氯化钠和0.001%普洛尼克f68(混合物ph为7.3),目标aav浓度为3.0
‑
5.0
×
10
12
vg/ml。然后在bsc内利用可程序化蠕动分配泵将经过滤原料药池无菌填充至2ml冷冻小瓶(1.8ml填充体积,1.6ml可萃取)。将产物小瓶塞住,加密封盖,100%目视检查并标记(在25℃下),然后储存于≤
‑
65℃下。
[1497]
在一个替代方案中,经由pall supor ekv,0.2μm无菌级过滤器过滤合并的原料药。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询,结果仅供参考。